Summary
De stria vascularis is van vitaal belang voor het genereren van endocochleair potentieel. Hier presenteren we de dissectie van de volwassen muis stria vascularis voor single-nucleus sequencing of immunostaining.
Abstract
Endocochleair potentieel, dat wordt gegenereerd door de stria vascularis, is essentieel om een omgeving te behouden die bevorderlijk is voor geschikte haarcelmechanotransductie en uiteindelijk gehoor. Pathologieën van de stria vascularis kunnen leiden tot een verminderd gehoor. Dissectie van de volwassen stria vascularis maakt gerichte single-nucleus capture en daaropvolgende single-nucleus sequencing en immunostaining mogelijk. Deze technieken worden gebruikt om stria vascularis pathofysiologie op eencellig niveau te bestuderen.
Single-nucleus sequencing kan worden gebruikt in de setting van transcriptionele analyse van de stria vascularis. Ondertussen blijft immunostaining nuttig bij het identificeren van specifieke populaties van cellen. Beide methoden vereisen een goede stria vascularis-dissectie als voorwaarde, wat technisch uitdagend kan blijken te zijn.
Introduction
Het slakkenhuis bestaat uit drie met vloeistof gevulde kamers, de scala vestibuli, scala media en scala tympani. De scala vestibuli en scala tympani bevatten elk perilymfe, dat een hoge concentratie natrium (138 mM) en een lage concentratie kalium (6,8 mM)1 heeft. Het scala media bevat endolymfe, dat een hoge concentratie kalium (154 mM) en een lage concentratie natrium (0,91 mM)1,2,3 heeft. Dit verschil in ionenconcentratie kan worden aangeduid als de endocochleaire potentiaal (EP) en wordt voornamelijk gegenereerd door de beweging van kaliumionen door verschillende ionkanalen en gap junctions in de stria vascularis (SV) langs de zijwand van het slakkenhuis 4,5,6,7,8,9,10,11 . De SV is een heterogeen, sterk gevasculariseerd weefsel dat het mediale aspect van de laterale wand van het slakkenhuis bekleedt en drie hoofdceltypen bevat: marginale, intermediaire en basale cellen12 (figuur 1).
Marginale cellen zijn verbonden door tight junctions om het meest mediale oppervlak van de SV te vormen. Het apicale membraan staat tegenover de endolymfe van de scala-media en draagt bij aan het transport van kaliumionen naar de endolymfe met behulp van verschillende kanalen, waaronder KCNE1 / KCNQ1, SLC12A2 en Na + -K + -ATPase (NKA) 5,10,13,14. Tussenliggende cellen zijn gepigmenteerde cellen die zich tussen marginale en basale cellen bevinden en kaliumtransport door de SV vergemakkelijken met behulp van KCNJ10 (Kir 4.1)15,16. Basale cellen liggen in de nabijheid van de laterale wand van het slakkenhuis en zijn nauw verbonden met fibrocyten van het spiraalligament om kaliumrecycling van de perilymfe12 te bevorderen. Pathologie van de SV is betrokken bij tal van otologische aandoeningen17,18. Mutaties in genen die tot expressie komen in de belangrijkste SV-celtypen, zoals Kcnq1, Kcne1, Kcnj10 en Cldn11, kunnen doofheid en SV-disfunctie veroorzaken, waaronder het verlies van EP 19,20,21,22,23. Naast de drie belangrijkste celtypen zijn er andere minder bestudeerde celtypen in de SV, zoals spindelcellen 22, wortelcellen12,24, macrofagen 25, pericyten 26 en endotheelcellen 27, die onvolledig gedefinieerde rollen hebben met ionische homeostase en het genereren van EP 28.
In vergelijking met bulk RNA-sequencing biedt single-nuclei RNA-sequencing (sNuc-Seq) informatie over celheterogeniteit, in plaats van een gemiddelde van mRNA over een groep cellen29, en kan bijzonder nuttig zijn bij het bestuderen van de heterogene SV30. SNuc-Seq heeft bijvoorbeeld transcriptionele analyse geproduceerd die suggereert dat er een rol kan zijn voor spindel- en wortelcellen bij het genereren van EP's, gehoorverlies en de ziekte van Ménière18. Verdere transcriptionele karakterisering van de verschillende SV-celtypen kan ons waardevolle informatie verschaffen over de pathofysiologie die ten grondslag ligt aan verschillende mechanismen en subtypen van SV-gerelateerde gehoorfluctuatie en gehoorverlies. De oogst van deze delicate binnenoorstructuren is van het grootste belang voor een optimale weefselanalyse.
In deze studie wordt de microdissectiebenadering beschreven om toegang te krijgen tot en de stria vascularis te isoleren van het volwassen muizenslakkenhuis voor sNuc-Seq of immunostaining. Dissectie van de volwassen muis SV is nodig om verschillende SV-celtypen te begrijpen en hun rol in het gehoor verder te karakteriseren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierproeven en procedures werden uitgevoerd volgens protocollen die zijn goedgekeurd door het Animal Care and Use Committee van het National Institute of Neurological Diseases and Stroke en het National Institute on Deafness and Other Communication Disorders, National Institutes of Health. Alle experimentele protocollen werden goedgekeurd door het Animal Care and Use Committee van het National Institute of Neurological Diseases and Stroke en het National Institute on Deafness and Other Communication Disorders, National Institutes of Health. Alle methoden werden uitgevoerd in overeenstemming met de relevante richtlijnen en voorschriften van het Animal Care and Use Committee van het National Institute of Neurological Diseases and Stroke en het National Institute on Deafness and Other Communication Disorders, National Institutes of Health.
1. Euthanasie bij dieren
- Gebruik C57BL/6J of Kcnj10-ZsGreen transgene muizen, postnatale dag 30+ (P30+), die tussen de 15-20 g wegen.
- Euthanaseer een volwassen muis (leeftijd P30 of ouder) met behulp van een goedgekeurd protocol (hier CO 2-verstikking). Voer onthoofding uit als een secundaire stap.
OPMERKING: Bij immunostaining kunnen sommige antilichamen een achtergrondsignaal hebben als gevolg van niet-specifieke binding aan bloed in de haarvaten van de SV. Hartperfusie met fixatief kan dit probleem aanpakken door bloed uit de haarvaten van de SV te verwijderen. De meeste antilichamen kunnen echter goede resultaten bereiken zonder deze methode en het zal niet in dit protocol worden behandeld.
2. Benig labyrint blootleggen
- Reinig de muis door te spuiten met 70% ethanol en af te vegen met keukenpapier. Besteed bijzondere aandacht aan het hoofdgebied om het risico op besmetting te verminderen. Verwijder de huid van de schedel door de huid naar de neus te trekken.
- Gebruik een scherpe schaar en splits de schedel langs het midsagittale vlak om het linker- en rechtergedeelte te scheiden.
- Verwijder de hersenen uit de schedel om het benige labyrint bloot te leggen.
3. Binnenoorextractie
- Identificeer het binnenoor in het temporale bot (figuur 2A) en schraap de hersenzenuwen weg met een # 55-tang.
OPMERKING: De gebruiker moet het monster stabiliseren met zijn niet-dominante hand met behulp van een tweede set # 55-tangen. Verschillende delen van het specimen kunnen tijdens de dissectie met de stabiliserende tang worden vastgepakt als kritieke delen van het specimen worden vermeden (bijv. het slakkenhuis niet verpletteren). - Gebruik # 55 tang, ontleed de bulla en capsule en maak ze los van het omliggende bot. Verwijder alle resterende weke delen van het oppervlak van het binnenoor.
- Breng het monster over in een heldere weefselkweekschaal met 1x koude PBS (fosfaatgebufferde zoutoplossing), pH 7,4, en plaats onder een dissectiescoop (figuur 2B).
4. SV-dissectie
OPMERKING: Met oefening is het mogelijk om de SV te ontleden als één lang stuk dat op een lint lijkt. De SV is fragiel, dus als hij in stukken breekt, kunnen deze samen worden opgeslagen. Als alternatief kunnen deze worden opgeslagen in afzonderlijk gelabelde putten op basis van hun draai (bijv. Basale, middelste, apicale).
- Als de lichtbronnen van de dissectiekijker kunnen worden verplaatst, plaatst u één licht boven de schotel en de tweede lichtbron vanaf de zijkant, parallel aan het ontleedoppervlak. Dit zorgt voor een beter contrast van het weefsel onder het cochleaire bot.
- Houd met een tang # 55 het monster bij het vestibulaire gedeelte met het slakkenhuis naar boven gericht.
- Gebruik # 55 tang en prik door het cochleaire bot aan de top.
OPMERKING: # 5 tang is dikker dan # 55 en kan worden gebruikt voor het breken van bot, maar de toename in grootte / kracht offert de fijnheid van de tang en het vermogen om kleine weefsels te manipuleren. Overweeg het gebruik van een tang gemaakt met een materiaal zoals inox of dumostar om schade te voorkomen die kan optreden bij een meer delicate tang. Vermijd het duwen van de tang te diep onder het bot om beschadiging van de SV te voorkomen. - Schraap met een # 55-tang langs de apicale draai (figuur 2C) en oefen zachte kracht uit om kleine stukjes van de buitenste botlaag weg te breken. Til het bot voorzichtig op en maak het los van de zijwand.
OPMERKING: Het kan nuttig zijn om over deze dissectie na te denken als "alles weghalen van de SV", in plaats van "de SV uit het slakkenhuis te ontleden". - Ga door met het gebruik van #55 tang om cochleaire botstukken uit de apicale en middelste bochten te verwijderen (Figuur 2D, E). Duw zachtjes de zijwand naar beneden, wrik en verwijder botwandstukken naar de middelste draai om de zijwand van de apicale en middelste bochten bloot te leggen.
- Ga verder met het gebruik van # 55 tang en duw voorzichtig de apicale draaizijwand opzij om het spiraalvormige ganglion bloot te leggen. Maak de laterale wand van apicale en middelste bochten los van het spiraalvormige ganglion langs de buitenste haarcellaag. Verwijder stukjes spiraalvormig ganglion uit het slakkenhuis.
OPMERKING: # 55 tangen zijn kleiner en bieden een voordeel bij het manipuleren van kleine en delicate weefsels. Extra zorg moet worden genomen om te voorkomen dat ze buigen of beschadigen. - Om betere toegang te hebben tot de laterale wand van de basale bocht, maakt u het slakkenhuis los van het vestibulaire deel van het temporale bot met behulp van # 55 tang. Plaats de # 55-tang in het ronde en ovale venster en duw naar beneden in de richting van de vestibule. Het slakkenhuis zal loskomen. Verwijder het vestibulaire deel van het binnenoor.
- Ga verder met het gebruik van # 55-tang en verwijder nu stukjes basaal cochleair bot, beginnend bij het middelste draaigebied. Duw de laterale wandlaag voorzichtig onder het bot om deze los te maken.
- Verwijder het verste basale deel van de zijwand door te wrikken en voorzichtig aan het weefsel te trekken. Het bot in dit gebied kan te dik zijn om te worden verwijderd zonder het zachte weefsel eronder te beschadigen.
- Nu, met het basale deel van de zijwand losgemaakt, scheidt u zoveel mogelijk van de zijwand van het slakkenhuis. Dit kan door de #55 tang langs de zijwand te volgen. Borstel voorzichtig de tang tussen het bot en de resterende zijwand. Dit kan helemaal tot aan de apex in één stuk worden gedaan als de gebruiker ervaren is. Verplaats de zijwand naar verse PBS.
OPMERKING: Hoewel grotere stukken SV gemakkelijker in beeld kunnen worden gebracht, gezien de delicate aard van de weefsels, kunnen kleinere stukken worden genomen (figuur 2F, G) en afhankelijk van de grootte kunnen ze ook werken voor beeldvorming. - Gebruik #55 tang om de zijwand plat te leggen. De SV moet zichtbaar zijn als een donkerdere laag weefsel aan de binnenkant van de zijwand.
OPMERKING: Gebruikers kunnen merken, met name dichter bij het apicale uiteinde, dat een deel van het SV-weefsel incidenteel loskomt van de laterale wand tijdens de dissectie. - Wrik de SV-laag voorzichtig los om deze los te maken van de zijwand aan het basale uiteinde (figuur 2H). Duw de losgemaakte SV voorzichtig opzij en beweeg de tang verder naar het apicale uiteinde van de zijwand, waarbij de SV indien mogelijk als één lang lint wordt losgemaakt (figuur 2I). Knijp niet in de SV met een tang om eraan te trekken. Als het weefsel te kwetsbaar is om te worden gepakt, kan het ook worden verzameld met behulp van een weefselschep, zoals een chalazioncurette.
OPMERKING: Het verplaatsen van de SV moet altijd worden gedaan onder lichtmicroscopie om ervoor te zorgen dat deze niet verloren gaat. Wees altijd voorzichtig bij het grijpen met een tang vanwege het risico op schade. Gebruikers kunnen merken dat het gebruik van chalazion curette het risico op schade aan SV-weefsel vermindert. Voor single-nucleus sequencing gaat u verder met rubriek 5. Ga voor SV-immunostaining verder met rubriek 7.
5. SV single-nucleus suspensie
OPMERKING: Dit protocol is specifiek aangepast voor SV-weefsel op basis van het single-nucleus suspensieprotocol van een gepubliceerde fabrikant. Platforms van verschillende fabrikanten kunnen worden gebruikt31. Gezien de platformspecifieke variatie wordt aanbevolen om het fabrikantspecifieke protocol dat bij de apparatuur wordt geleverd, te herzien. Om optimale resultaten voor sNuc-Seq te bereiken en RNA-afbraak te minimaliseren, hoe sneller de weefseldissectie hoe beter (aanbevolen binnen 15-20 minuten na euthanasie). Het kan nuttig zijn om één dier tegelijk te euthanaseren en alleen als het klaar is om te ontleden. Door meerdere mensen tegelijkertijd aan de dissecties te laten werken, kan ook de degradatietijd worden geëlimineerd (bijvoorbeeld een laboratoriumpersoneel dat aan het linkeroor werkt terwijl een ander aan het rechteroor werkt).
- Als het SV-weefsel wordt gebruikt voor sNuc-Seq, plaats het weefsel dan in gekoelde lysisbuffer (10 mM Tris-HCl, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 0,005% nonidet P40 in nucleasevrij water).
OPMERKING: Als de volgorde onmiddellijk na de dissectie moet worden uitgevoerd, gaat u verder met het protocol. Als het gewenst is om het protocol te pauzeren, is SV-conservering mogelijk door de SV in RNAlater te plaatsen. Een nacht bewaren bij 4 °C, vervolgens flashbevriezen in vloeibare stikstof en bewaren bij -80 °C tot het klaar is voor gebruik. Wanneer u klaar bent voor gebruik, ontdooit en wast u twee keer in PBS gedurende elk 5 minuten en gaat u verder met homogenisatie (stap 5.2). - Homogeniseer het weefsel in een homogenisator van 2 ml met 10-20 slagen op ijs.
OPMERKING: De glazen cilinder maakt handmatig contact met de onderkant van de glazen buis, waardoor de SV wordt gefragmenteerd. De SV is delicaat, dus 20 slagen bereikt meestal een succesvolle homogenisatie. - Lyseer het weefsel gedurende 25 minuten op ijs.
OPMERKING: De lysistijd varieert afhankelijk van het weefseltype. Een lysis van 25 minuten in SV-weefsel kan een lage levensvatbaarheid van de cel bereiken (minder dan 4%), maar de tijd kan worden aangepast als de levensvatbaarheid van de cel te hoog is (stap 5.8). - Filtreer door een filter van 30 μm en draai het filtraat gedurende 5 minuten op 500 x g bij 4 °C.
- Verwijder het supernatant en resuspensie van de celkorrel in 1 ml was- en resuspensiebuffer (1x PBS, 1% runderserumalbumine [BSA], 0,2U/μL RNaseremmer).
- Filtreer de cellen door een filter van 10 μm en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 4 °C op 500 x g .
- Verwijder het supernatant en resuspensie in 50 μL was- en resuspensiebuffer van de kernen.
- Tel de kernen met behulp van een celteller en trypan blauwe kleuring. Verdun 5 μL van de celsuspensie tot 50 μL 1x PBS voor celtelling; De levensvatbaarheid moet op dit moment minimaal zijn (3%-4%). Als de levensvatbaarheid hoger blijkt te zijn, pas dan het protocol voor stap 5.3 (lysis) aan en standaardiseer de lysistijd om voldoende lysis van de cellen te garanderen.
OPMERKING: Een hoge levensvatbaarheid van cellen in een enkel kernpreparaat betekent dat er meer intacte cellen zijn dan gewenst en dat extra vertering nodig kan zijn. - Laad het monster met de gewenste nucleaire dichtheid op het apparaat/de chip van de fabrikant (zie de handleiding van de fabrikant). Single-nuclei captures zijn nu klaar.
OPMERKING: Van één volwassen muis SV wordt gewoonlijk 50 μL van de suspensie in een concentratie van 150.000 kernen / ml bereikt.
6. SV single-nucleus sequencing
- Stuur de monsters naar de kernfaciliteit voor sequencing.
OPMERKING: Dit deel van het protocol volgt de algemene stappen van (1) gel beads-in emulsie (GEM) generatie en barcodering, (2) post-GEM-RT opschoning en cDNA amplificatie, en (3) 3' genexpressie bibliotheek constructie. De rest van het sNuc-Seq-protocol is relatief lang en het wordt aanbevolen dat lezers hun fabrikantspecifieke protocol gebruiken. De handleiding van de fabrikant beschrijft waarschijnlijk stappen met specifieke details en bijbehorende afbeeldingen. Er kunnen ook 'how-to'-video's op de website van de fabrikant staan. Gegenereerde datasets kunnen op een dimensionale gereduceerde manier worden weergegeven, zoals een uniforme variëteitbenadering en projectie (UMAP; Figuur 3). Veel labs gebruiken een sequencingkern die dit protocol voor gebruikers kan uitvoeren.
7. SV immunostaining en weefselmontage
- Als het weefsel wordt gebruikt voor immunostaining, breng het dan over naar een 24-well plaat, ondergedompeld in 200 μL van 4% paraformaldehyde (PFA) in 1x PBS, en incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.
OPMERKING: Het is nuttig om alle vloeistofverwijdering, wassen en immunostaining onder een microscoop uit te voeren. Visualisatie tijdens het pipetteren van het weefsel zorgt ervoor dat het niet per ongeluk verloren gaat tijdens het verwijderen van vloeistof. De volumes van de antilichamen en wasbeurten kunnen worden aangepast zolang het volume groot genoeg is om het SV-weefsel in de oplossing onder te dompelen. - Verwijder na de fixatiestap de PFA door twee korte wasbeurten uit te voeren in 1x PBS (ongeveer 500 μL) bij 4 °C gedurende 5 minuten elk op een orbitale shaker bij lage (30-50) RPM. Bij opslag kan het weefsel worden opgeslagen in 1x PBS bij 4 °C.
- Verwijder de PBS en permeabiliseer en blokkeer gedurende minimaal 1 uur bij kamertemperatuur in ongeveer 300 μL PBS-T-oplossing (0,05 Tween20 in 1x PBS met 10% foetaal runderserum).
OPMERKING: Primaire en secundaire antilichamen moeten in deze blokkerende oplossing worden verdund. - Kleuring van het weefsel met primair antilichaam volgens de specificaties van het gebruikte specifieke antilichaam, meestal 's nachts bij 4 °C . Verwijder de resterende PBS en voeg het verdunde primaire antilichaam toe.
OPMERKING: De verdunning moet worden gekozen op basis van de suggesties van de fabrikant, gepubliceerde gegevens, eerdere ervaring, enz. Meestal is de eerste concentratie om te testen een verdunning van 1:100-200. Voor het voorbeeld dat in dit artikel wordt gepresenteerd, werden de GS-IB4- en DAPI-antilichamen elk verdund bij 1:200. Als kleuring voor meer dan één eiwit, kunnen meerdere primaire antilichamen worden gecombineerd tot dezelfde oplossing, zolang elk primair antilichaam een andere gastheer heeft om kruisreactiviteit van secundaire antilichamen te voorkomen. - Was het primaire antilichaam van het weefsel met ongeveer 500 μL 1x PBS tweemaal gedurende 10 minuten elk op een orbitale shaker bij lage RPM.
OPMERKING: Blijf ervoor zorgen dat het SV-weefsel is ondergedompeld in de oplossing en niet vastzit aan de zijkant van de put. - Kleuring met een secundair antilichaam volgens de specificaties van het gebruikte specifieke antilichaam, meestal gedurende 2 uur bij kamertemperatuur op een orbitale shaker bij laag toerental. Bedek de 24-putplaat zodat het fluorescerend gelabelde secundaire antilichaam wordt beschermd tegen licht.
OPMERKING: Als er meer dan één secundair antilichaam nodig is, combineer dan de secundaire antilichamen in dezelfde oplossing. Zorg ervoor dat u cross-labeling vermijdt. - Was het secundaire antilichaam van het weefsel met ongeveer 500 μL 1x PBS vier keer gedurende 5 minuten elk op een orbitale shaker bij lage RPM. Houd de 24-putplaat afgedekt om deze te beschermen tegen licht.
- Bereid de grotere microslide (75 mm x 25 mm) voor door twee kleine strepen lijm langs de 25 mm-as te plaatsen, net kleiner dan de 18 mm x 18 mm kleinere glazen afdekplaat. Plaats één druppel montagereagens (ongeveer 50 μL) tussen de lijmstrepen.
OPMERKING: De lijm creëert een kleine hoeveelheid verticale ruimte, zodat wanneer de tweede coverslip bovenop wordt geplaatst, het SV-weefselmonster veilig kan bestaan, maar op zijn plaats kan blijven. Hoewel de striadikte 30-40 micron is, moet het knijpen van het weefsel tussen de glasoppervlakken worden vermeden om de morfologie te behouden. Als alternatief kan ook doorzichtige tape worden gebruikt. - Pak met behulp van een #55-tang zo min mogelijk weefsel aan het ene uiteinde van de SV en breng het over van de PBS naar de druppel montagereagens op de grotere microslide (75 mm x 25 mm). Plaats het ene uiteinde van een kleinere glazen afdekplaat (18 mm x 18 mm) op de dia waar een streep lijm is geplaatst en laat voorzichtig los om te voorkomen dat er luchtbellen ontstaan. De coverslip valt op de andere lijmstreep en bedekt het SV-weefsel.
- Sluit de houder af door op elke hoek van de houder een druppel transparante nagellak te deppen. Label het monster dienovereenkomstig op de glazen afdekkingslip weg van het visualisatieveld. Het is nu klaar voor confocale microscopie (figuur 4).
- Visualiseer het SV-weefsel met behulp van een dissectiemicroscoop om ervoor te zorgen dat het plat ligt en niet in de buurt van luchtbellen. Als het SV-weefsel niet correct is georiënteerd, kan de gebruiker proberen luchtbellen naar buiten te duwen of voorzichtig de kleinere glazen afdekplaat verwijderen en de SV verplaatsen. Dit moet voorzichtig worden gedaan om te voorkomen dat de glazen afdekplaten breken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
We presenteren een methode om de SV te isoleren voor gebruik voor sNuc-Seq of immunostaining. De relevante anatomie (figuur 1) van het slakkenhuis ten opzichte van de SV kan gebruikers helpen de organisatie van de SV en de stappen van het dissectieprotocol beter te begrijpen.
Elke stap van deze microdissectie van SV van een P30-muis wordt gedetailleerd beschreven in de bijbehorende video en snapshots van de belangrijkste stappen van deze dissectie en isolatie van SV worden weergegeven in figuur 2.
sNuc-Seq is nuttig bij het onderzoeken van het transcriptionele profiel van de verschillende cellen in de heterogene SV. Een manier waarop dit kan worden gevisualiseerd, is door te clusteren op een 2D UMAP (figuur 3). De dataset gegenereerd uit sNuc-Seq kan worden geëvalueerd met behulp van verschillende data-analysetechnieken, verder beschreven in de discussie.
SV volledige montage met GS-IB4 en DAPI immunolabeling, samen met Kcnj10-ZsGreen fluorescentie, zijn weergegeven in figuur 4. Met behulp van florescentie kan de SV worden gevisualiseerd na het verwijderen van de omliggende weefsels en montage. Bij deze muizen komt ZsGreen vooral tot expressie in de SV-tussencellen. De vasculatuur van de SV kan in rood worden gevisualiseerd (endotheelcellen, GS-IB4).
Figuur 1: Schema van de cellulaire heterogeniteit en organisatie van stria vascularis. Stria vascularis cellulaire heterogeniteit en organisatie. Schematische weergave van de stria vascularis (SV) en zijn relatie tot structuren in het slakkenhuis. De SV bestaat uit drie lagen cellen en is verantwoordelijk voor het genereren van EP en hoge kaliumconcentratie in de endolymfe-bevattende scala-media. De relatie tussen de marginale, intermediaire en basale cellen wordt aangetoond met de marginale verlengende basolaterale projecties om te interdigiteren met de tussenliggende cellen, die bidirectionele cellulaire projecties hebben die interdigiteren met zowel de marginale als de basale cellen. Naast deze celtypen zijn andere celtypen, waaronder spindelcellen (geel), endotheelcellen, pericyten en macrofagen (niet weergegeven) aanwezig in de SV. Gebruikt met toestemming van Korrapati et al.30. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Dissectie van een volwassen muizenslakkenhuis groter dan of gelijk aan postnatale dag 30 (P30+). (A) Monster tijdens extractie van het binnenoor uit het omliggende temporale bot tijdens stap 3.2. Het binnenoor is in paars omlijnd. B) Monster tijdens stap 4.2 met het oppervlak van het slakkenhuis en het onderliggende gepigmenteerde SV. (C) Monster tijdens stap 4.4 met bot verwijderd uit de apicale draai en de blootgestelde SV (gele pijl). (D) Monster tijdens stap 4.5 met het slakkenhuis met meer bot verwijderd uit de apicale en middelste bochten. (E) Monster tijdens stap 4.5 met de verwijdering van bot dat de middelste draai bedekt, met de onderliggende SV (gele pijl). (F) Voorbeeld van kleinere stukken SV (gele pijl) en de zijwand (blauwe pijl) tijdens stap 4.10. (G) Voorbeeld van fluorescerend ZsGreen SV terwijl de resterende zijwand donker blijft. Kcnj10-ZsGreen komt vooral tot expressie in de tussenliggende cellen van de SV. (H) Voorbeeld van grotere stukken SV (gele pijl) en de zijwand (blauw) die tijdens stap 4.12 van elkaar worden gescheiden. (I) De SV volledig gescheiden van de zijwand tijdens stap 4.12. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: UMAP plot van sNuc-Seq datasets van een RNAlater-behandelde volwassen stria vascularis. Monsters geconserveerd met RNAlater-behandeling van volwassen SV-weefsel met daaropvolgende kernisolatie werden geclusterd door een modulariteitsgebaseerde clusteringmethode met het Leidse optimalisatiealgoritme en op een dimensioneel gereduceerde manier gevisualiseerd door een 2D UMAP-plot. Elke stip vertegenwoordigt een enkele cel en cellen met vergelijkbare transcriptieprofielen zijn geclusterd. Celtypen worden gekleurd op basis van hun expressie van bekende genen die tot expressie worden gebracht door volwassen SV-celtypen. De monsters werden niet langer dan 6 maanden in RNAlater bewaard. De SV van ongeveer vijf CBA/J P30-muizen werd gebruikt om deze dataset te genereren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. Stria vascularis hele montage van een P30 Kcnj10-ZsGreen muis. Confocale afbeelding van SV hele montage van een P30-muis, die ZsGreen-expressie in de tussenliggende cellen, GS-IB4 (rood) labelende endotheelcellen en DAPI (witte) labelende kernen demonstreert. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vóór de komst van single-cell sequencing gebruikten veel onderzoekers bulkweefselanalyse, die het alleen mogelijk maakte om transcriptomen gemiddeld over cellen te analyseren. In het bijzonder maakten single-cell en sNuc-Seq het mogelijk om het transcriptoom van een enkele cel of enkele kern te isoleren, respectievelijk32. In dit geval kunnen transcriptomen met één kern worden geïdentificeerd voor marginale, intermediaire en basale cellen, evenals spindelcellen30. Dit maakt het mogelijk om transcriptionele heterogeniteit tussen SV-celtypen te onderzoeken en kan in de toekomst worden gebruikt om de bijdrage van deze celtypen aan de SV-functie te onderzoeken, inclusief het genereren en onderhouden van EP. Datasets gegenereerd met behulp van sNuc-Seq kunnen op een dimensioneel gereduceerde manier worden weergegeven om het begrip van algemene transcriptionele verschillen te vergemakkelijken en verschillende celpopulaties te vergelijken met behulp van een UMAP-plot Figuur 4. Er zijn talloze manieren om bioinformatische analyse uit te voeren voor de interpretatie van sNuc-Seq datasets. Deze omvatten, maar zijn niet beperkt tot: differentiële expressieanalyse, single-cell regulatory network inferentie en clustering (SCENIC), heatmap of grin viool plotconstructie en regulonanalyse18. Verdere computationele analysetechnieken voor single-cell RNA sequencing zijn vergelijkbaar met sNuc-Seq en worden in meer detail besproken in reviews door Hwang et al.32, Shafer33 en Chen et al.34.
De andere belangrijke toepassing van deze dissectietechniek is immunostaining om geselecteerde structuren binnen de SV beter te bestuderen. We kunnen dit waarnemen in de instelling van een SV-hele mount die is afgebeeld met behulp van confocale microscopie (figuur 3). De kernen van alle cellen worden gevisualiseerd met DAPI-labeling. De haarvaten zijn te zien via endotheelcelkleuring met GS-IB4 in rood. Tussenliggende cellen zijn in dit geval genetisch gemodificeerd met behulp van een intermediaire celspecifieke promotor om ZsGreen tot expressie te brengen.
Beperkingen van sNuc-Seq zijn onder meer: (1) gebrek aan ruimtelijke informatie, (2) vooroordelen tegen immuuncelpopulaties en (3) uitsluiting van cytoplasmatisch RNA. Ruimtelijke transcriptomische technieken kunnen meer specifieke informatie verschaffen over cellulaire subpopulaties binnen weefsel35. Gezien protocolverschillen tussen sNuc-Seq en single-cell RNA-sequencing, zoals weefseldissociatie en -opslag, kan het door sNuc-Seq gegenereerde transcriptionele profiel bevooroordeeld zijn tegen immuuncellen, terwijl het krachtiger is in het karakteriseren van aangehechte celtypen36. Ook omvat eencellige RNA-sequencing cytoplasmatisch RNA zoals mitochondriaal RNA, terwijl sNuc-Seq dat niet doet. Ondanks deze gevallen van transcriptionele verschillen tussen de twee methoden, is aangetoond dat sNuc-Seq over het algemeen een vergelijkbaar transcriptioneel profiel heeft als whole single-cell RNA sequencing37, en in de SV in het bijzonder30.
Voor een succesvolle microdissectie zijn er verschillende kritieke stappen om op de hoogte te zijn. In de eerste paar stappen moet men het binnenoor goed extraheren om te voorkomen dat het onderliggende slakkenhuis wordt verpletterd. Observatie van de juiste temporele botextractie is weergegeven in figuur 2A. Zodra het slakkenhuis goed is blootgesteld, moet ervoor worden gezorgd dat het cochleaire bot voorzichtig wordt geschraapt en gebroken om de onderliggende zijwand en SV bloot te leggen. Zodra de zijwand en SV met succes zijn geëxtraheerd, moet de gebruiker de SV voorzichtig losmaken van de laterale wand. Er moet voldoende kracht in het juiste vlak worden uitgeoefend om de SV van de zijwand te wrikken, terwijl schade aan de fragiele SV wordt vermeden. Voor SV-microdissectie kan het nuttig zijn om te denken aan "het ontleden van andere structuren weg van de SV", in plaats van "het ontleden van de SV uit het slakkenhuis".
Dit protocol kan worden aangepast voor verschillende leeftijden van muizen en voor verschillende zoogdiersoorten, zoals ratten. Voor jongere muizen zullen weefsels verschillen in textuur en structuren zullen in het algemeen kleiner zijn. Voor verschillende zoogdiersoorten zal de cochleaire anatomie relatief vergelijkbaar zijn, waarbij de grootte van het dier het grootste deel van het verschil bepaalt.
Over het algemeen zijn de nadelen van dit protocol vergelijkbaar met andere cochleaire microdissectietechnieken38. Het isoleren van de delicate SV kan technisch een uitdaging zijn en kan in kleinere stukken worden gebroken.
Deze techniek is niet optimaal voor het opslaan van het orgel van Corti voor hele montage, omdat het vaak wordt beschadigd met dit protocol. Er bestaan andere dissectietechnieken die specifiek gericht zijn op het behoud van het orgaan van Corti voor hele montage en immunostaining38, maar deze hebben hun eigen nadelen, aangezien sNuc-Seq moet worden gedaan met verse monsters om RNA-degradatie te voorkomen, niet in de setting van weefselfixatie en ontkalking.
Met de tijd en herhaling zullen gebruikers zich meer op hun gemak voelen met dit SV-microdissectieprotocol.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd mede ondersteund door het Intramuraal Onderzoeksprogramma van de NIH, NIDCD tot M.H. (DC000088)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10-µm filter (Polyethylenterephthalat) | PluriSelect | #43-50010-01 | Filter tissue during sNuc-Seq |
| 18 x 18 mm cover glass | Fisher Scientific | 12-541A | Cover slip to mount SV |
| 30-µm filter (Polyethylenterephthalat) | PluriSelect | #43-50030-03 | Filter tissue during sNuc-Seq |
| 75 x 25 mm Superfrost Plus/Colorforst Plus Microslide | Daigger | EF15978Z | Microslide to mount SV on |
| C57BL/6J Mice | The Jackson Laboratory | RRID: IMSR_JAX:000664 | General purpose mouse strain that has pigment more easily seen in the intermediate cells of the SV. |
| Cell Counter | Logos Biosystems | L20001 | Used for cell counting |
| Chalizon curette 5'', size 3 2.5 mm | Biomedical Research Instruments | 15-1020 | Used to transfer SV |
| Chromium Next GEM single Cell 3' GEM Kit v3.1 | Chromium | PN-1000141 | Generates single cell 3' gene expression libraries |
| Clear nail polish | Fisher Scientific | NC1849418 | Used for sealing SV mount |
| Corning Falcon Standard Tissue Culture Dishes, 24 well | Corning | 08-772B | Culture dish used to hold specimen during dissection |
| DAPI | Invitrogen | D1306, RRID: AB_2629482 | Stain used for nucleus labeling |
| Dounce homogenizer | Sigma-Aldrich | D8938 | Used to homogenize tissue for sNuc-seq |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | General forceps for dissection |
| Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | Forceps with fine tip that makes SV manipulation easier |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher | 16000044 | Used for steps of sNuc-Seq |
| Glue stick | Fisher Scientific | NC0691392 | Used for mounting SV |
| GS-IB4 Antibody | Molecular Probes | I21411, RRID: AB-2314662 | Antibody used for capillary labeling |
| KCNJ10-ZsGreen Mice | n/a | n/a | Transgenic mouse that expresses KCNJ10-ZsGreen, partiularly in the intermediate cells of the SV. |
| MgCl2 | ThermoFisher | AM9530G | Used for steps of sNuc-Seq |
| Mounting reagent | ThermoFisher | #S36940 | Mounting reagent for SV |
| Multiwell 24 well plate | Corning | #353047 | Plate used for immunostaining |
| NaCl | ThermoFisher | AAJ216183 | Used for steps of sNuc-Seq |
| Nonidet P40 | Sigma-Aldrich | 9-16-45-9 | Used for steps of sNuc-Seq |
| Nuclease free water | ThermoFisher | 4387936 | Used for steps of sNuc-Seq |
| Orbital shaker | Silent Shake | SYC-2102A | Used for steps of immunostaining |
| PBS | ThermoFisher | J61196.AP | Used for steps of immunostaining and dissection |
| RNA Later | Invitrogen | AM7021 | Used for preservation of SV for sNuc-Seq |
| Scizzors | Fine Science Tools | 14058-09 | Used for splitting mouse skull |
| Tris-HCl | Sigma-Aldrich | 15506017 | Used for steps of sNuc-Seq |
| Trypan blue stain | Gibco | 15250061 | Used for cell counting |
| Tween20 | ThermoFisher | AAJ20605AP | Used for steps of sNuc-Seq |
| Zeiss STEMI SV 11 Apo stereomicroscope | Zeiss | n/a | Microscope used for dissections |
References
- Bosher, S. K., Warren, R. L. Observations on the electrochemistry of the cochlear endolymph of the rat: a quantitative study of its electrical potential and ionic composition as determined by means of flame spectrophotometry. Proceedings of the Royal Society of London. Series B. Biological Sciences. 171 (1023), 227-247 (1968).
- Patuzzi, R. Ion flow in stria vascularis and the production and regulation of cochlear endolymph and the endolymphatic potential. Hearing Research. 277 (1-2), 4-19 (2011).
- Wangemann, P. K+ cycling and the endocochlear potential. Hearing Research. 165 (1-2), 1-9 (2002).
- Adachi, N., et al. The mechanism underlying maintenance of the endocochlear potential by the K+ transport system in fibrocytes of the inner ear. The Journal of Physiology. 591 (18), 4459-4472 (2013).
- Hibino, H., Nin, F., Tsuzuki, C., Kurachi, Y. How is the highly positive endocochlear potential formed? The specific architecture of the stria vascularis and the roles of the ion-transport apparatus. Pflugers Archiv. 459 (4), 521-533 (2010).
- Lang, F., Vallon, V., Knipper, M., Wangemann, P. Functional significance of channels and transporters expressed in the inner ear and kidney. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 293 (4), C1187-C1208 (2007).
- Liu, W., Schrott-Fischer, A., Glueckert, R., Benav, H., Rask-Andersen, H. The human "cochlear battery"-claudin-11 barrier and ion transport proteins in the lateral wall of the cochlea. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 239 (2017).
- Marcus, D. C., Wu, T., Wangemann, P., Kofuji, P. KCNJ10 (Kir4.1) potassium channel knockout abolishes endocochlear potential. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 282 (2), C403-C407 (2002).
- Spicer, S. S., Schulte, B. A. Differentiation of inner ear fibrocytes according to their ion transport related activity. Hearing Research. 56 (1-2), 53-64 (1991).
- Wangemann, P., Liu, J., Marcus, D. C. Ion transport mechanisms responsible for K+ secretion and the transepithelial voltage across marginal cells of stria vascularis in vitro. Hearing Research. 84 (1-2), 19-29 (1995).
- Yoshida, T., et al. The unique ion permeability profile of cochlear fibrocytes and its contribution to establishing their positive resting membrane potential. Pflugers Archiv. 468 (9), 1609-1619 (2016).
- Johns, J. D., Adadey, S. M., Hoa, M. The role of the stria vascularis in neglected otologic disease. Hearing Research. 428, 108682 (2023).
- Kim, J., Ricci, A. J. In vivo real-time imaging reveals megalin as the aminoglycoside gentamicin transporter into cochlea whose inhibition is otoprotective. Proceedings of the National Academy of Sciences. 119 (9), e2117846119 (2022).
- Zdebik, A. A., Wangemann, P., Jentsch, T. J. Potassium ion movement in the inner ear: insights from genetic disease and mouse models. Physiology. 24, 307-316 (2009).
- Chen, J., Zhao, H. B. The role of an inwardly rectifying K+ channel (Kir4.1) in the inner ear and hearing loss. Neuroscience. 265, 137-146 (2014).
- Steel, K. P., Barkway, C. Another role for melanocytes: their importance for normal stria vascularis development in the mammalian inner ear. Development. 107 (3), 453-463 (1989).
- Ito, T., Nishio, A., Wangemann, P., Griffith, A. J. Progressive irreversible hearing loss is caused by stria vascularis degeneration in an Slc26a4-insufficient mouse model of large vestibular aqueduct syndrome. Neuroscience. 310, 188-197 (2015).
- Gu, S., et al. Characterization of rare spindle and root cell transcriptional profiles in the stria vascularis of the adult mouse cochlea. Scientific Reports. 10 (1), 18100 (2020).
- Gow, A., et al. Deafness in claudin 11-null mice reveals the critical contribution of basal cell tight junctions to stria vascularis function. The Journal of Neuroscience. 24 (32), 7051-7062 (2004).
- Chang, Q., et al. Virally mediated Kcnq1 gene replacement therapy in the immature scala media restores hearing in a mouse model of human Jervell and Lange-Nielsen deafness syndrome. EMBO Molecular Medicine. 7 (8), 1077-1086 (2015).
- Faridi, R., et al. Mutational and phenotypic spectra of KCNE1 deficiency in Jervell and Lange-Nielsen Syndrome and Romano-Ward Syndrome. Human Mutation. 40 (2), 162-176 (2019).
- Wangemann, P., et al. Loss of KCNJ10 protein expression abolishes endocochlear potential and causes deafness in Pendred syndrome mouse model. BMC Medicine. 2, 30 (2004).
- Kitajiri, S. -I., et al. Expression patterns of claudins, tight junction adhesion molecules, in the inner ear. Hearing Research. 187 (1-2), 25-34 (2004).
- Jagger, D. J., Nevill, G., Forge, A. The membrane properties of cochlear root cells are consistent with roles in potassium recirculation and spatial buffering. Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 11 (3), 435-448 (2010).
- Ito, T., Kurata, N., Fukunaga, Y.
- Zhang, J., et al. VEGFA165 gene therapy ameliorates blood-labyrinth barrier breakdown and hearing loss. JCI Insight. 6 (8), e143285 (2021).
- Shi, X. Pathophysiology of the cochlear intrastrial fluid-blood barrier (review). Hearing Research. 338, 52-63 (2016).
- Gu, S., et al. Identification of potential Meniere's disease targets in the adult stria vascularis. Frontiers in Neurology. 12, 630561 (2021).
- Fischer, J., Ayers, T. Single nucleus RNA-sequencing: how it's done, applications and limitations. Emerging Topics in Life Sciences. 5 (5), 687-690 (2021).
- Korrapati, S., et al. Single cell and single nucleus RNA-Seq reveal cellular heterogeneity and homeostatic regulatory networks in adult mouse stria vascularis. Frontiers in Molecular Neuroscience. 12, 316 (2019).
- Pyle, M. P., Hoa, M. Applications of single-cell sequencing for the field of otolaryngology: A contemporary review. Laryngoscope Investigative Otolaryngology. 5 (3), 404-431 (2020).
- Hwang, B., Lee, J. H., Bang, D. Single-cell RNA sequencing technologies and bioinformatics pipelines. Experimental & Molecular Medicine. 50 (8), 1-14 (2018).
- Shafer, M. E. R. Cross-species analysis of single-cell transcriptomic data. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 175 (2019).
- Chen, G., Ning, B., Shi, T. Single-cell RNA-Seq technologies and related computational data analysis. Frontiers in Genetics. 10, 317 (2019).
- Longo, S. K., Guo, M. G., Ji, A. L., Khavari, P. A. Integrating single-cell and spatial transcriptomics to elucidate intercellular tissue dynamics. Nature Reviews Genetics. 22 (10), 627-644 (2021).
- Kim, N., Kang, H., Jo, A., Yoo, S. A., Lee, H. O. Perspectives on single-nucleus RNA sequencing in different cell types and tissues. Journal of Pathology and Translational Medicine. 57 (1), 52-59 (2023).
- Grindberg, R. V., et al.
- Montgomery, S. C., Cox, B. C. Whole mount dissection and immunofluorescence of the adult mouse cochlea. Journal of Visuazlied Experiments. (107), e53561 (2016).
