Summary
Stria vascularis er avgjørende for genereringen av endocochlear potensial. Her presenterer vi disseksjonen av den voksne musen stria vascularis for enkeltkjernesekvensering eller immunfarging.
Abstract
Endocochlear potensial, som genereres av stria vascularis, er avgjørende for å opprettholde et miljø som bidrar til passende hårcellemekanotransduksjon og til slutt hørsel. Patologier av stria vascularis kan resultere i nedsatt hørsel. Disseksjon av den voksne stria vascularis muliggjør fokusert enkeltkjernefangst og påfølgende enkeltkjernesekvensering og immunfarging. Disse teknikkene brukes til å studere stria vascularis patofysiologi på enkeltcellenivå.
Enkeltkjernesekvensering kan brukes i innstillingen av transkripsjonsanalyse av stria vascularis. I mellomtiden fortsetter immunfarging å være nyttig for å identifisere spesifikke populasjoner av celler. Begge metodene krever riktig stria vaskularis disseksjon som en forutsetning, noe som kan vise seg å være teknisk utfordrende.
Introduction
Sneglehuset består av tre væskefylte kamre, scala vestibuli, scala media og scala tympani. Scala vestibuli og scala tympani inneholder begge perilymfe, som har en høy konsentrasjon av natrium (138 mM) og en lav konsentrasjon av kalium (6,8 mM)1. Scalamediet inneholder endolymfe, som har en høy konsentrasjon av kalium (154 mM) og en lav konsentrasjon av natrium (0,91 mM)1,2,3. Denne forskjellen i ionkonsentrasjon kan refereres til som endocochlear potensial (EP), og genereres primært ved bevegelse av kaliumioner gjennom forskjellige ionkanaler og gapkryss i stria vascularis (SV) langs sideveggen av cochlea 4,5,6,7,8,9,10,11 . SV er et heterogent, sterkt vaskularisert vev som strekker det mediale aspektet av cochleas laterale vegg og inneholder tre hovedcelletyper: marginale, mellomliggende og basale celler12 (figur 1).
Marginale celler er forbundet med tette kryss for å danne den mest mediale overflaten av SV. Den apikale membranen vender mot endolymfen i scalamediet og bidrar til kaliumiontransport inn i endolymfen ved hjelp av forskjellige kanaler, inkludert KCNE1 / KCNQ1, SLC12A2 og Na + -K + -ATPase (NKA) 5,10,13,14. Mellomliggende celler er pigmenterte celler som ligger mellom marginale og basale celler og letter kaliumtransport gjennom SV ved hjelp av KCNJ10 (Kir 4.1)15,16. Basalceller ligger i nærheten av sideveggen av cochlea og er nært forbundet med fibrocytter i spiralligamentet for å fremme kaliumgjenvinning fra perilymfen12. Patologi i SV har vært involvert i en rekke otologiske lidelser17,18. Mutasjoner i gener uttrykt i de store SV-celletypene, som Kcnq1, Kcne1, Kcnj10 og Cldn11, kan forårsake døvhet og SV-dysfunksjon, inkludert tap av EP 19,20,21,22,23. I tillegg til de tre hovedcelletypene er det andre mindre studerte celletyper i SV, som spindelceller 22, rotceller12,24, makrofager 25, pericytter 26 og endotelceller 27, som har ufullstendig definerte roller som involverer ionisk homeostase og generering av EP 28.
Sammenlignet med bulk RNA-sekvensering, gir enkeltkjerner RNA-sekvensering (sNuc-Seq) informasjon om celleheterogenitet, snarere enn et gjennomsnitt av mRNA over en gruppe celler29, og kan være spesielt nyttig når man studerer den heterogene SV30. For eksempel har sNuc-Seq produsert transkripsjonsanalyse som antyder at det kan være en rolle for spindel og rotceller i EP-generasjon, hørselstap og Ménières sykdom18. Videre transkripsjonskarakterisering av de ulike SV-celletypene kan gi oss uvurderlig informasjon om patofysiologien bak ulike mekanismer og subtyper av SV-relatert hørselsfluktuasjon og hørselstap. Høstingen av disse delikate indre ørestrukturene er av avgjørende betydning for optimal vevsanalyse.
I denne studien er mikrodisseksjonstilnærmingen for å få tilgang til og isolere stria vascularis fra det voksne musecochlea for sNuc-Seq eller immunfarging beskrevet. Disseksjon av den voksne musen SV er nødvendig for å forstå ulike SV-celletyper og videre karakterisere deres rolle i hørselen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøk og prosedyrer ble utført i henhold til protokoller godkjent av Animal Care and Use Committee ved National Institute of Neurological Diseases and Stroke og National Institute on Deafness and Other Communication Disorders, National Institutes of Health. Alle eksperimentelle protokoller ble godkjent av Animal Care and Use Committee ved National Institute of Neurological Diseases and Stroke og National Institute on Deafness and Other Communication Disorders, National Institutes of Health. Alle metoder ble utført i samsvar med relevante retningslinjer og forskrifter fra Animal Care and Use Committee of National Institute of Neurological Diseases and Stroke og National Institute on Deafness and Other Communication Disorders, National Institutes of Health.
1. Avliving av dyr
- Bruk C57BL/6J eller Kcnj10-ZsGreen transgene mus, postnatal dag 30+ (P30+), som veier mellom 15-20 g.
- Avlive en voksen mus (alder P30 eller eldre) ved hjelp av en godkjent protokoll (her CO2 -kvelning). Utfør halshugging som et sekundært trinn.
MERK: Ved immunfarging kan noen antistoffer ha bakgrunnssignal på grunn av uspesifikk binding til blod i kapillærene til SV. Hjerteperfusjon med fiksativ kan løse dette problemet ved å fjerne blod fra kapillærene til SV. Imidlertid kan de fleste antistoffer oppnå gode resultater uten denne metoden, og det vil ikke bli dekket i denne protokollen.
2. Utsette benete labyrint
- Rengjør musen ved å spraye med 70% etanol og tørke av med et papirhåndkle. Vær spesielt oppmerksom på hodeområdet for å redusere risikoen for forurensning. Fjern huden fra skallen ved å trekke huden mot nesen.
- Bruk skarp saks, del skallen langs midtsagittalplanet for å skille venstre og høyre del.
- Fjern hjernen fra skallen for å avsløre den benete labyrinten.
3. Utvinning av det indre øret
- Identifiser det indre øret i tinningbenet (figur 2A) og skrap bort hjernenervene ved hjelp av #55 tang.
MERK: Brukeren bør stabilisere prøven med sin ikke-dominerende hånd ved hjelp av et andre sett med # 55 tang. Ulike områder av prøven kan gripes med stabiliserende tang gjennom hele disseksjonen hvis kritiske områder av prøven unngås (f.eks. ikke knus cochlea). - Bruk # 55 tang, dissekere ut bulla og kapsel, løsne dem fra omkringliggende bein. Fjern eventuelt gjenværende bløtvev fra den indre øreoverflaten.
- Overfør prøven til en klar vevskulturskål som inneholder 1x kald PBS (fosfatbufret saltvann), pH 7,4, og sett under et disseksjonsskop (figur 2B).
4. SV-disseksjon
MERK: Med øvelse er det mulig å dissekere SV som ett langt stykke som ligner et bånd. SV er skjør, så hvis den går i stykker, kan disse lagres sammen. Alternativt kan disse lagres i separat merkede brønner i henhold til deres tur (f.eks. basal, midtre, apikal).
- Hvis disseksjonsomfangets lyskilder kan flyttes, plasser ett lys over fatet og den andre lyskilden fra siden, parallelt med dissekeringsoverflaten. Dette muliggjør en bedre kontrast av vevet under cochleabenet.
- Bruk #55 tang, hold prøven ved den vestibulære delen med sneglehuset vendt oppover.
- Bruk # 55 tang, pierce gjennom cochlear bein på toppunktet.
MERK: # 5 tang er tykkere enn # 55 og kan brukes til å bryte bein, men økningen i størrelse / styrke ofrer finheten i tangen og evnen til å manipulere små vev. Vurder å bruke tang laget av et materiale som inox eller dumostar for å unngå skade som kan oppstå på mer delikate tang. Unngå å presse tangen for dypt under beinet for å unngå å skade SV. - Bruk #55 tang, skrap langs den apikale svingen (figur 2C), og bruk forsiktig kraft for å bryte bort små biter av det ytre beinlaget. Løft forsiktig beinet og løsne det fra sideveggen.
MERK: Det kan være nyttig å tenke på denne disseksjonen som å "fjerne alt vekk fra SV", i stedet for å "dissekere SV ut av sneglehuset". - Fortsett å bruke #55 tang for å fjerne cochleabeinbiter fra apikale og midtre svinger (figur 2D,E). Skyv forsiktig ned sideveggen, lirk og fjern beinveggbiter mot midtsvingen for å avsløre sideveggen i apikale og midtre svinger.
- Fortsett å bruke # 55 tang, forsiktig skyve den apikale sving sideveggen til side for å avsløre spiral ganglion. Løsne sideveggen av apikale og midtre svinger fra spiralganglion langs det ytre hårcellelaget. Fjern biter av spiralganglion fra innsiden av cochlea.
MERK: # 55 tang er mindre og gir en fordel når du manipulerer små og delikate vev. Ekstra forsiktighet bør utvises for å unngå å bøye eller skade dem. - For å få bedre tilgang til sideveggen i basalsvingen, løsne cochlea fra den vestibulære delen av tinningbenet ved hjelp av #55 tang. Sett tangen #55 inn i det runde og ovale vinduet og skyv ned mot vestibylen. Sneglehuset løsner. Fjern den vestibulære delen av det indre øret.
- Fortsett å bruke # 55 tang, nå fjerne biter av basal cochlea bein, starter fra midten sving området. Skyv forsiktig sideveggslaget under benet for å løsne det.
- Fjern den lengste basale delen av sideveggen ved å lirke og forsiktig trekke vevet. Benet i denne regionen kan være for tykt til å bli fjernet uten å skade bløtvevet under.
- Nå, med den basale delen av sideveggen løsrevet, skille så mye av sideveggen fra cochlea som mulig. Dette kan gjøres ved å spore #55 tangen langs sideveggen. Børst forsiktig tangen mellom beinet og den gjenværende sideveggen. Dette kan gjøres helt til toppunktet i ett stykke hvis brukeren er erfaren. Flytt sideveggen til fersk PBS.
MERK: Selv om større biter av SV kan være lettere å avbilde, gitt vevets delikate natur, kan mindre stykker tas (figur 2F, G), og avhengig av størrelsen kan de også fungere for avbildning. - Bruk #55 tang for å legge sideveggen flat. SV skal være synlig som et mørkere lag av vev på innsiden av sideveggen.
MERK: Brukere kan finne, spesielt nærmere den apikale enden, at noe av SV-vevet tilfeldigvis løsner fra sideveggen gjennom disseksjonen. - Lirk SV-laget forsiktig for å løsne det fra sideveggen i basalenden (figur 2H). Skyv forsiktig til side den frittliggende SV og flytt tangen videre mot den apikale enden av sideveggen, og løsne SV som ett langt bånd hvis mulig (figur 2I). Ikke klem SV med tang for å trekke den. Hvis vevet er for skjørt til å gripes, kan det alternativt samles inn ved hjelp av en vevskule, for eksempel en chalazioncurette.
MERK: Flytting av SV bør alltid gjøres under lysmikroskopi for å sikre at den ikke går tapt. Vær alltid forsiktig når du tar tak i tang på grunn av risikoen for skade. Brukere kan oppleve at bruk av chalazion curette reduserer risikoen for skade på SV-vev. For enkeltkjernesekvensering, fortsett til seksjon 5. For SV-immunfarging, gå videre til avsnitt 7.
5. SV enkeltkjerneoppheng
MERK: Denne protokollen er tilpasset SV-vev spesifikt fra en publisert produsents enkeltkjerneopphengsprotokoll. Plattformer fra forskjellige produsenter kan brukes31. Gitt plattformspesifikk variasjon, anbefales det å gjennomgå den produsentspesifikke protokollen som følger med utstyret. For å oppnå optimale resultater for sNuc-Seq og minimere RNA-nedbrytning, jo raskere vevsdisseksjon jo bedre (anbefales innen 15-20 minutter fra eutanasi). Det kan være nyttig å avlive ett dyr om gangen og bare når det er klart til å dissekere. Å ha flere personer samtidig arbeider på disseksjoner kan også eliminere nedbrytningstid (f.eks en lab personell som arbeider på venstre øre mens en annen arbeider på høyre øre).
- Hvis SV-vevet skal brukes til sNuc-Seq, plasser vevet i kjølt lysisbuffer (10 mM Tris-HCl, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 0,005% nonidet P40 i nukleasefritt vann).
MERK: Hvis sekvensering skal gjøres umiddelbart etter disseksjon, fortsett protokollen. Hvis det er ønskelig å sette protokollen på pause, er SV-bevaring mulig ved å plassere SV i RNAsenere. Oppbevares over natten ved 4 °C, deretter blitsfryses i flytende nitrogen og oppbevares ved -80 °C til den skal brukes. Når du er klar til bruk, tine og vaske to ganger i PBS i 5 minutter hver, og fortsett deretter med homogenisering (trinn 5.2). - Homogeniser vevet i en 2 ml dounce homogenisator med 10-20 slag på is.
NOTAT: Glasssylinderen kommer i manuell kontakt med bunnen av glassrøret, og fragmenterer SV. SV er delikat, så 20 slag oppnår vanligvis vellykket homogenisering. - Lyse vevet på is i 25 min.
MERK: Lysistiden varierer i henhold til vevstypen. En 25 minutters lysis i SV-vev kan gi lav cellelevedyktighet (mindre enn 4 %), men tiden kan tilpasses hvis cellens levedyktighet er for høy (trinn 5.8). - Filtrer gjennom et 30 μm filter og roter filtratet ved 500 x g i 5 minutter ved 4 °C.
- Fjern supernatanten og resuspender cellepelleten i 1 ml vaske- og resuspenderingsbuffer for kjerner (1x PBS, 1 % bovint serumalbumin [BSA], 0,2U/μL RNasehemmer).
- Filtrer cellene gjennom et 10 μm filter og sentrifuge ved 500 x g i 5 minutter ved 4 °C.
- Fjern supernatanten og resuspender i 50 mikrol kjernevask og resuspenderingsbuffer.
- Tell kjernene ved hjelp av en celleteller og trypanblå farging. Fortynn 5 μL av cellesuspensjonen i 50 μL 1x PBS for celletelling; Levedyktigheten bør være minimal (3% -4%) på dette tidspunktet. Hvis levedyktigheten er funnet å være høyere, tilpass protokollen for trinn 5.3 (lysis) og standardiser lysistiden for å sikre tilstrekkelig lysis av cellene.
MERK: En høy celle levedyktighet i en enkelt kjerne forberedelse betyr at det er flere intakte celler enn ønsket, og at ytterligere fordøyelse kan være nødvendig. - Legg prøven med ønsket nukleær tetthet på produsentens apparat / chip (se produsentens veiledning). Fangst av enkeltkjerner er nå klare.
MERK: Fra en voksen mus SV oppnås vanligvis 50 μL av suspensjonen ved en konsentrasjon på 150 000 kjerner / ml.
6. SV-sekvensering med én kjerne
- Send prøvene til kjernefasiliteten for sekvensering.
MERK: Denne delen av protokollen følger de generelle trinnene for (1) generering og strekkoding av gelperler i emulsjon (GEM), (2) opprydding etter GEM-RT og cDNA-amplifisering, og (3) 3' genuttrykksbibliotekkonstruksjon. Resten av sNuc-Seq-protokollen er relativt lang, og det anbefales at leserne bruker sin produsentspesifikke protokoll. Produsentens veiledning vil sannsynligvis beskrive trinn med spesifikke detaljer og tilhørende bilder. Det kan også være "how-to" -videoer på produsentens nettsted. Datasett som genereres kan representeres på en dimensjonal redusert måte, for eksempel en enhetlig manifoldtilnærming og projeksjon (UMAP; Figur 3). Mange laboratorier bruker en sekvenseringskjerne som kan utføre denne protokollen for brukere.
7. SV-immunfarging og vevsmontering
- Hvis vevet skal brukes til immunfarging, overfør det til en 24-brønnsplate, nedsenket i 200 μL 4% paraformaldehyd (PFA) i 1x PBS, og inkuber i 20 minutter ved romtemperatur.
MERK: Det er nyttig å utføre all væskefjerning, vasking og immunfarging under et mikroskop. Visualisering mens du pipetterer vevet vil sikre at det ikke ved et uhell går tapt under væskefjerning. Volumet av antistoffene og vaskene kan justeres så lenge volumet er stort nok til å senke SV-vevet ned i oppløsningen. - Etter fikseringstrinnet, fjern PFA ved å utføre to korte vasker i 1x PBS (ca. 500 μL) ved 4 °C i 5 minutter hver på en orbital shaker ved lave (30-50) RPM. Ved oppbevaring kan vevet oppbevares i 1x PBS ved 4 °C.
- Fjern PBS og permeabiliser og blokker i minst 1 time ved romtemperatur i ca. 300 mikrol PBS-T-oppløsning (0,05 Tween20 i 1x PBS med 10% føtal bovint serum).
MERK: Primære og sekundære antistoffer skal fortynnes i denne blokkerende oppløsningen. - Flekk vevet med primært antistoff i henhold til spesifikasjonene til det aktuelle antistoffet som brukes, vanligvis over natten ved 4 °C. Fjern gjenværende PBS og tilsett det fortynnede primære antistoffet.
MERK: Fortynningen bør velges basert på produsentens forslag, publiserte data, tidligere erfaring, etc. Vanligvis er den første konsentrasjonen som testes en fortynning på 1:100-200. For eksemplet som presenteres i denne artikkelen, ble GS-IB4- og DAPI-antistoffene hver fortynnet ved 1:200. Ved farging for mer enn ett protein, kan flere primære antistoffer kombineres i samme løsning, så lenge hvert primære antistoff har en annen vert for å unngå kryssreaktivitet av sekundære antistoffer. - Vask det primære antistoffet av vevet med ca. 500 μL 1x PBS to ganger i 10 minutter hver på en orbital shaker ved lavt turtall.
MERK: Fortsett å sikre at SV-vevet er nedsenket i løsningen og ikke sitter fast på siden av brønnen. - Flekk med et sekundært antistoff i henhold til spesifikasjonene til det aktuelle antistoffet som brukes, vanligvis i 2 timer ved romtemperatur på en orbital shaker ved lavt turtall. Dekk til 24-brønnsplaten slik at det fluorescerende merkede sekundære antistoffet er beskyttet mot lys.
MERK: Hvis mer enn ett sekundært antistoff er nødvendig, kombiner de sekundære antistoffene i samme løsning. Sørg for å unngå kryssmerking. - Vask det sekundære antistoffet av vevet med ca. 500 μL 1x PBS fire ganger i 5 minutter hver på en orbital shaker ved lavt turtall. Hold 24-brønnsplaten dekket for å beskytte den mot lys.
- Forbered den større mikrosklien (75 mm x 25 mm) ved å plassere to små limstriper langs 25 mm-aksen, bare mindre enn det 18 mm x 18 mm mindre glassdekselet. Plasser en dråpe monteringsreagens (ca. 50 μL) mellom limstripene.
MERK: Limet skaper en liten mengde vertikal plass, slik at når den andre dekselet er plassert på toppen, kan SV-vevsprøven trygt eksistere, men fortsette å forbli på plass. Mens striatykkelsen er 30-40 mikron, bør klemming av vevet mellom glassflatene unngås for å bevare morfologien. Alternativt kan klar tape også brukes. - Bruk #55 tang, ta så lite vev som mulig på den ene enden av SV og overfør fra PBS til dråpen monteringsreagens på større microslide (75 mm x 25 mm). Plasser den ene enden av et mindre glassdeksel (18 mm x 18 mm) på lysbildet der en limstripe ble plassert, og slipp forsiktig ut for å unngå å skape luftbobler. Dekselet vil falle til den andre limstripen og vil dekke SV-vevet.
- Forsegle festet ved å dryppe en dråpe gjennomsiktig neglelakk på hvert hjørne av festet. Merk prøven tilsvarende på glassdekselet vekk fra visualiseringsfeltet. Den er nå klar for konfokalmikroskopi (figur 4).
- Visualiser SV-vevet ved hjelp av et disseksjonsmikroskop for å sikre at det ligger flatt og ikke i nærheten av luftbobler. Hvis SV-vevet ikke er riktig orientert, kan brukeren forsøke å skyve ut luftbobler eller forsiktig fjerne det mindre glassdekselet og flytte SV-en. Dette må gjøres forsiktig for å unngå å knuse glassdekslene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi presenterer en metode for å isolere SV som skal brukes ved enten sNuc-Seq eller immunfarging. Den relevante anatomien (figur 1) i sneglehuset i forhold til SV kan hjelpe brukerne til bedre å forstå organiseringen av SV og trinnene i disseksjonsprotokollen.
Hvert trinn i denne mikrodisseksjonen av SV fra en P30-mus er detaljert i den tilhørende videoen, og øyeblikksbilder av de viktigste trinnene i denne disseksjonen og isoleringen av SV er presentert i figur 2.
sNuc-Seq er nyttig for å undersøke transkripsjonsprofilen til de forskjellige cellene i den heterogene SV. En måte dette kan visualiseres på, er ved å gruppere på en 2D UMAP (figur 3). Datasettet generert fra sNuc-Seq kan evalueres ved hjelp av ulike dataanalyseteknikker, nærmere skissert i diskusjonen.
SV-helmontering med GS-IB4 og DAPI immunmerking, sammen med Kcnj10-ZsGreen fluorescens, er presentert i figur 4. Ved hjelp av florescence kan SV visualiseres etter fjerning av omkringliggende vev og montering. I disse musene uttrykkes ZsGreen spesielt i SV-mellomliggende celler. Vaskulaturen til SV kan visualiseres i rødt (endotelceller, GS-IB4).
Figur 1 Skjematisk fremstilling av stria vascularis cellulær heterogenitet og organisering. Stria vascularis cellulær heterogenitet og organisasjon. Skjematisk fremstilling av stria vascularis (SV) og dens forhold til strukturer i sneglehuset. SV består av tre lag med celler og er ansvarlig for å generere EP og høy kaliumkonsentrasjon i det endolymfeholdige scalamediet. Forholdet mellom de marginale, mellomliggende og basale cellene er demonstrert med de marginale utvidende basolaterale projeksjonene for å interdigitere med de mellomliggende cellene, som har toveis cellulære fremspring som interdigiterer med både marginale og basale celler. I tillegg til disse celletypene er andre celletyper, inkludert spindelceller (gul), endotelceller, pericytter og makrofager (ikke vist) tilstede i SV. Brukt med tillatelse fra Korrapati et al.30. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2 Disseksjon av voksen musesneglehus ved større enn eller lik postnatal dag 30 (P30+). (A) Prøve under ekstraksjon av det indre øret fra det omkringliggende tinningbenet i trinn 3.2. Det indre øret er skissert i lilla. (B) Prøve i trinn 4.2 som viser overflaten av sneglehuset og underliggende pigmentert SV. (C) Prøve under trinn 4.4 som viser ben fjernet fra den apikale svingen og den eksponerte SV (gul pil). (D) Prøve i trinn 4.5 som viser sneglehuset med mer ben fjernet fra apikale og midtre svinger. (E) Prøve i trinn 4.5 som viser fjerning av bein som dekker midtsvingen, som viser underliggende SV (gul pil). (F) Eksempel på mindre biter av SV (gul pil) og sideveggen (blå pil) under trinn 4.10. (G) Eksempel på fluorescerende ZsGreen SV mens den gjenværende sideveggen forblir mørk. Kcnj10-ZsGreen uttrykkes spesielt i mellomcellene i SV. (H) Eksempel på at større biter av SV (gul pil) og sideveggen (blå) skilles fra hverandre i trinn 4.12. (I) SV ble helt skilt fra sideveggen i trinn 4.12. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: UMAP-plott av sNuc-Seq-datasett fra en RNAlater-behandlet voksen stria vascularis. Prøver bevart med RNAsenere behandling av voksent SV-vev med påfølgende kjerneisolasjon ble gruppert av en modularitetsbasert klyngemetode med Leiden-optimaliseringsalgoritmen og visualisert på en dimensjonalt redusert måte av et 2D UMAP-plott. Hver prikk representerer en enkelt celle, og celler med lignende transkripsjonsprofiler er gruppert sammen. Celletyper er farget basert på deres uttrykk for kjente gener uttrykt av voksne SV-celletyper. Prøvene ble lagret i RNA senere i ikke mer enn 6 måneder. SV fra omtrent fem CBA/J P30-mus ble brukt til å generere dette datasettet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4. Stria vascularis hele montering fra en P30 Kcnj10-ZsGreen mus. Konfokalt bilde av SV hele montering fra en P30 mus, som demonstrerer ZsGreen uttrykk i mellomliggende celler, GS-IB4 (rød) merking endotelceller, og DAPI (hvit) merking kjerner. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Før adventen av enkeltcellesekvensering brukte mange forskere bulkvevsanalyse, noe som bare gjorde det mulig å analysere transkriptomer i gjennomsnitt på tvers av celler. Spesielt gjorde enkeltcelle og sNuc-Seq det mulig å isolere transkriptomet til henholdsvis en enkeltcelle eller enkeltkjerne32. I dette tilfellet kan enkeltkjernetranskriptomer identifiseres for marginale, mellomliggende og basale celler, samt spindelceller30. Dette muliggjør undersøkelse av transkripsjonell heterogenitet blant SV-celletyper og kan brukes i fremtiden for å undersøke bidraget fra disse celletypene til SV-funksjonen, inkludert generering og vedlikehold av EP. Datasett generert ved hjelp av sNuc-Seq kan vises på en dimensjonalt redusert måte for å lette forståelsen av generelle transkripsjonsforskjeller og sammenligne forskjellige cellepopulasjoner ved hjelp av et UMAP-plott Figur 4. Det er mange måter å utføre bioinformatisk analyse for tolkning av sNuc-Seq datasett. Disse inkluderer, men er ikke begrenset til: differensialuttrykksanalyse, enkeltcelle regulatorisk nettverksinferens og klynger (SCENIC), varmekart eller glisefiolinplotkonstruksjon og regulonanalyse18. Videre beregningsanalyseteknikker for enkeltcelle RNA-sekvensering ligner sNuc-Seq, og diskuteres mer detaljert i vurderinger av Hwang et al.32, Shafer33 og Chen et al.34.
Den andre store anvendelsen av denne disseksjonsteknikken er immunfarging for bedre å studere utvalgte strukturer innen SV. Dette kan vi observere i innstillingen av en SV-helmontering som ble avbildet ved hjelp av konfokalmikroskopi (figur 3). Kjernene til alle celler visualiseres med DAPI-merking. Kapillærene ses via endotelcellefarging med GS-IB4 i rødt. Mellomliggende celler, i dette tilfellet, har blitt genetisk modifisert ved hjelp av en mellomliggende cellespesifikk promotor for å uttrykke ZsGreen.
Begrensninger av sNuc-Seq inkluderer: (1) mangel på romlig informasjon, (2) forstyrrelser mot immuncellepopulasjoner og (3) utelukkelse av cytoplasmatisk RNA. Romlige transkriptomiske teknikker kan gi mer spesifikk informasjon om cellulære subpopulasjoner i vev35. Gitt protokollforskjeller mellom sNuc-Seq og enkeltcelle RNA-sekvensering, som vevsdissosiasjon og lagring, kan den sNuc-Seq-genererte transkripsjonsprofilen forspenning mot immunceller samtidig som den er kraftigere ved å karakterisere vedlagte celletyper36. Også enkeltcelle RNA-sekvensering inkluderer cytoplasmatisk RNA som mitokondrielt RNA, mens sNuc-Seq ikke gjør det. Til tross for disse tilfellene av transkripsjonsforskjeller mellom de to metodene, har det vist seg at sNuc-Seq stort sett har en lignende transkripsjonsprofil som hele encellede RNA-sekvensering37, og spesielt i SV30.
For vellykket mikrodisseksjon er det flere kritiske trinn å være oppmerksom på. I de første trinnene må man trekke ut det indre øret riktig for å unngå å knuse det underliggende sneglehuset. Observasjon av riktig temporalbenekstraksjon er vist i figur 2A. Når cochlea er riktig eksponert, må det utvises forsiktighet for å skrape forsiktig og bryte cochleabenet for å eksponere den underliggende sideveggen og SV. Når sideveggen og SV er trukket ut, må brukeren forsiktig løsne SV fra sideveggen. Det bør brukes nok kraft i riktig plan til å lirke SV fra sideveggen, samtidig som man unngår skade på den skjøre SV. For SV-mikrodisseksjon kan det være nyttig å tenke på å «dissekere andre strukturer vekk fra SV», i stedet for å «dissekere SV ut av sneglehuset».
Denne protokollen kan modifiseres for ulike aldre av mus og for forskjellige pattedyrarter, for eksempel rotter. For yngre mus vil vev variere i tekstur og strukturer vil være mindre generelt. For forskjellige pattedyrarter vil cochlea-anatomien være relativt lik, med størrelsen på dyret som bestemmer størstedelen av forskjellen.
Generelt er ulempene med denne protokollen lik andre cochlear mikrodisseksjonsteknikker38. Å isolere den delikate SV kan være teknisk utfordrende, og den kan brytes opp i mindre biter.
Denne teknikken er ikke optimal for å lagre Corti-organet for helmontering, da det ofte blir skadet med denne protokollen. Det finnes andre disseksjonsteknikker som er spesielt rettet mot å bevare Corti-organet for helmontering og immunfarging38, men disse har sine egne ulemper, med tanke på at sNuc-Seq må gjøres med ferske prøver for å unngå RNA-nedbrytning, ikke i forbindelse med vevsfiksering og avkalkning.
Med tid og repetisjon vil brukerne bli mer komfortable med denne SV-mikrodisseksjonsprotokollen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Denne forskningen ble støttet delvis av NIHs intramurale forskningsprogram, NIDCD til MH (DC000088)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10-µm filter (Polyethylenterephthalat) | PluriSelect | #43-50010-01 | Filter tissue during sNuc-Seq |
| 18 x 18 mm cover glass | Fisher Scientific | 12-541A | Cover slip to mount SV |
| 30-µm filter (Polyethylenterephthalat) | PluriSelect | #43-50030-03 | Filter tissue during sNuc-Seq |
| 75 x 25 mm Superfrost Plus/Colorforst Plus Microslide | Daigger | EF15978Z | Microslide to mount SV on |
| C57BL/6J Mice | The Jackson Laboratory | RRID: IMSR_JAX:000664 | General purpose mouse strain that has pigment more easily seen in the intermediate cells of the SV. |
| Cell Counter | Logos Biosystems | L20001 | Used for cell counting |
| Chalizon curette 5'', size 3 2.5 mm | Biomedical Research Instruments | 15-1020 | Used to transfer SV |
| Chromium Next GEM single Cell 3' GEM Kit v3.1 | Chromium | PN-1000141 | Generates single cell 3' gene expression libraries |
| Clear nail polish | Fisher Scientific | NC1849418 | Used for sealing SV mount |
| Corning Falcon Standard Tissue Culture Dishes, 24 well | Corning | 08-772B | Culture dish used to hold specimen during dissection |
| DAPI | Invitrogen | D1306, RRID: AB_2629482 | Stain used for nucleus labeling |
| Dounce homogenizer | Sigma-Aldrich | D8938 | Used to homogenize tissue for sNuc-seq |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | General forceps for dissection |
| Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | Forceps with fine tip that makes SV manipulation easier |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher | 16000044 | Used for steps of sNuc-Seq |
| Glue stick | Fisher Scientific | NC0691392 | Used for mounting SV |
| GS-IB4 Antibody | Molecular Probes | I21411, RRID: AB-2314662 | Antibody used for capillary labeling |
| KCNJ10-ZsGreen Mice | n/a | n/a | Transgenic mouse that expresses KCNJ10-ZsGreen, partiularly in the intermediate cells of the SV. |
| MgCl2 | ThermoFisher | AM9530G | Used for steps of sNuc-Seq |
| Mounting reagent | ThermoFisher | #S36940 | Mounting reagent for SV |
| Multiwell 24 well plate | Corning | #353047 | Plate used for immunostaining |
| NaCl | ThermoFisher | AAJ216183 | Used for steps of sNuc-Seq |
| Nonidet P40 | Sigma-Aldrich | 9-16-45-9 | Used for steps of sNuc-Seq |
| Nuclease free water | ThermoFisher | 4387936 | Used for steps of sNuc-Seq |
| Orbital shaker | Silent Shake | SYC-2102A | Used for steps of immunostaining |
| PBS | ThermoFisher | J61196.AP | Used for steps of immunostaining and dissection |
| RNA Later | Invitrogen | AM7021 | Used for preservation of SV for sNuc-Seq |
| Scizzors | Fine Science Tools | 14058-09 | Used for splitting mouse skull |
| Tris-HCl | Sigma-Aldrich | 15506017 | Used for steps of sNuc-Seq |
| Trypan blue stain | Gibco | 15250061 | Used for cell counting |
| Tween20 | ThermoFisher | AAJ20605AP | Used for steps of sNuc-Seq |
| Zeiss STEMI SV 11 Apo stereomicroscope | Zeiss | n/a | Microscope used for dissections |
References
- Bosher, S. K., Warren, R. L. Observations on the electrochemistry of the cochlear endolymph of the rat: a quantitative study of its electrical potential and ionic composition as determined by means of flame spectrophotometry. Proceedings of the Royal Society of London. Series B. Biological Sciences. 171 (1023), 227-247 (1968).
- Patuzzi, R. Ion flow in stria vascularis and the production and regulation of cochlear endolymph and the endolymphatic potential. Hearing Research. 277 (1-2), 4-19 (2011).
- Wangemann, P. K+ cycling and the endocochlear potential. Hearing Research. 165 (1-2), 1-9 (2002).
- Adachi, N., et al. The mechanism underlying maintenance of the endocochlear potential by the K+ transport system in fibrocytes of the inner ear. The Journal of Physiology. 591 (18), 4459-4472 (2013).
- Hibino, H., Nin, F., Tsuzuki, C., Kurachi, Y. How is the highly positive endocochlear potential formed? The specific architecture of the stria vascularis and the roles of the ion-transport apparatus. Pflugers Archiv. 459 (4), 521-533 (2010).
- Lang, F., Vallon, V., Knipper, M., Wangemann, P. Functional significance of channels and transporters expressed in the inner ear and kidney. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 293 (4), C1187-C1208 (2007).
- Liu, W., Schrott-Fischer, A., Glueckert, R., Benav, H., Rask-Andersen, H. The human "cochlear battery"-claudin-11 barrier and ion transport proteins in the lateral wall of the cochlea. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 239 (2017).
- Marcus, D. C., Wu, T., Wangemann, P., Kofuji, P. KCNJ10 (Kir4.1) potassium channel knockout abolishes endocochlear potential. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 282 (2), C403-C407 (2002).
- Spicer, S. S., Schulte, B. A. Differentiation of inner ear fibrocytes according to their ion transport related activity. Hearing Research. 56 (1-2), 53-64 (1991).
- Wangemann, P., Liu, J., Marcus, D. C. Ion transport mechanisms responsible for K+ secretion and the transepithelial voltage across marginal cells of stria vascularis in vitro. Hearing Research. 84 (1-2), 19-29 (1995).
- Yoshida, T., et al. The unique ion permeability profile of cochlear fibrocytes and its contribution to establishing their positive resting membrane potential. Pflugers Archiv. 468 (9), 1609-1619 (2016).
- Johns, J. D., Adadey, S. M., Hoa, M. The role of the stria vascularis in neglected otologic disease. Hearing Research. 428, 108682 (2023).
- Kim, J., Ricci, A. J. In vivo real-time imaging reveals megalin as the aminoglycoside gentamicin transporter into cochlea whose inhibition is otoprotective. Proceedings of the National Academy of Sciences. 119 (9), e2117846119 (2022).
- Zdebik, A. A., Wangemann, P., Jentsch, T. J. Potassium ion movement in the inner ear: insights from genetic disease and mouse models. Physiology. 24, 307-316 (2009).
- Chen, J., Zhao, H. B. The role of an inwardly rectifying K+ channel (Kir4.1) in the inner ear and hearing loss. Neuroscience. 265, 137-146 (2014).
- Steel, K. P., Barkway, C. Another role for melanocytes: their importance for normal stria vascularis development in the mammalian inner ear. Development. 107 (3), 453-463 (1989).
- Ito, T., Nishio, A., Wangemann, P., Griffith, A. J. Progressive irreversible hearing loss is caused by stria vascularis degeneration in an Slc26a4-insufficient mouse model of large vestibular aqueduct syndrome. Neuroscience. 310, 188-197 (2015).
- Gu, S., et al. Characterization of rare spindle and root cell transcriptional profiles in the stria vascularis of the adult mouse cochlea. Scientific Reports. 10 (1), 18100 (2020).
- Gow, A., et al. Deafness in claudin 11-null mice reveals the critical contribution of basal cell tight junctions to stria vascularis function. The Journal of Neuroscience. 24 (32), 7051-7062 (2004).
- Chang, Q., et al. Virally mediated Kcnq1 gene replacement therapy in the immature scala media restores hearing in a mouse model of human Jervell and Lange-Nielsen deafness syndrome. EMBO Molecular Medicine. 7 (8), 1077-1086 (2015).
- Faridi, R., et al. Mutational and phenotypic spectra of KCNE1 deficiency in Jervell and Lange-Nielsen Syndrome and Romano-Ward Syndrome. Human Mutation. 40 (2), 162-176 (2019).
- Wangemann, P., et al. Loss of KCNJ10 protein expression abolishes endocochlear potential and causes deafness in Pendred syndrome mouse model. BMC Medicine. 2, 30 (2004).
- Kitajiri, S. -I., et al. Expression patterns of claudins, tight junction adhesion molecules, in the inner ear. Hearing Research. 187 (1-2), 25-34 (2004).
- Jagger, D. J., Nevill, G., Forge, A. The membrane properties of cochlear root cells are consistent with roles in potassium recirculation and spatial buffering. Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 11 (3), 435-448 (2010).
- Ito, T., Kurata, N., Fukunaga, Y.
- Zhang, J., et al. VEGFA165 gene therapy ameliorates blood-labyrinth barrier breakdown and hearing loss. JCI Insight. 6 (8), e143285 (2021).
- Shi, X. Pathophysiology of the cochlear intrastrial fluid-blood barrier (review). Hearing Research. 338, 52-63 (2016).
- Gu, S., et al. Identification of potential Meniere's disease targets in the adult stria vascularis. Frontiers in Neurology. 12, 630561 (2021).
- Fischer, J., Ayers, T. Single nucleus RNA-sequencing: how it's done, applications and limitations. Emerging Topics in Life Sciences. 5 (5), 687-690 (2021).
- Korrapati, S., et al. Single cell and single nucleus RNA-Seq reveal cellular heterogeneity and homeostatic regulatory networks in adult mouse stria vascularis. Frontiers in Molecular Neuroscience. 12, 316 (2019).
- Pyle, M. P., Hoa, M. Applications of single-cell sequencing for the field of otolaryngology: A contemporary review. Laryngoscope Investigative Otolaryngology. 5 (3), 404-431 (2020).
- Hwang, B., Lee, J. H., Bang, D. Single-cell RNA sequencing technologies and bioinformatics pipelines. Experimental & Molecular Medicine. 50 (8), 1-14 (2018).
- Shafer, M. E. R. Cross-species analysis of single-cell transcriptomic data. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 175 (2019).
- Chen, G., Ning, B., Shi, T. Single-cell RNA-Seq technologies and related computational data analysis. Frontiers in Genetics. 10, 317 (2019).
- Longo, S. K., Guo, M. G., Ji, A. L., Khavari, P. A. Integrating single-cell and spatial transcriptomics to elucidate intercellular tissue dynamics. Nature Reviews Genetics. 22 (10), 627-644 (2021).
- Kim, N., Kang, H., Jo, A., Yoo, S. A., Lee, H. O. Perspectives on single-nucleus RNA sequencing in different cell types and tissues. Journal of Pathology and Translational Medicine. 57 (1), 52-59 (2023).
- Grindberg, R. V., et al.
- Montgomery, S. C., Cox, B. C. Whole mount dissection and immunofluorescence of the adult mouse cochlea. Journal of Visuazlied Experiments. (107), e53561 (2016).
