Summary
Сосудистая полость жизненно важна для генерации эндокохлеарного потенциала. Здесь мы представляем вскрытие сосудистой полосы взрослой мыши для секвенирования одного ядра или иммуноокрашивания.
Abstract
Эндокохлеарный потенциал, который генерируется stria vascularis, необходим для поддержания среды, способствующей соответствующей механотрансдукции волосковых клеток и, в конечном итоге, слуху. Патологии сосудистой полосы могут привести к снижению слуха. Диссекция взрослой полости vascularis позволяет сфокусировать одноядерный захват и последующее одноядерное секвенирование и иммуноокрашивание. Эти методы используются для изучения патофизиологии васкулярной полоски на одноклеточном уровне.
Одноядерное секвенирование может быть использовано в условиях транскрипционного анализа stria vascularis. Между тем, иммуноокрашивание по-прежнему полезно для идентификации конкретных популяций клеток. Оба метода требуют надлежащего рассечения полоски сосудов в качестве предварительного условия, что может оказаться технически сложным.
Introduction
Улитка состоит из трех заполненных жидкостью камер: преддверия чешуйчатой полосы, средней полости и тимпанской щели. Scala vestibuli и scala tympani содержат перилимфу, которая имеет высокую концентрацию натрия (138 мМ) и низкую концентрацию калия (6,8 мМ)1. Средняя чешуя содержит эндолимфу, которая имеет высокую концентрацию калия (154 мМ) и низкую концентрацию натрия (0,91 мМ)1,2,3. Эта разница в концентрации ионов может быть названа эндокохлеарным потенциалом (EP) и в основном генерируется движением ионов калия через различные ионные каналы и щелевые соединения в stria vascularis (SV) вдоль боковой стенки улитки 4,5,6,7,8,9,10,11 . SV представляет собой гетерогенную ткань с высокой степенью васкуляризации, которая выстилает медиальный аспект латеральной стенки улитки и содержит три основных типа клеток: маргинальные, промежуточные и базальные клетки12 (рис. 1).
Краевые клетки соединены плотными соединениями, образуя самую медиальную поверхность SV. Апикальная мембрана обращена к эндолимфе средней челюсти и способствует транспорту ионов калия в эндолимфу с использованием различных каналов, включая KCNE1 / KCNQ1, SLC12A2 и Na+-K+-АТФазу (NKA) 5,10,13,14. Промежуточные клетки представляют собой пигментированные клетки, которые находятся между маргинальными и базальными клетками и облегчают транспорт калия через SV с использованием KCNJ10 (Kir 4.1)15,16. Базальные клетки лежат в непосредственной близости от боковой стенки улитки и тесно связаны с фиброцитами спиральной связки, способствуя рециркуляции калия из перилимфы12. Патология СВ связана с многочисленными отологическими заболеваниями17,18. Мутации в генах, экспрессируемых в основных типах клеток SV, таких как Kcnq1, Kcne1, Kcnj10 и Cldn11, могут вызывать глухоту и дисфункцию SV, включая потерю EP 19,20,21,22,23. В дополнение к трем основным типам клеток в SV есть и другие, менее изученные типы клеток, такие как веретенообразные клетки 22, корневые клетки12,24, макрофаги 25, перициты 26 и эндотелиальные клетки 27, которые имеют не полностью определенные роли, связанные с ионным гомеостазом и генерацией EP 28.
По сравнению с объемным секвенированием РНК, секвенирование РНК с одним ядром (sNuc-Seq) предоставляет информацию о гетерогенности клеток, а не о среднем значении мРНК по группеклеток 29, и может быть особенно полезно при изучении гетерогенного SV30. Например, sNuc-Seq произвел транскрипционный анализ, который предполагает, что веретенообразные и корневые клетки могут играть роль в генерации EP, потере слуха и болезни Меньера18. Дальнейшая транскрипционная характеристика различных типов клеток SV может дать нам бесценную информацию о патофизиологии, лежащей в основе различных механизмов и подтипов флуктуаций слуха и потери слуха, связанных с SV. Сбор этих тонких структур внутреннего уха имеет первостепенное значение для оптимального анализа тканей.
В этом исследовании описан подход микродиссекции для доступа и выделения stria vascularis из улитки взрослой мыши для sNuc-Seq или иммуноокрашивания. Вскрытие SV взрослой мыши необходимо для понимания различных типов SV-клеток и дальнейшей характеристики их роли в слухе.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты и процедуры на животных проводились в соответствии с протоколами, утвержденными Комитетом по уходу за животными и их использованию Национального института неврологических заболеваний и инсульта и Национальным институтом глухоты и других коммуникативных расстройств Национальных институтов здравоохранения. Все экспериментальные протоколы были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию Национального института неврологических заболеваний и инсульта и Национальным институтом глухоты и других коммуникативных расстройств Национального института здравоохранения. Все методы проводились в соответствии с соответствующими руководящими принципами и правилами Комитета по уходу за животными и их использованию Национального института неврологических заболеваний и инсульта и Национального института глухоты и других коммуникативных расстройств, Национальных институтов здравоохранения.
1. Эвтаназия животных
- Используйте трансгенных мышей C57BL/6J или Kcnj10-ZsGreen на 30+ день после родов (P30+) весом от 15 до 20 г.
- Усыпить взрослую мышь (в возрасте P30 и старше) с использованием утвержденного протокола (здесь удушье CO2 ). Выполните обезглавливание в качестве второстепенного шага.
ПРИМЕЧАНИЕ: При иммуноокрашивании некоторые антитела могут иметь фоновый сигнал из-за неспецифического связывания с кровью в капиллярах СВ. Сердечная перфузия фиксатором может решить эту проблему путем удаления крови из капилляров СВ. Тем не менее, большинство антител могут достичь хороших результатов без этого метода, и это не будет охвачено этим протоколом.
2. Обнажение костного лабиринта
- Очистите мышь, распылив 70% этанола и протерев бумажным полотенцем. Обратите особое внимание на область головы, чтобы снизить риск загрязнения. Удалите кожу с черепа, потянув кожу к носу.
- С помощью острых ножниц разделите череп вдоль средней сагиттальной плоскости, чтобы разделить левую и правую части.
- Извлеките мозг из черепа, чтобы обнажить костный лабиринт.
3. Удаление внутреннего уха
- Определите внутреннее ухо в височной кости (рис. 2A) и соскребите черепно-мозговые нервы с помощью щипцов #55.
ПРИМЕЧАНИЕ: Пользователь должен стабилизировать образец недоминантной рукой, используя второй набор щипцов #55. Различные области образца могут быть захвачены стабилизирующими щипцами на протяжении всего вскрытия, если избегать критических областей образца (например, не раздавливать улитку). - Используя щипцы #55, рассеките буллу и капсулу, отделив их от окружающей кости. Удалите все оставшиеся мягкие ткани с внутренней поверхности уха.
- Перенесите образец в прозрачную чашку для культивирования тканей, содержащую 1x холодный PBS (физиологический раствор с фосфатным буфером), pH 7,4, и поместите под область вскрытия (рис. 2B).
4. Вскрытие СВ
ПРИМЕЧАНИЕ: С практикой можно препарировать СВ как один длинный кусок, напоминающий ленту. SV хрупкий, поэтому, если он разобьется на куски, их можно хранить вместе. В качестве альтернативы они могут храниться в отдельно маркированных лунках в зависимости от их очередности (например, базальной, средней, апикальной).
- Если источники света диссекционной области можно перемещать, поместите один источник света над тарелкой, а второй источник света сбоку, параллельно рассекающей поверхности. Это позволяет лучше контрастировать ткань под улитковой костью.
- Используя щипцы #55, держите образец за вестибулярную часть улиткой вверх.
- Используя щипцы #55, проткните улитку на вершине.
ПРИМЕЧАНИЕ: щипцы #5 толще, чем #55, и могут использоваться для перелома кости, но увеличение размера / прочности приносит в жертву тонкость щипцов и способность манипулировать мелкими тканями. Рассмотрите возможность использования щипцов, изготовленных из такого материала, как inox или dumostar, чтобы избежать повреждения, которое может произойти с более деликатными щипцами. Не проталкивайте щипцы слишком глубоко под кость, чтобы не повредить SV. - Используя щипцы #55, соскребите вдоль апикального витка (рис. 2C), прилагая осторожное усилие, чтобы отколоть небольшие кусочки внешнего костного слоя. Аккуратно приподнимите кость и отсоедините ее от боковой стенки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Возможно, было бы полезно думать об этом вскрытии как об «удалении всего из СВ», а не о «препарировании СВ из улитки». - Продолжайте использовать щипцы #55 для удаления кусочков улитки из апикального и среднего витков (рис. 2D, E). Осторожно надавливая на боковую стенку, подденьте и удалите кусочки костной стенки к среднему витку, чтобы обнажить боковую стенку апикального и среднего витков.
- Продолжая использовать щипцы #55, осторожно отодвиньте верхушечную поворотную боковую стенку в сторону, чтобы обнажить спиральный ганглий. Отделяют боковую стенку апикального и среднего витков от спирального ганглия вдоль наружного слоя волосковых клеток. Удалите кусочки спирального ганглия изнутри улитки.
ПРИМЕЧАНИЕ: щипцы #55 меньше по размеру и дают преимущество при манипуляциях с мелкими и нежными тканями. Следует соблюдать особую осторожность, чтобы не согнуть и не повредить их. - Чтобы иметь лучший доступ к боковой стенке базального поворота, отделите улитку от вестибулярной части височной кости с помощью щипцов #55. Вставьте щипцы #55 в круглое и овальное окно и надавите вниз к вестибюлю. Улитка отсоединится. Удалите вестибулярную часть внутреннего уха.
- Продолжая использовать щипцы #55, теперь удаляйте кусочки базальной улитковой кости, начиная со средней области поворота. Аккуратно продвиньте слой боковой стенки под костью, чтобы отделить ее.
- Удалите самую дальнюю базальную часть боковой стенки, поддев и осторожно потянув ткань. Кость в этой области может быть слишком толстой, чтобы ее можно было удалить, не повредив мягкие ткани ниже.
- Теперь, отделив базальную часть боковой стенки, отделите как можно большую часть боковой стенки от улитки. Это можно сделать, проследив щипцы #55 вдоль боковой стенки. Аккуратно почистите щипцы между костью и оставшейся боковой стенкой. Это можно сделать до вершины целиком, если пользователь опытен. Переместите боковую стенку на свежий PBS.
ПРИМЕЧАНИЕ: Несмотря на то, что большие фрагменты SV может быть легче визуализировать, учитывая деликатную природу тканей, можно брать более мелкие фрагменты (рис. 2F, G), и в зависимости от размера они также могут работать для визуализации. - Используйте щипцы #55, чтобы уложить боковую стенку ровно. SV должен быть виден как более темный слой ткани на внутренней стороне боковой стенки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Пользователи могут обнаружить, особенно ближе к апикальному концу, что часть ткани SV случайно отделяется от боковой стенки на протяжении всего рассечения. - Аккуратно подденьте слой SV, чтобы отделить его от боковой стенки на базальном конце (рис. 2H). Осторожно отодвиньте отсоединенный SV и переместите щипцы дальше к апикальному концу боковой стенки, по возможности отсоединив SV как одну длинную ленту (рис. 2I). Не сжимайте SV щипцами, чтобы потянуть его. Если ткань слишком хрупкая, чтобы ее можно было схватить, ее можно собрать с помощью салфетной ложки, такой как кюретка.
ПРИМЕЧАНИЕ: Перемещение SV всегда следует выполнять под световой микроскопией, чтобы убедиться, что он не потеряется. Всегда будьте осторожны при захвате щипцами из-за риска повреждения. Пользователи могут обнаружить, что использование халязионной кюретки снижает риск повреждения тканей SV. Для секвенирования одного ядра перейдите к разделу 5. Для иммуноокрашивания SV перейдите к разделу 7.
5. Одноядерная суспензия СВ
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол адаптирован для тканей SV специально из опубликованного протокола одноядерной суспензии производителя. Можно использовать платформы разных производителей31. Учитывая различия, зависящие от платформы, рекомендуется ознакомиться с протоколом производителя, поставляемым с оборудованием. Для достижения оптимальных результатов для sNuc-Seq и минимизации деградации РНК чем быстрее рассечение ткани, тем лучше (рекомендуется в течение 15-20 мин после эвтаназии). Может быть полезно усыплять по одному животному за раз и только тогда, когда он будет готов к препарированию. Наличие нескольких человек, одновременно работающих над вскрытием, также может исключить время деградации (например, один лабораторный персонал работает над левым ухом, а другой работает с правым ухом).
- Если ткань SV будет использоваться для sNuc-Seq, поместите ткань в охлажденный лизирующий буфер (10 мМ Tris-HCl, 10 мМ NaCl, 3 мМ MgCl2, 0,005% нонидета P40 в воде без нуклеаз).
ПРИМЕЧАНИЕ: Если секвенирование должно быть выполнено сразу после вскрытия, продолжайте протокол. Если желательно приостановить протокол, сохранение SV возможно путем помещения SV в RNAlater. Хранить в течение ночи при температуре 4 °C, затем мгновенно заморозить в жидком азоте и хранить при температуре -80 °C до использования. Когда все будет готово к использованию, дважды разморозьте и промойте в PBS по 5 минут каждый, затем приступайте к гомогенизации (этап 5.2). - Гомогенизируйте ткань в гомогенизаторе объемом 2 мл 10-20 ударами по льду.
ПРИМЕЧАНИЕ: Стеклянный цилиндр вручную соприкасается с нижней частью стеклянной трубки, фрагментируя SV. SV деликатный, поэтому 20 ударов обычно обеспечивают успешную гомогенизацию. - Лизнируйте ткань на льду в течение 25 минут.
ПРИМЕЧАНИЕ: Время лизиса варьируется в зависимости от типа ткани. 25-минутный лизис в ткани SV может привести к низкой жизнеспособности клеток (менее 4%), но время может быть адаптировано, если жизнеспособность клеток слишком высока (этап 5.8). - Фильтруют через фильтр 30 мкм и отжимают фильтрат при 500 x g в течение 5 мин при 4 °C.
- Удалите надосадочную жидкость и ресуспендируйте клеточную гранулу в 1 мл буфера для промывки ядер и ресуспендирования (1x PBS, 1% бычий сывороточный альбумин [BSA], ингибитор 0,2 ЕД / мкл РНКазы).
- Отфильтруйте клетки через фильтр 10 мкм и центрифугу при 500 x g в течение 5 мин при 4 °C.
- Удалите надосадочную жидкость и ресуспендируйте в 50 мкл промывки ядер и буфера для ресуспендирования.
- Подсчитайте ядра с помощью счетчика клеток и окрашивания трипановым синим. Разбавьте 5 мкл клеточной суспензии до 50 мкл 1x PBS для подсчета клеток; Жизнеспособность должна быть минимальной (3-4%) на этом этапе. Если выясняется, что жизнеспособность выше, адаптируйте протокол для этапа 5.3 (лизис) и стандартизируйте время лизиса, чтобы обеспечить адекватный лизис клеток.
ПРИМЕЧАНИЕ: Высокая жизнеспособность клеток в препарате одного ядра означает, что интактных клеток больше, чем хотелось бы, и может потребоваться дополнительное переваривание. - Загрузите образец с желаемой ядерной плотностью на устройство/микросхему производителя (см. руководство производителя). Теперь одноядерные захваты готовы.
ПРИМЕЧАНИЕ: От одной взрослой мыши SV обычно получают 50 мкл суспензии в концентрации 150 000 ядер / мл.
6. Одноядерное секвенирование SV
- Отправьте образцы на основной объект для секвенирования.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта часть протокола следует общим этапам (1) генерации гелевых шариков в эмульсии (GEM) и штрих-кодирования, (2) очистки после GEM-RT и амплификации кДНК и (3) построения библиотеки экспрессии генов 3'. Остальная часть протокола sNuc-Seq относительно длинная, и читателям рекомендуется использовать протокол, специфичный для производителя. В руководстве производителя, скорее всего, будут описаны шаги с конкретными деталями и сопроводительными изображениями. На веб-сайте производителя также могут быть видеоролики с практическими рекомендациями. Сгенерированные наборы данных могут быть представлены в уменьшенном размере, таком как равномерное приближение и проекция многообразия (UMAP; Рисунок 3). Во многих лабораториях используется ядро секвенирования, которое может выполнять этот протокол для пользователей.
7. Иммуноокрашивание SV и крепление тканей
- Если ткань будет использоваться для иммуноокрашивания, перенесите ее в 24-луночную пластину, погруженную в 200 мкл 4% параформальдегида (PFA) в 1x PBS, и инкубируйте в течение 20 минут при комнатной температуре.
ПРИМЕЧАНИЕ: Полезно выполнять удаление жидкости, промывку и иммуноокрашивание под микроскопом. Визуализация во время пипетки ткани гарантирует, что она случайно не потеряется во время удаления жидкости. Объемы антител и смывов могут быть скорректированы до тех пор, пока объем достаточно велик, чтобы погрузить ткань SV в раствор. - После этапа фиксации удалите PFA, выполнив две короткие промывки в 1x PBS (приблизительно 500 мкл) при 4 ° C в течение 5 минут каждая на орбитальном шейкере при низких (30-50) оборотах в минуту. При хранении ткань можно хранить в 1x PBS при 4 °C.
- Удалите PBS, пермеабилизируйте и блокируйте в течение как минимум 1 ч при комнатной температуре в примерно 300 мкл раствора PBS-T (0,05 Tween20 в 1x PBS с 10% эмбриональной бычьей сывороткой).
ПРИМЕЧАНИЕ: Первичные и вторичные антитела следует разводить в этом блокирующем растворе. - Окрашивают ткань первичным антителом в соответствии со спецификациями конкретного используемого антитела, обычно в течение ночи при 4 ° C . Удалите оставшийся PBS и добавьте разбавленное первичное антитело.
ПРИМЕЧАНИЕ: Разбавление следует выбирать на основе предложений производителя, опубликованных данных, предыдущего опыта и т. Д. Обычно первой концентрацией для тестирования является разведение 1:100-200. В примере, представленном в этой статье, антитела GS-IB4 и DAPI были разбавлены в соотношении 1:200. При окрашивании более чем на один белок несколько первичных антител могут быть объединены в один и тот же раствор, при условии, что каждое первичное антитело имеет другого хозяина, чтобы избежать перекрестной реактивности вторичных антител. - Смойте первичное антитело с ткани, используя приблизительно 500 мкл 1x PBS два раза в течение 10 минут каждый на орбитальном шейкере на низких оборотах.
ПРИМЕЧАНИЕ: Продолжайте следить за тем, чтобы ткань SV была погружена в раствор и не застряла на стенке лунки. - Окрашивание вторичным антителом в соответствии со спецификациями конкретного используемого антитела, обычно в течение 2 ч при комнатной температуре на орбитальном шейкере при низких оборотах. Накройте 24-луночную пластину, чтобы вторичное антитело с флуоресцентной меткой было защищено от света.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если требуется более одного вторичного антитела, объедините вторичные антитела в один и тот же раствор. Убедитесь, что избегайте перекрестной маркировки. - Смойте вторичные антитела с ткани, используя приблизительно 500 мкл 1x PBS четыре раза в течение 5 минут каждый на орбитальном шейкере на низких оборотах. Держите пластину с 24 лунками закрытой, чтобы защитить ее от света.
- Подготовьте большую микрогорку (75 мм x 25 мм), поместив две небольшие полоски клея вдоль оси 25 мм, чуть меньше, чем стеклянное покровное стекло размером 18 мм x 18 мм. Поместите одну каплю монтажного реагента (примерно 50 мкл) между полосами клея.
ПРИМЕЧАНИЕ: Клей создает небольшое вертикальное пространство, так что, когда второе покровное стекло помещается сверху, образец ткани SV может безопасно существовать, но продолжать оставаться на месте. В то время как толщина стрии составляет 30-40 микрон, следует избегать сдавливания ткани между стеклянными поверхностями, чтобы сохранить морфологию. В качестве альтернативы также можно использовать прозрачную ленту. - Используя щипцы #55, возьмите как можно меньше ткани на одном конце SV и перенесите с PBS на каплю монтажного реагента на большем микрослайде (75 мм x 25 мм). Поместите один конец меньшего стеклянного покровного стекла (18 мм x 18 мм) на предметное стекло, куда была помещена одна полоса клея, и осторожно отпустите, чтобы избежать образования пузырьков воздуха. Покровное стекло попадет на другую клеевую полосу и покроет ткань SV.
- Запечатайте крепление, нанеся каплю прозрачного лака для ногтей на каждый угол крепления. Нанесите соответствующую маркировку на стеклянную крышку, подальше от поля визуализации. Теперь он готов к конфокальной микроскопии (рис. 4).
- Визуализируйте ткань SV с помощью диссекционного микроскопа, чтобы убедиться, что она лежит ровно и не находится рядом с пузырьками воздуха. Если ткань SV не ориентирована правильно, пользователь может попытаться вытолкнуть пузырьки воздуха или осторожно удалить меньшее стекло и переместить SV. Делать это нужно аккуратно, чтобы не разбить стекла.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Мы представляем метод выделения SV, который будет использоваться либо для sNuc-Seq, либо для иммуноокрашивания. Соответствующая анатомия (рис. 1) улитки по отношению к SV может помочь пользователям лучше понять организацию SV и этапы протокола вскрытия.
Каждый этап этого микродиссекционирования SV с мыши P30 подробно описан в соответствующем видео, а снимки ключевых этапов этого рассечения и выделения SV представлены на рисунке 2.
sNuc-Seq полезен при исследовании транскрипционного профиля различных клеток в гетерогенной SV. Одним из способов визуализации этого является кластеризация на 2D UMAP (рис. 3). Набор данных, сгенерированный с помощью sNuc-Seq, может быть оценен с использованием различных методов анализа данных, более подробно описанных в обсуждении.
На рисунке 4 представлен полный монтаж SV с иммуномаркировкой GS-IB4 и DAPI, а также флуоресценция Kcnj10-ZsGreen. Используя флуоресценцию, SV можно визуализировать после удаления окружающих тканей и установки. У этих мышей ZsGreen экспрессируется, в частности, в промежуточных клетках SV. Сосудистая сеть SV может быть визуализирована красным цветом (эндотелиальные клетки, GS-IB4).
Рисунок 1: Схема клеточной гетерогенности и организации полоски сосудов. Клеточная гетерогенность и организация Stria vascularis. Схема сосудистой полоски (СВ) и ее связь со структурами улитки. SV состоит из трех слоев клеток и отвечает за генерацию EP и высокую концентрацию калия в эндолимфатических средах scala. Взаимосвязь между маргинальными, промежуточными и базальными клетками демонстрируется с помощью маргинальных расширяющихся базолатеральных проекций для перемежания с промежуточными клетками, которые имеют двунаправленные клеточные проекции, которые перемежаются как с краевыми, так и с базальными клетками. В дополнение к этим типам клеток в SV присутствуют другие типы клеток, включая веретенообразные клетки (желтые), эндотелиальные клетки, перициты и макрофаги (не показаны). Используется с разрешения Korrapati et al.30. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Рассечение улитки взрослой мыши на 30-й день после родов (P30+). (A) Образец во время извлечения внутреннего уха из окружающей височной кости на этапе 3.2. Внутреннее ухо очерчено фиолетовым цветом. (B) Образец на этапе 4.2, показывающий поверхность улитки и лежащую под ней пигментированную SV. (C) Образец на этапе 4.4, показывающий кость, удаленную из апикального поворота и обнаженную SV (желтая стрелка). (D) Образец на этапе 4.5, показывающий улитку с большим количеством кости, удаленной из апикального и среднего витков. (E) Образец на этапе 4.5, показывающий удаление кости, покрывающей средний оборот, с изображением нижележащего SV (желтая стрелка). (F) Пример более мелких частей SV (желтая стрелка) и боковой стенки (синяя стрелка) на этапе 4.10. (G) Пример флуоресцентного ZsGreen SV, в то время как оставшаяся боковая стенка остается темной. Kcnj10-ZsGreen особенно экспрессируется в промежуточных клетках SV. (H) Пример отделения более крупных кусков SV (желтая стрелка) и боковой стенки (синий) на этапе 4.12. (I) SV полностью отделился от боковой стенки на этапе 4.12. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: График UMAP наборов данных sNuc-Seq из взрослой stria vascularis, обработанной РНК. Образцы, сохраненные с помощью РНКболее поздней обработки взрослой ткани SV с последующим выделением ядер, были сгруппированы методом кластеризации на основе модульности с алгоритмом оптимизации Лейдена и визуализированы в уменьшенном размерном виде с помощью 2D-графика UMAP. Каждая точка представляет собой одну клетку, а клетки с похожими транскрипционными профилями сгруппированы вместе. Типы клеток окрашиваются в зависимости от их экспрессии известных генов, экспрессируемых взрослыми типами клеток SV. Образцы хранились в РНК позже не более 6 месяцев. Для создания этого набора данных был использован SV примерно пяти мышей CBA/J P30. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4. Stria vascularis целиком крепится от мыши P30 Kcnj10-ZsGreen. Конфокальное изображение целого монтажа SV от мыши P30, демонстрирующее экспрессию ZsGreen в промежуточных клетках, эндотелиальные клетки, мечущие GS-IB4 (красные), и ядра, мечущие DAPI (белые). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
До появления секвенирования отдельных клеток многие исследователи использовали объемный анализ тканей, который позволял анализировать только транскриптомы, усредненные по клеткам. В частности, single-cell и sNuc-Seq позволили выделить транскриптом одной клетки или одиночного ядра соответственно32. В этом случае одноядерные транскриптомы могут быть идентифицированы для маргинальных, промежуточных и базальных клеток, а также веретенообразных клеток30. Это позволяет исследовать транскрипционную гетерогенность среди типов клеток SV и может быть использовано в будущем для изучения вклада этих типов клеток в функцию SV, включая генерацию и поддержание EP. Наборы данных, сгенерированные с помощью sNuc-Seq, могут быть отображены в уменьшенном размере, чтобы облегчить понимание общих транскрипционных различий и сравнить различные популяции клеток с использованием графика UMAP Рисунок 4. Существует множество способов проведения биоинформатического анализа для интерпретации наборов данных sNuc-Seq. К ним относятся, но не ограничиваются: анализ дифференциальных выражений, вывод и кластеризация одноклеточной регуляторной сети (SCENIC), построение тепловой карты или графика скрипки с улыбкой, а также анализрегулона 18. Дальнейшие методы вычислительного анализа для секвенирования одноклеточной РНК аналогичны sNuc-Seq и более подробно обсуждаются в обзорах Hwang et al.32, Shafer33 и Chen et al.34.
Другим важным применением этого метода диссекции является иммуноокрашивание для лучшего изучения отдельных структур в СВ. Мы можем наблюдать это в настройке всего крепления SV, которое было изображено с помощью конфокальной микроскопии (рис. 3). Ядра всех клеток визуализируются с помощью маркировки DAPI. Капилляры видны с помощью окрашивания эндотелиальных клеток GS-IB4 в красный цвет. Промежуточные клетки, в данном случае, были генетически модифицированы с использованием промежуточного промотора, специфичного для клеток, для экспрессии ZsGreen.
Ограничения sNuc-Seq включают: (1) отсутствие пространственной информации, (2) предубеждения против популяций иммунных клеток и (3) исключение цитоплазматической РНК. Методы пространственной транскриптомии могут предоставить более конкретную информацию о клеточных субпопуляциях в ткани35. Учитывая протокольные различия между секвенированием sNuc-Seq и секвенированием одноклеточной РНК, такие как диссоциация и хранение тканей, транскрипционный профиль, генерируемый sNuc-Seq, может смещаться против иммунных клеток, будучи более мощным при характеристике прикрепленных типовклеток 36. Кроме того, секвенирование одноклеточной РНК включает цитоплазматическую РНК, такую как митохондриальная РНК, в то время как sNuc-Seq этого не делает. Несмотря на эти примеры транскрипционных различий между двумя методами, было продемонстрировано, что в целом sNuc-Seq имеет сходный транскрипционный профиль с секвенированием всей одноклеточной РНК37 и, в частности, с SV30.
Для успешной микродиссекции необходимо знать о нескольких важных шагах. На первых нескольких этапах необходимо правильно извлечь внутреннее ухо, чтобы избежать раздавливания нижележащей улитки. Наблюдение за правильным извлечением височной кости показано на рисунке 2A. После того, как улитка должным образом обнажена, необходимо осторожно соскоблить и сломать улитковую кость, чтобы обнажить нижележащую боковую стенку и SV. После успешного извлечения боковой стенки и SV пользователь должен осторожно отсоединить SV от боковой стенки. Следует приложить достаточное усилие в правильной плоскости, чтобы поддеть СВ от боковой стенки, избегая при этом повреждения хрупкого СВ. Для микродиссекции SV может быть полезно подумать о «рассечении других структур от SV», а не о «рассечении SV из улитки».
Этот протокол может быть изменен для мышей разного возраста и для разных видов млекопитающих, таких как крысы. У молодых мышей ткани будут отличаться по текстуре, а структуры в целом будут меньше. Для разных видов млекопитающих анатомия улитки будет относительно схожей, причем размер животного будет определять большую часть различий.
В целом, недостатки этого протокола аналогичны другим методам кохлеарной микродиссекции38. Изоляция деликатного SV может быть технически сложной, и его можно разбить на более мелкие части.
Этот метод не является оптимальным для сохранения кортиева органа для целого монтажа, так как он часто повреждается при этом протоколе. Существуют и другие методы диссекции, специально направленные на сохранение кортиевого органа для целого монтажа и иммуноокрашивания38, но у них есть свои недостатки, учитывая, что sNuc-Seq необходимо проводить со свежими образцами, чтобы избежать деградации РНК, а не в условиях фиксации тканей и декальцификации.
Со временем и повторением пользователи станут более комфортно работать с этим протоколом микродиссекции SV.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам раскрывать нечего.
Acknowledgments
Это исследование было частично поддержано Программой внутренних исследований NIH, NIDCD to M.H. (DC000088)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10-µm filter (Polyethylenterephthalat) | PluriSelect | #43-50010-01 | Filter tissue during sNuc-Seq |
| 18 x 18 mm cover glass | Fisher Scientific | 12-541A | Cover slip to mount SV |
| 30-µm filter (Polyethylenterephthalat) | PluriSelect | #43-50030-03 | Filter tissue during sNuc-Seq |
| 75 x 25 mm Superfrost Plus/Colorforst Plus Microslide | Daigger | EF15978Z | Microslide to mount SV on |
| C57BL/6J Mice | The Jackson Laboratory | RRID: IMSR_JAX:000664 | General purpose mouse strain that has pigment more easily seen in the intermediate cells of the SV. |
| Cell Counter | Logos Biosystems | L20001 | Used for cell counting |
| Chalizon curette 5'', size 3 2.5 mm | Biomedical Research Instruments | 15-1020 | Used to transfer SV |
| Chromium Next GEM single Cell 3' GEM Kit v3.1 | Chromium | PN-1000141 | Generates single cell 3' gene expression libraries |
| Clear nail polish | Fisher Scientific | NC1849418 | Used for sealing SV mount |
| Corning Falcon Standard Tissue Culture Dishes, 24 well | Corning | 08-772B | Culture dish used to hold specimen during dissection |
| DAPI | Invitrogen | D1306, RRID: AB_2629482 | Stain used for nucleus labeling |
| Dounce homogenizer | Sigma-Aldrich | D8938 | Used to homogenize tissue for sNuc-seq |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | General forceps for dissection |
| Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | Forceps with fine tip that makes SV manipulation easier |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher | 16000044 | Used for steps of sNuc-Seq |
| Glue stick | Fisher Scientific | NC0691392 | Used for mounting SV |
| GS-IB4 Antibody | Molecular Probes | I21411, RRID: AB-2314662 | Antibody used for capillary labeling |
| KCNJ10-ZsGreen Mice | n/a | n/a | Transgenic mouse that expresses KCNJ10-ZsGreen, partiularly in the intermediate cells of the SV. |
| MgCl2 | ThermoFisher | AM9530G | Used for steps of sNuc-Seq |
| Mounting reagent | ThermoFisher | #S36940 | Mounting reagent for SV |
| Multiwell 24 well plate | Corning | #353047 | Plate used for immunostaining |
| NaCl | ThermoFisher | AAJ216183 | Used for steps of sNuc-Seq |
| Nonidet P40 | Sigma-Aldrich | 9-16-45-9 | Used for steps of sNuc-Seq |
| Nuclease free water | ThermoFisher | 4387936 | Used for steps of sNuc-Seq |
| Orbital shaker | Silent Shake | SYC-2102A | Used for steps of immunostaining |
| PBS | ThermoFisher | J61196.AP | Used for steps of immunostaining and dissection |
| RNA Later | Invitrogen | AM7021 | Used for preservation of SV for sNuc-Seq |
| Scizzors | Fine Science Tools | 14058-09 | Used for splitting mouse skull |
| Tris-HCl | Sigma-Aldrich | 15506017 | Used for steps of sNuc-Seq |
| Trypan blue stain | Gibco | 15250061 | Used for cell counting |
| Tween20 | ThermoFisher | AAJ20605AP | Used for steps of sNuc-Seq |
| Zeiss STEMI SV 11 Apo stereomicroscope | Zeiss | n/a | Microscope used for dissections |
References
- Bosher, S. K., Warren, R. L. Observations on the electrochemistry of the cochlear endolymph of the rat: a quantitative study of its electrical potential and ionic composition as determined by means of flame spectrophotometry. Proceedings of the Royal Society of London. Series B. Biological Sciences. 171 (1023), 227-247 (1968).
- Patuzzi, R. Ion flow in stria vascularis and the production and regulation of cochlear endolymph and the endolymphatic potential. Hearing Research. 277 (1-2), 4-19 (2011).
- Wangemann, P. K+ cycling and the endocochlear potential. Hearing Research. 165 (1-2), 1-9 (2002).
- Adachi, N., et al. The mechanism underlying maintenance of the endocochlear potential by the K+ transport system in fibrocytes of the inner ear. The Journal of Physiology. 591 (18), 4459-4472 (2013).
- Hibino, H., Nin, F., Tsuzuki, C., Kurachi, Y. How is the highly positive endocochlear potential formed? The specific architecture of the stria vascularis and the roles of the ion-transport apparatus. Pflugers Archiv. 459 (4), 521-533 (2010).
- Lang, F., Vallon, V., Knipper, M., Wangemann, P. Functional significance of channels and transporters expressed in the inner ear and kidney. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 293 (4), C1187-C1208 (2007).
- Liu, W., Schrott-Fischer, A., Glueckert, R., Benav, H., Rask-Andersen, H. The human "cochlear battery"-claudin-11 barrier and ion transport proteins in the lateral wall of the cochlea. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 239 (2017).
- Marcus, D. C., Wu, T., Wangemann, P., Kofuji, P. KCNJ10 (Kir4.1) potassium channel knockout abolishes endocochlear potential. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 282 (2), C403-C407 (2002).
- Spicer, S. S., Schulte, B. A. Differentiation of inner ear fibrocytes according to their ion transport related activity. Hearing Research. 56 (1-2), 53-64 (1991).
- Wangemann, P., Liu, J., Marcus, D. C. Ion transport mechanisms responsible for K+ secretion and the transepithelial voltage across marginal cells of stria vascularis in vitro. Hearing Research. 84 (1-2), 19-29 (1995).
- Yoshida, T., et al. The unique ion permeability profile of cochlear fibrocytes and its contribution to establishing their positive resting membrane potential. Pflugers Archiv. 468 (9), 1609-1619 (2016).
- Johns, J. D., Adadey, S. M., Hoa, M. The role of the stria vascularis in neglected otologic disease. Hearing Research. 428, 108682 (2023).
- Kim, J., Ricci, A. J. In vivo real-time imaging reveals megalin as the aminoglycoside gentamicin transporter into cochlea whose inhibition is otoprotective. Proceedings of the National Academy of Sciences. 119 (9), e2117846119 (2022).
- Zdebik, A. A., Wangemann, P., Jentsch, T. J. Potassium ion movement in the inner ear: insights from genetic disease and mouse models. Physiology. 24, 307-316 (2009).
- Chen, J., Zhao, H. B. The role of an inwardly rectifying K+ channel (Kir4.1) in the inner ear and hearing loss. Neuroscience. 265, 137-146 (2014).
- Steel, K. P., Barkway, C. Another role for melanocytes: their importance for normal stria vascularis development in the mammalian inner ear. Development. 107 (3), 453-463 (1989).
- Ito, T., Nishio, A., Wangemann, P., Griffith, A. J. Progressive irreversible hearing loss is caused by stria vascularis degeneration in an Slc26a4-insufficient mouse model of large vestibular aqueduct syndrome. Neuroscience. 310, 188-197 (2015).
- Gu, S., et al. Characterization of rare spindle and root cell transcriptional profiles in the stria vascularis of the adult mouse cochlea. Scientific Reports. 10 (1), 18100 (2020).
- Gow, A., et al. Deafness in claudin 11-null mice reveals the critical contribution of basal cell tight junctions to stria vascularis function. The Journal of Neuroscience. 24 (32), 7051-7062 (2004).
- Chang, Q., et al. Virally mediated Kcnq1 gene replacement therapy in the immature scala media restores hearing in a mouse model of human Jervell and Lange-Nielsen deafness syndrome. EMBO Molecular Medicine. 7 (8), 1077-1086 (2015).
- Faridi, R., et al. Mutational and phenotypic spectra of KCNE1 deficiency in Jervell and Lange-Nielsen Syndrome and Romano-Ward Syndrome. Human Mutation. 40 (2), 162-176 (2019).
- Wangemann, P., et al. Loss of KCNJ10 protein expression abolishes endocochlear potential and causes deafness in Pendred syndrome mouse model. BMC Medicine. 2, 30 (2004).
- Kitajiri, S. -I., et al. Expression patterns of claudins, tight junction adhesion molecules, in the inner ear. Hearing Research. 187 (1-2), 25-34 (2004).
- Jagger, D. J., Nevill, G., Forge, A. The membrane properties of cochlear root cells are consistent with roles in potassium recirculation and spatial buffering. Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 11 (3), 435-448 (2010).
- Ito, T., Kurata, N., Fukunaga, Y.
- Zhang, J., et al. VEGFA165 gene therapy ameliorates blood-labyrinth barrier breakdown and hearing loss. JCI Insight. 6 (8), e143285 (2021).
- Shi, X. Pathophysiology of the cochlear intrastrial fluid-blood barrier (review). Hearing Research. 338, 52-63 (2016).
- Gu, S., et al. Identification of potential Meniere's disease targets in the adult stria vascularis. Frontiers in Neurology. 12, 630561 (2021).
- Fischer, J., Ayers, T. Single nucleus RNA-sequencing: how it's done, applications and limitations. Emerging Topics in Life Sciences. 5 (5), 687-690 (2021).
- Korrapati, S., et al. Single cell and single nucleus RNA-Seq reveal cellular heterogeneity and homeostatic regulatory networks in adult mouse stria vascularis. Frontiers in Molecular Neuroscience. 12, 316 (2019).
- Pyle, M. P., Hoa, M. Applications of single-cell sequencing for the field of otolaryngology: A contemporary review. Laryngoscope Investigative Otolaryngology. 5 (3), 404-431 (2020).
- Hwang, B., Lee, J. H., Bang, D. Single-cell RNA sequencing technologies and bioinformatics pipelines. Experimental & Molecular Medicine. 50 (8), 1-14 (2018).
- Shafer, M. E. R. Cross-species analysis of single-cell transcriptomic data. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 175 (2019).
- Chen, G., Ning, B., Shi, T. Single-cell RNA-Seq technologies and related computational data analysis. Frontiers in Genetics. 10, 317 (2019).
- Longo, S. K., Guo, M. G., Ji, A. L., Khavari, P. A. Integrating single-cell and spatial transcriptomics to elucidate intercellular tissue dynamics. Nature Reviews Genetics. 22 (10), 627-644 (2021).
- Kim, N., Kang, H., Jo, A., Yoo, S. A., Lee, H. O. Perspectives on single-nucleus RNA sequencing in different cell types and tissues. Journal of Pathology and Translational Medicine. 57 (1), 52-59 (2023).
- Grindberg, R. V., et al.
- Montgomery, S. C., Cox, B. C. Whole mount dissection and immunofluorescence of the adult mouse cochlea. Journal of Visuazlied Experiments. (107), e53561 (2016).
