Summary
Stria vascularis, endokoklear potansiyelin oluşumu için hayati öneme sahiptir. Burada, yetişkin fare stria vascularis'in tek çekirdekli dizileme veya immün boyama için diseksiyonu sunulmuştur.
Abstract
Stria vascularis tarafından üretilen endokoklear potansiyel, uygun saç hücresi mekanotransdüksiyonuna ve nihayetinde işitmeye elverişli bir ortamı korumak için gereklidir. Stria vascularisin patolojileri işitmenin azalmasına neden olabilir. Erişkin stria vaskülarisin diseksiyonu, odaklanmış tek çekirdekli yakalamaya ve ardından tek çekirdekli dizileme ve immün boyamaya izin verir. Bu teknikler stria vascularis patofizyolojisini tek hücre düzeyinde incelemek için kullanılır.
Tek çekirdekli dizileme, stria vascularisin transkripsiyonel analizi ayarında kullanılabilir. Bu arada, immün boyama, spesifik hücre popülasyonlarını tanımlamada yararlı olmaya devam etmektedir. Her iki yöntem de ön koşul olarak uygun stria vascularis diseksiyonu gerektirir ve bu da teknik olarak zor olabilir.
Introduction
Koklea sıvı dolu üç odadan oluşur: scala vestibuli, scala media ve scala timpani. Scala vestibuli ve scala timpaninin her biri, yüksek konsantrasyonda sodyum (138 mM) ve düşük konsantrasyonda potasyum (6,8 mM)1 içeren perilenf içerir. Scala ortamı, yüksek konsantrasyonda potasyum (154 mM) ve düşük konsantrasyonda sodyum (0,91 mM)1,2,3 içeren endolenf içerir. İyon konsantrasyonundaki bu fark endokoklear potansiyel (EP) olarak adlandırılabilir ve esas olarak potasyum iyonlarının çeşitli iyon kanalları ve stria vascularis'teki (SV) boşluk kavşakları boyunca kokleanın lateral duvarı boyunca hareketi ile üretilir 4,5,6,7,8,9,10,11 . SV, kokleanın lateral duvarının medial yönünü kaplayan heterojen, yüksek vaskülarize bir dokudur ve üç ana hücre tipi içerir: marjinal, orta ve bazal hücreler12 (Şekil 1).
Marjinal hücreler, SV'nin en medial yüzeyini oluşturmak için sıkı bağlantılarla bağlanır. Apikal membran, scala media'nın endolenfine bakar ve KCNE1 / KCNQ1, SLC12A2 ve Na + -K + -ATPaz (NKA) 5,10,13,14 dahil olmak üzere çeşitli kanalları kullanarak endolenf içine potasyum iyonu taşınmasına katkıda bulunur. Ara hücreler, marjinal ve bazal hücreler arasında bulunan ve KCNJ10 (Kir 4.1)15,16 kullanarak SV yoluyla potasyum taşınmasını kolaylaştıran pigmentli hücrelerdir. Bazal hücreler kokleanın lateral duvarına yakın bir yerde bulunur ve perilenf12'den potasyum geri dönüşümünü teşvik etmek için spiral ligamentin fibrositleri ile yakından ilişkilidir. SV'nin patolojisi çok sayıda otolojik bozuklukla ilişkilendirilmiştir17,18. Kcnq1, Kcne1, Kcnj10 ve Cldn11 gibi majör SV hücre tiplerinde eksprese edilen genlerdeki mutasyonlar, EP 19,20,21,22,23 kaybı da dahil olmak üzere sağırlık ve SV disfonksiyonuna neden olabilir. Üç ana hücre tipine ek olarak, SV'de, iğ hücreleri 22, kök hücreler12,24, makrofajlar 25, perisitler 26 ve endotel hücreleri 27 gibi, iyonik homeostazı ve EP 28 oluşumunu içeren eksik tanımlanmış rollere sahip daha az çalışılmış başka hücre tipleri de vardır.
Toplu RNA dizilimine kıyasla, tek çekirdekli RNA dizilimi (sNuc-Seq), bir grup hücre29'daki mRNA'nın ortalamasından ziyade hücre heterojenliği hakkında bilgi sağlar ve heterojen SV30'u incelerken özellikle yararlı olabilir. Örneğin, sNuc-Seq, EP üretiminde, işitme kaybında ve Meniere hastalığında iğ ve kök hücrelerin rolü olabileceğini düşündüren transkripsiyonel analiz üretmiştir18. Çeşitli SV hücre tiplerinin daha ileri transkripsiyonel karakterizasyonu, SV ile ilişkili işitme dalgalanması ve işitme kaybının farklı mekanizmalarının ve alt tiplerinin altında yatan patofizyoloji hakkında bize paha biçilmez bilgiler sağlayabilir. Bu hassas iç kulak yapılarının toplanması, optimal doku analizi için büyük önem taşımaktadır.
Bu çalışmada, sNuc-Seq veya immün boyama için stria vaskülaris'e erişen ve izole eden yetişkin fare kokleasından izole etmek için mikrodiseksiyon yaklaşımı tanımlanmıştır. Yetişkin fare SV'nin diseksiyonu, çeşitli SV hücre tiplerini anlamak ve işitmedeki rollerini daha da karakterize etmek için gereklidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan deneyleri ve prosedürleri, Ulusal Nörolojik Hastalıklar ve İnme Enstitüsü Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi ve Ulusal Sağırlık ve Diğer İletişim Bozuklukları Enstitüsü, Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından onaylanan protokollere göre gerçekleştirilmiştir. Tüm deneysel protokoller, Ulusal Nörolojik Hastalıklar ve İnme Enstitüsü Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi ve Ulusal Sağırlık ve Diğer İletişim Bozuklukları Enstitüsü, Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından onaylanmıştır. Tüm yöntemler, Ulusal Nörolojik Hastalıklar ve İnme Enstitüsü Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi ve Ulusal Sağırlık ve Diğer İletişim Bozuklukları Enstitüsü, Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin ilgili kılavuz ve yönetmeliklerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
1. Hayvan ötenazisi
- 15-20 g ağırlığında C57BL / 6J veya Kcnj10-ZsGreen transgenik fareler, doğum sonrası gün 30+ (P30+) kullanın.
- Onaylanmış bir protokol kullanarak yetişkin bir fareyi (P30 yaş ve üstü) ötenazi yapın (burada CO2 boğulması). İkincil bir adım olarak kafa kesmeyi gerçekleştirin.
NOT: İmmün boyama varsa, SV'nin kılcal damarlarındaki kana spesifik olmayan bağlanma nedeniyle bazı antikorlar arka plan sinyaline sahip olabilir. Fiksatif ile kardiyak perfüzyon, SV'nin kılcal damarlarından kan alarak bu sorunu çözebilir. Bununla birlikte, çoğu antikor bu yöntem olmadan iyi sonuçlar elde edebilir ve bu protokolde ele alınmayacaktır.
2. Kemikli labirentin açığa çıkarılması
- Fareyi% 70 etanol püskürterek ve bir kağıt havluyla silerek temizleyin. Kontaminasyon riskini azaltmak için kafa bölgesine özellikle dikkat edin. Cildi buruna doğru çekerek cildi kafatasından çıkarın.
- Keskin makas kullanarak, sol ve sağ kısımları ayırmak için kafatasını orta sagital düzlem boyunca bölün.
- Kemikli labirenti ortaya çıkarmak için beyni kafatasından çıkarın.
3. İç kulak çekimi
- Temporal kemik içindeki iç kulağı tanımlayın (Şekil 2A) ve #55 forseps kullanarak kraniyal sinirleri kazıyın.
NOT: Kullanıcı, ikinci bir #55 forseps seti kullanarak numuneyi baskın olmayan elleriyle stabilize etmelidir. Numunenin kritik alanlarından kaçınılırsa, diseksiyon boyunca stabilize edici forseps ile numunenin farklı alanları tutulabilir (örneğin, kokleayı ezmeyin). - # 55 forseps kullanarak, bulla ve kapsülü parçalara ayırın, onları çevreleyen kemikten ayırın. Kalan yumuşak dokuları iç kulak yüzeyinden çıkarın.
- Numuneyi 1x soğuk PBS (fosfat tamponlu salin), pH 7.4 içeren berrak bir doku kültürü kabına aktarın ve bir diseksiyon kapsamı altına yerleştirin (Şekil 2B).
4. SV diseksiyonu
NOT: Uygulamada, SV'yi bir kurdeleye benzeyen uzun bir parça olarak incelemek mümkündür. SV kırılgandır, bu nedenle parçalara ayrılırsa, bunlar birlikte saklanabilir. Alternatif olarak, bunlar sıralarına göre ayrı ayrı etiketlenmiş kuyucuklarda saklanabilir (örneğin, bazal, orta, apikal).
- Diseksiyon kapsamı ışık kaynakları hareket ettirilebiliyorsa, bir ışığı çanağın üzerine ve ikinci ışık kaynağını diseksiyon yüzeyine paralel olarak yandan yerleştirin. Bu, koklear kemiğin altındaki dokunun daha iyi bir kontrastını sağlar.
- #55 forseps kullanarak, numuneyi koklea yukarı bakacak şekilde vestibüler kısımdan tutun.
- #55 forseps kullanarak, tepedeki koklear kemiği delin.
NOT: # 5 forseps, # 55'ten daha kalındır ve kemiği kırmak için kullanılabilir, ancak boyut / güçteki artış, forsepslerin inceliğini ve küçük dokuları manipüle etme yeteneğini feda eder. Daha hassas forsepslerde oluşabilecek hasarı önlemek için inox veya dumostar gibi bir malzemeden yapılmış forseps kullanmayı düşünün. SV'ye zarar vermemek için forsepsleri kemiğin altına çok derin itmekten kaçının. - # 55 forseps kullanarak, apikal dönüş boyunca kazıyın (Şekil 2C), dış kemik tabakasının küçük parçalarını ayırmak için hafif bir kuvvet uygulayın. Kemiği yavaşça kaldırın ve yanal duvardan ayırın.
NOT: Bu diseksiyonu "SV'yi kokleanın dışına çıkarmak" yerine "SV'den her şeyi çıkarmak" olarak düşünmek yararlı olabilir. - Koklear kemik parçalarını apikal ve orta dönüşlerden çıkarmak için #55 forseps kullanmaya devam edin (Şekil 2D, E). Yanal duvarı yavaşça aşağı iterek, apikal ve orta dönüşlerin lateral duvarını ortaya çıkarmak için kemik duvar parçalarını orta dönüşe doğru gözetin ve çıkarın.
- # 55 forseps kullanmaya devam ederek, spiral ganglionu ortaya çıkarmak için apikal dönüş yanal duvarını yavaşça bir kenara itin. Apikal ve orta dönüşlerin lateral duvarını, dış kıl hücresi tabakası boyunca spiral gangliondan ayırın. Spiral ganglion parçalarını kokleanın içinden çıkarın.
NOT: # 55 forseps daha küçüktür ve küçük ve hassas dokuları manipüle ederken avantaj sağlar. Bükülmelerini veya zarar görmelerini önlemek için ekstra özen gösterilmelidir. - Bazal dönüşün lateral duvarına daha iyi erişebilmek için, kokleayı #55 forseps kullanarak temporal kemiğin vestibüler kısmından ayırın. #55 forsepsleri yuvarlak ve oval pencereye koyun ve girişe doğru aşağı doğru itin. Koklea ayrılacaktır. İç kulağın vestibüler kısmını çıkarın.
- #55 forseps kullanmaya devam ederek, şimdi orta dönüş bölgesinden başlayarak bazal koklear kemik parçalarını çıkarın. Yanal duvar tabakasını ayırmak için kemiğin altına yavaşça itin.
- Yanal duvarın en uzak bazal kısmını, dokuyu meraklandırarak ve hafifçe çekerek çıkarın. Bu bölgedeki kemik, aşağıdaki yumuşak dokuya zarar vermeden çıkarılamayacak kadar kalın olabilir.
- Şimdi, lateral duvarın bazal kısmı ayrılmışken, lateral duvarın mümkün olduğunca çoğunu kokleadan ayırın. Bu, yanal duvar boyunca # 55 forsepsleri izleyerek yapılabilir. Forsepsleri kemik ile kalan lateral duvar arasında yavaşça fırçalayın. Bu, kullanıcı deneyimliyse tek parça halinde tepeye kadar yapılabilir. Yanal duvarı taze PBS'ye taşıyın.
NOT: SV'nin daha büyük parçalarının görüntülenmesi daha kolay olsa da, dokuların hassas doğası göz önüne alındığında, daha küçük parçalar alınabilir (Şekil 2F, G) ve boyuta bağlı olarak görüntüleme için de kullanılabilir. - Yanal duvarı düz bir şekilde döşemek için # 55 forseps kullanın. SV, yanal duvarın iç tarafında daha koyu bir doku tabakası olarak görülebilmelidir.
NOT: Kullanıcılar, özellikle apikal uca daha yakın bir yerde, SV dokusunun bir kısmının diseksiyon boyunca tesadüfen lateral duvardan ayrıldığını görebilirler. - SV tabakasını bazal ucundaki yanal duvardan ayırmak için yavaşça kaldırın (Şekil 2H). Ayrılmış SV'yi yavaşça bir kenara itin ve forsepsleri lateral duvarın apikal ucuna doğru hareket ettirin, mümkünse SV'yi uzun bir şerit olarak ayırın (Şekil 2I). SV'yi çekmek için forseps ile sıkmayın. Doku yakalanamayacak kadar kırılgansa, alternatif olarak şalazyon küreti gibi bir doku kepçesi kullanılarak toplanabilir.
NOT: SV'nin taşınması, kaybolmamasını sağlamak için her zaman ışık mikroskobu altında yapılmalıdır. Hasar riski nedeniyle forseps kullanarak yakalarken her zaman dikkatli olun. Kullanıcılar, şalazyon küreti kullanmanın SV dokusuna zarar verme riskini azalttığını görebilirler. Tek çekirdekli dizileme için, bölüm 5'e geçin. SV immün boyama için bölüm 7'ye geçin.
5. SV tek çekirdekli süspansiyon
NOT: Bu protokol, SV dokusu için özellikle yayınlanmış bir üreticinin tek çekirdekli süspansiyon protokolünden uyarlanmıştır. Farklı üreticilerin platformları kullanılabilir31. Platforma özgü varyasyon göz önüne alındığında, ekipmanla birlikte sağlanan üreticiye özgü protokolün gözden geçirilmesi önerilir. sNuc-Seq için en uygun sonuçları elde etmek ve RNA yıkımını en aza indirmek için, doku diseksiyonu ne kadar hızlı olursa o kadar iyidir (ötenaziden 15-20 dakika içinde önerilir). Bir seferde bir hayvanı ötenazi yapmak ve sadece disseke etmeye hazır olduğunda yararlı olabilir. Diseksiyonlar üzerinde aynı anda birden fazla kişinin çalışması da bozulma süresini ortadan kaldırabilir (örneğin, bir laboratuvar personeli sol kulakta çalışırken, diğeri sağ kulakta çalışır).
- SV dokusu sNuc-Seq için kullanılacaksa, dokuyu soğutulmuş lizis tamponuna yerleştirin (10 mM Tris-HCl, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2, nükleaz içermeyen suda% 0.005 nonidet P40).
NOT: Diseksiyondan hemen sonra sekanslama yapılacaksa, protokole devam edin. Protokolün duraklatılması istenirse, SV'nin RNAlater'a yerleştirilmesiyle SV koruması mümkündür. Gece boyunca 4 ° C'de saklayın, ardından sıvı azotta dondurun ve kullanıma hazır olana kadar -80 ° C'de saklayın. Kullanıma hazır olduğunda, PBS'de her biri 5 dakika boyunca iki kez çözün ve yıkayın, ardından homojenizasyona devam edin (adım 5.2). - Buz üzerinde 10-20 vuruşla 2 mL'lik bir sıçrama homojenizatöründe dokuyu homojenize edin.
NOT: Cam silindir, SV'yi parçalayarak cam tüpün tabanına manuel olarak temas edecektir. SV hassastır, bu nedenle 20 strok genellikle başarılı homojenizasyon sağlar. - Dokuyu 25 dakika boyunca buz üzerinde lize edin.
NOT: Lizis süresi doku tipine göre değişir. SV dokusunda 25 dakikalık bir lizis, düşük bir hücre canlılığı (% 4'ten az) elde edebilir, ancak hücre canlılığı çok yüksekse zaman adapte edilebilir (adım 5.8). - 30 μm'lik bir filtreden süzün ve filtreyi 500 x g'de 4 ° C'de 5 dakika döndürün.
- Süpernatantı çıkarın ve hücre peletini 1 mL çekirdek yıkama ve resüspansiyon tamponunda (1x PBS,% 1 sığır serum albümini [BSA], 0.2U / μL RNaz inhibitörü) yeniden askıya alın.
- Hücreleri 10 μm'lik bir filtreden geçirin ve 4 °C'de 5 dakika boyunca 500 x g'de santrifüj yapın.
- Süpernatantı çıkarın ve 50 μL çekirdek yıkama ve yeniden süspansiyon tamponunda yeniden askıya alın.
- Bir hücre sayacı ve tripan mavisi boyama kullanarak çekirdekleri sayın. Hücre sayımı için hücre süspansiyonunun 5 μL'sini 50 μL 1x PBS'ye seyreltin; Bu noktada canlılık minimum düzeyde (%3-%4) olmalıdır. Canlılığın daha yüksek olduğu tespit edilirse, protokolü adım 5.3 (lizis) için uyarlayın ve hücrelerin yeterli parçalanmasını sağlamak için lizis süresini standartlaştırın.
NOT: Tek bir çekirdek preparatında yüksek hücre canlılığı, istenenden daha fazla sağlam hücre olduğu ve ek sindirim gerekebileceği anlamına gelir. - İstenilen nükleer yoğunluktaki numuneyi üreticinin cihazına/çipine yükleyin (üretici kılavuzuna bakın). Tek çekirdekli yakalamalar artık hazır.
NOT: Bir yetişkin fare SV'den, genellikle 150.000 çekirdek/mL konsantrasyonda süspansiyonun 50 μL'si elde edilir.
6. SV tek çekirdekli dizileme
- Örnekleri sıralama için çekirdek tesise gönderin.
NOT: Protokolün bu kısmı, (1) jel boncuk içinde emülsiyon (GEM) üretimi ve barkodlama, (2) GEM-RT sonrası temizleme ve cDNA amplifikasyonu ve (3) 3' gen ekspresyon kütüphanesi yapımının genel adımlarını izlemektedir. sNuc-Seq protokolünün geri kalanı nispeten uzundur ve okuyucuların üreticiye özgü protokollerini kullanmaları önerilir. Üretici kılavuzu büyük olasılıkla belirli ayrıntıları ve beraberindeki görüntüleri içeren adımları açıklayacaktır. Üreticinin web sitesinde 'nasıl yapılır' videoları da olabilir. Oluşturulan veri kümeleri, tek tip manifold yaklaşımı ve projeksiyonu gibi boyutsal olarak azaltılmış bir şekilde temsil edilebilir (UMAP; Şekil 3). Birçok laboratuvar, kullanıcılar için bu protokolü gerçekleştirebilecek bir sıralama çekirdeği kullanır.
7. SV immün boyama ve doku montajı
- Doku immün boyama için kullanılacaksa, 24 delikli bir plakaya aktarın, 1x PBS'de 200 μL% 4 paraformaldehit (PFA) içine batırın ve oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin.
NOT: Tüm sıvı giderme, yıkama ve immün boyama işlemlerini mikroskop altında yapmak yararlıdır. Pipetleme sırasında dokuyu görselleştirmek, sıvının çıkarılması sırasında yanlışlıkla kaybolmamasını sağlayacaktır. Antikorların ve yıkamaların hacimleri, hacim SV dokusunu çözelti içine batıracak kadar büyük olduğu sürece ayarlanabilir. - Sabitleme adımından sonra, düşük (30-50) RPM'de bir orbital çalkalayıcıda her biri 5 dakika boyunca 4 ° C'de 1x PBS'de (yaklaşık 500 μL) iki kısa yıkama yaparak PFA'yı çıkarın. Saklanıyorsa, doku 4 ° C'de 1x PBS'de saklanabilir.
- PBS'yi çıkarın ve yaklaşık 300 μL PBS-T çözeltisinde (% 10 fetal sığır serumu ile 1x PBS'de 0.05 Tween20) oda sıcaklığında en az 1 saat geçirgenleştirin ve bloke edin.
NOT: Birincil ve ikincil antikorlar bu bloke edici çözelti içinde seyreltilmelidir. - Dokuyu, kullanılan belirli antikorun özelliklerine göre, genellikle gece boyunca 4 ° C'de birincil antikor ile lekeleyin. Kalan PBS'yi çıkarın ve seyreltilmiş birincil antikoru ekleyin.
NOT: Seyreltme, üretici önerilerine, yayınlanan verilere, önceki deneyimlere vb. Göre seçilmelidir. Genellikle, test edilecek ilk konsantrasyon 1:100-200 seyreltmedir. Bu makalede sunulan örnekte, GS-IB4 ve DAPI antikorlarının her biri 1:200'de seyreltilmiştir. Birden fazla protein için boyama yapılırsa, ikincil antikorların çapraz reaktivitesini önlemek için her birincil antikorun farklı bir konakçısı olduğu sürece, birden fazla birincil antikor aynı çözeltide birleştirilebilir. - Birincil antikoru, düşük RPM'de bir orbital çalkalayıcıda her biri 10 dakika boyunca iki kez yaklaşık 500 μL 1x PBS kullanarak dokudan yıkayın.
NOT: SV dokusunun çözeltiye batırıldığından ve kuyunun yan tarafına sıkışmadığından emin olmaya devam edin. - Kullanılan belirli bir antikorun özelliklerine göre ikincil bir antikor ile leke, genellikle düşük RPM'de bir orbital çalkalayıcı üzerinde oda sıcaklığında 2 saat boyunca. 24 delikli plakayı örtün, böylece floresan olarak etiketlenmiş ikincil antikor ışıktan korunur.
NOT: Birden fazla ikincil antikora ihtiyaç duyulursa, ikincil antikorları aynı çözeltide birleştirin. Çapraz etiketlemeden kaçındığınızdan emin olun. - İkincil antikoru, düşük RPM'de bir orbital çalkalayıcıda her biri 5 dakika boyunca dört kez yaklaşık 500 μL 1x PBS kullanarak dokudan yıkayın. 24 delikli plakayı ışıktan korumak için kapalı tutun.
- 25 mm eksen boyunca, 18 mm x 18 mm daha küçük cam kapak kaymasından sadece daha küçük olan iki küçük yapıştırıcı çizgisi yerleştirerek daha büyük mikro slaytı (75 mm x 25 mm) hazırlayın. Tutkal çizgilerinin arasına bir damla montaj reaktifi (yaklaşık 50 μL) yerleştirin.
NOT: Tutkal az miktarda dikey alan oluşturur, böylece ikinci kapak kayması üste yerleştirildiğinde, SV doku örneği güvenli bir şekilde var olabilir, ancak yerinde kalmaya devam edebilir. Stria kalınlığı 30-40 mikron iken, morfolojiyi korumak için cam yüzeyler arasındaki dokunun sıkılmasından kaçınılmalıdır. Alternatif olarak, şeffaf bant da kullanılabilir. - #55 forseps kullanarak, SV'nin bir ucunda mümkün olduğunca az doku tutun ve PBS'den daha büyük mikroslayttaki (75 mm x 25 mm) montaj reaktifinin damlasına aktarın. Daha küçük bir cam kapak kapağının (18 mm x 18 mm) bir ucunu, bir yapıştırıcı çizgisinin yerleştirildiği slayta yerleştirin ve hava kabarcıkları oluşturmamak için yavaşça serbest bırakın. Kapak kayması diğer tutkal çizgisine düşecek ve SV dokusunu kaplayacaktır.
- Montajın her köşesine bir damla şeffaf oje sürerek montajı kapatın. Numuneyi, görselleştirme alanından uzaktaki cam kapak üzerinde uygun şekilde etiketleyin. Artık konfokal mikroskopi için hazırdır (Şekil 4).
- SV dokusunu, herhangi bir hava kabarcığının yakınında değil, düz bir şekilde uzandığından emin olmak için bir diseksiyon mikroskobu kullanarak görselleştirin. SV dokusu doğru yönlendirilmemişse, kullanıcı hava kabarcıklarını dışarı itmeyi deneyebilir veya daha küçük cam kapak kaymasını dikkatlice çıkarabilir ve SV'yi yeniden konumlandırabilir. Bu, cam kapakların kırılmasını önlemek için nazikçe yapılmalıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu çalışmada, SV'yi sNuc-Seq veya immün boyama için kullanılacak şekilde izole etmek için bir yöntem sunuyoruz. Kokleanın SV'ye göre ilgili anatomisi (Şekil 1), kullanıcıların SV'nin organizasyonunu ve diseksiyon protokolünün adımlarını daha iyi anlamalarına yardımcı olabilir.
SV'nin bir P30 fareden bu mikrodiseksiyonunun her adımı ilişkili videoda detaylandırılmıştır ve SV'nin bu diseksiyonu ve izolasyonunun temel adımlarının anlık görüntüleri Şekil 2'de sunulmuştur.
sNuc-Seq, heterojen SV'deki çeşitli hücrelerin transkripsiyonel profilini araştırmada yararlıdır. Bunun görselleştirilmesinin bir yolu, 2B UMAP üzerinde kümeleme yapmaktır (Şekil 3). sNuc-Seq'ten oluşturulan veri kümesi, tartışmada daha ayrıntılı olarak özetlenen farklı veri analizi teknikleri kullanılarak değerlendirilebilir.
GS-IB4 ve DAPI immünoetiketleme ile SV tam montajı, Kcnj10-ZsGreen floresan ile birlikte Şekil 4'te sunulmuştur. Çiçeklenme kullanarak, SV çevreleyen dokuları çıkardıktan ve monte ettikten sonra görselleştirilebilir. Bu farelerde, ZsGreen özellikle SV ara hücrelerinde eksprese edilir. SV'nin vaskülatürü kırmızı renkte görüntülenebilir (endotel hücreleri, GS-IB4).
Şekil 1: Stria vascularis hücresel heterojenite şeması ve organizasyonu. Stria vascularis hücresel heterojenite ve organizasyon. Stria vascularis'in (SV) şeması ve kokleadaki yapılarla ilişkisi. SV üç hücre katmanından oluşur ve endolenf içeren scala ortamında EP ve yüksek potasyum konsantrasyonu üretmekten sorumludur. Marjinal, ara ve bazal hücreler arasındaki ilişki, hem marjinal hem de bazal hücrelerle interdijitasyona giren çift yönlü hücresel projeksiyonlara sahip olan ara hücrelerle interdijitasyona yönelik marjinal genişleyen bazolateral projeksiyonlarla gösterilmiştir. Bu hücre tiplerine ek olarak, iğ hücreleri (sarı), endotel hücreleri, perisitler ve makrofajlar (gösterilmemiş) dahil olmak üzere diğer hücre tipleri SV'de bulunur. Korrapati ve ark.30'un izniyle kullanılmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Yetişkin bir fare kokleasının doğum sonrası gün 30'dan (P30+) daha büyük veya buna eşit olarak diseksiyonu. (A) Adım 3.2 sırasında çevredeki temporal kemikten iç kulak ekstraksiyonu sırasında alınan numune. İç kulak mor renkle özetlenmiştir. (B) Adım 4.2 sırasında koklea yüzeyini ve altta yatan pigmentli SV'yi gösteren örnek. (C) Adım 4.4 sırasında, apikal dönüşten çıkarılan kemiği ve açıkta kalan SV'yi (sarı ok) gösteren örnek. (D) Adım 4.5 sırasında, apikal ve orta dönüşlerden daha fazla kemiğin çıkarıldığı kokleayı gösteren örnek. (E) Adım 4.5 sırasında, orta dönüşü kaplayan kemiğin çıkarılmasını gösteren, altta yatan SV'yi (sarı ok) gösteren örnek. (F) Adım 4.10 sırasında daha küçük SV (sarı ok) ve yanal duvar (mavi ok) parçalarına örnek. (G) Kalan yanal duvar karanlık kalırken floresan ZsGreen SV örneği. KCNJ10-ZsGreen özellikle SV'nin ara hücrelerinde eksprese edilir. (H) Adım 4.12 sırasında ayrılan daha büyük SV (sarı ok) ve yanal duvar (mavi) parçalarına örnek. (I) SV, adım 4.12 sırasında yanal duvardan tamamen ayrılmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: RNAlater-tedavi edilen yetişkin stria vascularis'ten sNuc-Seq veri kümelerinin UMAP grafiği. Yetişkin SV dokusunun RNAlater tedavisi ile daha sonraki çekirdek izolasyonu ile korunan örnekler, Leiden optimizasyon algoritması ile modülerlik tabanlı bir kümeleme yöntemi ile kümelendi ve 2D UMAP grafiği ile boyutsal olarak küçültülmüş bir şekilde görselleştirildi. Her nokta tek bir hücreyi temsil eder ve benzer transkripsiyonel profillere sahip hücreler birlikte kümelenir. Hücre tipleri, yetişkin SV hücre tipleri tarafından eksprese edilen bilinen genlerin ekspresyonuna göre renklendirilir. Örnekler RNAlater'da en fazla 6 ay saklandı. Bu veri kümesini oluşturmak için yaklaşık beş CBA / J P30 faresinden elde edilen SV kullanıldı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4. Stria vascularis bir P30 Kcnj10-ZsGreen fareden tüm montaj. Bir P30 fareden SV tüm montajının konfokal görüntüsü, ara hücrelerde ZsGreen ekspresyonunu, endotel hücrelerini etiketleyen GS-IB4 (kırmızı) ve DAPI (beyaz) etiketleme çekirdeklerini gösterir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tek hücreli dizilemenin ortaya çıkmasından önce, birçok araştırmacı toplu doku analizi kullandı, bu da sadece hücreler arasında ortalama transkriptomları analiz etmeyi mümkün kıldı. Özellikle, tek hücreli ve sNuc-Seq, sırasıyla tek bir hücrenin veya tek çekirdeğin transkriptomunu izole etmeyi mümkün kılmıştır32. Bu örnekte, marjinal, ara ve bazal hücrelerin yanı sıra iğ hücreleri30 için tek çekirdekli transkriptomlar tanımlanabilir. Bu, SV hücre tipleri arasında transkripsiyonel heterojenitenin araştırılmasını sağlar ve gelecekte EP'nin oluşturulması ve sürdürülmesi de dahil olmak üzere bu hücre tiplerinin SV fonksiyonuna katkısını araştırmak için kullanılabilir. sNuc-Seq kullanılarak oluşturulan veri kümeleri, genel transkripsiyonel farklılıkların anlaşılmasını kolaylaştırmak ve bir UMAP grafiği kullanarak farklı hücre popülasyonlarını karşılaştırmak için boyutsal olarak azaltılmış bir şekilde görüntülenebilir Şekil 4. sNuc-Seq veri kümelerinin yorumlanması için biyoinformatik analiz yapmanın birçok yolu vardır. Bunlar aşağıdakileri içerir, ancak bunlarla sınırlı değildir: diferansiyel ifade analizi, tek hücreli düzenleyici ağ çıkarımı ve kümeleme (SCENIC), ısı haritası veya sırıtma keman grafiği yapımı ve düzenleme analizi18. Tek hücreli RNA dizilimi için daha ileri hesaplamalı analiz teknikleri sNuc-Seq'e benzer ve Hwang ve ark.32, Shafer 33 ve Chen ve ark.34 tarafından yapılan incelemelerde daha ayrıntılı olarak tartışılmıştır.
Bu diseksiyon tekniğinin diğer önemli uygulaması, SV içindeki seçilmiş yapıları daha iyi incelemek için immün boyamadır. Bunu, konfokal mikroskopi kullanılarak görüntülenen bir SV bütün montajının ayarında gözlemleyebiliriz (Şekil 3). Tüm hücrelerin çekirdekleri DAPI etiketleme ile görselleştirilir. Kılcal damarlar endotel hücre boyaması ile GS-IB4 kırmızısı ile görülür. Bu durumda ara hücreler, ZsGreen'i eksprese etmek için ara hücreye özgü bir promotör kullanılarak genetik olarak modifiye edilmiştir.
sNuc-Seq'in sınırlamaları şunları içerir: (1) uzamsal bilgi eksikliği, (2) bağışıklık hücresi popülasyonlarına karşı önyargılar ve (3) sitoplazmik RNA'nın dışlanması. Uzamsal transkriptomik teknikler, doku35 içindeki hücresel alt popülasyonlar hakkında daha spesifik bilgi sağlayabilir. Doku ayrışması ve depolanması gibi sNuc-Seq ve tek hücreli RNA dizilimi arasındaki protokol farklılıkları göz önüne alındığında, sNuc-Seq tarafından oluşturulan transkripsiyonel profil, bağlı hücre tiplerini karakterize etmede daha güçlü olurken bağışıklık hücrelerine karşı önyargılı olabilir36. Ayrıca, tek hücreli RNA dizilimi, mitokondriyal RNA gibi sitoplazmik RNA'yı içerirken, sNuc-Seq içermez. İki yöntem arasındaki bu transkripsiyonel farklılıklara rağmen, sNuc-Seq'in genel olarak tüm tek hücreli RNA dizilimi37'ye ve özellikleSV'de 30'a benzer bir transkripsiyonel profile sahip olduğu gösterilmiştir.
Başarılı bir mikrodiseksiyon için, dikkat edilmesi gereken birkaç kritik adım vardır. İlk birkaç adımda, altta yatan kokleanın ezilmesini önlemek için iç kulağın uygun şekilde çıkarılması gerekir. Uygun temporal kemik ekstraksiyonunun gözlemlenmesi Şekil 2A'da gösterilmiştir. Koklea düzgün bir şekilde açığa çıktıktan sonra, altta yatan lateral duvarı ve SV'yi açığa çıkarmak için koklear kemiğin hafifçe kazınmasına ve kırılmasına özen gösterilmelidir. Yanal duvar ve SV başarılı bir şekilde çıkarıldıktan sonra, kullanıcı SV'yi yanal duvardan dikkatlice ayırmalıdır. SV'yi yanal duvardan çıkarmak için doğru düzlemde yeterli kuvvet uygulanmalı, kırılgan SV'ye zarar gelmesini önlemelidir. SV mikrodiseksiyonu için, "SV'yi kokleanın dışına çıkarmak" yerine, "SV'den diğer yapıları diseksiyon" etmeyi düşünmek yararlı olabilir.
Bu protokol, farklı yaşlardaki fareler ve sıçanlar gibi farklı memeli türleri için değiştirilebilir. Genç fareler için, dokular dokuda farklılık gösterecek ve yapılar genel olarak daha küçük olacaktır. Farklı memeli türleri için, koklear anatomi nispeten benzer olacak ve hayvanın büyüklüğü farkın çoğunu belirleyecektir.
Genel olarak, bu protokolün dezavantajları diğer koklear mikrodiseksiyon tekniklerine benzerdir38. Hassas SV'yi izole etmek teknik olarak zor olabilir ve daha küçük parçalara ayrılabilir.
Bu teknik, Corti'nin organını tüm montaj için kurtarmak için en uygun değildir, çünkü bu protokolle sıklıkla hasar görür. Özellikle tüm montaj ve immün boyama38 için Corti organını korumayı amaçlayan başka diseksiyon teknikleri de vardır, ancak bunların kendi dezavantajları vardır, çünkü sNuc-Seq, doku fiksasyonu ve dekalsifikasyon ortamında değil, RNA bozulmasını önlemek için taze örneklerle yapılmalıdır.
Zaman ve tekrarlama ile, kullanıcılar bu SV mikrodiseksiyon protokolü ile daha rahat olacaklardır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu araştırma kısmen NIH'nin Intramural Araştırma Programı, NIDCD to M.H. (DC000088) tarafından desteklenmiştir
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10-µm filter (Polyethylenterephthalat) | PluriSelect | #43-50010-01 | Filter tissue during sNuc-Seq |
| 18 x 18 mm cover glass | Fisher Scientific | 12-541A | Cover slip to mount SV |
| 30-µm filter (Polyethylenterephthalat) | PluriSelect | #43-50030-03 | Filter tissue during sNuc-Seq |
| 75 x 25 mm Superfrost Plus/Colorforst Plus Microslide | Daigger | EF15978Z | Microslide to mount SV on |
| C57BL/6J Mice | The Jackson Laboratory | RRID: IMSR_JAX:000664 | General purpose mouse strain that has pigment more easily seen in the intermediate cells of the SV. |
| Cell Counter | Logos Biosystems | L20001 | Used for cell counting |
| Chalizon curette 5'', size 3 2.5 mm | Biomedical Research Instruments | 15-1020 | Used to transfer SV |
| Chromium Next GEM single Cell 3' GEM Kit v3.1 | Chromium | PN-1000141 | Generates single cell 3' gene expression libraries |
| Clear nail polish | Fisher Scientific | NC1849418 | Used for sealing SV mount |
| Corning Falcon Standard Tissue Culture Dishes, 24 well | Corning | 08-772B | Culture dish used to hold specimen during dissection |
| DAPI | Invitrogen | D1306, RRID: AB_2629482 | Stain used for nucleus labeling |
| Dounce homogenizer | Sigma-Aldrich | D8938 | Used to homogenize tissue for sNuc-seq |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | General forceps for dissection |
| Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | Forceps with fine tip that makes SV manipulation easier |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher | 16000044 | Used for steps of sNuc-Seq |
| Glue stick | Fisher Scientific | NC0691392 | Used for mounting SV |
| GS-IB4 Antibody | Molecular Probes | I21411, RRID: AB-2314662 | Antibody used for capillary labeling |
| KCNJ10-ZsGreen Mice | n/a | n/a | Transgenic mouse that expresses KCNJ10-ZsGreen, partiularly in the intermediate cells of the SV. |
| MgCl2 | ThermoFisher | AM9530G | Used for steps of sNuc-Seq |
| Mounting reagent | ThermoFisher | #S36940 | Mounting reagent for SV |
| Multiwell 24 well plate | Corning | #353047 | Plate used for immunostaining |
| NaCl | ThermoFisher | AAJ216183 | Used for steps of sNuc-Seq |
| Nonidet P40 | Sigma-Aldrich | 9-16-45-9 | Used for steps of sNuc-Seq |
| Nuclease free water | ThermoFisher | 4387936 | Used for steps of sNuc-Seq |
| Orbital shaker | Silent Shake | SYC-2102A | Used for steps of immunostaining |
| PBS | ThermoFisher | J61196.AP | Used for steps of immunostaining and dissection |
| RNA Later | Invitrogen | AM7021 | Used for preservation of SV for sNuc-Seq |
| Scizzors | Fine Science Tools | 14058-09 | Used for splitting mouse skull |
| Tris-HCl | Sigma-Aldrich | 15506017 | Used for steps of sNuc-Seq |
| Trypan blue stain | Gibco | 15250061 | Used for cell counting |
| Tween20 | ThermoFisher | AAJ20605AP | Used for steps of sNuc-Seq |
| Zeiss STEMI SV 11 Apo stereomicroscope | Zeiss | n/a | Microscope used for dissections |
References
- Bosher, S. K., Warren, R. L. Observations on the electrochemistry of the cochlear endolymph of the rat: a quantitative study of its electrical potential and ionic composition as determined by means of flame spectrophotometry. Proceedings of the Royal Society of London. Series B. Biological Sciences. 171 (1023), 227-247 (1968).
- Patuzzi, R. Ion flow in stria vascularis and the production and regulation of cochlear endolymph and the endolymphatic potential. Hearing Research. 277 (1-2), 4-19 (2011).
- Wangemann, P. K+ cycling and the endocochlear potential. Hearing Research. 165 (1-2), 1-9 (2002).
- Adachi, N., et al. The mechanism underlying maintenance of the endocochlear potential by the K+ transport system in fibrocytes of the inner ear. The Journal of Physiology. 591 (18), 4459-4472 (2013).
- Hibino, H., Nin, F., Tsuzuki, C., Kurachi, Y. How is the highly positive endocochlear potential formed? The specific architecture of the stria vascularis and the roles of the ion-transport apparatus. Pflugers Archiv. 459 (4), 521-533 (2010).
- Lang, F., Vallon, V., Knipper, M., Wangemann, P. Functional significance of channels and transporters expressed in the inner ear and kidney. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 293 (4), C1187-C1208 (2007).
- Liu, W., Schrott-Fischer, A., Glueckert, R., Benav, H., Rask-Andersen, H. The human "cochlear battery"-claudin-11 barrier and ion transport proteins in the lateral wall of the cochlea. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 239 (2017).
- Marcus, D. C., Wu, T., Wangemann, P., Kofuji, P. KCNJ10 (Kir4.1) potassium channel knockout abolishes endocochlear potential. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 282 (2), C403-C407 (2002).
- Spicer, S. S., Schulte, B. A. Differentiation of inner ear fibrocytes according to their ion transport related activity. Hearing Research. 56 (1-2), 53-64 (1991).
- Wangemann, P., Liu, J., Marcus, D. C. Ion transport mechanisms responsible for K+ secretion and the transepithelial voltage across marginal cells of stria vascularis in vitro. Hearing Research. 84 (1-2), 19-29 (1995).
- Yoshida, T., et al. The unique ion permeability profile of cochlear fibrocytes and its contribution to establishing their positive resting membrane potential. Pflugers Archiv. 468 (9), 1609-1619 (2016).
- Johns, J. D., Adadey, S. M., Hoa, M. The role of the stria vascularis in neglected otologic disease. Hearing Research. 428, 108682 (2023).
- Kim, J., Ricci, A. J. In vivo real-time imaging reveals megalin as the aminoglycoside gentamicin transporter into cochlea whose inhibition is otoprotective. Proceedings of the National Academy of Sciences. 119 (9), e2117846119 (2022).
- Zdebik, A. A., Wangemann, P., Jentsch, T. J. Potassium ion movement in the inner ear: insights from genetic disease and mouse models. Physiology. 24, 307-316 (2009).
- Chen, J., Zhao, H. B. The role of an inwardly rectifying K+ channel (Kir4.1) in the inner ear and hearing loss. Neuroscience. 265, 137-146 (2014).
- Steel, K. P., Barkway, C. Another role for melanocytes: their importance for normal stria vascularis development in the mammalian inner ear. Development. 107 (3), 453-463 (1989).
- Ito, T., Nishio, A., Wangemann, P., Griffith, A. J. Progressive irreversible hearing loss is caused by stria vascularis degeneration in an Slc26a4-insufficient mouse model of large vestibular aqueduct syndrome. Neuroscience. 310, 188-197 (2015).
- Gu, S., et al. Characterization of rare spindle and root cell transcriptional profiles in the stria vascularis of the adult mouse cochlea. Scientific Reports. 10 (1), 18100 (2020).
- Gow, A., et al. Deafness in claudin 11-null mice reveals the critical contribution of basal cell tight junctions to stria vascularis function. The Journal of Neuroscience. 24 (32), 7051-7062 (2004).
- Chang, Q., et al. Virally mediated Kcnq1 gene replacement therapy in the immature scala media restores hearing in a mouse model of human Jervell and Lange-Nielsen deafness syndrome. EMBO Molecular Medicine. 7 (8), 1077-1086 (2015).
- Faridi, R., et al. Mutational and phenotypic spectra of KCNE1 deficiency in Jervell and Lange-Nielsen Syndrome and Romano-Ward Syndrome. Human Mutation. 40 (2), 162-176 (2019).
- Wangemann, P., et al. Loss of KCNJ10 protein expression abolishes endocochlear potential and causes deafness in Pendred syndrome mouse model. BMC Medicine. 2, 30 (2004).
- Kitajiri, S. -I., et al. Expression patterns of claudins, tight junction adhesion molecules, in the inner ear. Hearing Research. 187 (1-2), 25-34 (2004).
- Jagger, D. J., Nevill, G., Forge, A. The membrane properties of cochlear root cells are consistent with roles in potassium recirculation and spatial buffering. Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 11 (3), 435-448 (2010).
- Ito, T., Kurata, N., Fukunaga, Y.
- Zhang, J., et al. VEGFA165 gene therapy ameliorates blood-labyrinth barrier breakdown and hearing loss. JCI Insight. 6 (8), e143285 (2021).
- Shi, X. Pathophysiology of the cochlear intrastrial fluid-blood barrier (review). Hearing Research. 338, 52-63 (2016).
- Gu, S., et al. Identification of potential Meniere's disease targets in the adult stria vascularis. Frontiers in Neurology. 12, 630561 (2021).
- Fischer, J., Ayers, T. Single nucleus RNA-sequencing: how it's done, applications and limitations. Emerging Topics in Life Sciences. 5 (5), 687-690 (2021).
- Korrapati, S., et al. Single cell and single nucleus RNA-Seq reveal cellular heterogeneity and homeostatic regulatory networks in adult mouse stria vascularis. Frontiers in Molecular Neuroscience. 12, 316 (2019).
- Pyle, M. P., Hoa, M. Applications of single-cell sequencing for the field of otolaryngology: A contemporary review. Laryngoscope Investigative Otolaryngology. 5 (3), 404-431 (2020).
- Hwang, B., Lee, J. H., Bang, D. Single-cell RNA sequencing technologies and bioinformatics pipelines. Experimental & Molecular Medicine. 50 (8), 1-14 (2018).
- Shafer, M. E. R. Cross-species analysis of single-cell transcriptomic data. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 175 (2019).
- Chen, G., Ning, B., Shi, T. Single-cell RNA-Seq technologies and related computational data analysis. Frontiers in Genetics. 10, 317 (2019).
- Longo, S. K., Guo, M. G., Ji, A. L., Khavari, P. A. Integrating single-cell and spatial transcriptomics to elucidate intercellular tissue dynamics. Nature Reviews Genetics. 22 (10), 627-644 (2021).
- Kim, N., Kang, H., Jo, A., Yoo, S. A., Lee, H. O. Perspectives on single-nucleus RNA sequencing in different cell types and tissues. Journal of Pathology and Translational Medicine. 57 (1), 52-59 (2023).
- Grindberg, R. V., et al.
- Montgomery, S. C., Cox, B. C. Whole mount dissection and immunofluorescence of the adult mouse cochlea. Journal of Visuazlied Experiments. (107), e53561 (2016).
