Summary
Den stria vascularis är avgörande för genereringen av endokokleär potential. Här presenterar vi dissektionen av den vuxna musen stria vascularis för sekvensering av en kärna eller immunfärgning.
Abstract
Endokokleär potential, som genereras av stria vascularis, är avgörande för att upprätthålla en miljö som bidrar till lämplig hårcellsmekanotransduktion och slutligen hörsel. Patologier av stria vascularis kan leda till minskad hörsel. Dissektion av den vuxna stria vascularis möjliggör fokuserad enkärnig infångning och efterföljande sekvensering och immunfärgning med en kärna. Dessa tekniker används för att studera stria vascularis patofysiologi på encellsnivå.
Enkärnig sekvensering kan användas vid inställning av transkriptionsanalys av stria vascularis. Samtidigt fortsätter immunfärgning att vara användbar för att identifiera specifika populationer av celler. Båda metoderna kräver korrekt stria vascularis-dissektion som en förutsättning, vilket kan visa sig vara tekniskt utmanande.
Introduction
Cochlean består av tre vätskefyllda kamrar, scala vestibuli, scala media och scala tympani. Scala vestibuli och scala tympani innehåller vardera perilymfa, som har en hög koncentration av natrium (138 mM) och en låg koncentration av kalium (6,8 mM)1. Scalamediet innehåller endolymf, som har en hög koncentration av kalium (154 mM) och en låg koncentration av natrium (0,91 mM)1,2,3. Denna skillnad i jonkoncentration kan kallas endokokleär potential (EP), och genereras främst av rörelsen av kaliumjoner genom olika jonkanaler och gapkorsningar i stria vascularis (SV) längs sidoväggen i cochlea 4,5,6,7,8,9,11 . SV är en heterogen, mycket vaskulär vävnad som leder den mediala aspekten av cochleans sidovägg och innehåller tre huvudcelltyper: marginella, mellanliggande och basala celler12 (figur 1).
Marginalceller är förbundna med täta korsningar för att bilda SV: s mest mediala yta. Det apikala membranet vetter mot endolymfen i scala media och bidrar till kaliumjontransport till endolymfen med hjälp av olika kanaler, inklusive KCNE1 / KCNQ1, SLC12A2 och Na + -K + -ATPas (NKA) 5,10,13,14. Intermediära celler är pigmenterade celler som finns mellan marginal- och basalceller och underlättar kaliumtransport genom SV med användning av KCNJ10 (Kir 4.1)15,16. Basalceller ligger i närheten av cochleans sidovägg och är nära associerade med fibrocyter i spiralligamentet för att främja kaliumåtervinning från perilymph12. Patologi av SV har varit inblandad i många otologiska störningar17,18. Mutationer i gener uttryckta i de viktigaste SV-celltyperna, såsom Kcnq1, Kcne1, Kcnj10 och Cldn11, kan orsaka dövhet och SV-dysfunktion, inklusive förlust av EP 19,20,21,22,23. Förutom de tre huvudcelltyperna finns det andra mindre studerade celltyper i SV, såsom spindelceller 22, rotceller12,24, makrofager 25, pericyter 26 och endotelceller 27, som har ofullständigt definierade roller som involverar jonisk homeostas och generering av EP 28.
I jämförelse med bulk-RNA-sekvensering ger enkärnig RNA-sekvensering (sNuc-Seq) information om cellheterogenitet, snarare än ett genomsnitt av mRNA över en grupp celler29, och kan vara särskilt användbar när man studerar den heterogena SV30. Till exempel har sNuc-Seq producerat transkriptionsanalys som tyder på att det kan finnas en roll för spindel och rotceller i EP-generering, hörselnedsättning och Ménières sjukdom18. Ytterligare transkriptionell karakterisering av de olika SV-celltyperna kan ge oss ovärderlig information om patofysiologin bakom olika mekanismer och subtyper av SV-relaterade hörselfluktuationer och hörselnedsättning. Skörden av dessa känsliga inre öronstrukturer är av största vikt för optimal vävnadsanalys.
I denna studie beskrivs mikrodissektionsmetoden för att komma åt och isolera stria vascularis från den vuxna mussnäckan för sNuc-Seq eller immunfärgning. Dissektion av den vuxna musen SV krävs för att förstå olika SV-celltyper och ytterligare karakterisera deras roll i hörseln.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsök och procedurer utfördes enligt protokoll som godkänts av djurvårds- och användningskommittén vid National Institute of Neurological Diseases and Stroke och National Institute on Deafness and Other Communication Disorders, National Institutes of Health. Alla experimentella protokoll godkändes av djurvårds- och användningskommittén vid National Institute of Neurological Diseases and Stroke och National Institute on Deafness and Other Communication Disorders, National Institutes of Health. Alla metoder utfördes i enlighet med relevanta riktlinjer och föreskrifter från djurvårds- och användningskommittén vid National Institute of Neurological Diseases and Stroke och National Institute on Deafness and Other Communication Disorders, National Institutes of Health.
1. Avlivning av djur
- Använd C57BL / 6J eller Kcnj10-ZsGreen transgena möss, postnatal dag 30+ (P30 +), som väger mellan 15-20 g.
- Avliva en vuxen mus (ålder P30 eller äldre) med ett godkänt protokoll (här CO 2-kvävning). Utför halshuggning som ett sekundärt steg.
OBS: Vid immunfärgning kan vissa antikroppar ha bakgrundssignal på grund av ospecifik bindning till blod i kapillärerna i SV. Hjärtperfusion med fixativ kan lösa detta problem genom att ta bort blod från kapillärerna i SV. De flesta antikroppar kan dock uppnå goda resultat utan denna metod, och det kommer inte att omfattas av detta protokoll.
2. Exponera benig labyrint
- Rengör musen genom att spraya med 70% etanol och torka med en pappershandduk. Var särskilt uppmärksam på huvudregionen för att minska risken för kontaminering. Ta bort huden från skallen genom att dra huden mot näsan.
- Dela skallen längs midsagittalplanet med en vass sax för att separera vänster och höger del.
- Ta bort hjärnan från skallen för att exponera den beniga labyrinten.
3. Extraktion av innerörat
- Identifiera innerörat i tinningbenet (figur 2A) och skrapa bort kranialnerverna med #55 pincett.
OBS: Användaren bör stabilisera provet med sin icke-dominerande hand med hjälp av en andra uppsättning # 55 pincett. Olika delar av provet kan gripas med den stabiliserande pincetten under hela dissektionen om kritiska områden i provet undviks (t.ex. krossa inte cochlean). - Använd # 55 pincett, dissekera bulla och kapsel och lossa dem från omgivande ben. Ta bort eventuell kvarvarande mjukvävnad från innerörats yta.
- Överför provet till en klar vävnadsodlingsskål som innehåller 1x kall PBS (fosfatbuffrad saltlösning), pH 7,4 och placera under ett dissektionsområde (figur 2B).
4. SV-dissektion
OBS: Med övning är det möjligt att dissekera SV som en lång bit som liknar ett band. SV är ömtålig, så om den bryts i bitar kan dessa lagras tillsammans. Alternativt kan dessa förvaras i separat märkta brunnar enligt deras tur (t.ex. basal, mitten, apikal).
- Om dissektionsomfångets ljuskällor kan flyttas, placera ett ljus ovanför skålen och den andra ljuskällan från sidan, parallellt med dissekeringsytan. Detta möjliggör en bättre kontrast av vävnaden under cochleabenet.
- Använd # 55 pincett, håll provet i den vestibulära delen med cochlea uppåt.
- Använd # 55 pincett, genomborra genom cochleabenet vid toppen.
OBS: # 5 pincett är tjockare än # 55 och kan användas för att bryta ben, men ökningen i storlek / styrka offrar pincettens finhet och förmågan att manipulera små vävnader. Överväg att använda pincett gjord med ett material som inox eller dumostar för att undvika skador som kan uppstå på mer känsliga pincett. Undvik att trycka pincetten för djupt under benet för att undvika att skada SV. - Använd # 55 pincett, skrapa längs den apikala svängen (figur 2C) och använd mild kraft för att bryta bort små bitar av det yttre benskiktet. Lyft försiktigt benet och lossa det från sidoväggen.
OBS: Det kan vara till hjälp att tänka på denna dissektion som att "ta bort allt från SV", snarare än att "dissekera SV ur cochlean". - Fortsätt använda #55-pincett för att ta bort cochleabenbitar från apikala och mellersta varv (figur 2D,E). Tryck försiktigt ner sidoväggen, bända och ta bort benväggstycken mot mittsvängen för att exponera sidoväggen i apikala och mellersta varv.
- Fortsätt använda # 55 pincett, tryck försiktigt den apikala sväng sidoväggen åt sidan för att exponera spiralganglion. Lossa sidoväggen av apikala och mellersta varv från spiralganglion längs det yttre hårcellskiktet. Ta bort bitar av spiralganglion från insidan av cochlea.
OBS: # 55 pincett är mindre och ger en fördel vid manipulering av små och känsliga vävnader. Extra försiktighet bör vidtas för att undvika att böja eller skada dem. - För att få bättre tillgång till sidoväggen i basalsvängen, lossa cochlean från den vestibulära delen av det temporala benet med # 55 pincett. Sätt tången #55 i det runda och ovala fönstret och tryck ner mot vestibulen. Cochlea kommer att lossna. Ta bort den vestibulära delen av innerörat.
- Fortsätt använda # 55 pincett, ta nu bort bitar av basalt cochleärt ben, med början från mittsvängområdet. Tryck försiktigt sidoväggskiktet under benet för att lossa det.
- Ta bort den längsta basala delen av sidoväggen genom att nyfikna och försiktigt dra vävnaden. Benet i denna region kan vara för tjockt för att tas bort utan att skada mjukvävnaden nedan.
- Nu, med den basala delen av sidoväggen fristående, separera så mycket av sidoväggen från cochlea som möjligt. Detta kan göras genom att spåra tången # 55 längs sidoväggen. Borsta försiktigt pincetten mellan benet och den återstående sidoväggen. Detta kan göras hela vägen till toppen i ett stycke om användaren är erfaren. Flytta sidoväggen till färsk PBS.
OBS: Även om större bitar av SV kan vara lättare att avbilda, med tanke på vävnadernas känsliga natur, kan mindre bitar tas (figur 2F, G), och beroende på storlek, kan också fungera för avbildning. - Använd # 55 pincett för att lägga sidoväggen platt. SV ska vara synlig som ett mörkare vävnadslager på sidoväggens inre sida.
OBS: Användare kan finna, särskilt närmare den apikala änden, att en del av SV-vävnaden för övrigt lossnar från sidoväggen under hela dissektionen. - Bänd försiktigt SV-lagret för att lossa det från sidoväggen vid dess basala ände (figur 2H). Tryck försiktigt undan den fristående SV och flytta pincetten längre mot sidoväggens apikala ände, lossa SV som ett långt band om möjligt (figur 2I). Pressa inte SV med pincett för att dra den. Om vävnaden är för ömtålig för att gripas, kan den alternativt samlas in med hjälp av en vävnadsskopa, såsom en chalazion curette.
OBS: Flyttning av SV ska alltid göras under ljusmikroskopi för att säkerställa att den inte går förlorad. Var alltid försiktig när du tar tag i pincett på grund av risken för skador. Användare kan upptäcka att användning av chalazion curette minskar risken för skador på SV-vävnad. För sekvensering med en kärna, fortsätt till avsnitt 5. För SV-immunfärgning, fortsätt till avsnitt 7.
5. SV enkärnig suspension
OBS: Detta protokoll är anpassat för SV-vävnad specifikt från en publicerad tillverkares enkärniga suspensionsprotokoll. Plattformar från olika tillverkare kan användas31. Med tanke på plattformsspecifika variationer rekommenderas det att granska det tillverkarspecifika protokollet som medföljer utrustningen. För att uppnå optimala resultat för sNuc-Seq och minimera RNA-nedbrytning, ju snabbare vävnadsdissektion desto bättre (rekommenderas inom 15-20 min från eutanasi). Det kan vara till hjälp att avliva ett djur i taget och endast när det är redo att dissekera. Att ha flera personer samtidigt som man arbetar med dissektionerna kan också eliminera nedbrytningstiden (t.ex. en laboratoriepersonal som arbetar på vänster öra medan en annan arbetar på höger öra).
- Om SV-vävnaden ska användas för sNuc-Seq, placera vävnaden i kyld lysbuffert (10 mM Tris-HCl, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 0,005% nonidet P40 i nukleasfritt vatten).
OBS: Om sekvensering ska göras omedelbart efter dissektion, fortsätt protokollet. Om det är önskvärt att pausa protokollet är SV-bevarande möjligt genom att placera SV i RNAlater. Förvara över natten vid 4 °C, frys sedan blixt i flytande kväve och förvara vid -80 °C tills den ska användas. När du är klar att använda, tina och tvätta två gånger i PBS i 5 minuter vardera, fortsätt sedan med homogenisering (steg 5.2). - Homogenisera vävnaden i en 2 ml dounce homogenisator med 10-20 slag på is.
OBS: Glascylindern kommer manuellt i kontakt med glasrörets botten och fragmenterar SV. SV är känslig, så 20 slag uppnår vanligtvis framgångsrik homogenisering. - Lysera vävnaden på is i 25 min.
OBS: Lystiden varierar beroende på vävnadstyp. En 25 minuters lys i SV-vävnad kan uppnå en låg cellviabilitet (mindre än 4%), men tiden kan anpassas om cellviabiliteten är för hög (steg 5.8). - Filtrera genom ett 30 μm-filter och snurra filtratet vid 500 x g i 5 min vid 4 °C.
- Ta bort supernatanten och suspendera cellpelleten igen i 1 ml nukletvätt- och resuspensionsbuffert (1x PBS, 1% bovint serumalbumin [BSA], 0,2U/μL RNashämmare).
- Filtrera cellerna genom ett 10 μm filter och centrifugera vid 500 x g i 5 min vid 4 °C.
- Ta bort supernatanten och suspendera på nytt i 50 μl nukletvätt- och resuspensionsbuffert.
- Räkna kärnorna med en cellräknare och trypan blå färgning. Späd 5 μL av cellsuspensionen till 50 μL 1x PBS för cellräkning; Lönsamheten bör vara minimal (3% -4%) vid denna tidpunkt. Om viabiliteten visar sig vara högre, anpassa protokollet för steg 5.3 (lys) och standardisera lystiden för att säkerställa adekvat lys av cellerna.
OBS: En hög cellviabilitet i ett enda kärnpreparat innebär att det finns fler intakta celler än önskat, och att ytterligare matsmältning kan krävas. - Fyll provet med önskad kärndensitet på tillverkarens apparat/chip (se tillverkarens handbok). Enkärniga fångster är nu klara.
OBS: Från en vuxen mus SV uppnås vanligtvis 50 μL suspension vid en koncentration av 150 000 kärnor/ml.
6. SV-sekvensering med en kärna
- Skicka proverna till core facility för sekvensering.
OBS: Denna del av protokollet följer de allmänna stegen för (1) generering och streckkodning av gelpärlor (GEM), (2) rengöring efter GEM-RT och cDNA-amplifiering och (3) 3' konstruktion av genuttrycksbibliotek. Resten av sNuc-Seq-protokollet är relativt långt, och det rekommenderas att läsarna använder sitt tillverkarspecifika protokoll. Tillverkarens handbok kommer sannolikt att beskriva steg med specifika detaljer och medföljande bilder. Det kan också finnas instruktionsvideor på tillverkarens webbplats. Dataset som genereras kan representeras på ett dimensionellt reducerat sätt, såsom en enhetlig mångfaldig approximation och projektion (UMAP; Figur 3). Många labb använder en sekvenseringskärna som kan utföra detta protokoll för användare.
7. SV immunfärgning och vävnadsmontering
- Om vävnaden kommer att användas för immunfärgning, överför den till en 24-brunnsplatta, nedsänkt i 200 μL 4% paraformaldehyd (PFA) i 1x PBS och inkubera i 20 minuter vid rumstemperatur.
OBS: Det är bra att utföra all vätskeavlägsnande, tvättning och immunfärgning under ett mikroskop. Visualisering under pipettering av vävnaden säkerställer att den inte går förlorad av misstag under vätskeavlägsnande. Volymerna av antikroppar och tvättar kan justeras så länge volymen är tillräckligt stor för att sänka ner SV-vävnaden i lösningen. - Efter fixeringssteget, avlägsna PFA genom att utföra två korta tvättar i 1x PBS (cirka 500 μL) vid 4 °C i 5 minuter vardera på en orbitalskakapparat vid låga (30-50) varv / min. Vid förvaring kan vävnaden förvaras i 1x PBS vid 4 °C.
- Ta bort PBS och permeabilisera och blockera i minst 1 h vid rumstemperatur i cirka 300 μL PBS-T-lösning (0,05 Tween20 i 1x PBS med 10% fetalt bovint serum).
OBS: Primära och sekundära antikroppar ska spädas i denna blockerande lösning. - Färga vävnaden med primär antikropp enligt specifikationerna för den specifika antikropp som används, vanligtvis över natten vid 4 °C. Ta bort återstående PBS och tillsätt den utspädda primära antikroppen.
OBS: Utspädningen bör väljas baserat på tillverkarens förslag, publicerade data, tidigare erfarenheter etc. Vanligtvis är den första koncentrationen som testas en utspädning på 1: 100-200. För exemplet som presenteras i detta dokument späddes GS-IB4- och DAPI-antikropparna vardera vid 1:200. Vid färgning av mer än ett protein kan flera primära antikroppar kombineras till samma lösning, så länge varje primär antikropp har en annan värd för att undvika korsreaktivitet av sekundära antikroppar. - Tvätta bort den primära antikroppen från vävnaden med cirka 500 μl 1x PBS två gånger i 10 minuter vardera på en orbitalskakapparat vid lågt varvtal.
OBS: Fortsätt att se till att SV-vävnaden är nedsänkt i lösningen och inte fastnar på sidan av brunnen. - Färga med en sekundär antikropp enligt specifikationerna för den specifika antikropp som används, vanligtvis i 2 timmar vid rumstemperatur på en orbitalskakare vid lågt varvtal. Täck över plattan med 24 brunnar så att den fluorescerande märkta sekundära antikroppen skyddas från ljus.
OBS: Om mer än en sekundär antikropp behövs, kombinera de sekundära antikropparna i samma lösning. Se till att undvika korsmärkning. - Tvätta bort den sekundära antikroppen från vävnaden med cirka 500 μl 1x PBS fyra gånger i 5 minuter vardera på en orbitalskakapparat vid lågt varvtal. Håll plattan med 24 brunnar täckt för att skydda den mot ljus.
- Förbered den större mikrosliden (75 mm x 25 mm) genom att placera två små limstrimmor längs 25 mm-axeln, bara mindre än 18 mm x 18 mm mindre glastäckglas. Placera en droppe monteringsreagens (ca 50 μl) mellan limstrimmorna.
OBS: Limmet skapar en liten mängd vertikalt utrymme så att när det andra täckglaset placeras ovanpå kan SV-vävnadsprovet säkert existera, men fortsätta att förbli på plats. Medan striatjockleken är 30-40 mikron, bör man undvika att klämma vävnaden mellan glasytorna för att bevara morfologin. Alternativt kan klar tejp också användas. - Använd #55 pincett, ta tag i så lite vävnad som möjligt i ena änden av SV och överför från PBS till droppen av monteringsreagens på den större mikrosliden (75 mm x 25 mm). Placera ena änden av ett mindre glastäckglas (18 mm x 18 mm) på glaset där en limstrimma placerades och släpp försiktigt för att undvika att skapa luftbubblor. Täckglaset kommer att falla till den andra limstrimman och kommer att täcka SV-vävnaden.
- Försegla fästet genom att badda en droppe transparent nagellack i varje hörn av fästet. Märk provet i enlighet med detta på glastäcket bort från visualiseringsfältet. Den är nu klar för konfokalmikroskopi (figur 4).
- Visualisera SV-vävnaden med hjälp av ett dissektionsmikroskop för att säkerställa att den ligger platt och inte nära några luftbubblor. Om SV-vävnaden inte är korrekt orienterad kan användaren försöka trycka ut luftbubblor eller försiktigt ta bort det mindre glastäcket och flytta SV. Detta måste göras försiktigt för att undvika att glastäcket bryts.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi presenterar en metod för att isolera SV som ska användas för antingen sNuc-Seq eller immunfärgning. Den relevanta anatomin (figur 1) för cochlean i förhållande till SV kan hjälpa användare att bättre förstå organisationen av SV och stegen i dissektionsprotokollet.
Varje steg i denna mikrodissektion av SV från en P30-mus beskrivs i den tillhörande videon, och ögonblicksbilder av de viktigaste stegen i denna dissektion och isolering av SV presenteras i figur 2.
sNuc-Seq är användbart för att undersöka transkriptionsprofilen för de olika cellerna i heterogen SV. Ett sätt att visualisera detta är genom klustring på en 2D UMAP (figur 3). Datamängden som genereras från sNuc-Seq kan utvärderas med hjälp av olika dataanalystekniker, som beskrivs närmare i diskussionen.
SV helmontering med GS-IB4 och DAPI immunomärkning, tillsammans med Kcnj10-ZsGreen fluorescens, presenteras i figur 4. Med hjälp av florescens kan SV visualiseras efter avlägsnande av omgivande vävnader och montering. Hos dessa möss uttrycks ZsGreen särskilt i SV-intermediära celler. Vaskulaturen hos SV kan visualiseras i rött (endotelceller, GS-IB4).
Figur 1: Schematisk bild av stria vascularis cellulär heterogenitet och organisation. Stria vascularis cellulär heterogenitet och organisation. Schematisk bild av stria vascularis (SV) och dess förhållande till strukturer i cochlean. SV består av tre lager av celler och ansvarar för att generera EP och hög kaliumkoncentration i endolymfinnehållande scala media. Förhållandet mellan de marginella, mellanliggande och basala cellerna demonstreras med de marginella utsträckta basolaterala projektionerna för att interdigitera med de mellanliggande cellerna, som har dubbelriktade cellulära projektioner som interdigiterar med både marginal- och basalcellerna. Förutom dessa celltyper finns andra celltyper, inklusive spindelceller (gul), endotelceller, pericyter och makrofager (visas inte) i SV. Används med tillstånd från Korrapati et al.30. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Dissektion av en vuxen mussnäcka större än eller lika med postnatal dag 30 (P30+). (A) Prov vid extraktion från innerörat från omgivande tinningben under steg 3.2. Innerörat är skisserat i lila. b) Prov under steg 4.2 som visar cochleans yta och underliggande pigmenterade SV. (C) Prov under steg 4.4 som visar ben avlägsnat från den apikala svängen och den exponerade SV (gul pil). d) Prov under steg 4.5 som visar cochlean med mer ben avlägsnat från apikala och mellersta varv. E) Prov under steg 4.5 som visar avlägsnandet av ben som täcker mittvarvet, som visar underliggande SV (gul pil). (F) Exempel på mindre bitar av SV (gul pil) och sidoväggen (blå pil) under steg 4.10. (G) Exempel på fluorescerande ZsGreen SV medan den återstående sidoväggen förblir mörk. Kcnj10-ZsGreen uttrycks särskilt i de mellanliggande cellerna i SV. (H) Exempel på större delar av SV (gul pil) och sidoväggen (blå) separeras under steg 4.12. (I) SV helt separerad från sidoväggen under steg 4.12. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: UMAP-diagram över sNuc-Seq-dataset från en RNAlater-behandlad vuxen stria vascularis. Prover bevarade med RNAsenare behandling av vuxen SV-vävnad med efterföljande kärnisolering klustrades med en modularitetsbaserad klustringsmetod med Leiden-optimeringsalgoritmen och visualiserades på ett dimensionellt reducerat sätt av ett 2D UMAP-diagram. Varje punkt representerar en enda cell och celler med liknande transkriptionsprofiler är grupperade tillsammans. Celltyper färgas baserat på deras uttryck av kända gener uttryckta av vuxna SV-celltyper. Proverna lagrades i RNAsenare i högst 6 månader. SV från cirka fem CBA/J P30-möss användes för att generera denna datauppsättning. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4. Stria vascularis hela montering från en P30 Kcnj10-ZsGreen mus. Konfokal bild av SV hel montering från en P30-mus, som visar ZsGreen-uttryck i mellancellerna, GS-IB4 (röd) märkning endotelceller och DAPI (vit) märkning kärnor. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Före tillkomsten av encellssekvensering använde många forskare bulkvävnadsanalys, vilket bara gjorde det möjligt att analysera transkriptom i genomsnitt över celler. I synnerhet gjorde encell och sNuc-Seq det möjligt att isolera transkriptomet av en enda cell respektive enstaka kärna32. I detta fall kan transkriptom med en kärna identifieras för marginal-, mellan- och basalceller samt spindelceller30. Detta möjliggör undersökning av transkriptionell heterogenitet bland SV-celltyper och kan användas i framtiden för att undersöka dessa celltypers bidrag till SV-funktionen, inklusive generering och underhåll av EP. Dataset som genereras med sNuc-Seq kan visas på ett dimensionellt reducerat sätt för att underlätta förståelsen av övergripande transkriptionsskillnader och jämföra olika cellpopulationer med hjälp av ett UMAP-diagram Figur 4. Det finns många sätt att genomföra bioinformatisk analys för tolkning av sNuc-Seq-dataset. Dessa inkluderar men är inte begränsade till: differentiell expressionsanalys, encellsregulatorisk nätverksinferens och klustring (SCENIC), värmekarta eller grinfiolplotkonstruktion och regulonanalys18. Ytterligare beräkningsanalystekniker för encells RNA-sekvensering liknar sNuc-Seq och diskuteras mer detaljerat i recensioner av Hwang et al.32, Shafer33 och Chen et al.34.
Den andra stora tillämpningen av denna dissektionsteknik är immunfärgning för att bättre studera utvalda strukturer inom SV. Vi kan observera detta i inställningen av ett SV-helt fäste som avbildades med konfokalmikroskopi (figur 3). Kärnorna i alla celler visualiseras med DAPI-märkning. Kapillärerna ses via endotelcellsfärgning med GS-IB4 i rött. Intermediära celler, i detta fall, har genetiskt modifierats med hjälp av en intermediär cellspecifik promotor för att uttrycka ZsGreen.
Begränsningar av sNuc-Seq inkluderar: (1) brist på rumslig information, (2) fördomar mot immuncellpopulationer och (3) uteslutning av cytoplasmatiskt RNA. Rumsliga transkriptomiska tekniker kan ge mer specifik information om cellulära subpopulationer inom vävnad35. Med tanke på protokollskillnader mellan sNuc-Seq och encells-RNA-sekvensering, såsom vävnadsdissociation och lagring, kan den sNuc-Seq-genererade transkriptionsprofilen förspänning mot immunceller samtidigt som den är kraftfullare vid karaktärisering av bifogade celltyper36. Encells-RNA-sekvensering inkluderar också cytoplasmatiskt RNA såsom mitokondriellt RNA, medan sNuc-Seq inte gör det. Trots dessa fall av transkriptionsskillnader mellan de två metoderna har det visats att sNuc-Seq i stort sett har en liknande transkriptionsprofil som helcells-RNA-sekvensering37, och i SV i synnerhet30.
För framgångsrik mikrodissektion finns det flera kritiska steg att vara medveten om. I de första stegen måste man ordentligt extrahera innerörat för att undvika att krossa den underliggande cochlean. Observation av korrekt temporal benextraktion visas i figur 2A. När cochlean är ordentligt exponerad måste försiktighet iakttas för att försiktigt skrapa och bryta cochleabenet för att exponera den underliggande sidoväggen och SV. När sidoväggen och SV har extraherats framgångsrikt måste användaren försiktigt lossa SV från sidoväggen. Tillräcklig kraft i rätt plan bör appliceras för att bända SV från sidoväggen, samtidigt som skador på den ömtåliga SV undviks. För SV-mikrodissektion kan det vara till hjälp att tänka på att "dissekera andra strukturer bort från SV", snarare än att "dissekera SV ur cochlean".
Detta protokoll kan modifieras för olika åldrar av möss och för olika däggdjursarter, såsom råttor. För yngre möss kommer vävnaderna att skilja sig åt i textur och strukturerna blir mindre i allmänhet. För olika däggdjursarter kommer cochleaanatomin att vara relativt lika, där djurets storlek bestämmer majoriteten av skillnaden.
I allmänhet liknar nackdelarna med detta protokoll andra cochleära mikrodissektionstekniker38. Att isolera den känsliga SV kan vara tekniskt utmanande och den kan brytas i mindre bitar.
Denna teknik är inte optimal för att spara Corti-organet för hela monteringen eftersom det ofta skadas med detta protokoll. Det finns andra dissektionstekniker som specifikt syftar till att bevara Corti-organet för hel montering och immunfärgning38, men dessa har sina egna nackdelar, med tanke på att sNuc-Seq måste göras med färska prover för att undvika RNA-nedbrytning, inte vid inställning av vävnadsfixering och avkalkning.
Med tiden och upprepningen kommer användarna att bli mer bekväma med detta SV-mikrodissektionsprotokoll.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Denna forskning stöddes delvis av NIH: s intramurala forskningsprogram, NIDCD till MH (DC000088)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10-µm filter (Polyethylenterephthalat) | PluriSelect | #43-50010-01 | Filter tissue during sNuc-Seq |
| 18 x 18 mm cover glass | Fisher Scientific | 12-541A | Cover slip to mount SV |
| 30-µm filter (Polyethylenterephthalat) | PluriSelect | #43-50030-03 | Filter tissue during sNuc-Seq |
| 75 x 25 mm Superfrost Plus/Colorforst Plus Microslide | Daigger | EF15978Z | Microslide to mount SV on |
| C57BL/6J Mice | The Jackson Laboratory | RRID: IMSR_JAX:000664 | General purpose mouse strain that has pigment more easily seen in the intermediate cells of the SV. |
| Cell Counter | Logos Biosystems | L20001 | Used for cell counting |
| Chalizon curette 5'', size 3 2.5 mm | Biomedical Research Instruments | 15-1020 | Used to transfer SV |
| Chromium Next GEM single Cell 3' GEM Kit v3.1 | Chromium | PN-1000141 | Generates single cell 3' gene expression libraries |
| Clear nail polish | Fisher Scientific | NC1849418 | Used for sealing SV mount |
| Corning Falcon Standard Tissue Culture Dishes, 24 well | Corning | 08-772B | Culture dish used to hold specimen during dissection |
| DAPI | Invitrogen | D1306, RRID: AB_2629482 | Stain used for nucleus labeling |
| Dounce homogenizer | Sigma-Aldrich | D8938 | Used to homogenize tissue for sNuc-seq |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | General forceps for dissection |
| Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | Forceps with fine tip that makes SV manipulation easier |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher | 16000044 | Used for steps of sNuc-Seq |
| Glue stick | Fisher Scientific | NC0691392 | Used for mounting SV |
| GS-IB4 Antibody | Molecular Probes | I21411, RRID: AB-2314662 | Antibody used for capillary labeling |
| KCNJ10-ZsGreen Mice | n/a | n/a | Transgenic mouse that expresses KCNJ10-ZsGreen, partiularly in the intermediate cells of the SV. |
| MgCl2 | ThermoFisher | AM9530G | Used for steps of sNuc-Seq |
| Mounting reagent | ThermoFisher | #S36940 | Mounting reagent for SV |
| Multiwell 24 well plate | Corning | #353047 | Plate used for immunostaining |
| NaCl | ThermoFisher | AAJ216183 | Used for steps of sNuc-Seq |
| Nonidet P40 | Sigma-Aldrich | 9-16-45-9 | Used for steps of sNuc-Seq |
| Nuclease free water | ThermoFisher | 4387936 | Used for steps of sNuc-Seq |
| Orbital shaker | Silent Shake | SYC-2102A | Used for steps of immunostaining |
| PBS | ThermoFisher | J61196.AP | Used for steps of immunostaining and dissection |
| RNA Later | Invitrogen | AM7021 | Used for preservation of SV for sNuc-Seq |
| Scizzors | Fine Science Tools | 14058-09 | Used for splitting mouse skull |
| Tris-HCl | Sigma-Aldrich | 15506017 | Used for steps of sNuc-Seq |
| Trypan blue stain | Gibco | 15250061 | Used for cell counting |
| Tween20 | ThermoFisher | AAJ20605AP | Used for steps of sNuc-Seq |
| Zeiss STEMI SV 11 Apo stereomicroscope | Zeiss | n/a | Microscope used for dissections |
References
- Bosher, S. K., Warren, R. L. Observations on the electrochemistry of the cochlear endolymph of the rat: a quantitative study of its electrical potential and ionic composition as determined by means of flame spectrophotometry. Proceedings of the Royal Society of London. Series B. Biological Sciences. 171 (1023), 227-247 (1968).
- Patuzzi, R. Ion flow in stria vascularis and the production and regulation of cochlear endolymph and the endolymphatic potential. Hearing Research. 277 (1-2), 4-19 (2011).
- Wangemann, P. K+ cycling and the endocochlear potential. Hearing Research. 165 (1-2), 1-9 (2002).
- Adachi, N., et al. The mechanism underlying maintenance of the endocochlear potential by the K+ transport system in fibrocytes of the inner ear. The Journal of Physiology. 591 (18), 4459-4472 (2013).
- Hibino, H., Nin, F., Tsuzuki, C., Kurachi, Y. How is the highly positive endocochlear potential formed? The specific architecture of the stria vascularis and the roles of the ion-transport apparatus. Pflugers Archiv. 459 (4), 521-533 (2010).
- Lang, F., Vallon, V., Knipper, M., Wangemann, P. Functional significance of channels and transporters expressed in the inner ear and kidney. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 293 (4), C1187-C1208 (2007).
- Liu, W., Schrott-Fischer, A., Glueckert, R., Benav, H., Rask-Andersen, H. The human "cochlear battery"-claudin-11 barrier and ion transport proteins in the lateral wall of the cochlea. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 239 (2017).
- Marcus, D. C., Wu, T., Wangemann, P., Kofuji, P. KCNJ10 (Kir4.1) potassium channel knockout abolishes endocochlear potential. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 282 (2), C403-C407 (2002).
- Spicer, S. S., Schulte, B. A. Differentiation of inner ear fibrocytes according to their ion transport related activity. Hearing Research. 56 (1-2), 53-64 (1991).
- Wangemann, P., Liu, J., Marcus, D. C. Ion transport mechanisms responsible for K+ secretion and the transepithelial voltage across marginal cells of stria vascularis in vitro. Hearing Research. 84 (1-2), 19-29 (1995).
- Yoshida, T., et al. The unique ion permeability profile of cochlear fibrocytes and its contribution to establishing their positive resting membrane potential. Pflugers Archiv. 468 (9), 1609-1619 (2016).
- Johns, J. D., Adadey, S. M., Hoa, M. The role of the stria vascularis in neglected otologic disease. Hearing Research. 428, 108682 (2023).
- Kim, J., Ricci, A. J. In vivo real-time imaging reveals megalin as the aminoglycoside gentamicin transporter into cochlea whose inhibition is otoprotective. Proceedings of the National Academy of Sciences. 119 (9), e2117846119 (2022).
- Zdebik, A. A., Wangemann, P., Jentsch, T. J. Potassium ion movement in the inner ear: insights from genetic disease and mouse models. Physiology. 24, 307-316 (2009).
- Chen, J., Zhao, H. B. The role of an inwardly rectifying K+ channel (Kir4.1) in the inner ear and hearing loss. Neuroscience. 265, 137-146 (2014).
- Steel, K. P., Barkway, C. Another role for melanocytes: their importance for normal stria vascularis development in the mammalian inner ear. Development. 107 (3), 453-463 (1989).
- Ito, T., Nishio, A., Wangemann, P., Griffith, A. J. Progressive irreversible hearing loss is caused by stria vascularis degeneration in an Slc26a4-insufficient mouse model of large vestibular aqueduct syndrome. Neuroscience. 310, 188-197 (2015).
- Gu, S., et al. Characterization of rare spindle and root cell transcriptional profiles in the stria vascularis of the adult mouse cochlea. Scientific Reports. 10 (1), 18100 (2020).
- Gow, A., et al. Deafness in claudin 11-null mice reveals the critical contribution of basal cell tight junctions to stria vascularis function. The Journal of Neuroscience. 24 (32), 7051-7062 (2004).
- Chang, Q., et al. Virally mediated Kcnq1 gene replacement therapy in the immature scala media restores hearing in a mouse model of human Jervell and Lange-Nielsen deafness syndrome. EMBO Molecular Medicine. 7 (8), 1077-1086 (2015).
- Faridi, R., et al. Mutational and phenotypic spectra of KCNE1 deficiency in Jervell and Lange-Nielsen Syndrome and Romano-Ward Syndrome. Human Mutation. 40 (2), 162-176 (2019).
- Wangemann, P., et al. Loss of KCNJ10 protein expression abolishes endocochlear potential and causes deafness in Pendred syndrome mouse model. BMC Medicine. 2, 30 (2004).
- Kitajiri, S. -I., et al. Expression patterns of claudins, tight junction adhesion molecules, in the inner ear. Hearing Research. 187 (1-2), 25-34 (2004).
- Jagger, D. J., Nevill, G., Forge, A. The membrane properties of cochlear root cells are consistent with roles in potassium recirculation and spatial buffering. Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 11 (3), 435-448 (2010).
- Ito, T., Kurata, N., Fukunaga, Y.
- Zhang, J., et al. VEGFA165 gene therapy ameliorates blood-labyrinth barrier breakdown and hearing loss. JCI Insight. 6 (8), e143285 (2021).
- Shi, X. Pathophysiology of the cochlear intrastrial fluid-blood barrier (review). Hearing Research. 338, 52-63 (2016).
- Gu, S., et al. Identification of potential Meniere's disease targets in the adult stria vascularis. Frontiers in Neurology. 12, 630561 (2021).
- Fischer, J., Ayers, T. Single nucleus RNA-sequencing: how it's done, applications and limitations. Emerging Topics in Life Sciences. 5 (5), 687-690 (2021).
- Korrapati, S., et al. Single cell and single nucleus RNA-Seq reveal cellular heterogeneity and homeostatic regulatory networks in adult mouse stria vascularis. Frontiers in Molecular Neuroscience. 12, 316 (2019).
- Pyle, M. P., Hoa, M. Applications of single-cell sequencing for the field of otolaryngology: A contemporary review. Laryngoscope Investigative Otolaryngology. 5 (3), 404-431 (2020).
- Hwang, B., Lee, J. H., Bang, D. Single-cell RNA sequencing technologies and bioinformatics pipelines. Experimental & Molecular Medicine. 50 (8), 1-14 (2018).
- Shafer, M. E. R. Cross-species analysis of single-cell transcriptomic data. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 175 (2019).
- Chen, G., Ning, B., Shi, T. Single-cell RNA-Seq technologies and related computational data analysis. Frontiers in Genetics. 10, 317 (2019).
- Longo, S. K., Guo, M. G., Ji, A. L., Khavari, P. A. Integrating single-cell and spatial transcriptomics to elucidate intercellular tissue dynamics. Nature Reviews Genetics. 22 (10), 627-644 (2021).
- Kim, N., Kang, H., Jo, A., Yoo, S. A., Lee, H. O. Perspectives on single-nucleus RNA sequencing in different cell types and tissues. Journal of Pathology and Translational Medicine. 57 (1), 52-59 (2023).
- Grindberg, R. V., et al.
- Montgomery, S. C., Cox, B. C. Whole mount dissection and immunofluorescence of the adult mouse cochlea. Journal of Visuazlied Experiments. (107), e53561 (2016).
