Summary
La strie vasculaire est vitale pour la génération du potentiel endocochléaire. Ici, nous présentons la dissection de la strie vasculaire de la souris adulte pour le séquençage mononucléaire ou l’immunomarquage.
Abstract
Le potentiel endocochléaire, qui est généré par la strie vasculaire, est essentiel pour maintenir un environnement propice à une mécanotransduction appropriée des cellules ciliées et, finalement, à l’audition. Les pathologies de la strie vasculaire peuvent entraîner une diminution de l’audition. La dissection de la strie vasculaire adulte permet la capture focalisée d’un seul noyau, puis le séquençage et l’immunomarquage d’un seul noyau. Ces techniques sont utilisées pour étudier la physiopathologie de la strie vasculaire au niveau unicellulaire.
Le séquençage mononucléal peut être utilisé dans le cadre de l’analyse transcriptionnelle de la strie vasculaire. Pendant ce temps, l’immunomarquage continue d’être utile pour identifier des populations spécifiques de cellules. Les deux méthodes nécessitent une dissection appropriée de la strie vasculaire comme condition préalable, ce qui peut s’avérer techniquement difficile.
Introduction
La cochlée se compose de trois chambres remplies de liquide, la scala vestibuli, la scala media et la scala tympan. La scala vestibuli et la scala tympani contiennent chacune de la périlymphe, qui a une forte concentration de sodium (138 mM) et une faible concentration de potassium (6,8 mM)1. La scala media contient de l’endolymphe, qui a une forte concentration de potassium (154 mM) et une faible concentration de sodium (0,91 mM)1,2,3. Cette différence de concentration ionique peut être appelée potentiel endocochléaire (EP) et est principalement générée par le mouvement des ions potassium à travers divers canaux ioniques et jonctions lacunaires dans la strie vasculaire (SV) le long de la paroi latérale de la cochlée 4,5,6,7,8,9,10,11 . Le SV est un tissu hétérogène hautement vascularisé qui tapisse la face médiale de la paroi latérale de la cochlée et contient trois principaux types de cellules : les cellules marginales, intermédiaires et basales12 (Figure 1).
Les cellules marginales sont reliées par des jonctions serrées pour former la surface la plus médiale du SV. La membrane apicale fait face à l’endolymphe de la scala moyenne et contribue au transport des ions potassium dans l’endolymphe en utilisant divers canaux, y compris KCNE1 / KCNQ1, SLC12A2 et Na+-K+-ATPase (NKA)5,10,13,14. Les cellules intermédiaires sont des cellules pigmentées qui résident entre les cellules marginales et basales et facilitent le transport du potassium à travers le SV en utilisant KCNJ10 (Kir 4.1)15,16. Les cellules basales se trouvent à proximité de la paroi latérale de la cochlée et sont étroitement associées aux fibrocytes du ligament spiralé pour favoriser le recyclage du potassium de la périlymphe12. La pathologie du SV a été impliquée dans de nombreux troubles otologiques17,18. Les mutations dans les gènes exprimés dans les principaux types de cellules SV, tels que Kcnq1, Kcne1, Kcnj10 et Cldn11, peuvent causer la surdité et le dysfonctionnement de SV, y compris la perte de EP 19,20,21,22,23. En plus des trois principaux types cellulaires, il existe d’autres types de cellules moins étudiés dans le SV, tels que les cellules fusiformes 22, les cellules racinaires12,24, les macrophages 25, les péricytes 26 et les cellules endothéliales 27, qui ont des rôles incomplètement définis impliquant l’homéostasie ionique et la génération de EP 28.
Par rapport au séquençage de l’ARN en vrac, le séquençage de l’ARN à noyau unique (sNuc-Seq) fournit des informations sur l’hétérogénéité cellulaire, plutôt qu’une moyenne de l’ARNm dans un groupe de cellules29, et peut être particulièrement utile lors de l’étude de l’hétérogène SV30. Par exemple, sNuc-Seq a produit une analyse transcriptionnelle qui suggère qu’il pourrait y avoir un rôle pour les cellules fusiformes et racinaires dans la génération de PE, la perte auditive et la maladie de Ménière18. Une caractérisation transcriptionnelle plus poussée des différents types de cellules SV peut nous fournir des informations précieuses sur la physiopathologie sous-jacente aux différents mécanismes et sous-types de fluctuation auditive et de perte auditive liée à la SV. La récolte de ces structures délicates de l’oreille interne est d’une importance primordiale pour une analyse tissulaire optimale.
Dans cette étude, l’approche de microdissection pour accéder à la strie vasculaire et l’isoler de la cochlée de souris adulte pour sNuc-Seq ou immunomarquage est décrite. La dissection de la SV de souris adulte est nécessaire pour comprendre divers types de cellules SV et caractériser davantage leur rôle dans l’audition.
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Protocol
Toutes les expériences et procédures sur les animaux ont été effectuées conformément aux protocoles approuvés par le Comité de soin et d’utilisation des animaux de l’Institut national des maladies neurologiques et des accidents vasculaires cérébraux et l’Institut national sur la surdité et autres troubles de la communication, National Institutes of Health. Tous les protocoles expérimentaux ont été approuvés par le Comité de soin et d’utilisation des animaux de l’Institut national des maladies neurologiques et des accidents vasculaires cérébraux et l’Institut national sur la surdité et autres troubles de la communication, National Institutes of Health. Toutes les méthodes ont été appliquées conformément aux directives et règlements pertinents du Comité de soin et d’utilisation des animaux de l’Institut national des maladies neurologiques et des accidents vasculaires cérébraux et de l’Institut national sur la surdité et autres troubles de la communication, National Institutes of Health.
1. Euthanasie animale
- Utilisez des souris transgéniques C57BL/6J ou Kcnj10-ZsGreen, jour 30+ postnatal (P30+), qui pèsent entre 15 et 20 g.
- Euthanasier une souris adulte (âge P30 ou plus) en utilisant un protocole approuvé (ici l’asphyxie au CO2 ). Effectuez la décapitation comme étape secondaire.
REMARQUE: En cas d’immunomarquage, certains anticorps peuvent avoir un signal de fond en raison d’une liaison non spécifique au sang dans les capillaires de la SV. La perfusion cardiaque avec fixateur peut résoudre ce problème en retirant le sang des capillaires du SV. Cependant, la plupart des anticorps peuvent obtenir de bons résultats sans cette méthode, et elle ne sera pas couverte par ce protocole.
2. Exposer le labyrinthe osseux
- Nettoyez la souris en pulvérisant avec de l’éthanol à 70% et en l’essuyant avec une serviette en papier. Portez une attention particulière à la région de la tête pour réduire le risque de contamination. Enlevez la peau du crâne en tirant la peau vers le nez.
- À l’aide de ciseaux tranchants, fendez le crâne le long du plan médio-sagittal pour séparer les parties gauche et droite.
- Retirez le cerveau du crâne pour exposer le labyrinthe osseux.
3. Extraction de l’oreille interne
- Identifiez l’oreille interne dans l’os temporal (Figure 2A) et grattez les nerfs crâniens à l’aide d’une pince #55.
REMARQUE: L’utilisateur doit stabiliser l’échantillon avec sa main non dominante à l’aide d’un deuxième jeu de pinces #55. Différentes zones de l’échantillon peuvent être saisies avec la pince stabilisatrice tout au long de la dissection si les zones critiques de l’échantillon sont évitées (p. ex., ne pas écraser la cochlée). - À l’aide de la pince #55, disséquez la bulle et la capsule, en les détachant de l’os environnant. Retirez tous les tissus mous restants de la surface de l’oreille interne.
- Transférer l’échantillon dans une boîte de culture tissulaire transparente contenant 1x PBS froid (solution saline tamponnée au phosphate), pH 7,4, et placer sous une lunette de dissection (figure 2B).
4. Dissection SV
REMARQUE: Avec de la pratique, il est possible de disséquer le SV comme une longue pièce ressemblant à un ruban. Le SV est fragile, donc s’il se brise en morceaux, ceux-ci peuvent être stockés ensemble. Alternativement, ceux-ci peuvent être stockés dans des puits étiquetés séparément en fonction de leur tour (par exemple, basal, moyen, apical).
- Si les sources lumineuses de la lunette de dissection peuvent être déplacées, placez une lumière au-dessus de l’antenne parabolique et la deuxième source lumineuse sur le côté, parallèlement à la surface de dissection. Cela permet un meilleur contraste du tissu sous l’os cochléaire.
- À l’aide d’une pince #55, tenez le spécimen par la partie vestibulaire avec la cochlée tournée vers le haut.
- À l’aide de la pince #55, percez l’os cochléaire à l’apex.
REMARQUE: Les pinces #5 sont plus épaisses que #55 et peuvent être utilisées pour casser les os, mais l’augmentation de la taille / force sacrifie la finesse des pinces et la capacité de manipuler de petits tissus. Envisagez d’utiliser des pinces fabriquées avec un matériau tel que l’inox ou le dumostar pour éviter les dommages qui pourraient survenir aux pinces plus délicates. Évitez d’enfoncer la pince trop profondément sous l’os pour éviter d’endommager le SV. - À l’aide de la pince #55, gratter le long du tour apical (Figure 2C), en appliquant une force douce pour détacher de petits morceaux de la couche osseuse externe. Soulevez doucement l’os et détachez-le de la paroi latérale.
NOTE: Il peut être utile de penser à cette dissection comme « enlever tout du SV », plutôt que de « disséquer le SV hors de la cochlée ». - Continuez à utiliser les pinces #55 pour retirer les morceaux d’os cochléaire des tours apical et moyen (Figure 2D,E). En poussant doucement le long de la paroi latérale, soulevez et retirez les morceaux de paroi osseuse vers le virage du milieu pour exposer la paroi latérale des virages apical et moyen.
- En continuant à utiliser la pince #55, poussez doucement la paroi latérale du virage apical de côté pour exposer le ganglion en spirale. Détachez la paroi latérale des spires apicales et moyennes du ganglion en spirale le long de la couche externe des cellules ciliées. Retirez des morceaux de ganglion en spirale de l’intérieur de la cochlée.
REMARQUE: Les pinces #55 sont plus petites et offrent un avantage lors de la manipulation de tissus petits et délicats. Des précautions supplémentaires doivent être prises pour éviter de les plier ou de les endommager. - Pour avoir un meilleur accès à la paroi latérale du tour basal, détachez la cochlée de la partie vestibulaire de l’os temporal à l’aide d’une pince #55. Placez la pince #55 dans la fenêtre ronde et ovale et poussez vers le bas vers le vestibule. La cochlée se détachera. Retirez la partie vestibulaire de l’oreille interne.
- En continuant à utiliser les pinces #55, retirez maintenant les morceaux d’os cochléaire basal, en commençant par la zone de virage du milieu. Poussez doucement la couche de paroi latérale sous l’os pour le détacher.
- Enlevez la partie basale la plus éloignée de la paroi latérale en retirant et en tirant doucement le tissu. L’os dans cette région peut être trop épais pour être enlevé sans endommager les tissus mous en dessous.
- Maintenant, avec la partie basale de la paroi latérale détachée, séparez autant que possible la paroi latérale de la cochlée. Cela peut être fait en traçant la pince #55 le long de la paroi latérale. Brossez doucement la pince entre l’os et la paroi latérale restante. Cela peut être fait jusqu’au sommet en un seul morceau si l’utilisateur est expérimenté. Déplacez la paroi latérale vers un nouveau PBS.
REMARQUE : Bien que les plus gros morceaux de SV puissent être plus faciles à imager, étant donné la nature délicate des tissus, des morceaux plus petits peuvent être prélevés (Figure 2F, G) et, selon la taille, peuvent également fonctionner pour l’imagerie. - Utilisez des pinces #55 pour poser la paroi latérale à plat. Le SV doit être visible sous la forme d’une couche de tissu plus foncée sur le côté interne de la paroi latérale.
REMARQUE : Les utilisateurs peuvent constater, particulièrement près de l’extrémité apicale, qu’une partie du tissu SV se détache accidentellement de la paroi latérale tout au long de la dissection. - Retirez doucement la couche SV pour la détacher de la paroi latérale à son extrémité basale (Figure 2H). Écartez doucement le SV détaché et déplacez la pince plus loin vers l’extrémité apicale de la paroi latérale, en détachant le SV comme un long ruban si possible (Figure 2I). Ne pressez pas le SV avec une pince pour le tirer. Si le tissu est trop fragile pour être saisi, il peut également être prélevé à l’aide d’une cuillère de tissu, telle qu’une curette chalazion.
REMARQUE: Le déplacement du SV doit toujours être effectué sous microscopie optique pour s’assurer qu’il n’est pas perdu. Soyez toujours prudent lorsque vous saisissez à l’aide de forceps en raison du risque de dommages. Les utilisateurs peuvent constater que l’utilisation de chalazion curette atténue le risque de dommages aux tissus SV. Pour le séquençage mononoyau, passez à la section 5. Pour l’immunocoloration par SV, passez à la rubrique 7.
5. Suspension mononoyau SV
REMARQUE: Ce protocole est adapté pour le tissu SV spécifiquement à partir d’un protocole de suspension mononoyau publié par le fabricant. Des plates-formes de différents fabricants peuvent être utilisées31. Compte tenu des variations propres à la plate-forme, il est recommandé de revoir le protocole spécifique au fabricant fourni avec l’équipement. Pour obtenir des résultats optimaux pour sNuc-Seq et minimiser la dégradation de l’ARN, plus la dissection tissulaire est rapide, mieux c’est (recommandé dans les 15 à 20 minutes suivant l’euthanasie). Il peut être utile d’euthanasier un animal à la fois et seulement lorsqu’il est prêt à le disséquer. Le fait que plusieurs personnes travaillent simultanément sur les dissections peut également éliminer le temps de dégradation (p. ex., un membre du personnel de laboratoire travaille sur l’oreille gauche tandis qu’un autre travaille sur l’oreille droite).
- Si le tissu SV doit être utilisé pour le sNuc-Seq, placer le tissu dans un tampon de lyse réfrigéré (10 mM Tris-HCl, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 0,005% nonidet P40 dans de l’eau sans nucléase).
REMARQUE : Si le séquençage doit être effectué immédiatement après la dissection, poursuivez le protocole. Si l’on souhaite mettre en pause le protocole, la préservation de SV est possible en plaçant le SV dans RNAlater. Conserver toute la nuit à 4 °C, puis congeler dans de l’azote liquide et conserver à -80 °C jusqu’à ce qu’il soit prêt à être utilisé. Lorsque vous êtes prêt à l’emploi, décongeler et laver deux fois dans du PBS pendant 5 minutes chacun, puis procéder à l’homogénéisation (étape 5.2). - Homogénéiser le tissu dans un homogénéisateur de rebond de 2 ml avec 10-20 coups sur la glace.
REMARQUE: Le cylindre de verre entrera en contact manuellement avec le fond du tube de verre, fragmentant le SV. Le SV est délicat, donc 20 coups permettent généralement une homogénéisation réussie. - Lyser le tissu sur la glace pendant 25 min.
REMARQUE: Le temps de lyse varie selon le type de tissu. Une lyse de 25 minutes dans le tissu SV peut atteindre une faible viabilité cellulaire (moins de 4%), mais le temps peut être adapté si la viabilité cellulaire est trop élevée (étape 5.8). - Filtrer à travers un filtre de 30 μm et faire tourner le filtrat à 500 x g pendant 5 min à 4 °C.
- Retirer le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire dans 1 mL de tampon de lavage et de remise en suspension des noyaux (1x PBS, albumine sérique bovine à 1 % [BSA], inhibiteur de la RNase 0,2U/μL).
- Filtrer les cellules à travers un filtre de 10 μm et centrifuger à 500 x g pendant 5 min à 4 °C.
- Retirer le surnageant et remettre en suspension dans 50 μL de tampon de lavage et de remise en suspension des noyaux.
- Compter les noyaux à l’aide d’un compteur de cellules et d’une coloration bleue au trypan. Diluer 5 μL de la suspension cellulaire dans 50 μL de 1x PBS pour le comptage cellulaire; La viabilité devrait être minime (3 % à 4 %) à ce stade. Si la viabilité s’avère plus élevée, adapter le protocole pour l’étape 5.3 (lyse) et normaliser le temps de lyse pour assurer une lyse adéquate des cellules.
REMARQUE: Une viabilité cellulaire élevée dans une préparation à un seul noyau signifie qu’il y a plus de cellules intactes que souhaité, et qu’une digestion supplémentaire peut être nécessaire. - Chargez l’échantillon avec la densité nucléaire souhaitée sur l’appareil/puce du fabricant (voir le guide du fabricant). Les captures à noyau unique sont maintenant prêtes.
REMARQUE : À partir d’une souris adulte SV, on obtient habituellement 50 μL de la suspension à une concentration de 150 000 noyaux/mL.
6. Séquençage mononoyau SV
- Envoyez les échantillons à l’installation centrale pour le séquençage.
REMARQUE: Cette partie du protocole suit les étapes générales de (1) la génération et le codage à barres de l’émulsion de billes de gel (GEM), (2) le nettoyage post-GEM-RT et l’amplification de l’ADNc, et (3) la construction de la bibliothèque d’expression génique 3'. Le reste du protocole sNuc-Seq est relativement long, et il est recommandé aux lecteurs d’utiliser leur protocole spécifique au fabricant. Le guide du fabricant décrira probablement les étapes avec des détails spécifiques et des images d’accompagnement. Il peut également y avoir des vidéos pratiques sur le site Web du fabricant. Les ensembles de données générés peuvent être représentés de manière dimensionnelle réduite, telle qu’une approximation et une projection de variété uniforme (UMAP; Graphique 3). De nombreux laboratoires utilisent un noyau de séquençage qui peut exécuter ce protocole pour les utilisateurs.
7. Immunomarquage SV et montage tissulaire
- Si le tissu doit être utilisé pour l’immunomarquage, transférez-le dans une plaque de 24 puits, immergée dans 200 μL de paraformaldéhyde (PFA) à 4% dans 1x PBS et incuber pendant 20 minutes à température ambiante.
REMARQUE: Il est utile d’effectuer tout l’élimination des liquides, le lavage et l’immunocoloration sous un microscope. La visualisation lors du pipetage du tissu garantira qu’il n’est pas perdu accidentellement lors de l’élimination du liquide. Les volumes des anticorps et des lavages peuvent être ajustés tant que le volume est suffisamment important pour immerger le tissu SV dans la solution. - Après l’étape de fixation, retirer le PFA en effectuant deux courts lavages dans 1x PBS (environ 500 μL) à 4 °C pendant 5 minutes chacun sur un agitateur orbital à bas régime (30-50) RPM. En cas de stockage, le tissu peut être stocké dans 1x PBS à 4 °C.
- Retirer le PBS et perméabiliser et bloquer pendant au moins 1 h à température ambiante dans environ 300 μL de solution PBS-T (0,05 Tween20 dans 1x PBS avec 10% de sérum fœtal bovin).
REMARQUE : Les anticorps primaires et secondaires doivent être dilués dans cette solution bloquante. - Colorer le tissu avec l’anticorps primaire selon les spécifications de l’anticorps particulier utilisé, généralement pendant une nuit à 4 ° C. Retirez le PBS restant et ajoutez l’anticorps primaire dilué.
NOTA: La dilution doit être choisie en fonction des suggestions du fabricant, des données publiées, de l’expérience antérieure, etc. Habituellement, la première concentration à tester est une dilution de 1:100-200. Pour l’exemple présenté dans cet article, les anticorps GS-IB4 et DAPI ont chacun été dilués à 1:200. En cas de coloration pour plus d’une protéine, plusieurs anticorps primaires peuvent être combinés dans la même solution, à condition que chaque anticorps primaire ait un hôte différent pour éviter la réactivité croisée des anticorps secondaires. - Laver l’anticorps primaire du tissu en utilisant environ 500 μL de 1x PBS deux fois pendant 10 minutes chacun sur un agitateur orbital à bas régime.
REMARQUE : Continuez à vous assurer que le tissu SV est immergé dans la solution et non coincé sur le côté du puits. - Coloration avec un anticorps secondaire selon les spécifications de l’anticorps particulier utilisé, généralement pendant 2 h à température ambiante sur un agitateur orbital à bas régime. Couvrir la plaque de 24 puits afin que l’anticorps secondaire marqué par fluorescence soit protégé de la lumière.
REMARQUE : Si plus d’un anticorps secondaire est nécessaire, combinez les anticorps secondaires dans la même solution. Assurez-vous d’éviter l’étiquetage croisé. - Laver l’anticorps secondaire du tissu en utilisant environ 500 μL de 1x PBS quatre fois pendant 5 minutes chacun sur un agitateur orbital à bas régime. Gardez la plaque de 24 puits couverte pour la protéger de la lumière.
- Préparez la plus grande lame microscopique (75 mm x 25 mm) en plaçant deux petites traînées de colle le long de l’axe de 25 mm, juste plus petites que la lamelle de verre plus petite de 18 mm x 18 mm. Placez une goutte de réactif de montage (environ 50 μL) entre les traînées de colle.
REMARQUE: La colle crée une petite quantité d’espace vertical de sorte que lorsque le deuxième couvercle est placé sur le dessus, l’échantillon de tissu SV peut exister en toute sécurité, mais continuer à rester en place. Bien que l’épaisseur de la strie soit de 30 à 40 microns, il faut éviter de presser le tissu entre les surfaces vitrées pour préserver la morphologie. Alternativement, du ruban adhésif transparent peut également être utilisé. - À l’aide de pinces #55, saisir le moins de tissu possible à une extrémité du SV et transférer du PBS à la goutte de réactif de montage sur la plus grande microlame (75 mm x 25 mm). Placez une extrémité d’une petite glissière de verre (18 mm x 18 mm) sur la glissière où une traînée de colle a été placée et relâchez-la doucement pour éviter de créer des bulles d’air. Le couvercle tombera sur l’autre traînée de colle et couvrira le tissu SV.
- Scellez le support en tamponnant une goutte de vernis à ongles transparent sur chaque coin du support. Étiquetez l’échantillon en conséquence sur le couvercle en verre loin du champ de visualisation. Il est maintenant prêt pour la microscopie confocale (Figure 4).
- Visualisez le tissu SV à l’aide d’un microscope à dissection pour vous assurer qu’il est posé à plat et non près de bulles d’air. Si le tissu SV n’est pas orienté correctement, l’utilisateur peut tenter d’expulser les bulles d’air ou retirer soigneusement le plus petit capot en verre et repositionner le SV. Cela doit être fait doucement pour éviter de casser les lamelles de couvercle.
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Representative Results
Nous présentons une méthode pour isoler le SV à utiliser pour le sNuc-Seq ou l’immunomarquage. L’anatomie pertinente (Figure 1) de la cochlée par rapport à la SV peut aider les utilisateurs à mieux comprendre l’organisation de la SV et les étapes du protocole de dissection.
Chaque étape de cette microdissection de SV à partir d’une souris P30 est détaillée dans la vidéo associée, et des instantanés des étapes clés de cette dissection et de l’isolement de SV sont présentés à la figure 2.
sNuc-Seq est utile pour étudier le profil transcriptionnel des différentes cellules du SV hétérogène. Une façon de visualiser cela est de regrouper sur un UMAP 2D (Figure 3). L’ensemble de données généré à partir de sNuc-Seq peut être évalué à l’aide de différentes techniques d’analyse de données, décrites plus en détail dans la discussion.
Le montage complet SV avec immunomarquage GS-IB4 et DAPI, ainsi que la fluorescence Kcnj10-ZsGreen, sont présentés à la figure 4. En utilisant la florescence, le SV peut être visualisé après avoir retiré les tissus environnants et le montage. Chez ces souris, ZsGreen est exprimé en particulier dans les cellules intermédiaires SV. Le système vasculaire du SV peut être visualisé en rouge (cellules endothéliales, GS-IB4).
Figure 1 : Schéma de l’hétérogénéité et de l’organisation cellulaires de la strie vasculaire. Stria vascularis hétérogénéité cellulaire et organisation. Schéma de la strie vasculaire (SV) et de sa relation avec les structures de la cochlée. Le SV est composé de trois couches de cellules et est responsable de la génération d’EP et d’une concentration élevée de potassium dans le milieu scalaire contenant l’endolymphe. La relation entre les cellules marginales, intermédiaires et basales est démontrée avec les projections basolatérales marginales étendues pour interdigiter avec les cellules intermédiaires, qui ont des projections cellulaires bidirectionnelles qui interdigitent avec les cellules marginales et basales. En plus de ces types de cellules, d’autres types de cellules, y compris les cellules fusiformes (jaune), les cellules endothéliales, les péricytes et les macrophages (non représentés) sont présents dans le SV. Utilisé avec la permission de Korrapati et al.30. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Dissection d’une cochlée de souris adulte à un niveau supérieur ou égal au 30e jour postnatal (P30+). (A) Échantillon lors de l’extraction de l’oreille interne de l’os temporal environnant au cours de l’étape 3.2. L’oreille interne est soulignée en violet. (B) Échantillon à l’étape 4.2 montrant la surface de la cochlée et le SV pigmenté sous-jacent. (C) Échantillon à l’étape 4.4 montrant l’os retiré de la rotation apicale et le SV exposé (flèche jaune). (D) Échantillon à l’étape 4.5 montrant la cochlée avec plus d’os enlevé des tours apical et médian. (E) Spécimen à l’étape 4.5 montrant l’enlèvement de l’os recouvrant le virage du milieu, montrant le SV sous-jacent (flèche jaune). (F) Exemple de petits morceaux de SV (flèche jaune) et de la paroi latérale (flèche bleue) à l’étape 4.10. (G) Exemple de ZsGreen SV fluorescent alors que la paroi latérale restante reste sombre. Kcnj10-ZsGreen est particulièrement exprimé dans les cellules intermédiaires du SV. (H) Exemple de morceaux plus grands de SV (flèche jaune) et de la paroi latérale (bleu) séparés à l’étape 4.12. (I) Le SV s’est complètement séparé de la paroi latérale au cours de l’étape 4.12. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Diagramme UMAP des ensembles de données sNuc-Seq d’une strie vasculaire adulte traitée par ARN plus tard. Les échantillons conservés avec un traitement ARN ultérieur du tissu SV adulte avec isolement ultérieur des noyaux ont été regroupés par une méthode de clustering basée sur la modularité avec l’algorithme d’optimisation Leiden et visualisés de manière dimensionnelle réduite par un tracé UMAP 2D. Chaque point représente une seule cellule, et les cellules ayant des profils transcriptionnels similaires sont regroupées. Les types cellulaires sont colorés en fonction de leur expression de gènes connus exprimés par les types de cellules SV adultes. Les échantillons ont été stockés dans RNAlater pendant pas plus de 6 mois. Le SV d’environ cinq souris CBA/J P30 a été utilisé pour générer cet ensemble de données. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Graphique 4. Stria vascularis montage entier à partir d’une souris P30 Kcnj10-ZsGreen. Image confocale du montage entier de SV à partir d’une souris P30, démontrant l’expression de ZsGreen dans les cellules intermédiaires, les cellules endothéliales de marquage GS-IB4 (rouge) et les noyaux de marquage DAPI (blanc). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Avant l’avènement du séquençage unicellulaire, de nombreux chercheurs utilisaient l’analyse tissulaire en vrac, qui ne permettait que d’analyser les transcriptomes moyennés entre les cellules. En particulier, single-cell et sNuc-Seq ont permis d’isoler le transcriptome d’une seule cellule ou d’un seul noyau, respectivement32. Dans ce cas, les transcriptomes mononucléaux peuvent être identifiés pour les cellules marginales, intermédiaires et basales, ainsi que pour les cellules fusiformes30. Cela permet d’étudier l’hétérogénéité transcriptionnelle entre les types de cellules SV et peut être utilisé à l’avenir pour étudier la contribution de ces types de cellules à la fonction SV, y compris la génération et le maintien de l’EP. Les ensembles de données générés à l’aide de sNuc-Seq peuvent être affichés de manière dimensionnelle réduite pour faciliter la compréhension des différences transcriptionnelles globales et comparer différentes populations cellulaires à l’aide d’un graphique UMAP Figure 4. Il existe de nombreuses façons d’effectuer des analyses bioinformatiques pour l’interprétation des ensembles de données sNuc-Seq. Ceux-ci incluent, sans toutefois s’y limiter: l’analyse d’expression différentielle, l’inférence et le regroupement de réseaux de régulation de cellules uniques (SCENIC), la construction de cartes thermiques ou de tracés de violon grin et l’analyse de régulation18. D’autres techniques d’analyse informatique pour le séquençage de l’ARN unicellulaire sont similaires à sNuc-Seq et sont discutées plus en détail dans les revues de Hwang et al.32, Shafer33 et Chen et al.34.
L’autre application majeure de cette technique de dissection est l’immunomarquage pour mieux étudier les structures sélectionnées au sein du SV. Nous pouvons observer cela dans le réglage d’une monture SV entière qui a été imagée par microscopie confocale (Figure 3). Les noyaux de toutes les cellules sont visualisés avec un marquage DAPI. Les capillaires sont vus via la coloration des cellules endothéliales avec GS-IB4 en rouge. Les cellules intermédiaires, dans ce cas, ont été génétiquement modifiées en utilisant un promoteur cellulaire intermédiaire spécifique pour exprimer ZsGreen.
Les limites de sNuc-Seq comprennent: (1) le manque d’informations spatiales, (2) les biais contre les populations de cellules immunitaires et (3) l’exclusion de l’ARN cytoplasmique. Les techniques de transcriptomique spatiale peuvent fournir des informations plus spécifiques sur les sous-populations cellulaires dans les tissus35. Compte tenu des différences de protocole entre le sNuc-Seq et le séquençage de l’ARN unicellulaire, telles que la dissociation et le stockage des tissus, le profil transcriptionnel généré par sNuc-Seq peut biaiser contre les cellules immunitaires tout en étant plus puissant pour caractériser les types de cellules attachées36. En outre, le séquençage de l’ARN unicellulaire comprend l’ARN cytoplasmique tel que l’ARN mitochondrial, contrairement à sNuc-Seq. Malgré ces différences transcriptionnelles entre les deux méthodes, il a été démontré que, dans l’ensemble, sNuc-Seq a un profil transcriptionnel similaire au séquençage de l’ARN unicellulaire entier37, et dans le SV en particulier30.
Pour une microdissection réussie, il y a plusieurs étapes critiques à connaître. Dans les premières étapes, il faut extraire correctement l’oreille interne pour éviter d’écraser la cochlée sous-jacente. L’observation d’une extraction osseuse temporale appropriée est illustrée à la figure 2A. Une fois que la cochlée est correctement exposée, il faut prendre soin de gratter et de casser doucement l’os cochléaire pour exposer la paroi latérale sous-jacente et SV. Une fois la paroi latérale et SV extraites avec succès, l’utilisateur doit détacher soigneusement la SV de la paroi latérale. Une force suffisante dans le plan correct doit être appliquée pour extraire le SV de la paroi latérale, tout en évitant d’endommager le SV fragile. Pour la microdissection SV, il peut être utile de penser à « disséquer d’autres structures loin du SV », plutôt que de « disséquer le SV hors de la cochlée ».
Ce protocole peut être modifié pour différents âges de souris et pour différentes espèces de mammifères, comme les rats. Pour les souris plus jeunes, les tissus auront une texture différente et les structures seront plus petites en général. Pour différentes espèces de mammifères, l’anatomie cochléaire sera relativement similaire, la taille de l’animal déterminant la majorité de la différence.
En général, les inconvénients de ce protocole sont similaires à d’autres techniques de microdissection cochléaire38. Isoler le SV délicat peut être techniquement difficile et il peut être brisé en plus petits morceaux.
Cette technique n’est pas optimale pour sauvegarder l’organe de Corti pour un montage complet car il est souvent endommagé avec ce protocole. Il existe d’autres techniques de dissection visant spécifiquement à préserver l’organe de Corti pour le montage entier et l’immunomarquage38, mais celles-ci ont leurs propres inconvénients, étant donné que le sNuc-Seq doit être fait avec des échantillons frais pour éviter la dégradation de l’ARN, et non dans le cadre de la fixation et de la décalcification des tissus.
Avec le temps et la répétition, les utilisateurs deviendront plus à l’aise avec ce protocole de microdissection SV.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Cette recherche a été financée en partie par le programme de recherche intra-muros des NIH, NIDCD to M.H. (DC000088)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10-µm filter (Polyethylenterephthalat) | PluriSelect | #43-50010-01 | Filter tissue during sNuc-Seq |
| 18 x 18 mm cover glass | Fisher Scientific | 12-541A | Cover slip to mount SV |
| 30-µm filter (Polyethylenterephthalat) | PluriSelect | #43-50030-03 | Filter tissue during sNuc-Seq |
| 75 x 25 mm Superfrost Plus/Colorforst Plus Microslide | Daigger | EF15978Z | Microslide to mount SV on |
| C57BL/6J Mice | The Jackson Laboratory | RRID: IMSR_JAX:000664 | General purpose mouse strain that has pigment more easily seen in the intermediate cells of the SV. |
| Cell Counter | Logos Biosystems | L20001 | Used for cell counting |
| Chalizon curette 5'', size 3 2.5 mm | Biomedical Research Instruments | 15-1020 | Used to transfer SV |
| Chromium Next GEM single Cell 3' GEM Kit v3.1 | Chromium | PN-1000141 | Generates single cell 3' gene expression libraries |
| Clear nail polish | Fisher Scientific | NC1849418 | Used for sealing SV mount |
| Corning Falcon Standard Tissue Culture Dishes, 24 well | Corning | 08-772B | Culture dish used to hold specimen during dissection |
| DAPI | Invitrogen | D1306, RRID: AB_2629482 | Stain used for nucleus labeling |
| Dounce homogenizer | Sigma-Aldrich | D8938 | Used to homogenize tissue for sNuc-seq |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | General forceps for dissection |
| Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | Forceps with fine tip that makes SV manipulation easier |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher | 16000044 | Used for steps of sNuc-Seq |
| Glue stick | Fisher Scientific | NC0691392 | Used for mounting SV |
| GS-IB4 Antibody | Molecular Probes | I21411, RRID: AB-2314662 | Antibody used for capillary labeling |
| KCNJ10-ZsGreen Mice | n/a | n/a | Transgenic mouse that expresses KCNJ10-ZsGreen, partiularly in the intermediate cells of the SV. |
| MgCl2 | ThermoFisher | AM9530G | Used for steps of sNuc-Seq |
| Mounting reagent | ThermoFisher | #S36940 | Mounting reagent for SV |
| Multiwell 24 well plate | Corning | #353047 | Plate used for immunostaining |
| NaCl | ThermoFisher | AAJ216183 | Used for steps of sNuc-Seq |
| Nonidet P40 | Sigma-Aldrich | 9-16-45-9 | Used for steps of sNuc-Seq |
| Nuclease free water | ThermoFisher | 4387936 | Used for steps of sNuc-Seq |
| Orbital shaker | Silent Shake | SYC-2102A | Used for steps of immunostaining |
| PBS | ThermoFisher | J61196.AP | Used for steps of immunostaining and dissection |
| RNA Later | Invitrogen | AM7021 | Used for preservation of SV for sNuc-Seq |
| Scizzors | Fine Science Tools | 14058-09 | Used for splitting mouse skull |
| Tris-HCl | Sigma-Aldrich | 15506017 | Used for steps of sNuc-Seq |
| Trypan blue stain | Gibco | 15250061 | Used for cell counting |
| Tween20 | ThermoFisher | AAJ20605AP | Used for steps of sNuc-Seq |
| Zeiss STEMI SV 11 Apo stereomicroscope | Zeiss | n/a | Microscope used for dissections |
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