Summary
स्ट्रिया संवहनी एंडोकोक्लियर क्षमता की पीढ़ी के लिए महत्वपूर्ण है। यहां, हम एकल-नाभिक अनुक्रमण या इम्यूनोस्टेनिंग के लिए वयस्क माउस स्ट्रिया संवहनी के विच्छेदन को प्रस्तुत करते हैं।
Abstract
एंडोकोक्लियर क्षमता, जो स्ट्रिया संवहनी द्वारा उत्पन्न होती है, उचित बाल कोशिका मेकेनोट्रांसडक्शन और अंततः सुनवाई के लिए अनुकूल वातावरण बनाए रखने के लिए आवश्यक है। स्ट्रिया संवहनी के विकृति के परिणामस्वरूप सुनवाई में कमी हो सकती है। वयस्क स्ट्रिया संवहनी का विच्छेदन केंद्रित एकल-नाभिक कैप्चर और बाद में एकल-नाभिक अनुक्रमण और इम्यूनोस्टेनिंग की अनुमति देता है। इन तकनीकों का उपयोग एकल-कोशिका स्तर पर स्ट्रिया संवहनी पैथोफिज़ियोलॉजी का अध्ययन करने के लिए किया जाता है।
एकल-नाभिक अनुक्रमण का उपयोग स्ट्रिया संवहनी के ट्रांसक्रिप्शनल विश्लेषण की स्थापना में किया जा सकता है। इस बीच, इम्यूनोस्टेनिंग कोशिकाओं की विशिष्ट आबादी की पहचान करने में उपयोगी है। दोनों विधियों को एक शर्त के रूप में उचित स्ट्रिया संवहनी विच्छेदन की आवश्यकता होती है, जो तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण साबित हो सकती है।
Introduction
कोक्लेया में तीन द्रव भरे कक्ष होते हैं, स्काला वेस्टिबुली, स्काला मीडिया और स्काला टाइम्पानी। स्काला वेस्टिबुली और स्काला टाइम्पानी प्रत्येक में पेरिलिम्फ होता है, जिसमें सोडियम (138 एमएम) की उच्च सांद्रता और पोटेशियम की कम सांद्रता (6.8 एमएम) होती है। स्काला मीडिया में एंडोलिम्फ होता है, जिसमें पोटेशियम (154 एमएम) की उच्च सांद्रता और सोडियम (0.91 एमएम) 1,2,3 की कम सांद्रता होती है। आयन सांद्रता में इस अंतर को एंडोकोक्लियर पोटेंशियल (ईपी) के रूप में संदर्भित किया जा सकता है, और मुख्य रूप से कोक्लेया 4,5,6,7,8,9,10,11 की पार्श्व दीवार के साथ स्ट्रिया संवहनी (एसवी) में विभिन्न आयन चैनलों और गैप जंक्शनों के माध्यम से पोटेशियम आयनों की गति से उत्पन्न होता है।. एसवी एक विषमलैंगिक, अत्यधिक संवहनी ऊतक है जो कोक्लेया की पार्श्व दीवार के उपचारात्मक पहलू को रेखाबद्ध करता है और इसमें तीन मुख्य सेल प्रकार होते हैं: सीमांत, मध्यवर्ती और बेसल कोशिकाएं12 (चित्रा 1)।
सीमांत कोशिकाओं को एसवी की सबसे औसत दर्जे की सतह बनाने के लिए तंग जंक्शनों से जोड़ा जाता है। एपिकल झिल्ली स्काला मीडिया के एंडोलिम्फ का सामना करती है और विभिन्न चैनलों का उपयोग करके एंडोलिम्फ में पोटेशियम आयन परिवहन में योगदान देती है, जिसमें केसीएनई 1 / KCNQ1, SLC12A2, और Na+-K+-ATPase (NKA) 5,10,13,14 शामिल हैं। मध्यवर्ती कोशिकाएं वर्णक कोशिकाएं होती हैं जो सीमांत और बेसल कोशिकाओं के बीच रहती हैं और केसीएनजे 10 (किर 4.1)15,16 का उपयोग करके एसवी के माध्यम से पोटेशियम परिवहन की सुविधा प्रदान करती हैं। बेसल कोशिकाएं कोक्लेया की पार्श्व दीवार के करीब निकटता में होती हैं और पेरिलिम्फ12 से पोटेशियम रीसाइक्लिंग को बढ़ावा देने के लिए सर्पिल लिगामेंट के फाइब्रोसाइट्स के साथ निकटता से जुड़ी होती हैं। एसवी की पैथोलॉजी को कई ओटोलॉजिक विकारों17,18 में फंसाया गया है। प्रमुख एसवी सेल प्रकारों में व्यक्त जीन में उत्परिवर्तन, जैसे कि Kcnq1, Kcne1, Kcnj10, और Cldn11, बहरापन और SV शिथिलता का कारण बन सकता है, जिसमें EP 19,20,21,22,23 का नुकसान भी शामिल है। तीन प्रमुख सेल प्रकारों के अलावा, एसवी में अन्य कम अध्ययन किए गए सेल प्रकार हैं, जैसे स्पिंडल कोशिकाएं 22, रूट सेल12,24, मैक्रोफेज 25, पेरिसाइट्स 26, और एंडोथेलियल कोशिकाएं 27, जिनमें आयनिक होमियोस्टैसिस और ईपी 28 की पीढ़ी से जुड़ी भूमिकाएं पूरी तरह से परिभाषित हैं।
थोक आरएनए-अनुक्रमण की तुलना में, एकल-नाभिक आरएनए-अनुक्रमण (एसएनयूसी-सेक) कोशिकाओं के समूह29 में एमआरएनए के औसत के बजाय सेल विषमता के बारे में जानकारी प्रदान करता है, और हेटरोजेनस एसवी30 का अध्ययन करते समय विशेष रूप से उपयोगी हो सकता है। उदाहरण के लिए, sNuc-Seq ने ट्रांसक्रिप्शनल विश्लेषण का उत्पादन किया है जो बताता है कि ईपी पीढ़ी, सुनवाई हानि और मेनियर की बीमारी18 में स्पिंडल और रूट कोशिकाओं की भूमिका हो सकती है। विभिन्न एसवी सेल प्रकारों के आगे ट्रांसक्रिप्शनल लक्षण वर्णन हमें एसवी से संबंधित सुनवाई में उतार-चढ़ाव और सुनवाई हानि के विभिन्न तंत्रों और उपप्रकारों के अंतर्निहित पैथोफिज़ियोलॉजी पर अमूल्य जानकारी प्रदान कर सकते हैं। इन नाजुक आंतरिक कान संरचनाओं की फसल इष्टतम ऊतक विश्लेषण के लिए सर्वोपरि महत्व की है।
इस अध्ययन में, स्नुक-सेक या इम्यूनोस्टेनिंग के लिए वयस्क माउस कोक्लेया से स्ट्रिया संवहनी तक पहुंचने और अलग करने के लिए माइक्रोडिसेक्शन दृष्टिकोण का वर्णन किया गया है। वयस्क माउस एसवी का विच्छेदन विभिन्न एसवी सेल प्रकारों को समझने और सुनवाई में उनकी भूमिका को और चिह्नित करने के लिए आवश्यक है।
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Protocol
सभी पशु प्रयोगों और प्रक्रियाओं को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ न्यूरोलॉजिकल डिजीज एंड स्ट्रोक की पशु देखभाल और उपयोग समिति और राष्ट्रीय बहरापन और अन्य संचार विकार संस्थान, राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल के अनुसार किया गया था। सभी प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ न्यूरोलॉजिकल डिजीज एंड स्ट्रोक की पशु देखभाल और उपयोग समिति और राष्ट्रीय बहरापन और अन्य संचार विकार संस्थान, राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान द्वारा अनुमोदित किया गया था। सभी तरीकों को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ न्यूरोलॉजिकल डिजीज एंड स्ट्रोक की पशु देखभाल और उपयोग समिति और राष्ट्रीय बहरापन और अन्य संचार विकार संस्थान, राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के प्रासंगिक दिशानिर्देशों और नियमों के अनुसार किया गया था।
1. पशु इच्छामृत्यु
- C57BL/6J या Kcnj10-ZsGreen ट्रांसजेनिक चूहों का उपयोग करें, प्रसवोत्तर दिन 30+ (P30+), जिनका वजन 15-20 ग्राम के बीच होता है।
- एक अनुमोदित प्रोटोकॉल (यहां सीओ2 श्वासावरोध) का उपयोग करके एक वयस्क माउस (उम्र पी 30 या उससे अधिक) को इच्छामृत्यु दें। एक द्वितीयक चरण के रूप में विरूपण करें।
नोट: यदि इम्यूनोस्टेनिंग है, तो एसवी की केशिकाओं में रक्त के लिए निरर्थक बंधन के कारण कुछ एंटीबॉडी में पृष्ठभूमि संकेत हो सकते हैं। फिक्सेटिव के साथ कार्डियक छिड़काव एसवी की केशिकाओं से रक्त को हटाकर इस मुद्दे को संबोधित कर सकता है। हालांकि, अधिकांश एंटीबॉडी इस विधि के बिना अच्छे परिणाम प्राप्त कर सकते हैं, और यह इस प्रोटोकॉल में कवर नहीं किया जाएगा।
2. बोनी भूलभुलैया को उजागर करना
- माउस को 70% इथेनॉल के साथ छिड़काव करके और पेपर टॉवल से पोंछकर साफ करें। संदूषण के जोखिम को कम करने के लिए सिर क्षेत्र पर विशेष ध्यान दें। नाक की ओर त्वचा खींचकर खोपड़ी से त्वचा को हटा दें।
- तेज कैंची का उपयोग करके, बाएं और दाएं हिस्सों को अलग करने के लिए खोपड़ी को मध्य विमान के साथ विभाजित करें।
- बोनी भूलभुलैया को उजागर करने के लिए खोपड़ी से मस्तिष्क को हटा दें।
3. आंतरिक कान निष्कर्षण
- अस्थायी हड्डी (चित्रा 2 ए) के भीतर आंतरिक कान की पहचान करें और # 55 बल का उपयोग करके कपाल नसों को खुरचें।
नोट: उपयोगकर्ता को # 55 फोर्सप्स के दूसरे सेट का उपयोग करके अपने गैर-प्रभावी हाथ से नमूना को स्थिर करना चाहिए। नमूने के विभिन्न क्षेत्रों को विच्छेदन के दौरान स्थिर बल के साथ पकड़ा जा सकता है यदि नमूने के महत्वपूर्ण क्षेत्रों से बचा जाता है (उदाहरण के लिए, कोक्लेया को कुचल न दें)। - # 55 बल का उपयोग करके, बुला और कैप्सूल को विच्छेदित करें, उन्हें आसपास की हड्डी से अलग करें। आंतरिक कान की सतह से किसी भी शेष नरम ऊतक को हटा दें।
- नमूने को एक स्पष्ट ऊतक संवर्धन डिश में स्थानांतरित करें जिसमें 1x ठंडा पीबीएस (फॉस्फेट-बफर खारा), पीएच 7.4 हो, और विच्छेदन दायरे (चित्रा 2 बी) के तहत रखा जाए।
4. एसवी विच्छेदन
नोट: अभ्यास के साथ, एसवी को रिबन के समान एक लंबे टुकड़े के रूप में विच्छेदित करना संभव है। एसवी नाजुक है, इसलिए यदि यह टुकड़ों में टूट जाता है, तो इन्हें एक साथ संग्रहीत किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, इन्हें उनकी बारी (जैसे, बेसल, मध्य, एपिकल) के अनुसार अलग-अलग लेबल वाले कुओं में संग्रहीत किया जा सकता है।
- यदि विच्छेदन क्षेत्र प्रकाश स्रोतों को स्थानांतरित किया जा सकता है, तो एक प्रकाश को डिश के ऊपर रखें और दूसरे प्रकाश स्रोत को साइड से, विच्छेदन सतह के समानांतर। यह कॉक्लियर हड्डी के नीचे ऊतक के बेहतर विपरीत की अनुमति देता है।
- # 55 बल का उपयोग करके, नमूने को वेस्टिबुलर भाग द्वारा कोक्लेया के सामने रखें।
- # 55 बल का उपयोग करके, शीर्ष पर कॉक्लियर हड्डी के माध्यम से छेद करें।
नोट: # 5 फोर्स# 55 से अधिक मोटे होते हैं और हड्डी तोड़ने के लिए उपयोग किए जा सकते हैं, लेकिन आकार / ताकत में वृद्धि बल की बारीकी और छोटे ऊतकों में हेरफेर करने की क्षमता का त्याग करती है। अधिक नाजुक बल को होने वाले नुकसान से बचने के लिए आईनॉक्स या डुमोस्टार जैसी सामग्री से बने बल का उपयोग करने पर विचार करें। एसवी को नुकसान पहुंचाने से बचने के लिए हड्डी के नीचे बहुत गहराई तक बल को धक्का देने से बचें। - # 55 बल का उपयोग करके, एपिकल मोड़ (चित्रा 2 सी) के साथ खुरच ें, बाहरी हड्डी की परत के छोटे टुकड़ों को तोड़ने के लिए कोमल बल लागू करें। धीरे से हड्डी को उठाएं और इसे पार्श्व दीवार से अलग करें।
नोट: इस विच्छेदन के बारे में सोचना उपयोगी हो सकता है कि "एसवी से सब कुछ हटाना" के बजाय"कोक्लेया से एसवी को विच्छेदित करना"। - एपिकल और मध्य मोड़ (चित्रा 2 डी, ई) से कॉक्लियर हड्डी के टुकड़ों को हटाने के लिए # 55 फोर्सप्स का उपयोग करना जारी रखें। पार्श्व दीवार को धीरे से नीचे धकेलें, एपिकल और मध्य मोड़ की पार्श्व दीवार को उजागर करने के लिए मध्य मोड़ की ओर हड्डी की दीवार के टुकड़ों को देखें और हटा दें।
- # 55 फोर्सप्स का उपयोग जारी रखते हुए, सर्पिल नाड़ीग्रन्थि को उजागर करने के लिए धीरे से एपिकल टर्न लेटरल दीवार को एक तरफ धकेल ें। बाहरी बाल कोशिका परत के साथ सर्पिल नाड़ीग्रन्थि से एपिकल और मध्य मोड़ की पार्श्व दीवार को अलग करें। कोक्लेया के अंदर से सर्पिल नाड़ीग्रन्थि के टुकड़ों को हटा दें।
नोट: # 55 बल छोटे होते हैं और छोटे और नाजुक ऊतकों में हेरफेर करते समय एक लाभ प्रदान करते हैं। उन्हें झुकने या नुकसान पहुंचाने से बचने के लिए अतिरिक्त देखभाल की जानी चाहिए। - बेसल मोड़ की पार्श्व दीवार तक बेहतर पहुंच के लिए, # 55 फोर्सप्स का उपयोग करके अस्थायी हड्डी के वेस्टिबुलर हिस्से से कोक्लेया को अलग करें। # 55 बल को गोल और अंडाकार खिड़की में रखें और वेस्टिब्यूल की ओर नीचे धकेलें। कोक्लेया अलग हो जाएगा। आंतरिक कान के वेस्टिबुलर हिस्से को हटा दें।
- # 55 फोर्सप्स का उपयोग जारी रखते हुए, अब मध्य मोड़ क्षेत्र से शुरू होने वाले बेसल कॉक्लियर हड्डी के टुकड़ों को हटा दें। इसे अलग करने के लिए हड्डी के नीचे पार्श्व दीवार की परत को धीरे से धक्का दें।
- पार्श्व दीवार के सबसे दूर के बेसल हिस्से को ताक-झांक करके और धीरे से ऊतक को खींचकर हटा दें। इस क्षेत्र में हड्डी इतनी मोटी हो सकती है कि नीचे के नरम ऊतक को नुकसान पहुंचाए बिना हटाया नहीं जा सकता है।
- अब, पार्श्व दीवार के बेसल हिस्से को अलग करने के साथ, कोक्लेया से पार्श्व दीवार को जितना संभव हो उतना अलग करें। यह पार्श्व दीवार के साथ # 55 बल का पता लगाकर किया जा सकता है। हड्डी और शेष पार्श्व दीवार के बीच बल को धीरे से ब्रश करें। यदि उपयोगकर्ता अनुभवी है तो यह एक टुकड़े में शीर्ष तक किया जा सकता है। पार्श्व दीवार को ताजा पीबीएस में ले जाएं।
नोट: हालांकि एसवी के बड़े टुकड़ों को छवि बनाना आसान हो सकता है, ऊतकों की नाजुक प्रकृति को देखते हुए, छोटे टुकड़े लिए जा सकते हैं (चित्रा 2 एफ, जी), और आकार के आधार पर, इमेजिंग के लिए भी काम कर सकते हैं। - पार्श्व दीवार को सपाट बिछाने के लिए # 55 बल का उपयोग करें। एसवी को पार्श्व दीवार के आंतरिक पक्ष पर ऊतक की एक गहरी परत के रूप में दिखाई देना चाहिए।
नोट: उपयोगकर्ता ओं को विशेष रूप से एपिकल छोर के करीब मिल सकता है, कि कुछ एसवी ऊतक संयोग से विच्छेदन के दौरान पार्श्व दीवार से अलग हो जाते हैं। - धीरे से एसवी परत को उसके बेसल छोर पर पार्श्व दीवार से अलग करने के लिए देखें (चित्रा 2 एच)। धीरे-धीरे अलग एसवी को एक तरफ धकेलें और बल को पार्श्व दीवार के एपिकल छोर की ओर आगे बढ़ाएं, यदि संभव हो तो एसवी को एक लंबे रिबन के रूप में अलग करें (चित्रा 2 आई)। इसे खींचने के लिए एसवी को बल के साथ न निचोड़ें। यदि ऊतक पकड़ने के लिए बहुत नाजुक है, तो इसे वैकल्पिक रूप से ऊतक स्कूप का उपयोग करके एकत्र किया जा सकता है, जैसे कि चालाज़ियन इलाज।
नोट: एसवी को स्थानांतरित करना हमेशा प्रकाश माइक्रोस्कोपी के तहत किया जाना चाहिए ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि यह खो नहीं गया है। नुकसान के जोखिम के कारण बल का उपयोग करते समय हमेशा सावधान रहें। उपयोगकर्ता पा सकते हैं कि चालाज़ियन क्यूरेट का उपयोग एसवी ऊतक को नुकसान के जोखिम को कम करता है। एकल-नाभिक अनुक्रमण के लिए, अनुभाग 5 पर आगे बढ़ें। एसवी इम्यूनोस्टेनिंग के लिए, धारा 7 पर आगे बढ़ें।
5. एसवी सिंगल-न्यूक्लियस सस्पेंशन
नोट: यह प्रोटोकॉल एसवी ऊतक के लिए विशेष रूप से एक प्रकाशित निर्माता के एकल-नाभिक निलंबन प्रोटोकॉल से अनुकूलित है। विभिन्न निर्माताओं के प्लेटफार्मों का उपयोग किया जा सकताहै। प्लेटफ़ॉर्म-विशिष्ट भिन्नता को देखते हुए, उपकरण के साथ प्रदान किए गए निर्माता-विशिष्ट प्रोटोकॉल की समीक्षा करने की सिफारिश की जाती है। स्नुक-सेक के लिए इष्टतम परिणाम प्राप्त करने और आरएनए क्षरण को कम करने के लिए, ऊतक विच्छेदन जितनी तेजी से बेहतर होगा (इच्छामृत्यु से 15-20 मिनट के भीतर अनुशंसित)। एक समय में एक जानवर को इच्छामृत्यु देना सहायक हो सकता है और केवल तभी जब विच्छेदन के लिए तैयार हो। विच्छेदन पर एक साथ कई लोगों के काम करने से गिरावट का समय भी खत्म हो सकता है (उदाहरण के लिए, एक प्रयोगशाला कर्मी बाएं कान पर काम करता है जबकि दूसरा दाएं कान पर काम करता है)।
- यदि एसवी ऊतक का उपयोग स्नुक-सेक के लिए किया जाएगा, तो ऊतक को ठंडा लाइसिस बफर (10 एमएम ट्रिस-एचसीएल, 10 एमएम एनएसीएल, 3 एमएम एमजीसीएल2, 0.005% नोनिडेट पी 40 न्यूक्लियस मुक्त पानी में) में रखें।
नोट: यदि विच्छेदन के तुरंत बाद अनुक्रमण किया जाना है, तो प्रोटोकॉल जारी रखें। यदि प्रोटोकॉल को रोकना वांछित है, तो एसवी को आरएनएलेटर में रखकर एसवी संरक्षण संभव है। 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर स्टोर करें, फिर तरल नाइट्रोजन में फ्लैश फ्रीज करें और उपयोग के लिए तैयार होने तक -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। उपयोग करने के लिए तैयार होने पर, पीबीएस में 5 मिनट के लिए दो बार पिघलें और धोएं, फिर होमोजेनाइजेशन (चरण 5.2) के साथ आगे बढ़ें। - बर्फ पर 10-20 स्ट्रोक के साथ 2 एमएल डोंस होमोजिनाइज़र में ऊतक को समरूप करें।
नोट: ग्लास सिलेंडर मैन्युअल रूप से ग्लास ट्यूब के निचले हिस्से से संपर्क करेगा, एसवी को टुकड़े करेगा। एसवी नाजुक है, इसलिए 20 स्ट्रोक आमतौर पर सफल होमोजेनाइजेशन प्राप्त करते हैं। - ऊतक को 25 मिनट के लिए बर्फ पर रखें।
नोट: लाइसिस समय ऊतक प्रकार के अनुसार भिन्न होता है। एसवी ऊतक में 25 मिनट का लाइसिस कम सेल व्यवहार्यता (4% से कम) प्राप्त कर सकता है, लेकिन यदि सेल व्यवहार्यता बहुत अधिक है तो समय को अनुकूलित किया जा सकता है (चरण 5.8)। - 30 μm फ़िल्टर के माध्यम से फ़िल्टर करें और छानना 500 x g पर 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर घुमाएं।
- सतह पर तैरनेवाला को हटा दें और सेल गोली को 1 मिलीलीटर नाभिक धोने और पुन: निलंबन बफर (1x पीबीएस, 1% गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन [बीएसए], 0.2U / μL RNase अवरोधक) में पुन: निलंबित करें।
- 10 μm फ़िल्टर के माध्यम से कोशिकाओं को फ़िल्टर करें और 4 °C पर 5 मिनट के लिए 500 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें।
- सतह पर तैरनेवाला को हटा दें और नाभिक धोने और पुन: निलंबन बफर के 50 μL में पुन: निलंबित करें।
- सेल काउंटर का उपयोग करके नाभिक की गणना करें और नीले रंग को धुंधला करें। सेल की गिनती के लिए सेल निलंबन के 5 μL को 1x PBS के 50 μL में पतला करें; इस बिंदु पर व्यवहार्यता न्यूनतम (3% -4%) होनी चाहिए। यदि व्यवहार्यता अधिक पाई जाती है, तो चरण 5.3 (लाइसिस) के लिए प्रोटोकॉल को अनुकूलित करें और कोशिकाओं के पर्याप्त लाइसिस को सुनिश्चित करने के लिए लाइसिस समय को मानकीकृत करें।
नोट: एकल नाभिक तैयारी में एक उच्च कोशिका व्यवहार्यता का मतलब है कि वांछित से अधिक बरकरार कोशिकाएं हैं, और अतिरिक्त पाचन की आवश्यकता हो सकती है। - चिप पर वांछित परमाणु घनत्व के साथ नमूना लोड करें (निर्माता गाइड देखें)। एकल-नाभिक कैप्चर अब तैयार हैं।
नोट: एक वयस्क माउस एसवी से, 150,000 नाभिक / एमएल की एकाग्रता पर निलंबन का 50 μL आमतौर पर प्राप्त किया जाता है।
6. एसवी सिंगल-न्यूक्लियस अनुक्रमण।
- अनुक्रमण के लिए नमूने कोर सुविधा में भेजें।
नोट: प्रोटोकॉल का यह हिस्सा (1) जेल बीड्स-इन इमल्शन (जीईएम) पीढ़ी और बारकोडिंग, (2) पोस्ट-जीईएम-आरटी सफाई और सीडीएनए प्रवर्धन, और (3) 3 'जीन अभिव्यक्ति पुस्तकालय निर्माण के सामान्य चरणों का पालन करता है। SNuc-Seq प्रोटोकॉल का शेष अपेक्षाकृत लंबा है, और यह अनुशंसा की जाती है कि पाठक अपने निर्माता-विशिष्ट प्रोटोकॉल का उपयोग करें। निर्माता गाइड संभवतः विशिष्ट विवरण और साथ की छवियों के साथ चरणों का वर्णन करेगा। निर्माता वेबसाइट पर 'हाउ-टू' वीडियो भी हो सकते हैं। उत्पन्न डेटासेट को एक आयामी कम फैशन में दर्शाया जा सकता है, जैसे कि एक समान कई गुना अनुमान और प्रक्षेपण (यूएमएपी; चित्र 3)। कई प्रयोगशालाएं एक अनुक्रमण कोर का उपयोग करती हैं जो उपयोगकर्ताओं के लिए इस प्रोटोकॉल का प्रदर्शन कर सकती हैं।
7. एसवी इम्यूनोस्टेनिंग और ऊतक माउंटिंग।
- यदि ऊतक का उपयोग इम्यूनोस्टेनिंग के लिए किया जाएगा, तो इसे 24-वेल प्लेट में स्थानांतरित करें, 1x पीबीएस में 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) के 200 μL में डूबा हुआ, और कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
नोट: यह माइक्रोस्कोप के नीचे सभी तरल निष्कासन, धोने और इम्यूनोस्टेनिंग करने में सहायक है। ऊतक को पाइप करते समय विज़ुअलाइज़ेशन यह सुनिश्चित करेगा कि तरल हटाने के दौरान यह दुर्घटनावश खो न जाए। एंटीबॉडी और वॉश की मात्रा को तब तक समायोजित किया जा सकता है जब तक कि मात्रा समाधान के भीतर एसवी ऊतक को जलमग्न करने के लिए पर्याप्त बड़ी हो। - निर्धारण चरण के बाद, कम (30-50) आरपीएम पर कक्षीय शेकर पर 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 1x PBS (लगभग 500 μL) में दो छोटे वॉश करके पीएफए को हटा दें। यदि भंडारण किया जाता है, तो ऊतक को 4 डिग्री सेल्सियस पर 1x पीबीएस में संग्रहीत किया जा सकता है।
- पीबीएस को निकालें और पीबीएस-टी समाधान के लगभग 300 μL में कमरे के तापमान पर न्यूनतम 1 घंटे के लिए परमेबिलाइज और ब्लॉक करें (10% भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ 1x PBS में 0.05 ट्वीन 20)।
नोट: प्राथमिक और द्वितीयक एंटीबॉडी को इस अवरुद्ध समाधान में पतला किया जाना चाहिए। - उपयोग किए गए विशेष एंटीबॉडी के विनिर्देशों के अनुसार प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ ऊतक को दाग दें, आमतौर पर रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर। शेष पीबीएस को हटा दें और पतला प्राथमिक एंटीबॉडी जोड़ें।
नोट: कमजोर पड़ने को निर्माता सुझावों, प्रकाशित डेटा, पिछले अनुभव आदि के आधार पर चुना जाना चाहिए। आमतौर पर, परीक्षण करने के लिए पहली एकाग्रता 1: 100-200 कमजोर पड़ने है। इस पेपर में प्रस्तुत उदाहरण के लिए, जीएस-आईबी 4 और डीएपीआई एंटीबॉडी प्रत्येक को 1:200 पर पतला किया गया था। यदि एक से अधिक प्रोटीन के लिए धुंधला होना, तो कई प्राथमिक एंटीबॉडी को एक ही समाधान में जोड़ा जा सकता है, जब तक कि प्रत्येक प्राथमिक एंटीबॉडी में द्वितीयक एंटीबॉडी की क्रॉस रिएक्टिविटी से बचने के लिए एक अलग मेजबान होता है। - कम आरपीएम पर ऑर्बिटल शेकर पर प्रत्येक 10 मिनट के लिए दो बार 1x पीबीएस के लगभग 500 μL का उपयोग करके ऊतक से प्राथमिक एंटीबॉडी को धोएं।
नोट: यह सुनिश्चित करना जारी रखें कि एसवी ऊतक समाधान में डूबा हुआ है, और कुएं के किनारे पर अटक नहीं गया है। - उपयोग किए गए विशेष एंटीबॉडी के विनिर्देशों के अनुसार एक द्वितीयक एंटीबॉडी के साथ दाग, आमतौर पर कम आरपीएम पर कक्षीय शेकर पर कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए। 24-वेल प्लेट को कवर करें ताकि फ्लोरोसेंटली टैग किए गए द्वितीयक एंटीबॉडी प्रकाश से सुरक्षित रहें।
नोट: यदि एक से अधिक द्वितीयक एंटीबॉडी की आवश्यकता होती है, तो द्वितीयक एंटीबॉडी को एक ही समाधान में मिलाएं। क्रॉस लेबलिंग से बचना सुनिश्चित करें। - कम आरपीएम पर ऑर्बिटल शेकर पर प्रत्येक 5 मिनट के लिए चार बार 1x पीबीएस के लगभग 500 μL का उपयोग करके ऊतक से द्वितीयक एंटीबॉडी को धोएं। 24-वेल प्लेट को प्रकाश से बचाने के लिए ढककर रखें।
- 25 मिमी अक्ष के साथ गोंद की दो छोटी लकीरें रखकर बड़ी माइक्रोस्लाइड (75 मिमी x 25 मिमी) तैयार करें, जो 18 मिमी x 18 मिमी छोटे ग्लास कवरस्लिप से छोटा है। गोंद की लकीरों के बीच में माउंटिंग अभिकर्मक (लगभग 50 μL) की एक बूंद रखें।
नोट: गोंद ऊर्ध्वाधर स्थान की एक छोटी मात्रा बनाता है ताकि जब दूसरा कवरस्लिप शीर्ष पर रखा जाता है, तो एसवी ऊतक नमूना सुरक्षित रूप से मौजूद हो सकता है, लेकिन जगह में रहना जारी रखता है। जबकि स्ट्रिया मोटाई 30-40 माइक्रोन है, आकृति विज्ञान को संरक्षित करने के लिए कांच की सतहों के बीच ऊतक को निचोड़ने से बचना चाहिए। वैकल्पिक रूप से, स्पष्ट टेप का भी उपयोग किया जा सकता है। - # 55 फोर्सप्स का उपयोग करके, एसवी के एक छोर पर जितना संभव हो उतना कम ऊतक पकड़ें और पीबीएस से बड़े माइक्रोस्लाइड (75 मिमी x 25 मिमी) पर माउंटिंग अभिकर्मक की बूंद में स्थानांतरित करें। स्लाइड पर एक छोटे ग्लास कवरस्लिप (18 मिमी x 18 मिमी) के एक छोर को रखें जहां गोंद की एक लकीर रखी गई थी और हवा के बुलबुले बनाने से बचने के लिए धीरे से छोड़ दें। कवरस्लिप अन्य गोंद लकीर पर गिर जाएगा और एसवी ऊतक को कवर करेगा।
- माउंट के प्रत्येक कोने पर पारदर्शी नेल पॉलिश की एक बूंद दबाकर माउंट को सील करें। नमूना को विज़ुअलाइज़ेशन फ़ील्ड से दूर ग्लास कवरस्लिप पर तदनुसार लेबल करें। यह अब कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी (चित्रा 4) के लिए तैयार है।
- एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप का उपयोग करके एसवी ऊतक की कल्पना करें ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि यह सपाट बिछा रहा है और किसी भी हवा के बुलबुले के पास नहीं है। यदि एसवी ऊतक सही ढंग से उन्मुख नहीं है, तो उपयोगकर्ता हवा के बुलबुले को बाहर धकेलने का प्रयास कर सकता है या छोटे ग्लास कवरस्लिप को सावधानीपूर्वक हटा सकता है और एसवी को पुनर्स्थापित कर सकता है। ग्लास कवरलिप्स को तोड़ने से बचने के लिए इसे धीरे से किया जाना चाहिए।
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Representative Results
हम एसवी को अलग करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं जिसका उपयोग या तो स्नूक-सेक या इम्यूनोस्टेनिंग के लिए किया जाता है। एसवी के सापेक्ष कोक्लेया की प्रासंगिक शारीरिक रचना (चित्रा 1) उपयोगकर्ताओं को एसवी के संगठन और विच्छेदन प्रोटोकॉल के चरणों को बेहतर ढंग से समझने में मदद कर सकती है।
पी 30 माउस से एसवी के इस माइक्रोविच्छेदन के प्रत्येक चरण को संबंधित वीडियो में विस्तृत किया गया है, और एसवी के इस विच्छेदन और अलगाव के प्रमुख चरणों के स्नैपशॉट चित्रा 2 में प्रस्तुत किए गए हैं।
स्नुक-सेक हेटरोजेनस एसवी में विभिन्न कोशिकाओं के ट्रांसक्रिप्शनल प्रोफाइल की जांच में उपयोगी है। एक तरह से इसकी कल्पना की जा सकती है 2 डी यूएमएपी (चित्रा 3) पर क्लस्टरिंग द्वारा। SNuc-Seq से उत्पन्न डेटासेट का मूल्यांकन विभिन्न डेटा विश्लेषण तकनीकों का उपयोग करके किया जा सकता है, आगे चर्चा में उल्लिखित है।
जीएस-आईबी 4 और डीएपीआई इम्यूनोलेबलिंग के साथ एसवी पूरे माउंटिंग, केसीएनजे 10-जेडएसग्रीन फ्लोरेसेंस के साथ, चित्र 4 में प्रस्तुत किए गए हैं। फ्लोरेसेंस का उपयोग करके, आसपास के ऊतकों को हटाने और बढ़ने के बाद एसवी की कल्पना की जा सकती है। इन चूहों में, जेडएसग्रीन विशेष रूप से एसवी मध्यवर्ती कोशिकाओं में व्यक्त किया जाता है। एसवी के वाहिका को लाल (एंडोथेलियल कोशिकाओं, जीएस-आईबी 4) में देखा जा सकता है।
चित्रा 1: स्ट्रिया संवहनी सेलुलर विषमता और संगठन का योजनाबद्ध। स्ट्रिया संवहनी सेलुलर विषमता और संगठन। स्ट्रिया संवहनी (एसवी) का योजनाबद्ध और कोक्लेया में संरचनाओं के साथ इसका संबंध। एसवी कोशिकाओं की तीन परतों से बना है और एंडोलिम्फ युक्त स्काला मीडिया में ईपी और उच्च पोटेशियम एकाग्रता उत्पन्न करने के लिए जिम्मेदार है। सीमांत, मध्यवर्ती और बेसल कोशिकाओं के बीच संबंध मध्यवर्ती कोशिकाओं के साथ इंटरडिजिटेट करने के लिए सीमांत विस्तारित बेसोलेटरल अनुमानों के साथ प्रदर्शित किया जाता है, जिसमें द्विदिश सेलुलर अनुमान होते हैं जो सीमांत और बेसल कोशिकाओं दोनों के साथ इंटरडिजिटेट होते हैं। इन सेल प्रकारों के अलावा, स्पिंडल कोशिकाओं (पीले), एंडोथेलियल कोशिकाओं, पेरिसाइट्स और मैक्रोफेज (नहीं दिखाए गए) सहित अन्य सेल प्रकार एसवी में मौजूद हैं। कोर्रापति एट अल .30 से अनुमति के साथ उपयोग किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 2: प्रसवोत्तर दिन 30 (पी 30+) से अधिक या उसके बराबर एक वयस्क माउस कोक्लेया का विच्छेदन। (ए) चरण 3.2 के दौरान आसपास की अस्थायी हड्डी से आंतरिक कान निष्कर्षण के दौरान नमूना। आंतरिक कान बैंगनी रंग में उल्लिखित है। (बी) चरण 4.2 के दौरान नमूना कोक्लेया की सतह और अंतर्निहित पिगमेंटेड एसवी को दर्शाता है। (सी) चरण 4.4 के दौरान नमूना जिसमें एपिकल मोड़ से निकाली गई हड्डी और उजागर एसवी (पीला तीर) दिखाया गया है। (डी) चरण 4.5 के दौरान नमूना जिसमें एपिकल और मध्य मोड़ से अधिक हड्डी के साथ कोक्लेया को दिखाया गया है। (ई) चरण 4.5 के दौरान नमूना जो मध्य मोड़ को कवर करने वाली हड्डी को हटाने को दर्शाता है, अंतर्निहित एसवी (पीला तीर) दिखाता है। (एफ) चरण 4.10 के दौरान एसवी (पीला तीर) और पार्श्व दीवार (नीला तीर) के छोटे टुकड़ों का उदाहरण। (जी) फ्लोरोसेंट जेडएसग्रीन एसवी का उदाहरण जबकि शेष पार्श्व दीवार अंधेरा रहता है। Kcnj10-जेडएसग्रीन विशेष रूप से एसवी की मध्यवर्ती कोशिकाओं में व्यक्त किया जाता है। (एच) चरण 4.12 के दौरान एसवी (पीले तीर) और पार्श्व दीवार (नीले) के बड़े टुकड़ों को अलग करने का उदाहरण। (I) चरण 4.12 के दौरान एसवी पूरी तरह से पार्श्व दीवार से अलग हो गया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 3: आरएनएलेटर-उपचारित वयस्क स्ट्रिया संवहनी से स्नुक-सेक डेटासेट का यूएमएपी प्लॉट। बाद के नाभिक अलगाव के साथ वयस्क एसवी ऊतक के आरएनएलेटर उपचार के साथ संरक्षित नमूनों को लीडेन अनुकूलन एल्गोरिथ्म के साथ एक मॉड्यूलरिटी-आधारित क्लस्टरिंग विधि द्वारा क्लस्टर किया गया था और 2 डी यूएमएपी प्लॉट द्वारा आयामी रूप से कम फैशन में कल्पना की गई थी। प्रत्येक बिंदु एक एकल कोशिका का प्रतिनिधित्व करता है, और समान ट्रांसक्रिप्शनल प्रोफाइल वाली कोशिकाओं को एक साथ क्लस्टर किया जाता है। सेल प्रकार वयस्क एसवी सेल प्रकारों द्वारा व्यक्त ज्ञात जीन की अभिव्यक्ति के आधार पर रंगीन होते हैं। नमूने आरएनएलेटर में 6 महीने से अधिक समय तक संग्रहीत नहीं किए गए थे। इस डेटासेट को उत्पन्न करने के लिए लगभग पांच सीबीए / जे पी 30 चूहों से एसवी का उपयोग किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 4. स्ट्रिया संवहनी पूरी तरह से P30 Kcnj10-ZsGreen माउस से बढ़ रही है। पी 30 माउस से एसवी पूरे की कॉन्फोकल छवि, मध्यवर्ती कोशिकाओं में जेडएसग्रीन अभिव्यक्ति, जीएस-आईबी 4 (लाल) लेबलिंग एंडोथेलियल कोशिकाओं और डीएपीआई (सफेद) लेबलिंग नाभिक का प्रदर्शन करती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
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Discussion
एकल-कोशिका अनुक्रमण के आगमन से पहले, कई शोधकर्ताओं ने थोक ऊतक विश्लेषण का उपयोग किया, जिसने केवल कोशिकाओं में औसत ट्रांसक्रिपटम्स का विश्लेषण करना संभव बना दिया। विशेष रूप से, एकल-कोशिका और स्नुक-सेक ने क्रमशः एकल कोशिका याएकल नाभिक के प्रतिलेख को अलग करना संभव बना दिया। इस उदाहरण में, एकल-नाभिक प्रतिलेख को सीमांत, मध्यवर्ती और बेसल कोशिकाओं के साथ-साथ स्पिंडल कोशिकाओं30 के लिए पहचाना जा सकता है। यह एसवी सेल प्रकारों के बीच ट्रांसक्रिप्शनल विषमता की जांच को सक्षम बनाता है और भविष्य में ईपी के उत्पादन और रखरखाव सहित एसवी फ़ंक्शन में इन सेल प्रकारों के योगदान की जांच करने के लिए उपयोग किया जा सकता है।. SNuc-Seq डेटासेट की व्याख्या के लिए जैव सूचना विज्ञान विश्लेषण करने के कई तरीके हैं। इनमें शामिल हैं लेकिन इन तक सीमित नहीं हैं: अंतर अभिव्यक्ति विश्लेषण, एकल-सेल नियामक नेटवर्क अनुमान और क्लस्टरिंग (दर्शनीय), हीटमैप या ग्रिन वायलिन प्लॉट निर्माण, और रेगुलन विश्लेषण18। एकल-कोशिका आरएनए अनुक्रमण के लिए आगे कम्प्यूटेशनल विश्लेषण तकनीक ें स्नूक-सेक के समान हैं, और ह्वांग एट अल.32, शाफर33 और चेन एट अल.34 द्वारा समीक्षाओं में अधिक विस्तार से चर्चा की गई है।
इस विच्छेदन तकनीक का अन्य प्रमुख अनुप्रयोग एसवी के भीतर चयनित संरचनाओं का बेहतर अध्ययन करने के लिए इम्यूनोस्टेनिंग है। हम इसे एक एसवी पूरे माउंट की सेटिंग में देख सकते हैं जिसे कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी (चित्रा 3) का उपयोग करके चित्रित किया गया था। सभी कोशिकाओं के नाभिक को DAPI लेबलिंग के साथ देखा जाता है। केशिकाओं को लाल रंग में जीएस-आईबी 4 के साथ एंडोथेलियल सेल धुंधला होने के माध्यम से देखा जाता है। इस मामले में, मध्यवर्ती कोशिकाओं को आनुवंशिक रूप से जेडएसग्रीन को व्यक्त करने के लिए एक मध्यवर्ती सेल-विशिष्ट प्रमोटर का उपयोग करके संशोधित किया गया है।
स्नुक-सेक की सीमाओं में शामिल हैं: (1) स्थानिक जानकारी की कमी, (2) प्रतिरक्षा कोशिका आबादी के खिलाफ पूर्वाग्रह, और (3) साइटोप्लाज्मिक आरएनए का बहिष्करण। स्थानिक ट्रांसक्रिप्टोमिक तकनीक ऊतक35 के भीतर सेलुलर उप-आबादी के बारे में अधिक विशिष्ट जानकारी प्रदान कर सकती है। स्नुक-सेक और एकल-सेल आरएनए अनुक्रमण के बीच प्रोटोकॉल अंतर को देखते हुए, जैसे ऊतक पृथक्करण और भंडारण, एसएनयूसी-सेक-उत्पन्न ट्रांसक्रिप्शनल प्रोफाइल प्रतिरक्षा कोशिकाओं के खिलाफ पूर्वाग्रह कर सकता है, जबकि संलग्न सेल प्रकार36 को चिह्नित करने में अधिक शक्तिशाली हो सकता है। इसके अलावा, एकल-कोशिका आरएनए अनुक्रमण में माइटोकॉन्ड्रियल आरएनए जैसे साइटोप्लाज्मिक आरएनए शामिल हैं, जबकि एसएनयूसी-सेक नहीं है। दो विधियों के बीच ट्रांसक्रिप्शनल अंतर के इन उदाहरणों के बावजूद, यह प्रदर्शित किया गया है कि, बड़े पैमाने पर, एसएनयूसी-सेक में पूरे एकल-सेल आरएनए अनुक्रमण37 के समान ट्रांसक्रिप्शनल प्रोफाइल है, और विशेष रूप सेएसवी में 30।
सफल माइक्रोडिसेक्शन के लिए, जागरूक होने के लिए कई महत्वपूर्ण कदम हैं। पहले कुछ चरणों में, अंतर्निहित कोक्लेया को कुचलने से बचने के लिए आंतरिक कान को ठीक से निकालना चाहिए। उचित अस्थायी हड्डी निष्कर्षण का अवलोकन चित्रा 2 ए में दिखाया गया है। एक बार जब कोक्लेया ठीक से उजागर हो जाता है, तो अंतर्निहित पार्श्व दीवार और एसवी को उजागर करने के लिए कोक्लियर हड्डी को धीरे से खुरचने और तोड़ने के लिए देखभाल की जानी चाहिए। एक बार पार्श्व दीवार और एसवी सफलतापूर्वक निकाले जाने के बाद, उपयोगकर्ता को पार्श्व दीवार से एसवी को सावधानीपूर्वक अलग करना चाहिए। नाजुक एसवी को नुकसान से बचाते हुए, पार्श्व दीवार से एसवी को देखने के लिए सही विमान में पर्याप्त बल लागू किया जाना चाहिए। एसवी माइक्रोडिसेक्शन के लिए, "कोक्लेया से एसवी को विच्छेदित करने" के बजाय "एसवी से दूर अन्य संरचनाओं को विच्छेदित करने" के बारे में सोचना उपयोगी हो सकता है।
इस प्रोटोकॉल को चूहों की विभिन्न उम्र और विभिन्न स्तनधारी प्रजातियों, जैसे चूहों के लिए संशोधित किया जा सकता है। युवा चूहों के लिए, ऊतक बनावट में भिन्न होंगे और संरचनाएं सामान्य रूप से छोटी होंगी। विभिन्न स्तनधारी प्रजातियों के लिए, कॉक्लियर शरीर रचना अपेक्षाकृत समान होगी, जिसमें जानवर का आकार अंतर के बहुमत का निर्धारण करेगा।
सामान्य तौर पर, इस प्रोटोकॉल की कमियां अन्य कॉक्लियर माइक्रोडिसेक्शन तकनीकोंके समान हैं। नाजुक एसवी को अलग करना तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण हो सकता है और इसे छोटे टुकड़ों में तोड़ा जा सकता है।
यह तकनीक पूरे माउंटिंग के लिए कोर्टी के अंग को बचाने के लिए इष्टतम नहीं है क्योंकि यह अक्सर इस प्रोटोकॉल के साथ क्षतिग्रस्त हो जाता है। अन्य विच्छेदन तकनीकें मौजूद हैं जिनका उद्देश्य विशेष रूप से पूरे माउंटिंग और इम्यूनोस्टेनिंग38 के लिए कोर्टी के अंग को संरक्षित करना है, लेकिन इनकी अपनी कमियां हैं, यह देखते हुए कि आरएनए क्षरण से बचने के लिए एसएनयूसी-सेक को ताजा नमूनों के साथ किया जाना चाहिए, न कि ऊतक निर्धारण और डीकैल्सीफिकेशन की स्थापना में।
समय और पुनरावृत्ति के साथ, उपयोगकर्ता इस एसवी माइक्रोडिसेक्शन प्रोटोकॉल के साथ अधिक सहज हो जाएंगे।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।
Acknowledgments
इस शोध को एनआईएच, एनआईडीसीडी के इंट्राम्यूरल रिसर्च प्रोग्राम द्वारा एमएच (DC000088) द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10-µm filter (Polyethylenterephthalat) | PluriSelect | #43-50010-01 | Filter tissue during sNuc-Seq |
| 18 x 18 mm cover glass | Fisher Scientific | 12-541A | Cover slip to mount SV |
| 30-µm filter (Polyethylenterephthalat) | PluriSelect | #43-50030-03 | Filter tissue during sNuc-Seq |
| 75 x 25 mm Superfrost Plus/Colorforst Plus Microslide | Daigger | EF15978Z | Microslide to mount SV on |
| C57BL/6J Mice | The Jackson Laboratory | RRID: IMSR_JAX:000664 | General purpose mouse strain that has pigment more easily seen in the intermediate cells of the SV. |
| Cell Counter | Logos Biosystems | L20001 | Used for cell counting |
| Chalizon curette 5'', size 3 2.5 mm | Biomedical Research Instruments | 15-1020 | Used to transfer SV |
| Chromium Next GEM single Cell 3' GEM Kit v3.1 | Chromium | PN-1000141 | Generates single cell 3' gene expression libraries |
| Clear nail polish | Fisher Scientific | NC1849418 | Used for sealing SV mount |
| Corning Falcon Standard Tissue Culture Dishes, 24 well | Corning | 08-772B | Culture dish used to hold specimen during dissection |
| DAPI | Invitrogen | D1306, RRID: AB_2629482 | Stain used for nucleus labeling |
| Dounce homogenizer | Sigma-Aldrich | D8938 | Used to homogenize tissue for sNuc-seq |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | General forceps for dissection |
| Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | Forceps with fine tip that makes SV manipulation easier |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher | 16000044 | Used for steps of sNuc-Seq |
| Glue stick | Fisher Scientific | NC0691392 | Used for mounting SV |
| GS-IB4 Antibody | Molecular Probes | I21411, RRID: AB-2314662 | Antibody used for capillary labeling |
| KCNJ10-ZsGreen Mice | n/a | n/a | Transgenic mouse that expresses KCNJ10-ZsGreen, partiularly in the intermediate cells of the SV. |
| MgCl2 | ThermoFisher | AM9530G | Used for steps of sNuc-Seq |
| Mounting reagent | ThermoFisher | #S36940 | Mounting reagent for SV |
| Multiwell 24 well plate | Corning | #353047 | Plate used for immunostaining |
| NaCl | ThermoFisher | AAJ216183 | Used for steps of sNuc-Seq |
| Nonidet P40 | Sigma-Aldrich | 9-16-45-9 | Used for steps of sNuc-Seq |
| Nuclease free water | ThermoFisher | 4387936 | Used for steps of sNuc-Seq |
| Orbital shaker | Silent Shake | SYC-2102A | Used for steps of immunostaining |
| PBS | ThermoFisher | J61196.AP | Used for steps of immunostaining and dissection |
| RNA Later | Invitrogen | AM7021 | Used for preservation of SV for sNuc-Seq |
| Scizzors | Fine Science Tools | 14058-09 | Used for splitting mouse skull |
| Tris-HCl | Sigma-Aldrich | 15506017 | Used for steps of sNuc-Seq |
| Trypan blue stain | Gibco | 15250061 | Used for cell counting |
| Tween20 | ThermoFisher | AAJ20605AP | Used for steps of sNuc-Seq |
| Zeiss STEMI SV 11 Apo stereomicroscope | Zeiss | n/a | Microscope used for dissections |
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