Summary
La estría vascular es vital para la generación de potencial endococlear. Aquí, presentamos la disección de la estría vascular del ratón adulto para la secuenciación de un solo núcleo o inmunotinción.
Abstract
El potencial endococlear, que es generado por la estría vascular, es esencial para mantener un entorno propicio para la mecanotransducción adecuada de las células ciliadas y, en última instancia, la audición. Las patologías de la estría vascular pueden resultar en una disminución de la audición. La disección de la estría vascular adulta permite la captura focalizada de un solo núcleo y la posterior secuenciación e inmunotinción de un solo núcleo. Estas técnicas se utilizan para estudiar la fisiopatología de la estría vascular a nivel unicelular.
La secuenciación de un solo núcleo se puede utilizar en el contexto del análisis transcripcional de la estría vascular. Mientras tanto, la inmunotinción sigue siendo útil para identificar poblaciones específicas de células. Ambos métodos requieren una disección adecuada de la estría vascular como requisito previo, lo que puede resultar técnicamente desafiante.
Introduction
La cóclea consiste en tres cámaras llenas de líquido, la scala vestibuli, la scala media y la scala tympani. La scala vestibuli y la scala tympani contienen perilinfa, que tiene una alta concentración de sodio (138 mM) y una baja concentración de potasio (6,8 mM)1. La escala media contiene endolinfa, que tiene una alta concentración de potasio (154 mM) y una baja concentración de sodio (0,91 mM)1,2,3. Esta diferencia en la concentración de iones puede denominarse potencial endococlear (EP), y se genera principalmente por el movimiento de iones de potasio a través de varios canales iónicos y uniones de brecha en la estría vascular (SV) a lo largo de la pared lateral de la cóclea 4,5,6,7,8,9,10,11 . El SV es un tejido heterogéneo, altamente vascularizado, que recubre la cara medial de la pared lateral de la cóclea y contiene tres tipos principales de células: células marginales, intermedias y basales12 (Figura 1).
Las células marginales están conectadas por uniones estrechas para formar la superficie más medial del SV. La membrana apical se enfrenta a la endolinfa de la escala media y contribuye al transporte de iones de potasio en la endolinfa utilizando varios canales, incluyendo KCNE1/KCNQ1, SLC12A2 y Na+-K+-ATPasa (NKA)5,10,13,14. Las células intermedias son células pigmentadas que residen entre las células marginales y basales y facilitan el transporte de potasio a través del SV utilizando KCNJ10 (Kir 4.1)15,16. Las células basales se encuentran muy cerca de la pared lateral de la cóclea y están estrechamente asociadas con los fibrocitos del ligamento espiral para promover el reciclaje de potasio de la perilinfa12. La patología de la SV ha sido implicada en numerosos trastornos otológicos17,18. Las mutaciones en los genes expresados en los principales tipos de células SV, como Kcnq1, Kcne1, Kcnj10 y Cldn11, pueden causar sordera y disfunción de SV, incluida la pérdida de EP 19,20,21,22,23. Además de los tres tipos principales de células, hay otros tipos de células menos estudiadas en el SV, como las células fusiformes 22, las células raíz12,24, los macrófagos 25, los pericitos 26 y las células endoteliales 27, que tienen funciones incompletamente definidas que involucran la homeostasis iónica y la generación de EP 28.
En comparación con la secuenciación masiva de ARN, la secuenciación de ARN de núcleos únicos (sNuc-Seq) proporciona información sobre la heterogeneidad celular, en lugar de un promedio de ARNm en un grupo de células29, y puede ser particularmente útil cuando se estudia el SV30 heterogéneo. Por ejemplo, sNuc-Seq ha producido un análisis transcripcional que sugiere que puede haber un papel para las células fusiformes y radiculares en la generación de EP, la pérdida de audición y la enfermedad de Meniere18. La caracterización transcripcional adicional de los diversos tipos de células SV puede proporcionarnos información invaluable sobre la fisiopatología subyacente a los diferentes mecanismos y subtipos de fluctuación auditiva relacionada con SV y pérdida auditiva. La cosecha de estas delicadas estructuras del oído interno es de suma importancia para el análisis óptimo del tejido.
En este estudio, se describe el enfoque de microdisección para acceder y aislar la estría vascular de la cóclea de ratón adulta para sNuc-Seq o inmunotinción. La disección del SV del ratón adulto es necesaria para comprender varios tipos de células SV y caracterizar aún más su papel en la audición.
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Protocol
Todos los experimentos y procedimientos con animales se realizaron de acuerdo con los protocolos aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales del Instituto Nacional de Enfermedades Neurológicas y Accidentes Cerebrovasculares y el Instituto Nacional de la Sordera y Otros Trastornos de la Comunicación, Institutos Nacionales de Salud. Todos los protocolos experimentales fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales del Instituto Nacional de Enfermedades Neurológicas y Accidentes Cerebrovasculares y el Instituto Nacional de la Sordera y Otros Trastornos de la Comunicación, Institutos Nacionales de Salud. Todos los métodos se llevaron a cabo de acuerdo con las pautas y regulaciones relevantes del Comité de Cuidado y Uso de Animales del Instituto Nacional de Enfermedades Neurológicas y Accidentes Cerebrovasculares y el Instituto Nacional de la Sordera y Otros Trastornos de la Comunicación, Institutos Nacionales de Salud.
1. Eutanasia animal
- Utilizar ratones transgénicos C57BL/6J o Kcnj10-ZsGreen, postnatal día 30+ (P30+), que pesen entre 15-20 g.
- Eutanasia a un ratón adulto (de P30 años o más) utilizando un protocolo aprobado (aquí asfixia porCO2 ). Realizar la decapitación como paso secundario.
NOTA: Si se inmunotinción, algunos anticuerpos pueden tener señal de fondo debido a la unión inespecífica a la sangre en los capilares del SV. La perfusión cardíaca con fijador puede abordar este problema mediante la eliminación de sangre de los capilares del SV. Sin embargo, la mayoría de los anticuerpos pueden lograr buenos resultados sin este método, y no estará cubierto en este protocolo.
2. Exponer el laberinto óseo
- Limpie el ratón rociando con etanol al 70% y limpiando con una toalla de papel. Preste especial atención a la región de la cabeza para reducir el riesgo de contaminación. Retire la piel del cráneo tirando de la piel hacia la nariz.
- Usando tijeras afiladas, divida el cráneo a lo largo del plano sagital medio para separar las porciones izquierda y derecha.
- Retire el cerebro del cráneo para exponer el laberinto óseo.
3. Extracción del oído interno
- Identifique el oído interno dentro del hueso temporal (Figura 2A) y raspe los nervios craneales usando pinzas #55.
NOTA: El usuario debe estabilizar la muestra con su mano no dominante usando un segundo juego de pinzas #55. Se pueden agarrar diferentes áreas de la muestra con las pinzas estabilizadoras a lo largo de la disección si se evitan áreas críticas de la muestra (p. ej., no aplastar la cóclea). - Usando pinzas #55, disecciona la bulla y la cápsula, separándolas del hueso circundante. Retire cualquier tejido blando restante de la superficie del oído interno.
- Transfiera la muestra a una placa de cultivo de tejido transparente que contenga 1x PBS frío (solución salina tamponada con fosfato), pH 7.4, y colóquela bajo un endoscopio de disección (Figura 2B).
4. Disección SV
NOTA: Con la práctica, es posible diseccionar el SV como una pieza larga que se asemeja a una cinta. El SV es frágil, por lo que si se rompe en pedazos, estos pueden almacenarse juntos. Alternativamente, estos pueden almacenarse en pozos etiquetados por separado de acuerdo con su giro (por ejemplo, basal, medio, apical).
- Si se pueden mover las fuentes de luz del endoscopio de disección, coloque una luz sobre el plato y la segunda fuente de luz desde el lado, paralela a la superficie de disección. Esto permite un mejor contraste del tejido debajo del hueso coclear.
- Usando pinzas #55, sostenga la muestra por la porción vestibular con la cóclea hacia arriba.
- Usando pinzas #55, perfore el hueso coclear en el ápice.
NOTA: Los fórceps #5 son más gruesos que #55 y pueden usarse para romper huesos, pero el aumento en tamaño / fuerza sacrifica la finura de los fórceps y la capacidad de manipular tejidos pequeños. Considere usar fórceps hechos con un material como inox o dumostar para evitar daños que pueden ocurrir a los fórceps más delicados. Evite empujar los fórceps demasiado profundo debajo del hueso para evitar dañar el SV. - Usando pinzas #55, raspe a lo largo del giro apical (Figura 2C), aplicando una fuerza suave para romper pequeños trozos de la capa ósea externa. Levante suavemente el hueso y sepárelo de la pared lateral.
NOTA: Puede ser útil pensar en esta disección como "eliminar todo de la SV", en lugar de "diseccionar la SV de la cóclea". - Continúe usando fórceps #55 para extraer las piezas óseas cocleares de las vueltas apical y media (Figura 2D, E). Empujando suavemente hacia abajo la pared lateral, haga palanca y retire las piezas de la pared ósea hacia el giro medio para exponer la pared lateral de los giros apicales y medios.
- Continuando usando pinzas #55, empuje suavemente la pared lateral de giro apical a un lado para exponer el ganglio espiral. Separe la pared lateral de los giros apicales y medios del ganglio espiral a lo largo de la capa externa de células ciliadas. Retire pedazos de ganglio espiral del interior de la cóclea.
NOTA: Las pinzas #55 son más pequeñas y proporcionan una ventaja al manipular tejidos pequeños y delicados. Se debe tener especial cuidado para evitar doblarlos o dañarlos. - Para tener un mejor acceso a la pared lateral del giro basal, separe la cóclea de la porción vestibular del hueso temporal usando pinzas # 55. Coloque las pinzas #55 en la ventana redonda y ovalada y empuje hacia abajo hacia el vestíbulo. La cóclea se desprenderá. Retire la porción vestibular del oído interno.
- Continuando usando pinzas #55, ahora retire pedazos de hueso coclear basal, comenzando desde el área de giro medio. Empuje suavemente la capa de la pared lateral debajo del hueso para desprenderlo.
- Retire la parte basal más lejana de la pared lateral haciendo palanca y tirando suavemente del tejido. El hueso en esta región puede ser demasiado grueso para ser removido sin dañar el tejido blando debajo.
- Ahora, con la parte basal de la pared lateral separada, separe la mayor parte posible de la pared lateral de la cóclea. Esto se puede hacer trazando las pinzas #55 a lo largo de la pared lateral. Cepille suavemente las pinzas entre el hueso y la pared lateral restante. Esto se puede hacer hasta el ápice en una sola pieza si el usuario tiene experiencia. Mueva la pared lateral a PBS nuevo.
NOTA: Aunque las piezas más grandes de SV pueden ser más fáciles de visualizar, dada la naturaleza delicada de los tejidos, se pueden tomar piezas más pequeñas (Figura 2F, G) y, dependiendo del tamaño, también pueden funcionar para obtener imágenes. - Use pinzas #55 para colocar la pared lateral plana. El SV debe ser visible como una capa más oscura de tejido en el lado interno de la pared lateral.
NOTA: Los usuarios pueden encontrar, particularmente más cerca del extremo apical, que parte del tejido SV se desprende incidentalmente de la pared lateral a lo largo de la disección. - Haga palanca suavemente con la capa SV para separarla de la pared lateral en su extremo basal (Figura 2H). Empuje suavemente a un lado el SV separado y mueva los fórceps más hacia el extremo apical de la pared lateral, separando el SV como una cinta larga si es posible (Figura 2I). No apriete el SV con fórceps para tirar de él. Si el tejido es demasiado frágil para ser agarrado, alternativamente se puede recolectar usando una cuchara de pañuelo, como una cureta de chalazión.
NOTA: El movimiento del SV siempre debe hacerse bajo microscopía óptica para asegurarse de que no se pierda. Siempre tenga cuidado al agarrar con fórceps debido al riesgo de daño. Los usuarios pueden encontrar que el uso de la cureta chalazion mitiga el riesgo de daño al tejido SV. Para la secuenciación de un solo núcleo, continúe con la sección 5. Para la inmunotinción SV, continúe con la sección 7.
5. SV suspensión mononúcleo
NOTA: Este protocolo está adaptado para el tejido SV específicamente a partir de un protocolo de suspensión de un solo núcleo publicado por el fabricante. Se pueden utilizar plataformas de diferentes fabricantes31. Dada la variación específica de la plataforma, se recomienda revisar el protocolo específico del fabricante proporcionado con el equipo. Para lograr resultados óptimos para sNuc-Seq y minimizar la degradación del ARN, cuanto más rápida sea la disección del tejido, mejor (recomendado dentro de los 15-20 minutos posteriores a la eutanasia). Puede ser útil sacrificar a un animal a la vez y solo cuando esté listo para diseccionar. Tener varias personas trabajando simultáneamente en las disecciones también puede eliminar el tiempo de degradación (por ejemplo, un personal de laboratorio trabajando en el oído izquierdo mientras otro trabaja en el oído derecho).
- Si el tejido SV se va a utilizar para sNuc-Seq, coloque el tejido en tampón de lisis refrigerado (10 mM Tris-HCl, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 0,005% nonidet P40 en agua libre de nucleasa).
NOTA: Si la secuenciación se va a realizar inmediatamente después de la disección, continúe con el protocolo. Si se desea pausar el protocolo, la preservación de SV es posible colocando el SV en RNAlater. Conservar durante la noche a 4 °C, luego congelar rápidamente en nitrógeno líquido y almacenar a -80 °C hasta que esté listo para usar. Cuando esté listo para usar, descongele y lave dos veces en PBS durante 5 minutos cada una, luego proceda con la homogeneización (paso 5.2). - Homogeneizar el tejido en un homogeneizador de 2 mL con 10-20 golpes sobre hielo.
NOTA: El cilindro de vidrio contactará manualmente con la parte inferior del tubo de vidrio, fragmentando el SV. El SV es delicado, por lo que 20 golpes generalmente logran una homogeneización exitosa. - Lise el tejido en hielo durante 25 min.
NOTA: El tiempo de lisis varía según el tipo de tejido. Una lisis de 25 min en el tejido SV puede lograr una viabilidad celular baja (menos del 4%), pero el tiempo puede adaptarse si la viabilidad celular es demasiado alta (paso 5.8). - Filtrar a través de un filtro de 30 μm y girar el filtrado a 500 x g durante 5 min a 4 °C.
- Retire el sobrenadante y resuspenda el pellet celular en 1 ml de tampón de lavado y resuspensión de núcleos (1x PBS, albúmina sérica bovina al 1% [BSA], inhibidor de la RNasa 0.2U/μL).
- Filtrar las células a través de un filtro de 10 μm y centrifugar a 500 x g durante 5 min a 4 °C.
- Retirar el sobrenadante y resuspender en 50 μL de núcleos de lavado y tampón de resuspensión.
- Cuente los núcleos usando un contador de células y tinción de azul de tripano. Diluir 5 μL de la suspensión celular en 50 μL de 1x PBS para el recuento celular; La viabilidad debe ser mínima (3%-4%) en este punto. Si se encuentra que la viabilidad es mayor, adapte el protocolo para el paso 5.3 (lisis) y estandarice el tiempo de lisis para garantizar una lisis adecuada de las células.
NOTA: Una alta viabilidad celular en una preparación de un solo núcleo significa que hay más células intactas de las deseadas, y que puede ser necesaria una digestión adicional. - Cargue la muestra con la densidad nuclear deseada en el aparato/chip del fabricante (consulte la guía del fabricante). Las capturas de núcleos únicos ya están listas.
NOTA: A partir de un SV de ratón adulto, generalmente se alcanzan 50 μL de la suspensión a una concentración de 150,000 núcleos / ml.
6. Secuenciación de un solo núcleo SV
- Envíe las muestras a la instalación central para su secuenciación.
NOTA: Esta parte del protocolo sigue los pasos generales de (1) generación de perlas de gel en emulsión (GEM) y código de barras, (2) limpieza post-GEM-RT y amplificación de ADNc, y (3) construcción de la biblioteca de expresión génica 3'. El resto del protocolo sNuc-Seq es relativamente largo, y se recomienda que los lectores utilicen su protocolo específico del fabricante. La guía del fabricante probablemente describirá los pasos con detalles específicos e imágenes adjuntas. También puede haber videos de "cómo hacer" en el sitio web del fabricante. Los conjuntos de datos generados pueden representarse de manera dimensional reducida, como una aproximación y proyección de variedad uniforme (UMAP; Figura 3). Muchos laboratorios utilizan un núcleo de secuenciación que puede realizar este protocolo para los usuarios.
7. Inmunotinción SV y montaje de tejidos
- Si el tejido se va a utilizar para inmunotinción, transfiéralo a una placa de 24 pocillos, sumérjalo en 200 μL de paraformaldehído al 4% (PFA) en 1x PBS, e incubar durante 20 min a temperatura ambiente.
NOTA: Es útil realizar toda la eliminación de líquidos, lavado e inmunotinción bajo un microscopio. La visualización durante el pipeteo del tejido asegurará que no se pierda accidentalmente durante la eliminación del líquido. Los volúmenes de los anticuerpos y lavados pueden ajustarse siempre que el volumen sea lo suficientemente grande como para sumergir el tejido SV dentro de la solución. - Después de la etapa de fijación, retire el PFA realizando dos lavados cortos en 1x PBS (aproximadamente 500 μL) a 4 °C durante 5 min cada uno en un agitador orbital a bajas (30-50) RPM. Si se almacena, el tejido se puede almacenar en 1x PBS a 4 °C.
- Retirar el PBS y permeabilizar y bloquear durante un mínimo de 1 h a temperatura ambiente en aproximadamente 300 μL de solución de PBS-T (0,05 Tween20 en 1x PBS con 10% de suero fetal bovino).
NOTA: Los anticuerpos primarios y secundarios deben diluirse en esta solución bloqueante. - Teñir el tejido con anticuerpos primarios de acuerdo con las especificaciones del anticuerpo particular utilizado, generalmente durante la noche a 4 °C. Retire el PBS restante y agregue el anticuerpo primario diluido.
NOTA: La dilución debe elegirse en función de las sugerencias del fabricante, los datos publicados, la experiencia previa, etc. Por lo general, la primera concentración a probar es una dilución 1: 100-200. Para el ejemplo presentado en este documento, los anticuerpos GS-IB4 y DAPI se diluyeron cada uno a 1:200. Si se tinciona para más de una proteína, se pueden combinar múltiples anticuerpos primarios en la misma solución, siempre y cuando cada anticuerpo primario tenga un huésped diferente para evitar la reactividad cruzada de anticuerpos secundarios. - Lave el anticuerpo primario del tejido usando aproximadamente 500 μL de 1x PBS dos veces durante 10 minutos cada una en un agitador orbital a bajas RPM.
NOTA: Continúe asegurándose de que el tejido SV esté sumergido en la solución y no atascado en el lado del pozo. - Tinción con un anticuerpo secundario de acuerdo con las especificaciones del anticuerpo particular utilizado, generalmente durante 2 h a temperatura ambiente en un agitador orbital a bajas RPM. Cubra la placa de 24 pocillos para que el anticuerpo secundario marcado con fluorescencia esté protegido de la luz.
NOTA: Si se necesita más de un anticuerpo secundario, combine los anticuerpos secundarios en la misma solución. Asegúrese de evitar el etiquetado cruzado. - Lave el anticuerpo secundario del tejido usando aproximadamente 500 μL de 1x PBS cuatro veces durante 5 minutos cada una en un agitador orbital a bajas RPM. Mantenga la placa de 24 pocillos cubierta para protegerla de la luz.
- Prepare el microportaobjetos más grande (75 mm x 25 mm) colocando dos pequeñas vetas de pegamento a lo largo del eje de 25 mm, un poco más pequeño que el cubreobjetos de vidrio más pequeño de 18 mm x 18 mm. Coloque una gota de reactivo de montaje (aproximadamente 50 μL) entre las rayas de pegamento.
NOTA: El pegamento crea una pequeña cantidad de espacio vertical para que cuando el segundo cubreobjetos se coloque en la parte superior, la muestra de tejido SV pueda existir de manera segura, pero continúe en su lugar. Si bien el grosor de la estría es de 30-40 micras, se debe evitar apretar el tejido entre las superficies de vidrio para preservar la morfología. Alternativamente, también se puede usar cinta transparente. - Usando pinzas #55, agarre la menor cantidad de tejido posible en un extremo del SV y transfiéralo desde el PBS a la gota del reactivo de montaje en el microportaobjetos más grande (75 mm x 25 mm). Coloque un extremo de un cubreobjetos de vidrio más pequeño (18 mm x 18 mm) en la corredera donde se colocó una raya de pegamento y suéltela suavemente para evitar crear burbujas de aire. El cubreobjetos caerá a la otra raya de pegamento y cubrirá el tejido SV.
- Selle el soporte frotando una gota de esmalte de uñas transparente en cada esquina del soporte. Etiquete la muestra en consecuencia en el cubreobjetos de vidrio lejos del campo de visualización. Ahora está listo para microscopía confocal (Figura 4).
- Visualice el tejido SV con un microscopio de disección para asegurarse de que esté plano y no cerca de ninguna burbuja de aire. Si el tejido SV no está orientado correctamente, el usuario puede intentar expulsar las burbujas de aire o quitar cuidadosamente el cubreobjetos de vidrio más pequeño y reposicionar el SV. Esto debe hacerse suavemente para evitar romper los cubreobjetos de vidrio.
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Representative Results
Presentamos un método para aislar el SV que se utilizará para sNuc-Seq o inmunotinción. La anatomía relevante (Figura 1) de la cóclea en relación con la SV puede ayudar a los usuarios a comprender mejor la organización de la SV y los pasos del protocolo de disección.
Cada paso de esta microdisección de SV desde un mouse P30 se detalla en el video asociado, y las instantáneas de los pasos clave de esta disección y aislamiento de SV se presentan en la Figura 2.
sNuc-Seq es útil para investigar el perfil transcripcional de las diversas células en el SV heterogéneo. Una forma de visualizar esto es mediante la agrupación en clústeres en un UMAP 2D (Figura 3). El conjunto de datos generado a partir de sNuc-Seq puede evaluarse utilizando diferentes técnicas de análisis de datos, descritas con más detalle en la discusión.
El montaje completo SV con inmunomarcaje GS-IB4 y DAPI, junto con la fluorescencia Kcnj10-ZsGreen, se presentan en la Figura 4. Usando florescencia, el SV se puede visualizar después de eliminar los tejidos circundantes y montarlos. En estos ratones, ZsGreen se expresa particularmente en las células intermedias SV. La vasculatura del SV se puede visualizar en rojo (células endoteliales, GS-IB4).
Figura 1: Esquema de la heterogeneidad y organización celular de la estría vascular. Heterogeneidad y organización celular de Stria vascularis. Esquema de la estría vascular (SV) y su relación con las estructuras de la cóclea. El SV se compone de tres capas de células y es responsable de generar EP y alta concentración de potasio en la escala media que contiene endolinfa. La relación entre las células marginales, intermedias y basales se demuestra con las proyecciones basolaterales marginales que se extienden para interdigitarse con las células intermedias, que tienen proyecciones celulares bidireccionales que se interdigitan con las células marginales y basales. Además de estos tipos de células, otros tipos de células, incluyendo células fusiformes (amarillas), células endoteliales, pericitos y macrófagos (no mostrados) están presentes en el SV. Usado con permiso de Korrapati et al.30. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Disección de una cóclea de ratón adulta mayor o igual al día postnatal 30 (P30+). (A) Muestra durante la extracción del oído interno del hueso temporal circundante durante el paso 3.2. El oído interno está delineado en púrpura. (B) Muestra durante el paso 4.2 que muestra la superficie de la cóclea y el SV pigmentado subyacente. (C) Muestra durante el paso 4.4 que muestra el hueso extraído del giro apical y el SV expuesto (flecha amarilla). (D) Muestra durante el paso 4.5 que muestra la cóclea con más hueso extraído de los giros apicales y medios. (E) Muestra durante el paso 4.5 que muestra la extracción del hueso que cubre el giro medio, mostrando el SV subyacente (flecha amarilla). (F) Ejemplo de piezas más pequeñas de SV (flecha amarilla) y la pared lateral (flecha azul) durante el paso 4.10. (G) Ejemplo de ZsGreen SV fluorescente mientras que la pared lateral restante permanece oscura. KCNJ10-ZsGreen se expresa particularmente en las células intermedias del SV. (H) Ejemplo de piezas más grandes de SV (flecha amarilla) y la pared lateral (azul) separadas durante el paso 4.12. (I) El SV completamente separado de la pared lateral durante el paso 4.12. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Diagrama UMAP de conjuntos de datos sNuc-Seq de una estría vascular adulta tratada con ARN posterior. Las muestras conservadas con tratamiento posterior con ARN de tejido SV adulto con posterior aislamiento de núcleos se agruparon mediante un método de agrupamiento basado en modularidad con el algoritmo de optimización de Leiden y se visualizaron de manera dimensionalmente reducida mediante un gráfico UMAP 2D. Cada punto representa una sola celda, y las células con perfiles transcripcionales similares se agrupan. Los tipos de células se colorean en función de su expresión de genes conocidos expresados por tipos de células SV adultas. Las muestras se almacenaron en ARN más tarde durante no más de 6 meses. El SV de aproximadamente cinco ratones CBA / J P30 se utilizó para generar este conjunto de datos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Stria vascularis montaje completo de un ratón P30 Kcnj10-ZsGreen. Imagen confocal de SV de montaje completo de un ratón P30, que demuestra la expresión de ZsGreen en las células intermedias, las células endoteliales de marcado GS-IB4 (rojo) y los núcleos de marcado DAPI (blanco). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Antes del advenimiento de la secuenciación de células individuales, muchos investigadores utilizaron el análisis de tejido a granel, que solo hizo posible analizar transcriptomas promediados en las células. En particular, la célula única y sNuc-Seq permitieron aislar el transcriptoma de una sola célula o de un solo núcleo, respectivamente32. En este caso, se pueden identificar transcriptomas de un solo núcleo para células marginales, intermedias y basales, así como para células fusiformes30. Esto permite la investigación de la heterogeneidad transcripcional entre los tipos de células SV y se puede utilizar en el futuro para investigar la contribución de estos tipos de células a la función SV, incluida la generación y el mantenimiento de EP. Los conjuntos de datos generados con sNuc-Seq se pueden mostrar de manera dimensionalmente reducida para facilitar la comprensión de las diferencias transcripcionales generales y comparar diferentes poblaciones celulares utilizando un gráfico UMAP Figura 4. Existen numerosas formas de realizar análisis bioinformáticos para la interpretación de conjuntos de datos sNuc-Seq. Estos incluyen, entre otros: análisis de expresión diferencial, inferencia y agrupamiento de redes reguladoras de células individuales (SCENIC), construcción de diagramas de violín de mapa de calor o grin y análisis de regulones18. Otras técnicas de análisis computacional para la secuenciación de ARN unicelular son similares a sNuc-Seq, y se discuten con más detalle en las revisiones de Hwang et al.32, Shafer33 y Chen et al.34.
La otra aplicación importante de esta técnica de disección es la inmunotinción para estudiar mejor las estructuras seleccionadas dentro del SV. Podemos observar esto en la configuración de una montura completa SV que fue fotografiada usando microscopía confocal (Figura 3). Los núcleos de todas las células se visualizan con el etiquetado DAPI. Los capilares se ven a través de la tinción de células endoteliales con GS-IB4 en rojo. Las células intermedias, en este caso, han sido modificadas genéticamente utilizando un promotor celular intermedio específico para expresar ZsGreen.
Las limitaciones de sNuc-Seq incluyen: (1) falta de información espacial, (2) sesgos contra las poblaciones de células inmunes y (3) exclusión del ARN citoplasmático. Las técnicas transcriptómicas espaciales pueden proporcionar información más específica sobre las subpoblaciones celulares dentro del tejido35. Dadas las diferencias de protocolo entre sNuc-Seq y la secuenciación de ARN unicelular, como la disociación y el almacenamiento de tejidos, el perfil transcripcional generado por sNuc-Seq puede sesgar en contra de las células inmunes mientras que es más poderoso para caracterizar los tipos de células unidas36. Además, la secuenciación de ARN unicelular incluye ARN citoplasmático como el ARN mitocondrial, mientras que sNuc-Seq no lo hace. A pesar de estos casos de diferencias transcripcionales entre los dos métodos, se ha demostrado que, en general, sNuc-Seq tiene un perfil transcripcional similar a la secuenciación de ARN unicelular completo37, y en el SV en particular30.
Para una microdisección exitosa, hay varios pasos críticos a tener en cuenta. En los primeros pasos, uno debe extraer adecuadamente el oído interno para evitar aplastar la cóclea subyacente. La observación de la extracción ósea temporal adecuada se muestra en la Figura 2A. Una vez que la cóclea está correctamente expuesta, se debe tener cuidado de raspar suavemente y romper el hueso coclear para exponer la pared lateral subyacente y SV. Una vez que la pared lateral y SV se extraen con éxito, el usuario debe separar cuidadosamente el SV de la pared lateral. Se debe aplicar suficiente fuerza en el plano correcto para sacar el SV de la pared lateral, evitando dañar el SV frágil. Para la microdisección SV, puede ser útil pensar en "diseccionar otras estructuras lejos de la SV", en lugar de "diseccionar la SV fuera de la cóclea".
Este protocolo se puede modificar para diferentes edades de ratones y para diferentes especies de mamíferos, como las ratas. Para los ratones más jóvenes, los tejidos diferirán en textura y las estructuras serán más pequeñas en general. Para diferentes especies de mamíferos, la anatomía coclear será relativamente similar, con el tamaño del animal determinando la mayor parte de la diferencia.
En general, los inconvenientes de este protocolo son similares a otras técnicas de microdisección coclear38. Aislar el delicado SV puede ser técnicamente desafiante y se puede romper en pedazos más pequeños.
Esta técnica no es óptima para salvar el órgano de Corti para todo el montaje, ya que a menudo se daña con este protocolo. Existen otras técnicas de disección específicamente dirigidas a preservar el órgano de Corti para montaje completo e inmunotinción38, pero éstas tienen sus propios inconvenientes, considerando que sNuc-Seq debe hacerse con muestras frescas para evitar la degradación del ARN, no en el contexto de la fijación tisular y la descalcificación.
Con el tiempo y la repetición, los usuarios se sentirán más cómodos con este protocolo de microdisección SV.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Esta investigación fue apoyada en parte por el Programa de Investigación Intramuros de los NIH, NIDCD a M.H. (DC000088)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10-µm filter (Polyethylenterephthalat) | PluriSelect | #43-50010-01 | Filter tissue during sNuc-Seq |
| 18 x 18 mm cover glass | Fisher Scientific | 12-541A | Cover slip to mount SV |
| 30-µm filter (Polyethylenterephthalat) | PluriSelect | #43-50030-03 | Filter tissue during sNuc-Seq |
| 75 x 25 mm Superfrost Plus/Colorforst Plus Microslide | Daigger | EF15978Z | Microslide to mount SV on |
| C57BL/6J Mice | The Jackson Laboratory | RRID: IMSR_JAX:000664 | General purpose mouse strain that has pigment more easily seen in the intermediate cells of the SV. |
| Cell Counter | Logos Biosystems | L20001 | Used for cell counting |
| Chalizon curette 5'', size 3 2.5 mm | Biomedical Research Instruments | 15-1020 | Used to transfer SV |
| Chromium Next GEM single Cell 3' GEM Kit v3.1 | Chromium | PN-1000141 | Generates single cell 3' gene expression libraries |
| Clear nail polish | Fisher Scientific | NC1849418 | Used for sealing SV mount |
| Corning Falcon Standard Tissue Culture Dishes, 24 well | Corning | 08-772B | Culture dish used to hold specimen during dissection |
| DAPI | Invitrogen | D1306, RRID: AB_2629482 | Stain used for nucleus labeling |
| Dounce homogenizer | Sigma-Aldrich | D8938 | Used to homogenize tissue for sNuc-seq |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | General forceps for dissection |
| Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | Forceps with fine tip that makes SV manipulation easier |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher | 16000044 | Used for steps of sNuc-Seq |
| Glue stick | Fisher Scientific | NC0691392 | Used for mounting SV |
| GS-IB4 Antibody | Molecular Probes | I21411, RRID: AB-2314662 | Antibody used for capillary labeling |
| KCNJ10-ZsGreen Mice | n/a | n/a | Transgenic mouse that expresses KCNJ10-ZsGreen, partiularly in the intermediate cells of the SV. |
| MgCl2 | ThermoFisher | AM9530G | Used for steps of sNuc-Seq |
| Mounting reagent | ThermoFisher | #S36940 | Mounting reagent for SV |
| Multiwell 24 well plate | Corning | #353047 | Plate used for immunostaining |
| NaCl | ThermoFisher | AAJ216183 | Used for steps of sNuc-Seq |
| Nonidet P40 | Sigma-Aldrich | 9-16-45-9 | Used for steps of sNuc-Seq |
| Nuclease free water | ThermoFisher | 4387936 | Used for steps of sNuc-Seq |
| Orbital shaker | Silent Shake | SYC-2102A | Used for steps of immunostaining |
| PBS | ThermoFisher | J61196.AP | Used for steps of immunostaining and dissection |
| RNA Later | Invitrogen | AM7021 | Used for preservation of SV for sNuc-Seq |
| Scizzors | Fine Science Tools | 14058-09 | Used for splitting mouse skull |
| Tris-HCl | Sigma-Aldrich | 15506017 | Used for steps of sNuc-Seq |
| Trypan blue stain | Gibco | 15250061 | Used for cell counting |
| Tween20 | ThermoFisher | AAJ20605AP | Used for steps of sNuc-Seq |
| Zeiss STEMI SV 11 Apo stereomicroscope | Zeiss | n/a | Microscope used for dissections |
References
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