Summary
Die Stria vascularis ist für die Bildung des endocochleären Potentials von entscheidender Bedeutung. In dieser Arbeit stellen wir die Präparation der adulten Stria vascularis der Maus für die Einzelkernsequenzierung oder Immunfärbung vor.
Abstract
Das endocochleäre Potential, das von der Stria vascularis erzeugt wird, ist wichtig, um ein Umfeld zu erhalten, das der Mechanotransduktion der Haarzellen und letztendlich dem Gehör förderlich ist. Pathologien der Stria vascularis können zu einer verminderten Hörfähigkeit führen. Die Präparation der adulten Stria vascularis ermöglicht eine fokussierte Einzelkernerfassung und anschließende Einzelkernsequenzierung und Immunfärbung. Diese Techniken werden verwendet, um die Pathophysiologie von Stria vascularis auf Einzelzellebene zu untersuchen.
Die Einzelkernsequenzierung kann im Rahmen der Transkriptionsanalyse der Stria vascularis eingesetzt werden. In der Zwischenzeit ist die Immunfärbung weiterhin nützlich, um bestimmte Zellpopulationen zu identifizieren. Beide Methoden setzen eine ordnungsgemäße Stria vascularis-Dissektion voraus, die sich als technisch anspruchsvoll erweisen kann.
Introduction
Die Cochlea besteht aus drei flüssigkeitsgefüllten Kammern, der Scala vestibuli, der Scala media und der Scala tympani. Die Scala vestibuli und die Scala tympani enthalten jeweils Perilymphe, die eine hohe Konzentration an Natrium (138 mM) und eine niedrige Konzentration an Kalium (6,8 mM) aufweist1. Die Scala media enthält Endolymphe mit einer hohen Kaliumkonzentration (154 mM) und einer niedrigen Natriumkonzentration (0,91 mM)1,2,3. Dieser Unterschied in der Ionenkonzentration kann als endocochleäres Potential (EP) bezeichnet werden und wird hauptsächlich durch die Bewegung von Kaliumionen durch verschiedene Ionenkanäle und Gap Junctions in der Stria vascularis (SV) entlang der Seitenwand der Cochlea erzeugt 4,5,6,7,8,9,10,11 . Die SV ist ein heterogenes, stark vaskularisiertes Gewebe, das den medialen Aspekt der lateralen Wand der Cochlea auskleidet und drei Hauptzelltypen enthält: marginale, intermediäre und basale Zellen12 (Abbildung 1).
Die Randzellen sind durch Tight Junctions miteinander verbunden, um die medialste Oberfläche des SV zu bilden. Die apikale Membran ist der Endolymphe der Scala media zugewandt und trägt über verschiedene Kanäle zum Kaliumionentransport in die Endolymphe bei, darunter KCNE1/KCNQ1, SLC12A2 und Na+-K+-ATPase (NKA)5,10,13,14. Intermediäre Zellen sind pigmentierte Zellen, die sich zwischen Rand- und Basalzellen befinden und den Kaliumtransport durch die SV mit Hilfe von KCNJ10 (Kir 4.1)15,16 erleichtern. Basalzellen liegen in unmittelbarer Nähe der Seitenwand der Cochlea und sind eng mit den Fibrozyten des Spiralbandes verbunden, um das Kaliumrecycling aus der Perilymphe zu fördern12. Die Pathologie der SV wurde mit zahlreichen otologischen Erkrankungen in Verbindung gebracht17,18. Mutationen in Genen, die in den wichtigsten SV-Zelltypen wie Kcnq1, Kcne1, Kcnj10 und Cldn11 exprimiert werden, können Taubheit und SV-Dysfunktion verursachen, einschließlich des Verlusts von EP 19,20,21,22,23. Zusätzlich zu den drei Hauptzelltypen gibt es andere, weniger untersuchte Zelltypen in der SV, wie z. B. Spindelzellen 22, Wurzelzellen12,24, Makrophagen 25, Perizyten 26 und Endothelzellen 27, die eine unvollständig definierte Rolle bei der ionischen Homöostase und der Erzeugung von EP 28 spielen.
Im Vergleich zur Bulk-RNA-Sequenzierung liefert die Einzelkern-RNA-Sequenzierung (sNuc-Seq) Informationen über die Zellheterogenität und nicht über einen Durchschnitt der mRNA in einer Gruppe von Zellen29 und kann besonders nützlich sein, wenn die heterogene SV30 untersucht wird. Zum Beispiel hat sNuc-Seq eine Transkriptionsanalyse erstellt, die darauf hindeutet, dass Spindel- und Wurzelzellen eine Rolle bei der EP-Bildung, Hörverlust und Morbus Menière spielenkönnten 18. Die weitere transkriptionelle Charakterisierung der verschiedenen SV-Zelltypen kann uns unschätzbare Informationen über die Pathophysiologie liefern, die den verschiedenen Mechanismen und Subtypen der SV-bedingten Hörfluktuation und des Hörverlusts zugrunde liegt. Die Entnahme dieser empfindlichen Innenohrstrukturen ist für eine optimale Gewebeanalyse von größter Bedeutung.
In dieser Arbeit wird der Mikrodissektionsansatz beschrieben, um die Stria vascularis aus der Cochlea der adulten Maus für sNuc-Seq oder Immunfärbung zu erreichen und zu isolieren. Die Präparation der erwachsenen Maus ist erforderlich, um verschiedene SV-Zelltypen zu verstehen und ihre Rolle beim Hören weiter zu charakterisieren.
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Protocol
Alle Tierversuche und -verfahren wurden nach Protokollen durchgeführt, die vom Animal Care and Use Committee des National Institute of Neurological Diseases and Stroke und dem National Institute on Deafness and Other Communication Disorders der National Institutes of Health genehmigt wurden. Alle Versuchsprotokolle wurden vom Animal Care and Use Committee des National Institute of Neurological Diseases and Stroke und des National Institute on Deafness and Other Communication Disorders der National Institutes of Health genehmigt. Alle Methoden wurden in Übereinstimmung mit den einschlägigen Richtlinien und Vorschriften des Komitees für Tierpflege und -verwendung des National Institute of Neurological Diseases and Stroke und des National Institute on Deafness and Other Communication Disorders der National Institutes of Health durchgeführt.
1. Euthanasie von Tieren
- Verwenden Sie transgene Mäuse C57BL/6J oder Kcnj10-ZsGreen, postnatal day 30+ (P30+), die zwischen 15-20 g wiegen.
- Euthanasieren Sie eine erwachsene Maus (Alter P30 oder älter) mit einem zugelassenen Protokoll (hier CO2 - Erstickung). Führen Sie die Enthauptung als zweiten Schritt durch.
HINWEIS: Bei der Immunfärbung können einige Antikörper aufgrund einer unspezifischen Bindung an Blut in den Kapillaren des SV ein Hintergrundsignal aufweisen. Die Herzperfusion mit Fixiermittel kann dieses Problem beheben, indem Blut aus den Kapillaren des SV entfernt wird. Die meisten Antikörper können jedoch ohne diese Methode gute Ergebnisse erzielen, und sie wird in diesem Protokoll nicht behandelt.
2. Freilegung des knöchernen Labyrinths
- Reinigen Sie die Maus, indem Sie sie mit 70% Ethanol besprühen und mit einem Papiertuch abwischen. Achten Sie besonders auf den Kopfbereich, um das Risiko einer Kontamination zu verringern. Entferne die Haut vom Schädel, indem du die Haut in Richtung Nase ziehst.
- Spalten Sie den Schädel mit einer scharfen Schere entlang der mittleren Sagittalebene, um den linken und rechten Teil zu trennen.
- Entfernen Sie das Gehirn aus dem Schädel, um das knöcherne Labyrinth freizulegen.
3. Innenohr-Extraktion
- Identifizieren Sie das Innenohr innerhalb des Schläfenbeins (Abbildung 2A) und kratzen Sie die Hirnnerven mit einer Pinzette #55 ab.
HINWEIS: Der Benutzer sollte die Probe mit seiner nicht dominanten Hand mit einem zweiten Satz #55-Pinzetten stabilisieren. Verschiedene Bereiche der Probe können während der gesamten Dissektion mit der stabilisierenden Pinzette gegriffen werden, wenn kritische Bereiche der Probe vermieden werden (z. B. die Cochlea nicht zerquetschen). - Präparieren Sie mit einer Pinzette #55 die Bulla und die Kapsel und lösen Sie sie vom umgebenden Knochen. Entfernen Sie verbleibendes Weichgewebe von der Innenohroberfläche.
- Übertragen Sie die Probe in eine durchsichtige Gewebekulturschale mit 1x kalter PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung), pH 7,4, und legen Sie sie unter ein Präparierfernrohr (Abbildung 2B).
4. SV-Präparation
HINWEIS: Mit etwas Übung ist es möglich, den SV als ein langes Stück zu zerlegen, das einem Band ähnelt. Der SV ist zerbrechlich, wenn er also in Stücke zerbricht, können diese zusammen gelagert werden. Alternativ können diese entsprechend ihrer Wendung (z.B. basal, mittel, apikal) in separat gekennzeichneten Vertiefungen gelagert werden.
- Wenn die Lichtquellen des Sezierfernrohrs bewegt werden können, platzieren Sie eine Leuchte über der Schüssel und die zweite Lichtquelle von der Seite, parallel zur Präparierfläche. Dies ermöglicht einen besseren Kontrast des Gewebes unter dem Cochlea-Knochen.
- Halten Sie die Probe mit einer Pinzette #55 mit der Cochlea nach oben am vestibulären Anteil.
- Mit einer Pinzette #55 den Cochlea-Knochen an der Spitze durchstechen.
Anmerkungen: Die Pinzette #5 ist dicker als #55 und kann zum Brechen von Knochen verwendet werden, aber die Zunahme der Größe/Stärke beeinträchtigt die Feinheit der Pinzette und die Fähigkeit, kleines Gewebe zu manipulieren. Erwägen Sie die Verwendung einer Pinzette, die aus einem Material wie Inox oder Dumostar hergestellt wurde, um Schäden zu vermeiden, die an empfindlicheren Pinzetten auftreten können. Vermeiden Sie es, die Pinzette zu tief unter den Knochen zu schieben, um eine Beschädigung des SV zu vermeiden. - Kratzen Sie mit einer Pinzette #55 entlang der apikalen Drehung (Abbildung 2C) und wenden Sie dabei sanfte Kraft an, um kleine Stücke der äußeren Knochenschicht abzubrechen. Heben Sie den Knochen vorsichtig an und lösen Sie ihn von der Seitenwand.
HINWEIS: Es kann hilfreich sein, sich diese Sektion so vorzustellen, dass "alles von der SV entfernt wird", anstatt "die SV aus der Cochlea zu präparieren". - Fahren Sie mit der Pinzette #55 fort, um Cochlea-Knochenstücke aus der apikalen und mittleren Windung zu entfernen (Abbildung 2D,E). Drücken Sie die Seitenwand vorsichtig nach unten, hebeln und entfernen Sie Knochenwandstücke in Richtung der mittleren Windung, um die Seitenwand der apikalen und mittleren Windung freizulegen.
- Fahren Sie mit der Pinzette #55 fort und schieben Sie die apikale seitliche Wand vorsichtig zur Seite, um das Spiralganglion freizulegen. Lösen Sie die laterale Wand der apikalen und mittleren Windungen vom Spiralganglion entlang der äußeren Haarzellschicht. Entfernen Sie Stücke des Spiralganglions aus dem Inneren der Cochlea.
HINWEIS: Die Pinzette #55 ist kleiner und bietet einen Vorteil bei der Handhabung von kleinen und empfindlichen Geweben. Es sollte besonders darauf geachtet werden, dass sie nicht verbogen oder beschädigt werden. - Um einen besseren Zugang zur lateralen Wand der Basaldrehung zu haben, lösen Sie die Cochlea mit einer Pinzette #55 vom vestibulären Teil des Schläfenbeins. Stecken Sie die Pinzette #55 in das runde und ovale Fenster und drücken Sie sie nach unten in Richtung Vorraum. Die Cochlea löst sich ab. Entfernen Sie den vestibulären Teil des Innenohrs.
- Fahren Sie mit der Pinzette #55 fort und entfernen Sie nun Stücke des basalen Cochlea-Knochens, beginnend im mittleren Drehbereich. Schieben Sie die seitliche Wandschicht vorsichtig unter den Knochen, um ihn zu lösen.
- Entfernen Sie den am weitesten entfernten basalen Teil der Seitenwand, indem Sie das Gewebe aufhebeln und vorsichtig ziehen. Der Knochen in diesem Bereich kann zu dick sein, um entfernt zu werden, ohne das darunter liegende Weichgewebe zu beschädigen.
- Trennen Sie nun, nachdem sich der basale Teil der Seitenwand gelöst hat, so viel wie möglich von der Seitenwand von der Cochlea. Dies kann durch Nachzeichnen der Pinzette #55 entlang der Seitenwand erfolgen. Bürsten Sie die Pinzette vorsichtig zwischen dem Knochen und der verbleibenden Seitenwand. Dies kann in einem Stück bis zum Scheitelpunkt erfolgen, wenn der Benutzer erfahren ist. Verschieben Sie die Seitenwand in frisches PBS.
HINWEIS: Obwohl größere SV-Stücke aufgrund der empfindlichen Beschaffenheit des Gewebes möglicherweise einfacher abzubilden sind, können kleinere Stücke entnommen werden (Abbildung 2F, G) und je nach Größe auch für die Bildgebung geeignet sein. - Verwenden Sie eine Pinzette #55, um die Seitenwand flach zu legen. Die SV sollte als dunklere Gewebeschicht auf der Innenseite der Seitenwand sichtbar sein.
HINWEIS: Insbesondere in der Nähe des apikalen Endes kann sich ein Teil des SV-Gewebes während der gesamten Dissektion zufällig von der Seitenwand lösen. - Hebeln Sie die SV-Schicht vorsichtig auf, um sie an ihrem basalen Ende von der Seitenwand zu lösen (Abbildung 2H). Schieben Sie die abgelöste SV vorsichtig beiseite und bewegen Sie die Pinzette weiter in Richtung des apikalen Endes der lateralen Wand, wobei Sie die SV nach Möglichkeit als ein langes Band ablösen (Abbildung 2I). Drücken Sie den SV nicht mit einer Pinzette, um ihn zu ziehen. Wenn das Gewebe zu zerbrechlich ist, um gegriffen zu werden, kann es alternativ mit einer Taschentuchschaufel, wie z. B. einer Chalazion-Kürette, entnommen werden.
Anmerkungen: Das Bewegen des SV sollte immer unter dem Lichtmikroskop erfolgen, um sicherzustellen, dass es nicht verloren geht. Seien Sie immer vorsichtig, wenn Sie mit einer Pinzette greifen, da die Gefahr einer Beschädigung besteht. Benutzer können feststellen, dass die Verwendung von Chalazion-Kürette das Risiko einer Schädigung des SV-Gewebes verringert. Für die Einzelkernsequenzierung fahren Sie mit Abschnitt 5 fort. Für die SV-Immunfärbung fahren Sie mit Abschnitt 7 fort.
5. SV-Einzelkern-Suspension
HINWEIS: Dieses Protokoll wurde speziell für SV-Gewebe aus dem Einzelkernsuspensionsprotokoll eines veröffentlichten Herstellers angepasst. Es können Plattformen verschiedener Hersteller verwendet werden31. Angesichts plattformspezifischer Variationen wird empfohlen, das mit dem Gerät gelieferte herstellerspezifische Protokoll zu überprüfen. Um optimale Ergebnisse für sNuc-Seq zu erzielen und den RNA-Abbau zu minimieren, gilt: Je schneller die Gewebedissektion, desto besser (empfohlen innerhalb von 15-20 Minuten nach der Euthanasie). Es kann hilfreich sein, jeweils ein Tier einzuschläfern und nur, wenn es zum Sezieren bereit ist. Wenn mehrere Personen gleichzeitig an den Dissektionen arbeiten, kann auch die Abbauzeit entfallen (z. B. ein Laborpersonal, das am linken Ohr arbeitet, während ein anderes am rechten Ohr arbeitet).
- Wenn das SV-Gewebe für sNuc-Seq verwendet wird, legen Sie das Gewebe in gekühlten Lysepuffer (10 mM Tris-HCl, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 0,005% Nonidet P40 in nukleasefreiem Wasser).
HINWEIS: Wenn die Sequenzierung unmittelbar nach der Präparation durchgeführt werden soll, fahren Sie mit dem Protokoll fort. Wenn das Protokoll pausiert werden soll, ist die SV-Konservierung möglich, indem die SV in RNAlater platziert wird. Über Nacht bei 4 °C lagern, dann in flüssigem Stickstoff einfrieren und bis zur Verwendung bei -80 °C lagern. Wenn Sie gebrauchsfertig sind, tauen Sie es auf und waschen Sie es zweimal in PBS für jeweils 5 Minuten, dann fahren Sie mit dem Homogenisieren fort (Schritt 5.2). - Homogenisieren Sie das Gewebe in einem 2-ml-Homogenisator mit 10-20 Hüben auf Eis.
Anmerkungen: Der Glaszylinder berührt manuell den Boden des Glasrohrs und fragmentiert den SV. Der SV ist empfindlich, so dass 20 Hübe in der Regel eine erfolgreiche Homogenisierung erreichen. - Das Gewebe 25 Minuten auf Eis lysieren.
HINWEIS: Die Lysezeit variiert je nach Gewebetyp. Eine 25-minütige Lyse in SV-Gewebe kann eine geringe Zellviabilität (weniger als 4%) erreichen, aber die Zeit kann angepasst werden, wenn die Zellviabilität zu hoch ist (Schritt 5.8). - Durch einen 30 μm Filter filtrieren und das Filtrat bei 500 x g für 5 min bei 4 °C schleudern.
- Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 1 ml Kernwasch- und Resuspensionspuffer (1x PBS, 1% Rinderserumalbumin [BSA], 0,2U/μL RNase-Inhibitor).
- Filtrieren Sie die Zellen durch einen 10-μm-Filter und zentrifugieren Sie sie bei 500 x g für 5 min bei 4 °C.
- Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie ihn in 50 μl Kernwasch- und Resuspensionspuffer.
- Zählen Sie die Zellkerne mit einem Zellzähler und einer Trypanblau-Färbung. Verdünnen Sie 5 μl der Zellsuspension zu 50 μl 1x PBS für die Zellzählung; Die Rentabilität sollte zu diesem Zeitpunkt minimal sein (3%-4%). Wenn sich herausstellt, dass die Viabilität höher ist, wird das Protokoll für Schritt 5.3 (Lyse) angepasst und die Lysezeit standardisiert, um eine ausreichende Lyse der Zellen zu gewährleisten.
HINWEIS: Eine hohe Zellviabilität in einem einzigen Zellkernpräparat bedeutet, dass mehr intakte Zellen als gewünscht vorhanden sind und dass möglicherweise eine zusätzliche Verdauung erforderlich ist. - Laden Sie die Probe mit der gewünschten Kerndichte auf die Apparatur/den Chip des Herstellers (siehe Herstellerhandbuch). Einzelkern-Einfänge sind jetzt fertig.
HINWEIS: Aus einer erwachsenen Maus SV werden in der Regel 50 μl der Suspension bei einer Konzentration von 150.000 Zellkernen/ml erreicht.
6. SV-Einzelkern-Sequenzierung
- Senden Sie die Proben zur Sequenzierung an die Core Facility.
HINWEIS: Dieser Teil des Protokolls folgt den allgemeinen Schritten (1) der Erzeugung und des Barcodes von Gel-Beads-in-Emulsionen (GEM), (2) der Aufreinigung und cDNA-Amplifikation nach GEM-RT und (3) der Erstellung einer 3'-Genexpressionsbibliothek. Der Rest des sNuc-Seq-Protokolls ist relativ langwierig, und es wird empfohlen, dass die Leser ihr herstellerspezifisches Protokoll verwenden. In der Herstelleranleitung werden die Schritte wahrscheinlich mit spezifischen Details und begleitenden Bildern beschrieben. Möglicherweise gibt es auch Anleitungsvideos auf der Website des Herstellers. Die erzeugten Datensätze können in einer dimensional reduzierten Weise dargestellt werden, z. B. in einer gleichmäßigen mannigfaltigen Approximation und Projektion (UMAP; Abbildung 3). Viele Labore verwenden einen Sequenzierungskern, der dieses Protokoll für Benutzer ausführen kann.
7. SV-Immunfärbung und Gewebemontage
- Wenn das Gewebe für die Immunfärbung verwendet werden soll, übertragen Sie es auf eine 24-Well-Platte, tauchen Sie es in 200 μl 4%iges Paraformaldehyd (PFA) in 1x PBS und inkubieren Sie es 20 Minuten lang bei Raumtemperatur.
HINWEIS: Es ist hilfreich, alle Flüssigkeitsentfernungen, Waschungen und Immunfärbungen unter einem Mikroskop durchzuführen. Die Visualisierung während des Pipettierens des Gewebes stellt sicher, dass es bei der Flüssigkeitsentfernung nicht versehentlich verloren geht. Das Volumen der Antikörper und Waschungen kann eingestellt werden, solange das Volumen groß genug ist, um das SV-Gewebe in die Lösung einzutauchen. - Entfernen Sie nach dem Fixierungsschritt die PFA, indem Sie zwei kurze Waschgänge in 1x PBS (ca. 500 μL) bei 4 °C für jeweils 5 Minuten auf einem Orbitalschüttler bei niedriger (30-50) Drehzahl durchführen. Bei der Einlagerung kann das Gewebe in 1x PBS bei 4 °C gelagert werden.
- Entfernen Sie das PBS und permeabilisieren und blockieren Sie es für mindestens 1 h bei Raumtemperatur in ca. 300 μl PBS-T-Lösung (0,05 Tween20 in 1x PBS mit 10 % fötalem Kälberserum).
Anmerkungen: Primäre und sekundäre Antikörper sollten in dieser Blockierungslösung verdünnt werden. - Färben Sie das Gewebe mit Primärantikörpern gemäß den Spezifikationen des jeweils verwendeten Antikörpers, in der Regel über Nacht bei 4 °C. Entfernen Sie das restliche PBS und fügen Sie den verdünnten Primärantikörper hinzu.
HINWEIS: Die Verdünnung sollte auf der Grundlage der Herstellervorschläge, der veröffentlichten Daten, der bisherigen Erfahrungen usw. gewählt werden. In der Regel ist die erste zu testende Konzentration eine Verdünnung von 1:100-200. Für das in dieser Arbeit vorgestellte Beispiel wurden die GS-IB4- und DAPI-Antikörper jeweils im Verhältnis 1:200 verdünnt. Bei der Färbung für mehr als ein Protein können mehrere Primärantikörper in derselben Lösung kombiniert werden, solange jeder Primärantikörper einen anderen Wirt hat, um eine Kreuzreaktivität von Sekundärantikörpern zu vermeiden. - Waschen Sie den primären Antikörper mit ca. 500 μl 1x PBS zweimal für jeweils 10 Minuten auf einem Orbitalschüttler bei niedriger Drehzahl vom Gewebe.
Anmerkungen: Stellen Sie weiterhin sicher, dass das SV-Gewebe in die Lösung getaucht ist und nicht an der Seite der Vertiefung klebt. - Färbung mit einem sekundären Antikörper gemäß den Spezifikationen des jeweils verwendeten Antikörpers, in der Regel für 2 h bei Raumtemperatur auf einem Orbitalschüttler bei niedriger Drehzahl. Decken Sie die 24-Well-Platte ab, damit der fluoreszenzmarkierte Sekundärantikörper vor Licht geschützt ist.
HINWEIS: Wenn mehr als ein Sekundärantikörper benötigt wird, kombinieren Sie die Sekundärantikörper in derselben Lösung. Achten Sie darauf, Kreuzetiketten zu vermeiden. - Waschen Sie den Sekundärantikörper viermal für jeweils 5 Minuten auf einem Orbitalschüttler bei niedriger Drehzahl mit ca. 500 μl 1x PBS aus dem Gewebe. Halten Sie die 24-Well-Platte abgedeckt, um sie vor Licht zu schützen.
- Bereiten Sie den größeren Objektträger (75 mm x 25 mm) vor, indem Sie zwei kleine Klebestreifen entlang der 25-mm-Achse platzieren, die etwas kleiner sind als das 18 mm x 18 mm kleinere Glasdeckglas. Geben Sie einen Tropfen Eindeckreagenz (ca. 50 μl) zwischen die Klebestreifen.
Anmerkungen: Der Kleber schafft einen kleinen vertikalen Raum, so dass die SV-Gewebeprobe sicher vorhanden sein kann, aber weiterhin an Ort und Stelle bleibt, wenn das zweite Deckglas darauf gelegt wird. Während die Streifendicke 30-40 Mikrometer beträgt, sollte das Zusammendrücken des Gewebes zwischen den Glasoberflächen vermieden werden, um die Morphologie zu erhalten. Alternativ kann auch durchsichtiges Klebeband verwendet werden. - Fassen Sie mit einer Pinzette #55 so wenig Gewebe wie möglich an einem Ende des SV und übertragen Sie es vom PBS auf den Tropfen des Eindeckreagenzes auf dem größeren Mikroobjektträger (75 mm x 25 mm). Legen Sie ein Ende eines kleineren Glasdeckglases (18 mm x 18 mm) auf den Objektträger, auf dem ein Streifen Kleber platziert wurde, und lösen Sie es vorsichtig, um Luftblasen zu vermeiden. Das Deckglas fällt auf den anderen Klebestreifen und bedeckt das SV-Gewebe.
- Versiegeln Sie die Halterung, indem Sie einen Tropfen transparenten Nagellack auf jede Ecke der Halterung tupfen. Beschriften Sie die Probe entsprechend auf dem Glasdeckglas weg vom Visualisierungsfeld. Es ist nun bereit für die konfokale Mikroskopie (Abbildung 4).
- Visualisieren Sie das SV-Gewebe mit einem Präpariermikroskop, um sicherzustellen, dass es flach und nicht in der Nähe von Luftblasen liegt. Wenn das SV-Gewebe nicht richtig ausgerichtet ist, kann der Benutzer versuchen, Luftblasen herauszudrücken oder das kleinere Glasdeckglas vorsichtig zu entfernen und das SV neu zu positionieren. Dies muss vorsichtig erfolgen, um ein Brechen der Glasdeckgläser zu vermeiden.
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Representative Results
Wir stellen eine Methode vor, um den SV zu isolieren, der entweder für sNuc-Seq oder für die Immunfärbung verwendet werden kann. Die relevante Anatomie (Abbildung 1) der Cochlea in Bezug auf die SV kann den Anwendern helfen, die Organisation der SV und die Schritte des Dissektionsprotokolls besser zu verstehen.
Jeder Schritt dieser Mikrodissektion von SV aus einer P30-Maus wird im zugehörigen Video detailliert beschrieben, und Momentaufnahmen der wichtigsten Schritte dieser Dissektion und Isolierung von SV sind in Abbildung 2 dargestellt.
sNuc-Seq ist nützlich, um das Transkriptionsprofil der verschiedenen Zellen in der heterogenen SV zu untersuchen. Eine Möglichkeit, dies zu visualisieren, ist das Clustering auf einem 2D-UMAP (Abbildung 3). Der aus sNuc-Seq generierte Datensatz kann mit verschiedenen Datenanalysetechniken ausgewertet werden, die in der Diskussion näher erläutert werden.
Abbildung 4 zeigt die gesamte SV-Einbettung mit GS-IB4 und DAPI-Immunmarkierung sowie Kcnj10-ZsGreen-Fluoreszenz. Mit Hilfe der Fluoreszenz kann die SV nach der Entfernung des umgebenden Gewebes und der Befestigung sichtbar gemacht werden. Bei diesen Mäusen wird ZsGreen vor allem in den SV-Zwischenzellen exprimiert. Das Gefäßsystem der SV kann rot dargestellt werden (Endothelzellen, GS-IB4).
Abbildung 1: Schematische Darstellung der zellulären Heterogenität und Organisation der Stria vascularis. Stria vascularis zelluläre Heterogenität und Organisation. Schematische Darstellung der Stria vascularis (SV) und ihrer Beziehung zu Strukturen in der Cochlea. Die SV besteht aus drei Zellschichten und ist für die Bildung von EP und einer hohen Kaliumkonzentration in den endolymphhaltigen Scala media verantwortlich. Die Beziehung zwischen den marginalen, intermediären und basalen Zellen wird mit den marginal ausdehnenden basolateralen Projektionen demonstriert, um mit den intermediären Zellen zu interdigitieren, die bidirektionale zelluläre Projektionen haben, die sowohl mit den marginalen als auch mit den basalen Zellen interdigitieren. Zusätzlich zu diesen Zelltypen sind andere Zelltypen, darunter Spindelzellen (gelb), Endothelzellen, Perizyten und Makrophagen (nicht dargestellt) in der SV vorhanden. Verwendung mit Genehmigung von Korrapati et al.30. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Dissektion einer Cochlea einer erwachsenen Maus größer oder gleich dem 30. postnatalen Tag (P30+). (A) Probe während der Innenohrentnahme aus dem umgebenden Schläfenbein in Schritt 3.2. Das Innenohr ist violett umrandet. (B) Probe aus Schritt 4.2, die die Oberfläche der Cochlea und die darunter liegende pigmentierte SV zeigt. (C) Probe aus Schritt 4.4, die den aus der apikalen Windung entfernten Knochen und den freiliegenden SV zeigt (gelber Pfeil). (D) Probe aus Schritt 4.5, die die Cochlea zeigt, wobei mehr Knochen aus den apikalen und mittleren Windungen entfernt wurde. (E) Probe aus Schritt 4.5, die die Entfernung des Knochens zeigt, der die mittlere Windung bedeckt, und zeigt die darunter liegende SV (gelber Pfeil). (F) Beispiel für kleinere SV-Stücke (gelber Pfeil) und die seitliche Wand (blauer Pfeil) in Schritt 4.10. (G) Beispiel für fluoreszierendes ZsGreen SV, während die verbleibende Seitenwand dunkel bleibt. KCNJ10-ZsGreen wird vor allem in den Zwischenzellen des SV exprimiert. (H) Beispiel für größere SV-Stücke (gelber Pfeil) und die Seitenwand (blau), die in Schritt 4.12 getrennt werden. (I) Der SV hat sich in Schritt 4.12 vollständig von der Seitenwand getrennt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: UMAP-Diagramm von sNuc-Seq-Datensätzen aus einer RNAspäter behandelten adulten Stria vascularis. Proben, die mit RNAlater Behandlung von adultem SV-Gewebe mit anschließender Zellkernisolierung konserviert wurden, wurden durch eine modularitätsbasierte Clustering-Methode mit dem Leiden-Optimierungsalgorithmus geclustert und durch einen 2D-UMAP-Plot in einer dimensional reduzierten Weise visualisiert. Jeder Punkt steht für eine einzelne Zelle, und Zellen mit ähnlichen Transkriptionsprofilen werden gruppiert. Die Zelltypen werden basierend auf ihrer Expression bekannter Gene, die von adulten SV-Zelltypen exprimiert werden, eingefärbt. Die Proben wurden nicht länger als 6 Monate in RNA gelagert. Die SV von etwa fünf CBA/J P30 Mäusen wurden verwendet, um diesen Datensatz zu generieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4. Stria vascularis gesamte Montage von einer P30 Kcnj10-ZsGreen Maus. Konfokale Aufnahme der gesamten SV-Montage von einer P30-Maus, die die ZsGreen-Expression in den intermediären Zellen, GS-IB4 (rot) markierende Endothelzellen und DAPI (weiß) markierende Kerne zeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
Vor dem Aufkommen der Einzelzellsequenzierung verwendeten viele Forscher die Bulk-Gewebeanalyse, die es nur ermöglichte, Transkriptome zu analysieren, die über Zellen gemittelt waren. Insbesondere Einzelzell- und sNuc-Seq ermöglichten es, das Transkriptom einer einzelnen Zelle bzw. eines einzelnen Zellkerns zu isolieren32. In diesem Fall können Einzelkern-Transkriptome für marginale, intermediäre und basale Zellen sowie für Spindelzellen identifiziertwerden 30. Dies ermöglicht die Untersuchung der transkriptionellen Heterogenität zwischen SV-Zelltypen und kann in Zukunft verwendet werden, um den Beitrag dieser Zelltypen zur SV-Funktion, einschließlich der Bildung und Aufrechterhaltung von EP, zu untersuchen. Datensätze, die mit sNuc-Seq generiert wurden, können in einer dimensional reduzierten Weise dargestellt werden, um das Verständnis der gesamten transkriptionellen Unterschiede zu erleichtern und verschiedene Zellpopulationen anhand eines UMAP-Diagramms zu vergleichen Abbildung 4. Es gibt zahlreiche Möglichkeiten, bioinformatische Analysen zur Interpretation von sNuc-Seq-Datensätzen durchzuführen. Dazu gehören unter anderem: differentielle Expressionsanalyse, Inferenz und Clustering von Einzelzell-Regulationsnetzwerken (SCENIC), Heatmap- oder Grin-Violin-Plot-Konstruktion und Regulon-Analyse18. Weitere computergestützte Analysetechniken für die Einzelzell-RNA-Sequenzierung ähneln sNuc-Seq und werden in Übersichtsarbeiten von Hwang et al.32, Shafer33 und Chen et al.34 ausführlicher diskutiert.
Die andere Hauptanwendung dieser Dissektionstechnik ist die Immunfärbung, um ausgewählte Strukturen innerhalb der SV besser untersuchen zu können. Wir können dies in der Umgebung einer SV-Gesamtmontierung beobachten, die mit konfokaler Mikroskopie abgebildet wurde (Abbildung 3). Die Zellkerne aller Zellen werden mit DAPI-Markierung visualisiert. Die Kapillaren sind durch Endothelzellfärbung mit GS-IB4 in Rot zu sehen. Intermediäre Zellen wurden in diesem Fall genetisch verändert, indem ein intermediärer zellspezifischer Promotor verwendet wurde, um ZsGreen zu exprimieren.
Zu den Einschränkungen von sNuc-Seq gehören: (1) Mangel an räumlicher Information, (2) Verzerrungen gegenüber Immunzellpopulationen und (3) Ausschluss von zytoplasmatischer RNA. Räumliche Transkriptomtechniken können spezifischere Informationen über zelluläre Subpopulationen innerhalb von Gewebeliefern 35. Angesichts der Protokollunterschiede zwischen sNuc-Seq und Einzelzell-RNA-Sequenzierung, wie z. B. Gewebedissoziation und -speicherung, kann das von sNuc-Seq generierte Transkriptionsprofil gegen Immunzellen gerichtet sein, während es bei der Charakterisierung von angehängten Zelltypen leistungsfähiger ist36. Außerdem umfasst die Einzelzell-RNA-Sequenzierung zytoplasmatische RNA wie mitochondriale RNA, während sNuc-Seq dies nicht tut. Trotz dieser Transkriptionsunterschiede zwischen den beiden Methoden konnte gezeigt werden, dass sNuc-Seq im Großen und Ganzen ein ähnliches Transkriptionsprofil aufweist wie die Sequenzierung ganzer Einzelzell-RNA37 und insbesondere in der SV30.
Für eine erfolgreiche Mikrodissektion gibt es einige wichtige Schritte zu beachten. In den ersten Schritten muss das Innenohr richtig entfernt werden, um eine Quetschung der darunter liegenden Cochlea zu vermeiden. Die Beobachtung der korrekten Extraktion des Schläfenbeins ist in Abbildung 2A dargestellt. Sobald die Cochlea richtig freigelegt ist, muss darauf geachtet werden, den Cochlea-Knochen vorsichtig abzukratzen und zu brechen, um die darunter liegende Seitenwand und den SV freizulegen. Sobald die Seitenwand und der SV erfolgreich herausgezogen wurden, muss der Benutzer den SV vorsichtig von der Seitenwand lösen. Es sollte genügend Kraft in der richtigen Ebene aufgebracht werden, um den SV von der Seitenwand zu hebeln und gleichzeitig eine Beschädigung des zerbrechlichen SV zu vermeiden. Für die SV-Mikrodissektion kann es hilfreich sein, an die "Sektion anderer Strukturen weg von der SV" zu denken, anstatt "die SV aus der Cochlea zu präparieren".
Dieses Protokoll kann für verschiedene Altersgruppen von Mäusen und für verschiedene Säugetierarten, wie z. B. Ratten, modifiziert werden. Bei jüngeren Mäusen unterscheiden sich die Gewebe in der Textur und die Strukturen sind im Allgemeinen kleiner. Bei verschiedenen Säugetierarten ist die Anatomie der Cochlea relativ ähnlich, wobei die Größe des Tieres den größten Teil des Unterschieds ausmacht.
Im Allgemeinen sind die Nachteile dieses Protokolls ähnlich wie bei anderen Cochlea-Mikrodissektionstechniken38. Das Isolieren des empfindlichen SV kann technisch anspruchsvoll sein und er kann in kleinere Stücke zerbrochen werden.
Diese Technik ist nicht optimal, um das Corti-Organ für die gesamte Montage zu retten, da es mit diesem Protokoll oft beschädigt wird. Es gibt andere Dissektionstechniken, die speziell darauf abzielen, das Corti-Organ für die gesamte Einlagerung und Immunfärbung zu erhalten38, aber diese haben ihre eigenen Nachteile, wenn man bedenkt, dass sNuc-Seq mit frischen Proben durchgeführt werden muss, um einen RNA-Abbau zu vermeiden, und nicht im Rahmen der Gewebefixierung und -entkalkung.
Mit der Zeit und der Wiederholung werden sich die Benutzer mit diesem SV-Mikrodissektionsprotokoll wohler fühlen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Forschung wurde zum Teil durch das Intramurale Forschungsprogramm der NIH, NIDCD to M.H. (DC000088) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10-µm filter (Polyethylenterephthalat) | PluriSelect | #43-50010-01 | Filter tissue during sNuc-Seq |
| 18 x 18 mm cover glass | Fisher Scientific | 12-541A | Cover slip to mount SV |
| 30-µm filter (Polyethylenterephthalat) | PluriSelect | #43-50030-03 | Filter tissue during sNuc-Seq |
| 75 x 25 mm Superfrost Plus/Colorforst Plus Microslide | Daigger | EF15978Z | Microslide to mount SV on |
| C57BL/6J Mice | The Jackson Laboratory | RRID: IMSR_JAX:000664 | General purpose mouse strain that has pigment more easily seen in the intermediate cells of the SV. |
| Cell Counter | Logos Biosystems | L20001 | Used for cell counting |
| Chalizon curette 5'', size 3 2.5 mm | Biomedical Research Instruments | 15-1020 | Used to transfer SV |
| Chromium Next GEM single Cell 3' GEM Kit v3.1 | Chromium | PN-1000141 | Generates single cell 3' gene expression libraries |
| Clear nail polish | Fisher Scientific | NC1849418 | Used for sealing SV mount |
| Corning Falcon Standard Tissue Culture Dishes, 24 well | Corning | 08-772B | Culture dish used to hold specimen during dissection |
| DAPI | Invitrogen | D1306, RRID: AB_2629482 | Stain used for nucleus labeling |
| Dounce homogenizer | Sigma-Aldrich | D8938 | Used to homogenize tissue for sNuc-seq |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | General forceps for dissection |
| Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | Forceps with fine tip that makes SV manipulation easier |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher | 16000044 | Used for steps of sNuc-Seq |
| Glue stick | Fisher Scientific | NC0691392 | Used for mounting SV |
| GS-IB4 Antibody | Molecular Probes | I21411, RRID: AB-2314662 | Antibody used for capillary labeling |
| KCNJ10-ZsGreen Mice | n/a | n/a | Transgenic mouse that expresses KCNJ10-ZsGreen, partiularly in the intermediate cells of the SV. |
| MgCl2 | ThermoFisher | AM9530G | Used for steps of sNuc-Seq |
| Mounting reagent | ThermoFisher | #S36940 | Mounting reagent for SV |
| Multiwell 24 well plate | Corning | #353047 | Plate used for immunostaining |
| NaCl | ThermoFisher | AAJ216183 | Used for steps of sNuc-Seq |
| Nonidet P40 | Sigma-Aldrich | 9-16-45-9 | Used for steps of sNuc-Seq |
| Nuclease free water | ThermoFisher | 4387936 | Used for steps of sNuc-Seq |
| Orbital shaker | Silent Shake | SYC-2102A | Used for steps of immunostaining |
| PBS | ThermoFisher | J61196.AP | Used for steps of immunostaining and dissection |
| RNA Later | Invitrogen | AM7021 | Used for preservation of SV for sNuc-Seq |
| Scizzors | Fine Science Tools | 14058-09 | Used for splitting mouse skull |
| Tris-HCl | Sigma-Aldrich | 15506017 | Used for steps of sNuc-Seq |
| Trypan blue stain | Gibco | 15250061 | Used for cell counting |
| Tween20 | ThermoFisher | AAJ20605AP | Used for steps of sNuc-Seq |
| Zeiss STEMI SV 11 Apo stereomicroscope | Zeiss | n/a | Microscope used for dissections |
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