Summary
הסטריה וסקולריס חיונית ליצירת הפוטנציאל האנדוקוכליארי. כאן, אנו מציגים את הדיסקציה של העכבר הבוגר stria vascularis עבור ריצוף גרעין יחיד או immunostaining.
Abstract
הפוטנציאל האנדוקוכליארי, אשר נוצר על ידי כלי הדם stria, הוא חיוני כדי לשמור על סביבה תורמת mechanotransduction תאי שיער מתאים ובסופו של דבר שמיעה. פתולוגיות של כלי הדם stria יכול לגרום לירידה בשמיעה. דיסקציה של הסטריה וסקולריס הבוגרת מאפשרת לכידה ממוקדת של גרעין יחיד ולאחר מכן ריצוף גרעין יחיד וצביעת חיסון. טכניקות אלה משמשות לחקר פתופיזיולוגיה של סטריה וסקולריס ברמת התא היחיד.
ריצוף גרעין יחיד יכול לשמש בהגדרה של ניתוח שעתוק של כלי הדם stria. בינתיים, צביעת מערכת החיסון ממשיכה להיות שימושית בזיהוי אוכלוסיות ספציפיות של תאים. שתי השיטות דורשות דיסקציה נכונה של stria vascularis כתנאי מוקדם, אשר יכול להוכיח להיות מאתגר מבחינה טכנית.
Introduction
השבלול מורכב משלושה תאים מלאים בנוזל, סקאלה וסטיבולי, סקאלה מדיה וסקלה טימפני. סקאלה וסטיבולי וסקלה טימפאני מכילים כל אחד פרילימפה, אשר יש ריכוז גבוה של נתרן (138 mM) וריכוז נמוך של אשלגן (6.8 mM)1. מדיה סקאלה מכיל endolymph, אשר יש ריכוז גבוה של אשלגן (154 mM) וריכוז נמוך של נתרן (0.91 mM)1,2,3. הבדל זה בריכוז היונים יכול להיקרא פוטנציאל אנדוקוכליארי (EP), והוא נוצר בעיקר על ידי תנועה של יוני אשלגן דרך תעלות יונים שונות וצמתים מרווחים בסטריה וסקולריס (SV) לאורך הדופן הצידית של השבלול 4,5,6,7,8,9,10,11 . SV היא רקמה הטרוגנית, מאוד וסקולרית, שמרפדת את האספקט המדיאלי של הדופן הצידית של השבלול ומכילה שלושה סוגי תאים עיקריים: תאים שוליים, תאי ביניים ותאי בסיס12 (איור 1).
תאי שוליים מחוברים על ידי צמתים הדוקים כדי ליצור את המשטח המדיאלי ביותר של SV. הממברנה האפיקלית פונה לאנדולימפה של מדיה סקאלה ותורמת להעברת יוני אשלגן לתוך האנדולימפה באמצעות ערוצים שונים, כולל KCNE1/KCNQ1, SLC12A2 ו-Na+-K+-ATPase (NKA)5,10,13,14. תאי ביניים הם תאים פיגמנטיים השוכנים בין תאים שוליים לתאי בסיס ומאפשרים העברת אשלגן דרך SV באמצעות KCNJ10 (Kir 4.1)15,16. תאי הבסיס נמצאים בסמיכות לדופן הצידית של השבלול וקשורים קשר הדוק עם פיברוציט של הרצועה הספירלית כדי לקדם מחזור אשלגן מהפרילימפה12. פתולוגיה של SV הייתה מעורבת בהפרעות אוטולוגיות רבות17,18. מוטציות בגנים המתבטאים בסוגי תאי SV העיקריים, כגון Kcnq1, Kcne1, Kcnj10 ו-Cldn11, עלולות לגרום לחירשות ולתפקוד לקוי של SV, כולל אובדן EP 19,20,21,22,23. בנוסף לשלושת סוגי התאים העיקריים, ישנם סוגי תאים אחרים פחות נחקרים ב-SV, כגון תאי ציר 22, תאי שורש12,24, מקרופאגים 25, פריציטים 26 ותאי אנדותל 27, שיש להם תפקידים לא מוגדרים לחלוטין הקשורים להומאוסטזיס יוני וליצירת EP 28.
בהשוואה לריצוף רנ"א בתפזורת, ריצוף רנ"א חד-גרעיני (sNuc-Seq) מספק מידע על הטרוגניות התא, ולא ממוצע של mRNA על פני קבוצת תאים29, ויכול להיות שימושי במיוחד כאשר חוקרים את SV30 ההטרוגני. לדוגמה, sNuc-Seq הפיק ניתוח שעתוק המצביע על כך שייתכן שיש תפקיד לתאי ציר ושורש ביצירת EP, אובדן שמיעה ומחלת מנייר18. אפיון שעתוק נוסף של סוגי תאי SV השונים יכול לספק לנו מידע רב ערך על הפתופיזיולוגיה העומדת בבסיס מנגנונים ותת-סוגים שונים של תנודות שמיעה הקשורות ל-SV ואובדן שמיעה. הקציר של מבני האוזן הפנימית העדינים הללו הוא בעל חשיבות עליונה לניתוח רקמות אופטימלי.
במחקר זה מתוארת גישת המיקרודיסקציה לגישה ולבידוד של כלי הדם הסטריה משברלול העכבר הבוגר עבור sNuc-Seq או immunostaining. דיסקציה של SV עכבר בוגר נדרשת כדי להבין סוגים שונים של תאי SV ולאפיין עוד יותר את תפקידם בשמיעה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הניסויים וההליכים בבעלי חיים בוצעו על פי פרוטוקולים שאושרו על ידי הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים של המכון הלאומי למחלות נוירולוגיות ושבץ מוחי והמכון הלאומי לחירשות והפרעות תקשורת אחרות, המכונים הלאומיים לבריאות. כל הפרוטוקולים הניסיוניים אושרו על ידי הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים של המכון הלאומי למחלות נוירולוגיות ושבץ מוחי והמכון הלאומי לחירשות והפרעות תקשורת אחרות, המכונים הלאומיים לבריאות. כל השיטות בוצעו בהתאם להנחיות ולתקנות הרלוונטיות של הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים של המכון הלאומי למחלות נוירולוגיות ושבץ מוחי והמכון הלאומי לחירשות והפרעות תקשורת אחרות, המכונים הלאומיים לבריאות.
1. המתת חסד של בעלי חיים
- השתמש C57BL/6J או Kcnj10-ZsGreen עכברים טרנסגניים, יום לאחר הלידה 30+ (P30+), כי לשקול בין 15-20 גרם.
- יש להרדים עכבר בוגר (מגיל P30 ומעלה) באמצעות פרוטוקול מאושר (כאן חנק CO2 ). בצע עריפת ראש כשלב משני.
הערה: במקרה של immunostaining, נוגדנים מסוימים עשויים להיות אות רקע עקב קשירה לא ספציפית לדם בנימים של SV. זילוח לב עם קיבוע יכול לטפל בבעיה זו על ידי הסרת דם מן הנימים של SV. עם זאת, רוב הנוגדנים יכולים להשיג תוצאות טובות ללא שיטה זו, וזה לא יהיה מכוסה בפרוטוקול זה.
2. חשיפת מבוך גרמי
- נקו את העכבר על ידי ריסוס באתנול 70% וניגוב במגבת נייר. שימו לב במיוחד לאזור הראש כדי להפחית את הסיכון לזיהום. הסר את העור מהגולגולת על ידי משיכת העור לכיוון האף.
- בעזרת מספריים חדים, פצלו את הגולגולת לאורך מישור הקשת האמצעית כדי להפריד בין החלק השמאלי לחלק הימני.
- הסר את המוח מהגולגולת כדי לחשוף את המבוך הגרמי.
3. מיצוי האוזן הפנימית
- זהו את האוזן הפנימית בתוך העצם הרקתית (איור 2A) וגרדו את עצבי הגולגולת באמצעות מלקחיים #55.
הערה: המשתמש צריך לייצב את הדגימה עם היד הלא דומיננטית שלו באמצעות קבוצה שנייה של #55 מלקחיים. אזורים שונים של הדגימה עשויים להיתפס עם המלקחיים המייצבים לאורך כל הדיסקציה אם נמנעים מאזורים קריטיים של הדגימה (למשל, לא למחוץ את השבלול). - באמצעות #55 מלקחיים, לנתח את הבולה ואת הקפסולה, לנתק אותם מן העצם שמסביב. יש להסיר את שאריות הרקמה הרכה משטח האוזן הפנימית.
- העבירו את הדגימה לצלחת תרבית רקמה שקופה המכילה 1x PBS קר (מלח חוצץ פוספט), pH 7.4, והניחו תחת תחום דיסקציה (איור 2B).
4. דיסקציה SV
הערה: עם תרגול, ניתן לנתח את SV כמו חתיכה אחת ארוכה הדומה לסרט. ה-SV שביר, כך שאם הוא נשבר לחתיכות, ניתן לאחסן אותן יחד. לחלופין, ניתן לאחסן אותם בבארות המסומנות בנפרד בהתאם לתורם (למשל, בזאלי, אמצעי, אפיקלי).
- אם ניתן להזיז את מקורות האור של טווח הדיסקציה, הניחו מקור אור אחד מעל הצלחת ואת מקור האור השני מהצד, במקביל למשטח הניתוח. זה מאפשר ניגודיות טובה יותר של הרקמה מתחת לעצם השבלול.
- באמצעות מלקחיים #55, החזיקו את הדגימה בחלק שיווי המשקל כשהשבלול פונה כלפי מעלה.
- באמצעות #55 מלקחיים, לחדור דרך עצם השבלול בקודקוד.
הערה: #5 מלקחיים עבים יותר מ #55 וניתן להשתמש בהם לשבירת עצם, אך הגידול בגודל / כוח מקריב את עדינות המלקחיים ואת היכולת לתפעל רקמות קטנות. שקול להשתמש במלקחיים העשויים מחומר כגון inox או dumostar כדי למנוע נזק שעלול להתרחש למלקחיים עדינים יותר. הימנע מדחיפת המלקחיים עמוק מדי מתחת לעצם כדי למנוע נזק ל- SV. - באמצעות מלקחיים #55, גרדו לאורך הסיבוב האפי (איור 2C), תוך הפעלת כוח עדין כדי לשבור חתיכות קטנות של שכבת העצם החיצונית. הרימו בעדינות את העצם ונתקו אותה מהדופן הצידית.
הערה: ייתכן שיהיה מועיל לחשוב על נתיחה זו כעל "הסרת הכל מה-SV", במקום "לנתח את ה-SV מתוך השבלול". - המשיכו להשתמש במלקחיים #55 כדי להסיר חתיכות עצם שבלול מהפניות האפיקליות והאמצעיות (איור 2D,E). דוחפים בעדינות את הקיר הרוחבי, מחטטים ומסירים חתיכות דופן עצם לכיוון הפנייה האמצעית כדי לחשוף את הקיר הצידי של הסיבובים האפיקליים והאמצעיים.
- ממשיכים להשתמש במלקחיים #55, דוחפים בעדינות את הקיר הצידי של הסיבוב האפי הצידה כדי לחשוף את הגנגליון הספירלי. נתקו את הדופן הצידית של סיבובים אפיים ואמצעיים מהגנגליון הספירלי לאורך שכבת תא השערה החיצונית. הסר חתיכות של גנגליון ספירלי מתוך השבלול.
הערה: #55 מלקחיים קטנים יותר ומספקים יתרון בעת מניפולציה של רקמות קטנות ועדינות. יש לנקוט משנה זהירות כדי למנוע כיפוף או פגיעה בהם. - כדי לקבל גישה טובה יותר לדופן הצידית של סיבוב הבסיס, נתק את השבלול מהחלק הווסטיבולרי של העצם הטמפורלית באמצעות מלקחיים #55. הכניסו את המלקחיים #55 לחלון העגול והסגלגל ודחפו כלפי מטה לכיוון הפרוזדור. השבלול יתנתק. הסר את החלק הווסטיבולרי של האוזן הפנימית.
- המשך שימוש #55 מלקחיים, עכשיו להסיר חתיכות של עצם השבלול הבסיסית, החל מאזור הסיבוב האמצעי. דחפו בעדינות את שכבת הדופן הצידית מתחת לעצם כדי לנתק אותה.
- הסר את החלק הבסיסי הרחוק ביותר של הדופן הצידית על ידי חטטנות ומשיכה עדינה של הרקמה. העצם באזור זה עשויה להיות עבה מכדי שניתן יהיה להסיר אותה מבלי לפגוע ברקמה הרכה שמתחתיה.
- כעת, כאשר החלק הבסיסי של הדופן הצידית מנותק, יש להפריד ככל האפשר את הדופן הצידית מהשבלול. ניתן לעשות זאת על ידי מעקב אחר המלקחיים #55 לאורך הקיר הרוחבי. מברישים בעדינות את המלקחיים בין העצם לדופן הצידית הנותרת. ניתן לעשות זאת עד לשיא בחתיכה אחת אם המשתמש מנוסה. העבר את הקיר הצידי ל- PBS טרי.
הערה: אף על פי שחתיכות SV גדולות יותר עשויות להיות קלות יותר לצילום, בהתחשב באופי העדין של הרקמות, ניתן לצלם חתיכות קטנות יותר (איור 2F,G), ובהתאם לגודל, הן יכולות לעבוד גם להדמיה. - השתמש #55 מלקחיים כדי להניח את הקיר לרוחב שטוח. ה- SV צריך להיראות כשכבה כהה יותר של רקמה בצד הפנימי של הקיר הצידי.
הערה: משתמשים עשויים לגלות, במיוחד קרוב יותר לקצה האפיקאלי, שחלק מרקמת SV מתנתקת אגב מהדופן הצידית לאורך כל הדיסקציה. - חטטו בעדינות בשכבת SV כדי לנתק אותה מהדופן הצידית בקצה הבסיסי שלה (איור 2H). דחפו הצידה בעדינות את ה-SV המנותק והזיזו את המלקחיים עוד יותר לכיוון הקצה האפי של הקיר הצידי, תוך ניתוק ה-SV כסרט אחד ארוך במידת האפשר (איור 2I). אין לסחוט את ה-SV עם מלקחיים כדי למשוך אותו. אם הרקמה שברירית מכדי שניתן יהיה לתפוס אותה, ניתן לחילופין לאסוף אותה באמצעות סקופ רקמה, כגון גרידת כלזיון.
הערה: הזזת SV צריכה להיעשות תמיד תחת מיקרוסקופ אור כדי להבטיח שהוא לא יאבד. היזהר תמיד בעת אחיזה באמצעות מלקחיים בשל הסיכון לנזק. משתמשים עשויים לגלות כי שימוש בגרידת chalazion מפחית את הסיכון לנזק לרקמת SV. לריצוף גרעין יחיד, המשך לסעיף 5. עבור SV immunostaining, המשך לסעיף 7.
5. מתלה SV בעל גרעין יחיד
הערה: פרוטוקול זה מותאם לרקמת SV במיוחד מפרוטוקול השעיה של גרעין יחיד של יצרן שפורסם. ניתן להשתמש בפלטפורמות של יצרנים שונים31. בהינתן וריאציה ספציפית לפלטפורמה, מומלץ לסקור את הפרוטוקול הספציפי ליצרן שסופק עם הציוד. כדי להשיג תוצאות אופטימליות עבור sNuc-Seq ולמזער את פירוק ה-RNA, ככל שדיסקציה של הרקמה מהירה יותר כך טוב יותר (מומלץ תוך 15-20 דקות מהמתת חסד). זה עשוי להיות מועיל להרדים בעל חיים אחד בכל פעם ורק כאשר מוכן לנתח. העובדה שמספר אנשים עובדים בו זמנית על הנתיחות יכולה גם למנוע את זמן ההשפלה (למשל, צוות מעבדה אחד עובד על אוזן שמאל בעוד שאחר עובד על אוזן ימין).
- אם רקמת SV תשמש עבור sNuc-Seq, מקם את הרקמה במאגר ליזה מקורר (10 mM Tris-HCl, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 0.005% nonidet P40 במים ללא נוקלאז).
הערה: אם יש לבצע ריצוף מיד לאחר הנתיחה, המשך את הפרוטוקול. אם רוצים להשהות את הפרוטוקול, שימור SV אפשרי על ידי הכנסת SV ל-RNAlater. יש לאחסן למשך הלילה בטמפרטורה של 4°C, ולאחר מכן להקפיא במהירות הבזק בחנקן נוזלי ולאחסן בטמפרטורה של -80°C עד לשימוש מוכן. כאשר המוצר מוכן לשימוש, יש להפשיר ולשטוף פעמיים ב-PBS למשך 5 דקות כל אחד, ולאחר מכן להמשיך בהומוגניזציה (שלב 5.2). - הומוגניזציה של הרקמה בהומוגנייזר 2 מ"ל עם 10-20 פעימות על קרח.
הערה: גליל הזכוכית יבוא במגע ידני עם תחתית צינור הזכוכית ויקטע את ה-SV. SV הוא עדין, ולכן 20 שבץ בדרך כלל משיג הומוגניזציה מוצלחת. - מפזרים את הרקמה על קרח במשך 25 דקות.
הערה: זמן הליזה משתנה בהתאם לסוג הרקמה. ליזה של 25 דקות ברקמת SV עשויה להשיג כדאיות תאים נמוכה (פחות מ -4%), אך הזמן עשוי להיות מותאם אם הכדאיות התאית גבוהה מדי (שלב 5.8). - סנן דרך מסנן 30 מיקרומטר וסובב את התסנין ב 500 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C.
- הסר את supernatant ו resuspend את גלולת התא ב 1 מ"ל של גרעינים לשטוף חיץ השעיה (1x PBS, 1% אלבומין בסרום בקר [BSA], 0.2U / μL מעכב RNase).
- סנן את התאים דרך מסנן 10 מיקרומטר וצנטריפוגה ב 500 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C.
- הסר את supernatant ו resuspend ב 50 μL של גרעינים לשטוף ואת חיץ התלייה.
- ספרו את הגרעינים באמצעות מונה תאים וצביעה כחולה טריפאן. לדלל 5 μL של תרחיף התא לתוך 50 μL של 1x PBS לספירת תאים; הכדאיות צריכה להיות מינימלית (3%-4%) בשלב זה. אם הכדאיות נמצאה גבוהה יותר, התאימו את הפרוטוקול לשלב 5.3 (ליזיס) ותקננו את זמן הליזה כדי להבטיח ליזה נאותה של התאים.
הערה: יכולת קיום גבוהה של תאים בהכנת גרעין יחיד פירושה שיש יותר תאים שלמים מהרצוי, וכי ייתכן שיהיה צורך בעיכול נוסף. - טען את הדגימה עם הצפיפות הגרעינית הרצויה על המנגנון/שבב של היצרן (ראה מדריך יצרנים). לכידות של גרעינים בודדים מוכנות כעת.
הערה: מעכבר בוגר אחד SV, 50 μL של התרחיף בריכוז של 150,000 גרעינים/מ"ל מושגת בדרך כלל.
6. ריצוף גרעין יחיד SV
- שלח את הדגימות למתקן הליבה לריצוף.
הערה: חלק זה של הפרוטוקול עוקב אחר השלבים הכלליים של (1) יצירה וקידוד של חרוזי ג'ל בתחליב (GEM), (2) ניקוי לאחר GEM-RT והגברת cDNA, ו-(3) בניית ספריית ביטוי גנים 3 אינץ'. שאר פרוטוקול sNuc-Seq ארוך יחסית, ומומלץ לקוראים להשתמש בפרוטוקול הספציפי ליצרן שלהם. סביר להניח שמדריך היצרן יתאר שלבים עם פרטים ספציפיים ותמונות נלוות. ייתכנו גם סרטוני 'כיצד לבצע' באתר היצרן. מערכי נתונים שנוצרו עשויים להיות מיוצגים באופן מופחת ממדים, כגון קירוב סעפת אחיד והקרנה (UMAP; איור 3). מעבדות רבות משתמשות בליבת ריצוף שעשויה לבצע פרוטוקול זה עבור משתמשים.
7. SV immunostaining והרכבת רקמות
- אם הרקמה תשמש לצביעת חיסון, העבירו אותה לצלחת בת 24 בארות, שקועה ב-200 מיקרוליטר של 4% פרפורמלדהיד (PFA) ב-1x PBS, ודגרו במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.
הערה: כדאי לבצע את כל ההסרה, השטיפה והצביעה החיסונית של נוזלים מתחת למיקרוסקופ. הדמיה תוך כדי פיפטינג הרקמה תבטיח שהיא לא תאבד בטעות במהלך הסרת נוזלים. ניתן להתאים את נפחי הנוגדנים והשטיפות כל עוד הנפח גדול מספיק כדי להטביע את רקמת SV בתוך התמיסה. - לאחר שלב הקיבוע, הסר את ה- PFA על ידי ביצוע שתי שטיפות קצרות ב- 1x PBS (כ- 500 μL) ב- 4 ° C למשך 5 דקות כל אחת על שייקר מסלול בסל"ד נמוך (30-50). אם מאחסנים, ניתן לאחסן את הרקמה ב-1x PBS ב-4°C.
- יש להסיר את ה-PBS ולחדור ולחסום למשך שעה לפחות בטמפרטורת החדר בכ-300 מיקרוליטר של תמיסת PBS-T (0.05 Tween20 ב-1x PBS עם 10% נסיוב בקר עוברי).
הערה: יש לדלל נוגדנים ראשוניים ומשניים בתמיסת חסימה זו. - מכתימים את הרקמה בנוגדן ראשוני בהתאם למפרט של הנוגדן המסוים בו משתמשים, בדרך כלל לילה ב 4 מעלות צלזיוס . הסר את PBS הנותרים והוסף את הנוגדן הראשוני המדולל.
הערה: יש לבחור את הדילול על סמך הצעות היצרן, הנתונים שפורסמו, ניסיון קודם וכו'. בדרך כלל, הריכוז הראשון שיש לבדוק הוא דילול של 1:100-200. לדוגמה המוצגת במאמר זה, נוגדני GS-IB4 ו- DAPI דוללו כל אחד בשעה 1:200. אם מכתימים יותר מחלבון אחד, ניתן לשלב נוגדנים ראשוניים מרובים לאותה תמיסה, כל עוד לכל נוגדן ראשוני יש מארח שונה כדי למנוע תגובתיות צולבת של נוגדנים משניים. - שטפו את הנוגדן הראשוני מהרקמה באמצעות כ-500 μL של 1x PBS פעמיים למשך 10 דקות כל אחת על שייקר אורביטלי בסל"ד נמוך.
הערה: המשך לוודא שרקמת SV שקועה בתמיסה, ולא תקועה בצד הבאר. - מכתים בנוגדן משני בהתאם למפרט הנוגדן המסוים בו משתמשים, בדרך כלל למשך שעתיים בטמפרטורת החדר על שייקר אורביטלי בסל"ד נמוך. כסו את צלחת 24 הבארות כך שהנוגדן המשני המתויג פלואורסצנטית מוגן מפני אור.
הערה: אם יש צורך ביותר מנוגדן משני אחד, שלב את הנוגדנים המשניים לאותה תמיסה. הקפד להימנע מתיוג צולב. - שטפו את הנוגדן המשני מהרקמה באמצעות כ-500 מיקרוליטר של PBS 1x ארבע פעמים למשך 5 דקות כל אחת על שייקר אורביטלי בסל"ד נמוך. שמור את צלחת 24 בארות מכוסה כדי להגן עליו מפני אור.
- הכינו את המגלשה הגדולה יותר (75 מ"מ x 25 מ"מ) על ידי הנחת שני פסים קטנים של דבק לאורך ציר ה-25 מ"מ, קטנים רק מכיסויי הזכוכית הקטנים יותר בגודל 18 מ"מ x 18 מ"מ. הניחו טיפה אחת של מגיב הרכבה (כ-50 מיקרוליטר) בין פסי הדבק.
הערה: הדבק יוצר כמות קטנה של רווח אנכי כך שכאשר מניחים את הכיסוי השני למעלה, דגימת רקמת SV יכולה להתקיים בבטחה, אך להמשיך להישאר במקומה. בעוד שעובי הסטריה הוא 30-40 מיקרון, יש להימנע מסחיטת הרקמה בין משטחי הזכוכית כדי לשמר מורפולוגיה. לחלופין, ניתן להשתמש גם בסרט שקוף. - באמצעות #55 מלקחיים, לתפוס כמה שפחות רקמות על קצה אחד של SV ולהעביר מן PBS כדי טיפה של מגיב הרכבה על microslide גדול יותר (75 מ"מ x 25 מ"מ). הניחו קצה אחד של מכסה זכוכית קטן יותר (18 מ"מ x 18 מ"מ) על המגלשה שבה הונח פס דבק אחד ושחררו בעדינות כדי למנוע יצירת בועות אוויר. הכיסוי ייפול לפס הדבק השני ויכסה את רקמת SV.
- אטמו את התושבת על ידי טבילת טיפה של לק שקוף בכל פינה של התושב. תייגו את הדגימה בהתאם על כיסוי הזכוכית הרחק משדה ההדמיה. כעת הוא מוכן למיקרוסקופ קונפוקלי (איור 4).
- דמיינו את רקמת SV באמצעות מיקרוסקופ דיסקציה כדי לוודא שהיא מונחת שטוחה ולא ליד בועות אוויר. אם רקמת SV אינה מכוונת כראוי, המשתמש יכול לנסות לדחוף החוצה בועות אוויר או להסיר בזהירות את כיסוי הזכוכית הקטן יותר ולמקם מחדש את ה- SV. יש לעשות זאת בעדינות כדי למנוע שבירת כיסויי הזכוכית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
אנו מציגים שיטה לבודד את SV לשימוש עבור sNuc-Seq או immunostaining. האנטומיה הרלוונטית (איור 1) של השבלול ביחס ל-SV יכולה לעזור למשתמשים להבין טוב יותר את הארגון של SV ואת השלבים של פרוטוקול הדיסקציה.
כל שלב של מיקרו-דיסקציה זו של SV מעכבר P30 מפורט בווידיאו המשויך, ותצלומי בזק של שלבי המפתח של הדיסקציה והבידוד של SV מוצגים באיור 2.
sNuc-Seq שימושי בחקירת פרופיל השעתוק של התאים השונים ב-SV ההטרוגני. דרך אחת שבה ניתן להמחיש זאת היא באמצעות קיבוץ באשכולות ב-UMAP דו-ממדי (איור 3). ניתן להעריך את מערך הנתונים שנוצר מ- sNuc-Seq באמצעות טכניקות ניתוח נתונים שונות, המתוארות בהמשך הדיון.
SV הרכבה שלמה עם תיוג חיסוני GS-IB4 ו-DAPI, יחד עם פלואורסצנטיות Kcnj10-ZsGreen, מוצגים באיור 4. באמצעות תפרחת, SV ניתן לדמיין לאחר הסרת הרקמות שמסביב הרכבה. בעכברים אלה, ZsGreen מתבטא במיוחד בתאי הביניים SV. כלי הדם של SV ניתן לדמיין באדום (תאי אנדותל, GS-IB4).
איור 1: סכמטיות של ההטרוגניות התאית של הסטריה וסקולריס והארגון. Stria vascularis הטרוגניות תאית וארגון. סכמטי של הסטריה וסקולריס (SV) והקשר שלה למבנים בשבלול. ה-SV מורכב משלוש שכבות של תאים והוא אחראי על יצירת EP וריכוז אשלגן גבוה במצע סקאלה המכיל אנדולימפה. הקשר בין תאי השוליים, תאי הביניים ותאי הבסיס מודגם באמצעות ההקרנות הבזולטרליות המתרחבות השוליות לתאי הביניים, שיש להם הקרנות תאיות דו-כיווניות המשתלבות הן עם תאי השוליים והן עם תאי הבסיס. בנוסף לסוגי תאים אלה, סוגי תאים אחרים, כולל תאי ציר (צהוב), תאי אנדותל, פריציטים ומקרופאגים (לא מוצגים) נמצאים ב-SV. בשימוש באישור Korrapati et al.30. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: דיסקציה של שבלול עכבר בוגר ביום 30 שלאחר הלידה או שווה לה (P30+). (A) דגימה במהלך עקירת האוזן הפנימית מהעצם הרקתית שמסביב במהלך שלב 3.2. האוזן הפנימית מסומנת בסגול. (B) דגימה במהלך שלב 4.2 המראה את פני השטח של השבלול ואת הפיגמנט SV שמתחתיו. (C) דגימה במהלך שלב 4.4 המראה עצם שהוסרה מהסיבוב האפי וה-SV החשוף (חץ צהוב). (D) דגימה במהלך שלב 4.5 המראה את השבלול עם יותר עצם שהוסרה מהסיבוב האפי והאמצעי. (E) דגימה במהלך שלב 4.5 המראה את הסרת העצם המכסה את הסיבוב האמצעי, ומראה את ה-SV (חץ צהוב) שמתחתיו. (F) דוגמה לחלקים קטנים יותר של SV (חץ צהוב) והקיר הצידי (חץ כחול) במהלך שלב 4.10. (G) דוגמה של ZsGreen SV פלואורסצנטי בעוד שהקיר הצידי הנותר נשאר כהה. Kcnj10-ZsGreen מתבטא במיוחד בתאי הביניים של SV. (H) דוגמה של חלקים גדולים יותר של SV (חץ צהוב) והקיר הצידי (כחול) המופרדים במהלך שלב 4.12. (I) ה-SV מופרד לחלוטין מהקיר הצידי במהלך שלב 4.12. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: תרשים UMAP של מערכי נתונים sNuc-Seq מ-stria vascularis בוגר שטופל ב-RNAlater. דגימות שנשמרו עם טיפול RNAמאוחר יותר ברקמת SV בוגרת עם בידוד גרעינים לאחר מכן קובצו בשיטת אשכולות מבוססת מודולריות עם אלגוריתם האופטימיזציה של ליידן והודמיינו באופן מופחת ממד על ידי תרשים UMAP דו-ממדי. כל נקודה מייצגת תא בודד, ותאים עם פרופילי שעתוק דומים מקובצים יחד. סוגי תאים צבועים בהתבסס על ביטוי גנים ידועים המבוטאים על ידי סוגי תאי SV בוגרים. הדגימות אוחסנו ב-RNAlater לא יותר מ-6 חודשים. ה-SV מכחמישה עכברי CBA/J P30 שימש ליצירת מערך נתונים זה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4. Stria vascularis הרכבה שלמה מעכבר P30 Kcnj10-ZsGreen. תמונה קונפוקלית של SV הרכבה שלמה מעכבר P30, המדגימה ביטוי ZsGreen בתאי הביניים, GS-IB4 (אדום) תיוג תאי אנדותל, וגרעיני תיוג DAPI (לבן). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
לפני הופעתו של ריצוף תא יחיד, חוקרים רבים השתמשו בניתוח רקמות בתפזורת, אשר איפשר רק לנתח תעתיקים ממוצעים על פני תאים. בפרט, תא בודד ו- sNuc-Seq אפשרו לבודד את התעתיק של תא בודד או גרעין יחיד, בהתאמה32. במקרה זה, ניתן לזהות תעתיקי גרעין יחיד עבור תאים שוליים, בינוניים ובזאליים, כמו גם תאי ציר30. זה מאפשר לחקור הטרוגניות שעתוק בין סוגי תאים SV וניתן להשתמש בו בעתיד כדי לחקור את התרומה של סוגי תאים אלה לתפקוד SV, כולל יצירה ותחזוקה של EP. מערכי נתונים שנוצרו באמצעות sNuc-Seq יכולים להיות מוצגים באופן מופחת ממד כדי להקל על ההבנה של הבדלי שעתוק כוללים ולהשוות אוכלוסיות תאים שונות באמצעות תרשים UMAP איור 4. ישנן דרכים רבות לבצע ניתוח ביואינפורמטי לפרשנות של מערכי נתונים sNuc-Seq. אלה כוללים אך אינם מוגבלים ל: ניתוח ביטוי דיפרנציאלי, הסקה ואשכולות רשת רגולטורית של תא יחיד (SCENIC), מפת חום או בניית חלקת כינור גרינה, וניתוח רגולון18. טכניקות ניתוח חישוביות נוספות לריצוף RNA של תא בודד דומות ל- sNuc-Seq, ונדונות בפירוט רב יותר בסקירות של Hwang et al.32, Shafer33 ו- Chen et al.34.
היישום העיקרי השני של טכניקת דיסקציה זו הוא immunostaining כדי לחקור טוב יותר מבנים נבחרים בתוך SV. אנו יכולים לראות זאת בהגדרה של תושבת SV שלמה שצולמה באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי (איור 3). הגרעינים של כל התאים מוצגים באופן חזותי באמצעות תיוג DAPI. הנימים נראים באמצעות צביעת תאי אנדותל עם GS-IB4 באדום. תאי ביניים, במקרה זה, הונדסו גנטית באמצעות מקדם ספציפי לתאי ביניים כדי לבטא ZsGreen.
המגבלות של sNuc-Seq כוללות: (1) חוסר מידע מרחבי, (2) הטיות נגד אוכלוסיות תאי מערכת החיסון, ו-(3) אי הכללה של RNA ציטופלזמי. טכניקות שעתוק מרחביות יכולות לספק מידע ספציפי יותר על תת-אוכלוסיות תאיות בתוך רקמה35. בהתחשב בהבדלי פרוטוקול בין sNuc-Seq לבין ריצוף RNA של תא יחיד, כגון דיסוציאציה ואחסון של רקמות, פרופיל השעתוק שנוצר על ידי sNuc-Seq עשוי להטות נגד תאי מערכת החיסון תוך שהוא חזק יותר באפיון סוגי תאים מחוברים36. כמו כן, ריצוף RNA חד-תאי כולל RNA ציטופלזמי כגון RNA מיטוכונדריאלי, בעוד sNuc-Seq לא. למרות מקרים אלה של הבדלי שעתוק בין שתי השיטות, הוכח כי, באופן כללי, sNuc-Seq יש פרופיל שעתוק דומה לריצוף RNA חד תאי שלם37, וב- SV בפרט30.
עבור microdissection מוצלח, ישנם מספר שלבים קריטיים להיות מודעים. בצעדים הראשונים, יש לחלץ כראוי את האוזן הפנימית כדי למנוע ריסוק השבלול הבסיסי. תצפית על מיצוי נכון של עצם הרקתית מוצגת באיור 2A. ברגע שהשבלול נחשף כראוי, יש להקפיד לגרד ולשבור בעדינות את עצם השבלול כדי לחשוף את הדופן הצידית הבסיסית ואת SV. לאחר חילוץ מוצלח של הקיר הצידי וה-SV, על המשתמש לנתק בזהירות את ה-SV מהקיר הצידי. יש להפעיל מספיק כוח במישור הנכון כדי לחטט ב-SV מהקיר הרוחבי, תוך הימנעות מנזק ל-SV השברירי. עבור מיקרודיסקציה של SV, זה עשוי להיות מועיל לחשוב על "ניתוח מבנים אחרים הרחק מה-SV", במקום "לנתח את ה-SV מתוך השבלול".
פרוטוקול זה יכול להשתנות עבור גילאים שונים של עכברים ועבור מיני יונקים שונים, כגון חולדות. עבור עכברים צעירים יותר, הרקמות יהיו שונות במרקמן והמבנים יהיו קטנים יותר באופן כללי. עבור מיני יונקים שונים, האנטומיה של השבלול תהיה דומה יחסית, כאשר גודל החיה קובע את רוב ההבדל.
באופן כללי, החסרונות של פרוטוקול זה דומים לטכניקות מיקרודיסקציה שבלולאחרות 38. בידוד ה-SV העדין יכול להיות מאתגר מבחינה טכנית וניתן לשבור אותו לחתיכות קטנות יותר.
טכניקה זו אינה אופטימלית לשמירת האיבר של קורטי להרכבה שלמה מכיוון שהוא ניזוק לעתים קרובות עם פרוטוקול זה. קיימות טכניקות דיסקציה אחרות המכוונות במיוחד לשימור האיבר של קורטי עבור הרכבה שלמה וצביעת חיסון38, אך לאלה יש חסרונות משלהם, בהתחשב בכך ש- sNuc-Seq חייב להיעשות עם דגימות טריות כדי למנוע השפלה של RNA, לא במצב של קיבוע רקמות והסתיידות.
עם הזמן והחזרות, המשתמשים ירגישו יותר בנוח עם פרוטוקול מיקרודיסקציה SV זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך בחלקו על ידי תוכנית המחקר האינטרמורלית של ה-NIH, NIDCD to M.H. (DC000088)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10-µm filter (Polyethylenterephthalat) | PluriSelect | #43-50010-01 | Filter tissue during sNuc-Seq |
| 18 x 18 mm cover glass | Fisher Scientific | 12-541A | Cover slip to mount SV |
| 30-µm filter (Polyethylenterephthalat) | PluriSelect | #43-50030-03 | Filter tissue during sNuc-Seq |
| 75 x 25 mm Superfrost Plus/Colorforst Plus Microslide | Daigger | EF15978Z | Microslide to mount SV on |
| C57BL/6J Mice | The Jackson Laboratory | RRID: IMSR_JAX:000664 | General purpose mouse strain that has pigment more easily seen in the intermediate cells of the SV. |
| Cell Counter | Logos Biosystems | L20001 | Used for cell counting |
| Chalizon curette 5'', size 3 2.5 mm | Biomedical Research Instruments | 15-1020 | Used to transfer SV |
| Chromium Next GEM single Cell 3' GEM Kit v3.1 | Chromium | PN-1000141 | Generates single cell 3' gene expression libraries |
| Clear nail polish | Fisher Scientific | NC1849418 | Used for sealing SV mount |
| Corning Falcon Standard Tissue Culture Dishes, 24 well | Corning | 08-772B | Culture dish used to hold specimen during dissection |
| DAPI | Invitrogen | D1306, RRID: AB_2629482 | Stain used for nucleus labeling |
| Dounce homogenizer | Sigma-Aldrich | D8938 | Used to homogenize tissue for sNuc-seq |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | General forceps for dissection |
| Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | Forceps with fine tip that makes SV manipulation easier |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher | 16000044 | Used for steps of sNuc-Seq |
| Glue stick | Fisher Scientific | NC0691392 | Used for mounting SV |
| GS-IB4 Antibody | Molecular Probes | I21411, RRID: AB-2314662 | Antibody used for capillary labeling |
| KCNJ10-ZsGreen Mice | n/a | n/a | Transgenic mouse that expresses KCNJ10-ZsGreen, partiularly in the intermediate cells of the SV. |
| MgCl2 | ThermoFisher | AM9530G | Used for steps of sNuc-Seq |
| Mounting reagent | ThermoFisher | #S36940 | Mounting reagent for SV |
| Multiwell 24 well plate | Corning | #353047 | Plate used for immunostaining |
| NaCl | ThermoFisher | AAJ216183 | Used for steps of sNuc-Seq |
| Nonidet P40 | Sigma-Aldrich | 9-16-45-9 | Used for steps of sNuc-Seq |
| Nuclease free water | ThermoFisher | 4387936 | Used for steps of sNuc-Seq |
| Orbital shaker | Silent Shake | SYC-2102A | Used for steps of immunostaining |
| PBS | ThermoFisher | J61196.AP | Used for steps of immunostaining and dissection |
| RNA Later | Invitrogen | AM7021 | Used for preservation of SV for sNuc-Seq |
| Scizzors | Fine Science Tools | 14058-09 | Used for splitting mouse skull |
| Tris-HCl | Sigma-Aldrich | 15506017 | Used for steps of sNuc-Seq |
| Trypan blue stain | Gibco | 15250061 | Used for cell counting |
| Tween20 | ThermoFisher | AAJ20605AP | Used for steps of sNuc-Seq |
| Zeiss STEMI SV 11 Apo stereomicroscope | Zeiss | n/a | Microscope used for dissections |
References
- Bosher, S. K., Warren, R. L. Observations on the electrochemistry of the cochlear endolymph of the rat: a quantitative study of its electrical potential and ionic composition as determined by means of flame spectrophotometry. Proceedings of the Royal Society of London. Series B. Biological Sciences. 171 (1023), 227-247 (1968).
- Patuzzi, R. Ion flow in stria vascularis and the production and regulation of cochlear endolymph and the endolymphatic potential. Hearing Research. 277 (1-2), 4-19 (2011).
- Wangemann, P. K+ cycling and the endocochlear potential. Hearing Research. 165 (1-2), 1-9 (2002).
- Adachi, N., et al. The mechanism underlying maintenance of the endocochlear potential by the K+ transport system in fibrocytes of the inner ear. The Journal of Physiology. 591 (18), 4459-4472 (2013).
- Hibino, H., Nin, F., Tsuzuki, C., Kurachi, Y. How is the highly positive endocochlear potential formed? The specific architecture of the stria vascularis and the roles of the ion-transport apparatus. Pflugers Archiv. 459 (4), 521-533 (2010).
- Lang, F., Vallon, V., Knipper, M., Wangemann, P. Functional significance of channels and transporters expressed in the inner ear and kidney. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 293 (4), C1187-C1208 (2007).
- Liu, W., Schrott-Fischer, A., Glueckert, R., Benav, H., Rask-Andersen, H. The human "cochlear battery"-claudin-11 barrier and ion transport proteins in the lateral wall of the cochlea. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 239 (2017).
- Marcus, D. C., Wu, T., Wangemann, P., Kofuji, P. KCNJ10 (Kir4.1) potassium channel knockout abolishes endocochlear potential. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 282 (2), C403-C407 (2002).
- Spicer, S. S., Schulte, B. A. Differentiation of inner ear fibrocytes according to their ion transport related activity. Hearing Research. 56 (1-2), 53-64 (1991).
- Wangemann, P., Liu, J., Marcus, D. C. Ion transport mechanisms responsible for K+ secretion and the transepithelial voltage across marginal cells of stria vascularis in vitro. Hearing Research. 84 (1-2), 19-29 (1995).
- Yoshida, T., et al. The unique ion permeability profile of cochlear fibrocytes and its contribution to establishing their positive resting membrane potential. Pflugers Archiv. 468 (9), 1609-1619 (2016).
- Johns, J. D., Adadey, S. M., Hoa, M. The role of the stria vascularis in neglected otologic disease. Hearing Research. 428, 108682 (2023).
- Kim, J., Ricci, A. J. In vivo real-time imaging reveals megalin as the aminoglycoside gentamicin transporter into cochlea whose inhibition is otoprotective. Proceedings of the National Academy of Sciences. 119 (9), e2117846119 (2022).
- Zdebik, A. A., Wangemann, P., Jentsch, T. J. Potassium ion movement in the inner ear: insights from genetic disease and mouse models. Physiology. 24, 307-316 (2009).
- Chen, J., Zhao, H. B. The role of an inwardly rectifying K+ channel (Kir4.1) in the inner ear and hearing loss. Neuroscience. 265, 137-146 (2014).
- Steel, K. P., Barkway, C. Another role for melanocytes: their importance for normal stria vascularis development in the mammalian inner ear. Development. 107 (3), 453-463 (1989).
- Ito, T., Nishio, A., Wangemann, P., Griffith, A. J. Progressive irreversible hearing loss is caused by stria vascularis degeneration in an Slc26a4-insufficient mouse model of large vestibular aqueduct syndrome. Neuroscience. 310, 188-197 (2015).
- Gu, S., et al. Characterization of rare spindle and root cell transcriptional profiles in the stria vascularis of the adult mouse cochlea. Scientific Reports. 10 (1), 18100 (2020).
- Gow, A., et al. Deafness in claudin 11-null mice reveals the critical contribution of basal cell tight junctions to stria vascularis function. The Journal of Neuroscience. 24 (32), 7051-7062 (2004).
- Chang, Q., et al. Virally mediated Kcnq1 gene replacement therapy in the immature scala media restores hearing in a mouse model of human Jervell and Lange-Nielsen deafness syndrome. EMBO Molecular Medicine. 7 (8), 1077-1086 (2015).
- Faridi, R., et al. Mutational and phenotypic spectra of KCNE1 deficiency in Jervell and Lange-Nielsen Syndrome and Romano-Ward Syndrome. Human Mutation. 40 (2), 162-176 (2019).
- Wangemann, P., et al. Loss of KCNJ10 protein expression abolishes endocochlear potential and causes deafness in Pendred syndrome mouse model. BMC Medicine. 2, 30 (2004).
- Kitajiri, S. -I., et al. Expression patterns of claudins, tight junction adhesion molecules, in the inner ear. Hearing Research. 187 (1-2), 25-34 (2004).
- Jagger, D. J., Nevill, G., Forge, A. The membrane properties of cochlear root cells are consistent with roles in potassium recirculation and spatial buffering. Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 11 (3), 435-448 (2010).
- Ito, T., Kurata, N., Fukunaga, Y.
- Zhang, J., et al. VEGFA165 gene therapy ameliorates blood-labyrinth barrier breakdown and hearing loss. JCI Insight. 6 (8), e143285 (2021).
- Shi, X. Pathophysiology of the cochlear intrastrial fluid-blood barrier (review). Hearing Research. 338, 52-63 (2016).
- Gu, S., et al. Identification of potential Meniere's disease targets in the adult stria vascularis. Frontiers in Neurology. 12, 630561 (2021).
- Fischer, J., Ayers, T. Single nucleus RNA-sequencing: how it's done, applications and limitations. Emerging Topics in Life Sciences. 5 (5), 687-690 (2021).
- Korrapati, S., et al. Single cell and single nucleus RNA-Seq reveal cellular heterogeneity and homeostatic regulatory networks in adult mouse stria vascularis. Frontiers in Molecular Neuroscience. 12, 316 (2019).
- Pyle, M. P., Hoa, M. Applications of single-cell sequencing for the field of otolaryngology: A contemporary review. Laryngoscope Investigative Otolaryngology. 5 (3), 404-431 (2020).
- Hwang, B., Lee, J. H., Bang, D. Single-cell RNA sequencing technologies and bioinformatics pipelines. Experimental & Molecular Medicine. 50 (8), 1-14 (2018).
- Shafer, M. E. R. Cross-species analysis of single-cell transcriptomic data. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 175 (2019).
- Chen, G., Ning, B., Shi, T. Single-cell RNA-Seq technologies and related computational data analysis. Frontiers in Genetics. 10, 317 (2019).
- Longo, S. K., Guo, M. G., Ji, A. L., Khavari, P. A. Integrating single-cell and spatial transcriptomics to elucidate intercellular tissue dynamics. Nature Reviews Genetics. 22 (10), 627-644 (2021).
- Kim, N., Kang, H., Jo, A., Yoo, S. A., Lee, H. O. Perspectives on single-nucleus RNA sequencing in different cell types and tissues. Journal of Pathology and Translational Medicine. 57 (1), 52-59 (2023).
- Grindberg, R. V., et al.
- Montgomery, S. C., Cox, B. C. Whole mount dissection and immunofluorescence of the adult mouse cochlea. Journal of Visuazlied Experiments. (107), e53561 (2016).
