Summary
A estria vascular é vital para a geração do potencial endococlear. Apresentamos aqui a dissecção da estria vascular de camundongos adultos para sequenciamento de núcleo único ou imunomarcação.
Abstract
O potencial endococlear, gerado pela estria vascular, é essencial para manter um ambiente propício à adequada mecanotransdução das células ciliadas e, finalmente, à audição. Patologias da estria vascular podem resultar em diminuição da audição. A dissecção da estria vascular do adulto permite a captura focalizada de núcleo único e subsequente sequenciamento e imunomarcação de núcleo único. Essas técnicas são usadas para estudar a fisiopatologia da estria vascular em nível unicelular.
O sequenciamento de núcleo único pode ser usado na análise transcricional da estria vascular. Enquanto isso, a imunomarcação continua a ser útil na identificação de populações específicas de células. Ambos os métodos requerem dissecção adequada da estria vascular como pré-requisito, o que pode revelar-se tecnicamente desafiador.
Introduction
A cóclea consiste de três câmaras cheias de líquido, a escala vestibular, a escala média e a escala timpânica. A escala vestibular e a escala timpânica contêm perilinfa, que apresenta alta concentração de sódio (138 mM) e baixa concentração de potássio (6,8 mM)1. A escala média contém endolinfa, que apresenta alta concentração de potássio (154 mM) e baixa concentração de sódio (0,91 mM)1,2,3. Essa diferença na concentração de íons pode ser chamada de potencial endococlear (PE), e é gerada primariamente pelo movimento de íons potássio através de vários canais iônicos e junções comunicantes na estria vascular (VS) ao longo da parede lateral da cóclea4,5,6,7,8,9,10,11 . A VS é um tecido heterogêneo, altamente vascularizado, que reveste a face medial da parede lateral da cóclea e contém três tipos celulares principais: células marginais, intermediárias ebasais12 (Figura 1).
As células marginais são conectadas por tight junctions para formar a superfície mais medial da VS. A membrana apical está voltada para a endolinfa da escala média e contribui para o transporte iônico de potássio para a endolinfa usando vários canais, incluindo KCNE1/KCNQ1, SLC12A2 e Na+-K+-ATPase (NKA)5,10,13,14. As células intermediárias são células pigmentadas que residem entre as células marginais e basais e facilitam o transporte de potássio através da VS utilizando KCNJ10 (Kir 4.1)15,16. As células basais estão próximas à parede lateral da cóclea e estão intimamente associadas aos fibrócitos do ligamento espiral para promover a reciclagem de potássio da perilinfa12. A patologia da VS tem sido implicada em inúmeras afecçõesotológicas17,18. Mutações em genes expressos nos principais tipos celulares de VS, como Kcnq1, Kcne1, Kcnj10 e Cldn11, podem causar surdez e disfunção de VS, incluindo a perda de PE19,20,21,22,23. Além dos três principais tipos celulares, existem outros tipos celulares menos estudados na VS, como as células fusiformes22, as células radiculares12,24, os macrófagos25, os pericitos26 e as células endoteliais27, que têm papéis incompletamente definidos envolvendo a homeostase iônica e a geração de EP28.
Em comparação com o sequenciamento de RNA em massa, o sequenciamento de RNA de núcleo único (sNuc-Seq) fornece informações sobre a heterogeneidade celular, em vez de uma média de RNAm em um grupo de células29, e pode ser particularmente útil ao estudar o SV30 heterogêneo. Por exemplo, o sNuc-Seq produziu uma análise transcricional que sugere que pode haver um papel das células fusiformes e radiculares na geração de PE, perda auditiva e doença de Ménière18. Uma caracterização transcricional adicional dos vários tipos de células da VS pode nos fornecer informações valiosas sobre a fisiopatologia subjacente aos diferentes mecanismos e subtipos de flutuação e perda auditiva relacionados à VS. A colheita dessas delicadas estruturas da orelha interna é de suma importância para a análise ótima dos tecidos.
Neste estudo, a abordagem de microdissecção para acessar e isolar a estria vascular da cóclea de camundongos adultos para sNuc-Seq ou imunomarcação é descrita. A dissecção do VS de camundongos adultos é necessária para entender vários tipos de células VS e caracterizar melhor seu papel na audição.
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Protocol
Todos os experimentos e procedimentos com animais foram realizados de acordo com protocolos aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais do National Institute of Neurological Diseases and Stroke e do National Institute on Deafness and Other Communication Disorders, National Institutes of Health. Todos os protocolos experimentais foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais do National Institute of Neurological Diseases and Stroke e pelo National Institute on Deafness and Other Communication Disorders, National Institutes of Health. Todos os métodos foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos relevantes do Comitê de Cuidados e Uso de Animais do National Institute of Neurological Diseases and Stroke e do National Institute on Deafness and Other Communication Disorders, National Institutes of Health.
1. Eutanásia animal
- Use camundongos transgênicos C57BL/6J ou Kcnj10-ZsGreen, dia pós-natal 30+ (P30+), que pesam entre 15-20 g.
- Eutanásia de um camundongo adulto (idade P30 ou mais) usando um protocolo aprovado (aqui asfixia por CO2 ). Execute a decapitação como uma etapa secundária.
NOTA: Se a imunomarcação, alguns anticorpos podem ter sinal de fundo devido à ligação inespecífica ao sangue nos capilares da VS. A perfusão cardíaca com fixador pode resolver essa questão removendo o sangue dos capilares da VS. No entanto, a maioria dos anticorpos pode alcançar bons resultados sem esse método, e ele não será abordado neste protocolo.
2. Expondo o labirinto ósseo
- Limpe o rato pulverizando com etanol 70% e limpando com um papel toalha. Preste especial atenção à região da cabeça para reduzir o risco de contaminação. Remova a pele do crânio puxando a pele em direção ao nariz.
- Com uma tesoura afiada, divida o crânio ao longo do plano sagital médio para separar as porções esquerda e direita.
- Remova o cérebro do crânio para expor o labirinto ósseo.
3. Extração da orelha interna
- Identificar a orelha interna dentro do osso temporal (Figura 2A) e raspar os nervos cranianos com pinça #55.
NOTA: O usuário deve estabilizar o espécime com sua mão não dominante usando um segundo conjunto de pinças #55. Diferentes áreas do espécime podem ser agarradas com a pinça estabilizadora durante toda a dissecção, se áreas críticas do espécime forem evitadas (por exemplo, não esmagar a cóclea). - Usando pinças #55, disseque a bula e a cápsula, desprendendo-as do osso circundante. Remova qualquer tecido mole restante da superfície da orelha interna.
- Transfira o espécime para uma placa de cultura de tecidos transparente contendo 1x PBS fria (solução salina tamponada com fosfato), pH 7,4, e coloque sob um escopo de dissecção (Figura 2B).
4. Dissecção VS
OBS: Com a prática, é possível dissecar o SV como uma peça longa que se assemelha a uma fita. O SV é frágil, portanto, se ele se quebrar em pedaços, estes podem ser armazenados juntos. Alternativamente, estes podem ser armazenados em poços rotulados separadamente de acordo com seu turno (por exemplo, basal, médio, apical).
- Se as fontes de luz do escopo de dissecção puderem ser movidas, coloque uma luz acima da placa e a segunda fonte de luz do lado, paralela à superfície dissecante. Isso permite um melhor contraste do tecido sob o osso coclear.
- Com pinça #55, segure o espécime pela porção vestibular com a cóclea voltada para cima.
- Usando pinça #55, perfurar o osso coclear no ápice.
NOTA: A pinça #5 é mais grossa que a #55 e pode ser usada para quebrar osso, mas o aumento do tamanho/força sacrifica a finura da pinça e a capacidade de manipular pequenos tecidos. Considere o uso de pinças feitas com um material como inox ou dumostar para evitar danos que podem ocorrer a pinças mais delicadas. Evite empurrar a pinça muito fundo sob o osso para evitar danificar a VS. - Usando pinça #55, raspe ao longo da espira apical (Figura 2C), aplicando força suave para quebrar pequenos pedaços da camada óssea externa. Levante suavemente o osso e desconecte-o da parede lateral.
NOTA: Pode ser útil pensar nesta dissecação como "remover tudo da VS", em vez de "dissecar a VS para fora da cóclea". - Continuar usando pinça #55 para remover fragmentos de osso coclear das espiras apical e média (Figura 2D,E). Empurrar suavemente a parede lateral, fritar e remover os pedaços da parede óssea em direção à curva média para expor a parede lateral das espiras apical e média.
- Continuando usando pinça #55, empurre suavemente a parede lateral do giro apical para o lado para expor o gânglio espiral. Destacar-se a parede lateral das espiras apical e média do gânglio espiral ao longo da camada externa de células ciliadas. Remova pedaços de gânglio espiral de dentro da cóclea.
NOTA: As pinças #55 são menores e oferecem uma vantagem ao manipular tecidos pequenos e delicados. Cuidados extras devem ser tomados para evitar dobrá-los ou danificá-los. - Para melhor acesso à parede lateral do giro basal, desprenda a cóclea da porção vestibular do osso temporal utilizando pinça #55. Coloque a pinça #55 na janela redonda e oval e empurre para baixo em direção ao vestíbulo. A cóclea vai se destacar. Remova a porção vestibular da orelha interna.
- Continuando usando a pinça #55, agora remova pedaços de osso coclear basal, começando pela área do giro médio. Empurre suavemente a camada lateral da parede sob o osso para desprendê-lo.
- Remova a parte basal mais distante da parede lateral por meio de fritura e puxando suavemente o tecido. O osso nesta região pode ser muito espesso para ser removido sem danificar o tecido mole abaixo.
- Agora, com a parte basal da parede lateral descolada, separe o máximo possível da parede lateral da cóclea. Isso pode ser feito traçando a pinça #55 ao longo da parede lateral. Escove suavemente a pinça entre o osso e a parede lateral restante. Isso pode ser feito até o ápice em uma única peça, se o usuário for experiente. Mova a parede lateral para PBS fresco.
NOTA: Embora pedaços maiores de VS possam ser mais fáceis de obter imagens, dada a natureza delicada dos tecidos, pedaços menores podem ser retirados (Figura 2F,G) e, dependendo do tamanho, também podem funcionar para aquisição de imagens. - Use pinça #55 para colocar a parede lateral plana. A VS deve ser visível como uma camada mais escura de tecido no lado interno da parede lateral.
NOTA: Os usuários podem encontrar, particularmente mais perto da extremidade apical, que parte do tecido da VS acidentalmente se desprende da parede lateral durante toda a dissecção. - Delicadamente pincelar a camada do VS para descolá-la da parede lateral em sua extremidade basal (Figura 2H). Afastar suavemente o VS descolado e mover a pinça em direção à extremidade apical da parede lateral, desprendendo o VS como uma fita longa, se possível (Figura 2I). Não aperte o SV com pinça para puxá-lo. Se o tecido for muito frágil para ser agarrado, ele pode ser coletado alternativamente usando uma colher de tecido, como uma cureta de calázio.
NOTA: A movimentação do SV deve ser sempre feita sob microscopia de luz para garantir que ele não seja perdido. Tenha sempre cuidado ao agarrar usando pinças devido ao risco de danos. Os usuários podem achar que o uso de cureta de calázio atenua o risco de danos ao tecido SV. Para sequenciamento de núcleo único, prossiga para a seção 5. Para imunomarcação de VS, prossiga para a seção 7.
5. Suspensão de núcleo único SV
NOTA: Este protocolo é adaptado para tecido SV especificamente a partir de um protocolo de suspensão de núcleo único publicado pelo fabricante. Plataformas de diferentes fabricantes podem ser utilizadas31. Dada a variação específica da plataforma, recomenda-se rever o protocolo específico do fabricante fornecido com o equipamento. Para obter resultados ótimos para sNuc-Seq e minimizar a degradação do RNA, quanto mais rápida a dissecção do tecido, melhor (recomendado dentro de 15-20 min da eutanásia). Pode ser útil eutanasiar um animal de cada vez e somente quando estiver pronto para dissecar. Ter várias pessoas trabalhando simultaneamente nas dissecções também pode eliminar o tempo de degradação (por exemplo, um pessoal de laboratório trabalhando na orelha esquerda enquanto outro trabalha na orelha direita).
- Se o tecido SV for usado para sNuc-Seq, colocar o tecido em tampão de lise refrigerado (Tris-HCl 10 mM, NaCl 10 mM, MgCl2 3 mM, P40 nonidet 0,005% em água livre de nucleases).
Observação : se o sequenciamento deve ser feito imediatamente após a dissecção, continue o protocolo. Se desejar pausar o protocolo, a preservação da VS é possível colocando-a em RNAlater. Conservar durante a noite a 4 °C, congelar rapidamente em azoto líquido e conservar a -80 °C até estar pronto a utilizar. Quando estiver pronto para uso, descongelar e lavar duas vezes em PBS por 5 min cada, em seguida, proceder à homogeneização (passo 5.2). - Homogeneizar o tecido em homogeneizador de 2 mL com 10-20 golpes de gelo.
NOTA: O cilindro de vidro entrará em contato manualmente com o fundo do tubo de vidro, fragmentando o SV. A VS é delicada, de modo que 20 golpes geralmente alcançam homogeneização bem-sucedida. - Lise o tecido no gelo por 25 min.
OBS: O tempo de lise varia de acordo com o tipo de tecido. Uma lise de 25 minutos no tecido da VS pode atingir uma baixa viabilidade celular (menos de 4%), mas o tempo pode ser adaptado se a viabilidade celular for muito alta (passo 5.8). - Filtrar através de um filtro de 30 μm e girar o filtrado a 500 x g durante 5 min a 4 °C.
- Retirar o sobrenadante e ressuspender o pellet celular em 1 mL de tampão de lavagem e ressuspensão dos núcleos (1x PBS, albumina de soro bovino [BSA] 1%, inibidor de RNase 0,2U/μL).
- Filtrar as células através de um filtro de 10 μm e centrifugar a 500 x g durante 5 min a 4 °C.
- Retirar o sobrenadante e ressuspender em 50 μL de tampão de lavagem e ressuspensão dos núcleos.
- Conte os núcleos usando um contador de células e coloração azul de tripano. Diluir 5 μL da suspensão celular em 50 μL de 1x PBS para contagem celular; A viabilidade deve ser mínima (3%-4%) neste momento. Se a viabilidade for maior, adaptar o protocolo para a etapa 5.3 (lise) e padronizar o tempo de lise para garantir a lise adequada das células.
NOTA: Uma alta viabilidade celular em uma única preparação de núcleo significa que há mais células intactas do que o desejado, e que a digestão adicional pode ser necessária. - Carregue a amostra com a densidade nuclear desejada no aparelho/chip do fabricante (consulte o guia do fabricante). As capturas de núcleos únicos já estão prontas.
NOTA: A partir de um camundongo adulto SV, geralmente são alcançados 50 μL da suspensão a uma concentração de 150.000 núcleos/mL.
6. Sequenciamento de núcleo único da VS
- Envie as amostras para a instalação principal para sequenciamento.
NOTA: Esta parte do protocolo segue as etapas gerais de (1) geração de emulsão de contas de gel (GEM) e código de barras, (2) limpeza pós-GEM-RT e amplificação de cDNA, e (3) construção de biblioteca de expressão gênica 3'. O restante do protocolo sNuc-Seq é relativamente longo, e recomenda-se que os leitores usem seu protocolo específico do fabricante. O guia do fabricante provavelmente descreverá as etapas com detalhes específicos e imagens que o acompanham. Também pode haver vídeos de "como fazer" no site do fabricante. Os conjuntos de dados gerados podem ser representados de forma reduzida dimensionalmente, como uma aproximação e projeção de variedade uniforme (UMAP; Gráfico 3). Muitos laboratórios utilizam um núcleo de sequenciamento que pode executar esse protocolo para os usuários.
7. Imunomarcação do VS e montagem tecidual
- Se o tecido for usado para imunomarcação, transferi-lo para uma placa de 24 poços, submersa em 200 μL de paraformaldeído (PFA) a 4% em 1x PBS, e incubar por 20 min à temperatura ambiente.
NOTA: É útil realizar toda a remoção de líquido, lavagem e imunomarcação sob um microscópio. A visualização durante a pipetagem do tecido garantirá que ele não seja perdido acidentalmente durante a remoção do líquido. Os volumes dos anticorpos e lavagens podem ser ajustados desde que o volume seja grande o suficiente para submergir o tecido da VS dentro da solução. - Após a etapa de fixação, remova o PFA realizando duas lavagens curtas em 1x PBS (aproximadamente 500 μL) a 4 °C por 5 min cada em um agitador orbital a baixa (30-50) RPM. Se armazenar, o tecido pode ser armazenado em 1x PBS a 4 °C.
- Remover o PBS e permeabilizar e bloquear por um mínimo de 1 h à temperatura ambiente em aproximadamente 300 μL de solução de PBS-T (0,05 Tween20 em 1x PBS com 10% de soro fetal bovino).
NOTA: Os anticorpos primários e secundários devem ser diluídos nesta solução de bloqueio. - Manchar o tecido com anticorpo primário de acordo com as especificações do anticorpo específico usado, geralmente durante a noite a 4 °C . Remova o PBS restante e adicione o anticorpo primário diluído.
NOTA: A diluição deve ser escolhida com base nas sugestões do fabricante, dados publicados, experiência anterior, etc. Normalmente, a primeira concentração a ser testada é uma diluição de 1:100-200. Para o exemplo apresentado neste trabalho, os anticorpos GS-IB4 e DAPI foram diluídos a 1:200. Se houver coloração para mais de uma proteína, vários anticorpos primários podem ser combinados na mesma solução, desde que cada anticorpo primário tenha um hospedeiro diferente para evitar a reatividade cruzada de anticorpos secundários. - Lave o anticorpo primário do tecido usando aproximadamente 500 μL de 1x PBS duas vezes por 10 min cada em um agitador orbital a baixas RPM.
NOTA: Continue a garantir que o tecido SV esteja submerso na solução e não preso na lateral do poço. - Coloração com um anticorpo secundário de acordo com as especificações do anticorpo específico usado, geralmente por 2 h à temperatura ambiente em um agitador orbital a baixas RPM. Cubra a placa de 24 poços para que o anticorpo secundário marcado fluorescentemente esteja protegido da luz.
NOTA: Se for necessário mais de um anticorpo secundário, combine os anticorpos secundários na mesma solução. Certifique-se de evitar a rotulagem cruzada. - Lave o anticorpo secundário do tecido usando aproximadamente 500 μL de 1x PBS quatro vezes por 5 min cada em um agitador orbital a baixas RPM. Mantenha a placa de 24 poços coberta para protegê-la da luz.
- Prepare a microlâmina maior (75 mm x 25 mm) colocando duas pequenas faixas de cola ao longo do eixo de 25 mm, um pouco menor do que a tampa de vidro menor de 18 mm x 18 mm. Coloque uma gota de reagente de montagem (aproximadamente 50 μL) entre as estrias de cola.
NOTA: A cola cria uma pequena quantidade de espaço vertical para que, quando a segunda lamínula for colocada na parte superior, a amostra de tecido SV possa existir com segurança, mas continuar no lugar. Enquanto a espessura da estria é de 30-40 mícrons, a compressão do tecido entre as superfícies de vidro deve ser evitada para preservar a morfologia. Alternativamente, fita transparente também pode ser usada. - Usando pinça #55, pegue o mínimo de tecido possível em uma extremidade da VS e transfira do PBS para a gota do reagente de montagem na microlâmina maior (75 mm x 25 mm). Coloque uma extremidade de uma tampa de vidro menor (18 mm x 18 mm) na lâmina onde uma faixa de cola foi colocada e solte suavemente para evitar a criação de bolhas de ar. A lamínula cairá para a outra faixa de cola e cobrirá o tecido SV.
- Sele o suporte passando uma gota de esmalte transparente em cada canto do suporte. Rotule o espécime de acordo com a tampa de vidro para longe do campo de visualização. Está pronto para a microscopia confocal (Figura 4).
- Visualize o tecido SV usando um microscópio de dissecção para garantir que ele esteja plano e não perto de bolhas de ar. Se o tecido SV não estiver orientado corretamente, o usuário pode tentar empurrar bolhas de ar para fora ou remover cuidadosamente a tampa de vidro menor e reposicionar o SV. Isso deve ser feito com cuidado para evitar quebrar as tampas de vidro.
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Representative Results
Apresentamos um método para isolar o VS a ser usado para sNuc-Seq ou imunomarcação. A anatomia relevante (Figura 1) da cóclea em relação à VS pode ajudar o usuário a entender melhor a organização da VS e as etapas do protocolo de dissecção.
Cada passo dessa microdissecção de VS de um mouse P30 é detalhado no vídeo associado, e instantâneos dos principais passos dessa dissecção e isolamento de VS são apresentados na Figura 2.
O sNuc-Seq é útil na investigação do perfil transcricional das várias células da VS heterogênea. Uma maneira de visualizar isso é agrupando em um UMAP 2D (Figura 3). O conjunto de dados gerado a partir do sNuc-Seq pode ser avaliado usando diferentes técnicas de análise de dados, mais detalhadas na discussão.
A montagem completa do SV com imunomarcação GS-IB4 e DAPI, juntamente com fluorescência Kcnj10-ZsGreen, são apresentadas na Figura 4. Usando a florescência, a VS pode ser visualizada após a remoção dos tecidos circundantes e montagem. Nestes camundongos, ZsGreen é expresso particularmente nas células intermediárias SV. A vasculatura da VS pode ser visualizada em vermelho (células endoteliais, GS-IB4).
Figura 1: Esquema da heterogeneidade e organização celular da estria vascular. Heterogeneidade e organização celular da estria vascular. Esquema da estria vascular (VS) e sua relação com estruturas da cóclea. O VS é composto por três camadas de células e é responsável por gerar EP e alta concentração de potássio na escala média contendo endolinfa. A relação entre as células marginais, intermediárias e basais é demonstrada com as projeções basaterais marginais estendendo para interdigitar com as células intermediárias, que possuem projeções celulares bidirecionais que interdigitam com as células marginais e basais. Além desses tipos celulares, outros tipos celulares, incluindo células fusiformes (amarelas), células endoteliais, pericitos e macrófagos (não mostrados) estão presentes na VS. Utilizado com permissão de Korrapati et al.30. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Dissecção da cóclea de camundongos adultos maior ou igual ao 30º dia pós-natal (P30+). (A) Espécime durante a extração da orelha interna do osso temporal circundante durante a etapa 3.2. O ouvido interno é delineado em roxo. (B) Espécime durante a etapa 4.2 mostrando a superfície da cóclea e o VS pigmentado subjacente. (C) Espécime durante o passo 4.4 mostrando osso retirado da espira apical e VS exposto (seta amarela). (D) Espécime durante a etapa 4.5 mostrando a cóclea com mais osso retirado dos giros apical e médio. (E) Peça cirúrgica durante o passo 4.5 mostrando a remoção do osso que recobre a espira média, mostrando a VS subjacente (seta amarela). (F) Exemplo de pedaços menores de VS (seta amarela) e da parede lateral (seta azul) durante o passo 4.10. (G) Exemplo de fluorescente ZsGreen SV enquanto a parede lateral restante permanece escura. Kcnj10-ZsGreen é particularmente expresso nas células intermediárias do SV. (H) Exemplo de pedaços maiores de VS (seta amarela) e parede lateral (azul) sendo separados durante o passo 4.12. (I) A VS separou-se totalmente da parede lateral durante o passo 4.12. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Gráfico UMAP de conjuntos de dados sNuc-Seq de uma estria vascular adulta tratada com RNAlater. Amostras preservadas com tratamento RNAlater de tecido SV adulto com subsequente isolamento de núcleos foram agrupadas por um método de agrupamento baseado em modularidade com o algoritmo de otimização de Leiden e visualizadas de forma dimensionalmente reduzida por um gráfico UMAP 2D. Cada ponto representa uma única célula, e células com perfis transcricionais semelhantes são agrupadas. Os tipos celulares são coloridos com base em sua expressão de genes conhecidos expressos por tipos celulares adultos SV. As amostras foram armazenadas em RNAlater por no máximo 6 meses. A VS de cerca de cinco camundongos CBA/J P30 foi usada para gerar esse conjunto de dados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Gráfico 4. Stria vascularis toda a montagem a partir de um rato P30 Kcnj10-ZsGreen. Imagem confocal da montagem completa de SV a partir de um camundongo P30, demonstrando a expressão de ZsGreen nas células intermediárias, células endoteliais marcadas com GS-IB4 (vermelho) e núcleos marcados com DAPI (branco). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Antes do advento do sequenciamento de célula única, muitos pesquisadores usaram a análise de tecido em massa, que só tornou possível analisar transcriptomas médios entre células. Em particular, unicelular e sNuc-Seq permitiram isolar o transcriptoma de uma única célula ou núcleo único, respectivamente32. Nesse caso, transcriptomas de núcleo único podem ser identificados para células marginais, intermediárias e basais, bem como células fusiformes30. Isso permite a investigação da heterogeneidade transcricional entre os tipos celulares de SV e pode ser usado no futuro para investigar a contribuição desses tipos celulares para a função de SV, incluindo a geração e manutenção de EP. Os conjuntos de dados gerados usando sNuc-Seq podem ser exibidos de forma dimensionalmente reduzida para facilitar a compreensão das diferenças transcricionais gerais e comparar diferentes populações celulares usando um gráfico UMAP Figura 4. Existem inúmeras maneiras de conduzir análises de bioinformática para a interpretação de conjuntos de dados sNuc-Seq. Estes incluem, mas não estão limitados a: análise de expressão diferencial, inferência e agrupamento de redes regulatórias de célula única (SCENIC), construção de gráfico de violino de mapa de calor ou grin e análise de regulon18. Outras técnicas de análise computacional para o sequenciamento de RNA de célula única são semelhantes ao sNuc-Seq, e são discutidas em mais detalhes nas revisões de Hwang et al.32, Shafer33 e Chen et al.34.
A outra grande aplicação dessa técnica de dissecção é a imunomarcação para melhor estudar estruturas selecionadas dentro da VS. Podemos observar isso no cenário de uma montagem completa da VS que foi obtida por microscopia confocal (Figura 3). Os núcleos de todas as células são visualizados com marcação DAPI. Os capilares são vistos via coloração de células endoteliais com GS-IB4 em vermelho. Células intermediárias, neste caso, foram geneticamente modificadas usando um promotor específico de célula intermediária para expressar ZsGreen.
As limitações do sNuc-Seq incluem: (1) falta de informação espacial, (2) vieses contra populações de células imunes e (3) exclusão de RNA citoplasmático. Técnicas de transcriptômica espacial podem fornecer informações mais específicas sobre as subpopulações celulares dentro do tecido35. Dadas as diferenças de protocolo entre o sNuc-Seq e o sequenciamento de RNA de célula única, tais como dissociação e armazenamento tecidual, o perfil transcricional gerado pelo sNuc-Seq pode enviesar contra células imunes enquanto é mais poderoso na caracterização de tipos celulares aderidos36. Além disso, o sequenciamento de RNA de célula única inclui RNA citoplasmático, como o RNA mitocondrial, enquanto o sNuc-Seq não. Apesar desses casos de diferenças transcricionais entre os dois métodos, tem sido demonstrado que, em geral, o sNuc-Seq tem um perfil transcricional semelhante ao sequenciamento de RNA de célula única37, e no SV em particular30.
Para uma microdissecção bem-sucedida, há várias etapas críticas a serem observadas. Nos primeiros passos, deve-se extrair adequadamente a orelha interna para evitar o esmagamento da cóclea subjacente. A observação da extração adequada do osso temporal é mostrada na Figura 2A. Uma vez que a cóclea esteja adequadamente exposta, deve-se tomar cuidado para raspar suavemente e quebrar o osso coclear para expor a parede lateral subjacente e a VS. Uma vez que a parede lateral e a VS são extraídas com sucesso, o usuário deve desprender cuidadosamente a VS da parede lateral. Deve-se aplicar força suficiente no plano correto para arrancar a VS da parede lateral, evitando danos à frágil VS. Para a microdissecção de VS, pode ser útil pensar em "dissecar outras estruturas longe da VS", em vez de "dissecar a VS para fora da cóclea".
Este protocolo pode ser modificado para diferentes idades de camundongos e para diferentes espécies de mamíferos, como ratos. Para camundongos mais jovens, os tecidos serão diferentes em textura e as estruturas serão menores em geral. Para diferentes espécies de mamíferos, a anatomia coclear será relativamente semelhante, com o tamanho do animal determinando a maior parte da diferença.
Em geral, as desvantagens deste protocolo são semelhantes a outras técnicas de microdissecção coclear38. Isolar o delicado SV pode ser tecnicamente desafiador e pode ser quebrado em pedaços menores.
Esta técnica não é ideal para salvar o órgão de Corti para toda a montagem, pois muitas vezes é danificado com este protocolo. Existem outras técnicas de dissecção voltadas especificamente para a preservação do órgão de Corti para montagem total e imunomarcação38, mas estas têm suas próprias desvantagens, considerando que a sNuc-Seq deve ser feita com amostras frescas para evitar degradação do RNA, e não no contexto de fixação e descalcificação tecidual.
Com o tempo e a repetição, os usuários ficarão mais confortáveis com este protocolo de microdissecção da VS.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Esta pesquisa foi apoiada em parte pelo Programa de Pesquisa Intramural do NIH, NIDCD para M.H. (DC000088)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10-µm filter (Polyethylenterephthalat) | PluriSelect | #43-50010-01 | Filter tissue during sNuc-Seq |
| 18 x 18 mm cover glass | Fisher Scientific | 12-541A | Cover slip to mount SV |
| 30-µm filter (Polyethylenterephthalat) | PluriSelect | #43-50030-03 | Filter tissue during sNuc-Seq |
| 75 x 25 mm Superfrost Plus/Colorforst Plus Microslide | Daigger | EF15978Z | Microslide to mount SV on |
| C57BL/6J Mice | The Jackson Laboratory | RRID: IMSR_JAX:000664 | General purpose mouse strain that has pigment more easily seen in the intermediate cells of the SV. |
| Cell Counter | Logos Biosystems | L20001 | Used for cell counting |
| Chalizon curette 5'', size 3 2.5 mm | Biomedical Research Instruments | 15-1020 | Used to transfer SV |
| Chromium Next GEM single Cell 3' GEM Kit v3.1 | Chromium | PN-1000141 | Generates single cell 3' gene expression libraries |
| Clear nail polish | Fisher Scientific | NC1849418 | Used for sealing SV mount |
| Corning Falcon Standard Tissue Culture Dishes, 24 well | Corning | 08-772B | Culture dish used to hold specimen during dissection |
| DAPI | Invitrogen | D1306, RRID: AB_2629482 | Stain used for nucleus labeling |
| Dounce homogenizer | Sigma-Aldrich | D8938 | Used to homogenize tissue for sNuc-seq |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | General forceps for dissection |
| Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | Forceps with fine tip that makes SV manipulation easier |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher | 16000044 | Used for steps of sNuc-Seq |
| Glue stick | Fisher Scientific | NC0691392 | Used for mounting SV |
| GS-IB4 Antibody | Molecular Probes | I21411, RRID: AB-2314662 | Antibody used for capillary labeling |
| KCNJ10-ZsGreen Mice | n/a | n/a | Transgenic mouse that expresses KCNJ10-ZsGreen, partiularly in the intermediate cells of the SV. |
| MgCl2 | ThermoFisher | AM9530G | Used for steps of sNuc-Seq |
| Mounting reagent | ThermoFisher | #S36940 | Mounting reagent for SV |
| Multiwell 24 well plate | Corning | #353047 | Plate used for immunostaining |
| NaCl | ThermoFisher | AAJ216183 | Used for steps of sNuc-Seq |
| Nonidet P40 | Sigma-Aldrich | 9-16-45-9 | Used for steps of sNuc-Seq |
| Nuclease free water | ThermoFisher | 4387936 | Used for steps of sNuc-Seq |
| Orbital shaker | Silent Shake | SYC-2102A | Used for steps of immunostaining |
| PBS | ThermoFisher | J61196.AP | Used for steps of immunostaining and dissection |
| RNA Later | Invitrogen | AM7021 | Used for preservation of SV for sNuc-Seq |
| Scizzors | Fine Science Tools | 14058-09 | Used for splitting mouse skull |
| Tris-HCl | Sigma-Aldrich | 15506017 | Used for steps of sNuc-Seq |
| Trypan blue stain | Gibco | 15250061 | Used for cell counting |
| Tween20 | ThermoFisher | AAJ20605AP | Used for steps of sNuc-Seq |
| Zeiss STEMI SV 11 Apo stereomicroscope | Zeiss | n/a | Microscope used for dissections |
References
- Bosher, S. K., Warren, R. L. Observations on the electrochemistry of the cochlear endolymph of the rat: a quantitative study of its electrical potential and ionic composition as determined by means of flame spectrophotometry. Proceedings of the Royal Society of London. Series B. Biological Sciences. 171 (1023), 227-247 (1968).
- Patuzzi, R. Ion flow in stria vascularis and the production and regulation of cochlear endolymph and the endolymphatic potential. Hearing Research. 277 (1-2), 4-19 (2011).
- Wangemann, P. K+ cycling and the endocochlear potential. Hearing Research. 165 (1-2), 1-9 (2002).
- Adachi, N., et al. The mechanism underlying maintenance of the endocochlear potential by the K+ transport system in fibrocytes of the inner ear. The Journal of Physiology. 591 (18), 4459-4472 (2013).
- Hibino, H., Nin, F., Tsuzuki, C., Kurachi, Y. How is the highly positive endocochlear potential formed? The specific architecture of the stria vascularis and the roles of the ion-transport apparatus. Pflugers Archiv. 459 (4), 521-533 (2010).
- Lang, F., Vallon, V., Knipper, M., Wangemann, P. Functional significance of channels and transporters expressed in the inner ear and kidney. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 293 (4), C1187-C1208 (2007).
- Liu, W., Schrott-Fischer, A., Glueckert, R., Benav, H., Rask-Andersen, H. The human "cochlear battery"-claudin-11 barrier and ion transport proteins in the lateral wall of the cochlea. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 239 (2017).
- Marcus, D. C., Wu, T., Wangemann, P., Kofuji, P. KCNJ10 (Kir4.1) potassium channel knockout abolishes endocochlear potential. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 282 (2), C403-C407 (2002).
- Spicer, S. S., Schulte, B. A. Differentiation of inner ear fibrocytes according to their ion transport related activity. Hearing Research. 56 (1-2), 53-64 (1991).
- Wangemann, P., Liu, J., Marcus, D. C. Ion transport mechanisms responsible for K+ secretion and the transepithelial voltage across marginal cells of stria vascularis in vitro. Hearing Research. 84 (1-2), 19-29 (1995).
- Yoshida, T., et al. The unique ion permeability profile of cochlear fibrocytes and its contribution to establishing their positive resting membrane potential. Pflugers Archiv. 468 (9), 1609-1619 (2016).
- Johns, J. D., Adadey, S. M., Hoa, M. The role of the stria vascularis in neglected otologic disease. Hearing Research. 428, 108682 (2023).
- Kim, J., Ricci, A. J. In vivo real-time imaging reveals megalin as the aminoglycoside gentamicin transporter into cochlea whose inhibition is otoprotective. Proceedings of the National Academy of Sciences. 119 (9), e2117846119 (2022).
- Zdebik, A. A., Wangemann, P., Jentsch, T. J. Potassium ion movement in the inner ear: insights from genetic disease and mouse models. Physiology. 24, 307-316 (2009).
- Chen, J., Zhao, H. B. The role of an inwardly rectifying K+ channel (Kir4.1) in the inner ear and hearing loss. Neuroscience. 265, 137-146 (2014).
- Steel, K. P., Barkway, C. Another role for melanocytes: their importance for normal stria vascularis development in the mammalian inner ear. Development. 107 (3), 453-463 (1989).
- Ito, T., Nishio, A., Wangemann, P., Griffith, A. J. Progressive irreversible hearing loss is caused by stria vascularis degeneration in an Slc26a4-insufficient mouse model of large vestibular aqueduct syndrome. Neuroscience. 310, 188-197 (2015).
- Gu, S., et al. Characterization of rare spindle and root cell transcriptional profiles in the stria vascularis of the adult mouse cochlea. Scientific Reports. 10 (1), 18100 (2020).
- Gow, A., et al. Deafness in claudin 11-null mice reveals the critical contribution of basal cell tight junctions to stria vascularis function. The Journal of Neuroscience. 24 (32), 7051-7062 (2004).
- Chang, Q., et al. Virally mediated Kcnq1 gene replacement therapy in the immature scala media restores hearing in a mouse model of human Jervell and Lange-Nielsen deafness syndrome. EMBO Molecular Medicine. 7 (8), 1077-1086 (2015).
- Faridi, R., et al. Mutational and phenotypic spectra of KCNE1 deficiency in Jervell and Lange-Nielsen Syndrome and Romano-Ward Syndrome. Human Mutation. 40 (2), 162-176 (2019).
- Wangemann, P., et al. Loss of KCNJ10 protein expression abolishes endocochlear potential and causes deafness in Pendred syndrome mouse model. BMC Medicine. 2, 30 (2004).
- Kitajiri, S. -I., et al. Expression patterns of claudins, tight junction adhesion molecules, in the inner ear. Hearing Research. 187 (1-2), 25-34 (2004).
- Jagger, D. J., Nevill, G., Forge, A. The membrane properties of cochlear root cells are consistent with roles in potassium recirculation and spatial buffering. Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 11 (3), 435-448 (2010).
- Ito, T., Kurata, N., Fukunaga, Y.
- Zhang, J., et al. VEGFA165 gene therapy ameliorates blood-labyrinth barrier breakdown and hearing loss. JCI Insight. 6 (8), e143285 (2021).
- Shi, X. Pathophysiology of the cochlear intrastrial fluid-blood barrier (review). Hearing Research. 338, 52-63 (2016).
- Gu, S., et al. Identification of potential Meniere's disease targets in the adult stria vascularis. Frontiers in Neurology. 12, 630561 (2021).
- Fischer, J., Ayers, T. Single nucleus RNA-sequencing: how it's done, applications and limitations. Emerging Topics in Life Sciences. 5 (5), 687-690 (2021).
- Korrapati, S., et al. Single cell and single nucleus RNA-Seq reveal cellular heterogeneity and homeostatic regulatory networks in adult mouse stria vascularis. Frontiers in Molecular Neuroscience. 12, 316 (2019).
- Pyle, M. P., Hoa, M. Applications of single-cell sequencing for the field of otolaryngology: A contemporary review. Laryngoscope Investigative Otolaryngology. 5 (3), 404-431 (2020).
- Hwang, B., Lee, J. H., Bang, D. Single-cell RNA sequencing technologies and bioinformatics pipelines. Experimental & Molecular Medicine. 50 (8), 1-14 (2018).
- Shafer, M. E. R. Cross-species analysis of single-cell transcriptomic data. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 175 (2019).
- Chen, G., Ning, B., Shi, T. Single-cell RNA-Seq technologies and related computational data analysis. Frontiers in Genetics. 10, 317 (2019).
- Longo, S. K., Guo, M. G., Ji, A. L., Khavari, P. A. Integrating single-cell and spatial transcriptomics to elucidate intercellular tissue dynamics. Nature Reviews Genetics. 22 (10), 627-644 (2021).
- Kim, N., Kang, H., Jo, A., Yoo, S. A., Lee, H. O. Perspectives on single-nucleus RNA sequencing in different cell types and tissues. Journal of Pathology and Translational Medicine. 57 (1), 52-59 (2023).
- Grindberg, R. V., et al.
- Montgomery, S. C., Cox, B. C. Whole mount dissection and immunofluorescence of the adult mouse cochlea. Journal of Visuazlied Experiments. (107), e53561 (2016).
