Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

تثبيط البصريات الوراثية لانقباض أكتوميوسين بوساطة Rho1 إلى جانب قياس التوتر الظهاري في أجنة ذبابة الفاكهة

Published: April 14, 2023 doi: 10.3791/65314
Automatic Translation
1,2, 3, 1
1Department of Biological Sciences, Dartmouth College, 2School of Life Sciences, Westlake University, 3Department of Molecular Biology, Princeton University

Summary

يلعب انقباض Actomyosin دورا مهما في تكوين الخلايا والأنسجة. ومع ذلك ، من الصعب التلاعب بانقباض الأكتوميوسين في الجسم الحي بشكل حاد. يصف هذا البروتوكول نظاما بصريا وراثيا يثبط بسرعة انقباض الأكتوميوسين بوساطة Rho1 في أجنة ذبابة الفاكهة ، مما يكشف عن الفقدان الفوري للتوتر الظهاري بعد تعطيل الأكتوميوسين في الجسم الحي.

Abstract

تعتبر القوى المقلصة الناتجة عن الأكتين والميوسين الثاني غير العضلي ("انقباض الأكتوميوسين") ضرورية للتغيرات المورفولوجية للخلايا والأنسجة على مقاييس طول متعددة ، مثل انقسام الخلايا ، وهجرة الخلايا ، والطي الظهاري ، والتشكل المتفرع. يتطلب الفهم المتعمق لدور انقباض الأكتوميوسين في التشكل مناهج تسمح بالتعطيل السريع للأكتوميوسين ، وهو أمر يصعب تحقيقه باستخدام الأساليب الجينية أو الدوائية التقليدية. يوضح البروتوكول المقدم استخدام نظام dimerization البصري الوراثي القائم على CRY2-CIBN ، Opto-Rho1DN ، لمنع انقباض الأكتوميوسين في أجنة ذبابة الفاكهة مع ضوابط زمنية ومكانية دقيقة. في هذا النظام ، يتم دمج CRY2 في الشكل السلبي السائد ل Rho1 (Rho1DN) ، بينما يتم تثبيت CIBN على غشاء البلازما. يؤدي التثبيط بوساطة الضوء الأزرق ل CRY2 و CIBN إلى الانتقال السريع ل Rho1DN من السيتوبلازم إلى غشاء البلازما ، حيث يثبط نشاط الأكتوميوسين عن طريق تثبيط Rho1 الداخلي. بالإضافة إلى ذلك ، تقدم هذه المقالة بروتوكولا مفصلا لاقتران تعطيل الأكتوميوسين بوساطة Opto-Rho1DN مع الاستئصال بالليزر للتحقيق في دور الأكتوميوسين في توليد التوتر الظهاري أثناء تكوين ثلم ذبابة الفاكهة البطني. يمكن تطبيق هذا البروتوكول على العديد من العمليات المورفولوجية الأخرى التي تنطوي على انقباض الأكتوميوسين في أجنة ذبابة الفاكهة مع الحد الأدنى من التعديلات. بشكل عام ، تعد هذه الأداة البصرية الجينية نهجا قويا لتشريح وظيفة انقباض الأكتوميوسين في التحكم في ميكانيكا الأنسجة أثناء إعادة تشكيل الأنسجة الديناميكية.

Introduction

انقباض Actomyosin ، قوة الانقباض التي يمارسها الميوسين II غير العضلي (المشار إليه فيما يلي باسم "الميوسين") على شبكة F-actin ، هي واحدة من أهم القوى في تغيير شكل الخلية ودفع التشكل على مستوى الأنسجة 1,2. على سبيل المثال ، يؤدي تنشيط انقباض الأكتوميوسين في المجال القمي للخلايا الظهارية إلى انقباض قمي ، مما يسهل مجموعة متنوعة من العمليات المورفولوجية ، بما في ذلك الطي الظهاري ، وقذف الخلايا ، والتفريغ ، والتئام الجروح3،4،5،6،7. يتطلب تنشيط الميوسين فسفرة سلسلة الضوء التنظيمية. يخفف هذا التعديل من التشكل المثبط لجزيئات الميوسين ، مما يسمح لها بتكوين حزم خيوط الميوسين ثنائية القطب مع مجالات رأس متعددة على كلا الطرفين. تدفع خيوط الميوسين ثنائية القطب الحركة المضادة للتوازي لخيوط الأكتين وتؤدي إلى توليد قوة انقباضية1،8،9.

تلعب عائلة Rho الصغيرة GTPase RhoA المحفوظة تطوريا (Rho1 في ذبابة الفاكهة) دورا مركزيا في تنشيط انقباض الأكتوميوسين في سياقات خلوية مختلفة10,11. يعمل Rho1 كمفتاح ثنائي الجزيئات عن طريق ربط إما GTP (الشكل النشط) أو الناتج المحلي الإجمالي (الشكل غير النشط)12. يتم تنظيم الدورة بين Rho1 المرتبط ب GTP أو الناتج المحلي الإجمالي من خلال البروتينات المنشطة ل GTPase (GAPs) وعوامل تبادل نيوكليوتيدات الجوانين (GEFs) 13. تعمل GEFs على تسهيل تبادل الناتج المحلي الإجمالي ل GTP وبالتالي تنشيط نشاط Rho1. من ناحية أخرى ، تعمل GAPs على تعزيز نشاط GTPase ل Rho1 وبالتالي إلغاء تنشيط Rho1. يعزز Rho1 المنشط انقباض الأكتوميوسين من خلال التفاعل مع المستجيبات النهائية وتنشيطها ، الكيناز المرتبط ب Rho (Rok) و Diaphanous14. يحث Rok على تنشيط الميوسين وانقباض الأكتوميوسين عن طريق فسفرة سلسلة الضوء التنظيمية للميوسين15. بالإضافة إلى ذلك ، يمنع Rok أيضا الفوسفاتيز المنظم لسلسلة الميوسين الخفيفة ، وبالتالي يعزز تجميع خيوط الميوسين16. يمكن ل Rok أيضا فسفرة كينازات LIM ، والتي ، عند تنشيطها ، تمنع تفكيك الأكتين عن طريق فسفرة وتثبيط عامل إزالة بلمرة الأكتين cofilin17,18. Diaphanous هو نواة الأكتين من عائلة الفورمين التي تعزز بلمرة الأكتين ، مما يوفر قاعدة للميوسين للتفاعل مع19،20،21.

في حين أن الآليات الخلوية التي تنشط انقباض الأكتوميوسين قد تم توضيحها جيدا ، إلا أن فهمنا لوظيفتها في تنظيم إعادة تشكيل الأنسجة الديناميكية لا يزال غير مكتمل. يتطلب سد هذه الفجوة المعرفية مناهج يمكنها تعطيل الأكتوميوسين بسرعة في مناطق أنسجة معينة في الجسم الحي وتسجيل التأثير الفوري على سلوك الأنسجة وخصائصها. يصف هذا البروتوكول استخدام نهج البصريات الوراثي لتثبيط انقباض الأكتوميوسين بشكل حاد أثناء غزو ذبابة الفاكهة الأديم المتوسط ، يليه قياس التوتر الظهاري باستخدام الاستئصال بالليزر. أثناء ذبابة الفاكهة ، تخضع خلايا سلائف الأديم المتوسط الموضعية بطنيا لانقباض قمي وتتسرب من سطح الجنين عن طريق تشكيل ثلم أمامي خلفي22,23. منذ فترة طويلة يستخدم تشكيل الأخاديد البطنية كنموذج لدراسة آلية الطي الظهاري. يتم إعطاء تشكيل الأخدود البطني بواسطة نظام الزخرفة الظهرية البطنية في ذبابة الفاكهة24،25،26،27. يتحكم التعبير عن عاملين للنسخ ، Twist و Snail ، الواقعان في الجانب البطني من الجنين ، في تكوين الأخدود البطني ويحدد مصير خلايا الأديم المتوسط28. يعمل Twist and Snail على تنشيط تجنيد Rho1 GEF RhoGEF2 إلى قمة خلايا سلائف الأديم المتوسط عبر مسار مستقبلات مقترن بالبروتين G وبروتين محول RhoGEF2 ، T4829،30،31،32،33. بعد ذلك ، ينشط RhoGEF2 الميوسين في جميع أنحاء السطح القمي للأديم المتوسط المحتمل من خلال مسار كيناز Rho-Rho34،35،36،37،38،39. يشكل الميوسين المنشط شبكة أكتوميوسين فوق الخلية في جميع أنحاء السطح القمي للأديم المتوسط البدائي ، حيث تؤدي تقلصاتها إلى انقباض قمي وتؤدي إلى زيادة سريعة في توتر الأنسجة القمية14،37،40.

تمنع الأداة البصرية الجينية الموصوفة في هذا البروتوكول ، Opto-Rho1DN ، انقباض الأكتوميوسين من خلال تجنيد غشاء البلازما المعتمد على الضوء الأزرق لشكل سلبي سائد من Rho1 (Rho1DN) 41. تلغي طفرة T19N في Rho1DN قدرة البروتين الطافر على استبدال الناتج المحلي الإجمالي ب GTP وبالتالي تجعل البروتين غير نشط على الدوام34. طفرة لاحقة في Rho1DN ، C189Y ، تقضي على إشارة استهداف الغشاء الساذج42,43. عندما يتم غرس Rho1DN في غشاء البلازما ، فإنه يرتبط ب Rho1 GEFs ويحجزه ، وبالتالي يمنع تنشيط Rho1 وكذلك التنشيط بوساطة Rho1 للميوسين والأكتين34,44. يتم تحقيق توظيف غشاء البلازما ل Rho1DN من خلال وحدة dimerization تعتمد على الضوء مشتقة من Cryptochrome 2 وشريكها الملزم CIB1. Cryptochrome 2 هو مستقبل ضوئي كريبتوكروم نشط بالضوء الأزرق في أرابيدوبسيس ثاليانا45. يرتبط Cryptochrome 2 ب CIB1 ، وهو بروتين حلزوني حلزوني أساسي ، فقط في حالته الضوئية45. وجد لاحقا أن منطقة التماثل الضوئي الطرفية المحفوظة N، من Cryptochrome 2 (CRY2PHR، المشار إليها فيما يلي باسم CRY2) والمجال N-terminal (aa 1-170) من CIB1 (المشار إليها فيما يلي باسم CIBN) مهمة للإزالة المستحثة بالضوء46. يحتوي Opto-Rho1DN على مكونين. المكون الأول هو بروتين CIBN المنصهر مع مرساة CAAX ، والتي تحدد موقع البروتين إلى غشاء البلازما47. المكون الثاني هو CRY2 الموسوم ب mCherry المنصهر مع Rho1DN41. في غياب الضوء الأزرق ، يبقى CRY2-Rho1DN في السيتوبلازم. عند تحفيز الضوء الأزرق ، يتم استهداف CRY2-Rho1DN لغشاء البلازما من خلال التفاعل بين CIBN المرتبط بالغشاء و CRY2 المثار. يمكن تنشيط Opto-Rho1DN عن طريق الأشعة فوق البنفسجية A (UVA) والضوء الأزرق (400-500 نانومتر ، ذروة التنشيط عند 450-488 نانومتر) ، أو بواسطة ليزر نابض 830-980 نانومتر عند إجراء تحفيز ثنائي الفوتون41،46،47،48. لذلك ، يتم تحفيز Opto-Rho1DN بواسطة الأطوال الموجية المستخدمة عادة ل GFP المثير (488 نانومتر لتصوير الفوتون الفردي و 920 نانومتر للتصوير ثنائي الفوتون). في المقابل ، فإن الأطوال الموجية المستخدمة بشكل شائع في mCherry المثير (561 نانومتر لتصوير الفوتون الفردي و 1040 نانومتر للتصوير ثنائي الفوتون) لا تحفز وحدة البصريات الوراثية وبالتالي يمكن استخدامها للتصوير المسبق للتحفيز. يصف البروتوكول الأساليب المستخدمة لتقليل مخاطر التحفيز غير المرغوب فيه أثناء معالجة العينة.

تم استخدام الاستئصال بالليزر على نطاق واسع للكشف عن التوتر في الخلايا والأنسجةوقياسه 49. أظهرت الدراسات السابقة أنه عندما يتم التحكم في شدة الليزر بشكل مناسب ، فإن الاجتثاث بالليزر ثنائي الفوتون الذي يستخدم ليزر الفيمتو ثانية القريب من الأشعة تحت الحمراء يمكن أن يضعف جسديا بعض الهياكل تحت الخلوية (على سبيل المثال ، شبكات الأكتوميوسين القشرية) دون التسبب في نشوة غشاء البلازما50,51. إذا كان النسيج تحت التوتر ، فإن الاستئصال بالليزر لمنطقة ذات أهمية داخل الأنسجة يؤدي إلى ارتداد خارجي فوري للخلايا المجاورة للمنطقة المستأصلة. سرعة الارتداد هي دالة لحجم التوتر ولزوجة الوسائط (السيتوبلازم) المحيطة بالهياكل التي تخضع للارتداد49. نظرا لعمق الاختراق الفائق لليزر القريب من الأشعة تحت الحمراء والقدرة على تحقيق الاستئصال البؤري المحصور جيدا ، فإن الاستئصال بالليزر ثنائي الفوتون مفيد بشكل خاص للكشف عن توتر الأنسجة في الجسم الحي. كما هو موضح في هذا البروتوكول ، يمكن دمج هذه الطريقة بسهولة مع تعطيل انقباض الأكتوميوسين بوساطة Opto-Rho1DN للتحقيق في التأثير المباشر للانقباض الخلوي المعتمد على Rho1 على ميكانيكا الأنسجة أثناء إعادة تشكيل الأنسجة الديناميكية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد الصليب الجيني وإعداد كوب جمع البويضات

  1. حدد الذباب الأنثوي (العذراء) من الخط البصري الوراثي UASp-CIBNpm (I) ؛ UASp-CRY2-Rho1DN-mCherry (III) على وسادة CO2 تحت المجهر المجسم وإعداد صليب مع الذباب الذكور من خط سائق الأم GAL4 67 Sqh-mCherry ؛ 15 E-cadherin-GFP.
    ملاحظة: يرمز 67 و 15 إلى الأم توبولين GAL4 الذي تم إدخاله في الكروموسومات الثانية (II) والثالثة (III) ، على التوالي52. يعبر خط GAL4 المستخدم في هذا البروتوكول أيضا عن سلسلة الضوء التنظيمية للميوسين الموسومة ب mCherry Sqh (اسباجيتي الاسكواش) 37 و E-cadherin53 الموسوم ب GFP. قد لا يزال الذباب من الخط البصري الوراثي يحتوي على كروموسومات موازن FM7 و TM6. قد لا يزال الذباب من خط سائق GAL4 للأم يحتوي على كروموسومات موازن CyO و TM3.
  2. بعد ~ 10 أيام ، حدد إناث الذباب F1 التي لها النمط الجيني التالي: UASp-CIBNpm / + ؛ 67 متر مربع-mCherry / + ؛ 15 إي-كاديرين-GFP/UASp-CRY2-Rho1DN-mCherry. قم بإعداد كوب جمع البيض مع ذكور الذباب.
    1. تأكد من أن أنثى الذباب ذات النمط الجيني الصحيح لا تحتوي على أي كروموسومات موازنة (أي يجب ألا تحتوي على أجنحة مجعدة [Cy] أو شعيرات قصيرة [Sb] أو عيون على شكل قضيب أو كلية [B] أو شعيرات عظمية إضافية [Hu]) ، وهي علامات لموازنات CyO و TM3 و FM7 و TM6 المستخدمة في توليد الأسهم ، على التوالي. غطي الكوب بطبق عصير التفاح مع مسحة من معجون الخميرة الطازجة على السطح.
      ملاحظة: في الإناث F1 ، يتم التعبير عن المكونات البصرية الوراثية للأم. لذلك ، لا تحتاج إناث F1 المستخدمة لإعداد الكأس إلى أن تكون عذارى. يوصى باستخدام الذباب الذكور من نفس سكان F1 للكوب للراحة.
  3. احتفظ بالكوب في صندوق من الورق المقوى مغطى بورق الألمنيوم لتجنب أي تسرب محتمل للضوء من البيئة. قم بتغيير طبق عصير التفاح كل يوم للأكواب المحفوظة في درجة حرارة الغرفة (~ 21-23 درجة مئوية) ، أو كل يومين للأكواب المحفوظة عند 18 درجة مئوية.
    1. مباشرة قبل تغيير اللوحة ، اطرق الكوب على سطح مستو (على سبيل المثال ، أعلى الطاولة) لإبقاء الذباب في قاع الكوب ومنعه من الهروب. قم بتغيير طبق عصير التفاح في غرفة مظلمة واستخدم مصباحا أماميا بضوء أحمر للإضاءة (انظر جدول المواد).
      ملاحظة: لزيادة التعبير عن التركيبات التي تخضع لسيطرة الأم - توبولين - GAL4 و UASp ، يوصى بإبقاء الكوب عند 18 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 3 أيام قبل جمع الأجنة. تسمح فترة الحضانة هذه أيضا للذباب بالتكيف مع الكأس وتغذيته جيدا على معجون الخميرة لتحقيق الإنتاج الأمثل للبيض.

2. جمع الأجنة في المرحلة المطلوبة وإعدادها للتحفيز البصري الوراثي

ملاحظة: يجب إجراء جميع خطوات جمع العينات وتحضيرها في غرفة مظلمة ، باستخدام "ضوء آمن" (على سبيل المثال ، ضوء أحمر) للإضاءة. المكونات البصرية الوراثية حساسة للغاية للضوء المحيط. حتى أدنى تعرض للضوء المحيط يؤدي إلى التحفيز المبكر للعينة. عادة ، لا تسبب الأضواء في النطاق الأخضر والأحمر (>532 نانومتر) تحفيزا غير مرغوب فيه.

  1. لجمع الأجنة في مرحلة التطور الجنيني المبكرة ، ضع طبقا جديدا لعصير التفاح على الكوب من 8 إلى 16 ساعة قبل جمع الأجنة (عند 18 درجة مئوية).
  2. في وقت جمع الأجنة ، قم بتغيير طبق عصير التفاح. قم بتسمية اللوحة التي تم إزالتها من الكوب وقم بتغطية سطح اللوحة بطبقة رقيقة من زيت الهالوكربون 27 (انظر جدول المواد). انتظر حتى يصبح قشر البيض شفافا لمدة 30-60 ثانية.
  3. ضع درعا بلاستيكيا برتقاليا أحمر (انظر جدول المواد) على مسرح مجسوس مستقيم. يمنع وضع الدرع البرتقالي والأحمر التحفيز غير المرغوب فيه أثناء إضاءة العينة عن طريق منع الأطوال الموجية الزرقاء والخضراء من الضوء المرسل.
    ملاحظة: في هذا البروتوكول ، يتم استخدام مجسمة منتصبة لجمع الأجنة (انظر جدول المواد).
  4. ضع طبق عصير التفاح فوق الدرع البرتقالي والأحمر. قم بتشغيل الضوء المرسل للمجهر المجسم لإلقاء الضوء على العينة. جمع 5-15 أجنة في المرحلة المناسبة من لوحة عصير التفاح باستخدام زوج من الملقط. لا تضغط على الأجنة بالملاقط.
    ملاحظة: في هذا البروتوكول ، يجب أن يكون الجنين المناسب في مرحلة الخلوي المبكرة والمتوسطة. يجب أن يكون للجنين في هذه المرحلة صفار معتم داكن محاط بطبقة محيطية واضحة وموحدة تحتوي على خلايا البلاستوديرم المتكونة. يجب ألا تمر الحافة الأمامية لأخاديد الانقسام ("جبهة الخلوية") ، والتي تظهر كخط مستمر مواز لسطح الجنين ، بنصف عمق المحيط.
  5. لطخة الأجنة برفق على قطعة من منشفة ورقية (~ 1.5 سم × 1.5 سم) لإزالة الزيت الزائد من الأجنة باستخدام الملقط.
  6. أضف عدة قطرات من المبيض الطازج بنسبة 40٪ (~ 3٪ هيبوكلوريت الصوديوم ؛ انظر جدول المواد) إلى قطعة مربعة صغيرة جديدة من منشفة ورقية (~ 1.5 سم × 1.5 سم) باستخدام ماصة نقل بلاستيكية بحيث يتم تغطية المنشفة الورقية بطبقة رقيقة من المبيض. انقل الجنين من المنشفة الورقية الجافة إلى المنشفة الورقية المبللة بالمبيض باستخدام الملقط وتأكد من نقع الأجنة في المبيض. انتظري 2-4 دقائق حتى يصبح الجنين منزوع الأيوان.
  7. بعد إزالة التبييض، استخدم الملقط لمسح المنشفة الورقية المربعة على قطعة كبيرة من المناديل الورقية لإزالة المبيض الزائد. تأكد من أن الجانب مع الأجنة متجها لأعلى.
  8. لشطف الأجنة ، استخدم الملقط لنقع المنشفة الورقية المربعة برفق في قطرة من الماء منزوع الأيونات ومسحها بسرعة على قطعة كبيرة من المناديل الورقية. كرر هذه العملية ثماني مرات لضمان إزالة أي بقايا مبيض.
  9. استخدم أداة رمش لنقل الجنين من منشفة ورقية إلى طبق زجاجي القاع 35 مم (انظر جدول المواد). أضف الماء منزوع الأيونات إلى الطبق لتغطية الأجنة بالكامل. اضبط موضع واتجاه الأجنة باستخدام أداة الرموش.
    ملاحظة: بعد إزالة العضل ، يميل الجنين إلى الالتصاق بسطح الزجاج ويكون غير متحرك دون اضطراب ، لذلك ليس من الضروري تطبيق علاج إضافي (مثل الغراء) لشل حركة الجنين على الطبق ذي القاع الزجاجي.
  10. ضع الطبق ذو القاع الزجاجي مقاس 35 مم مع الأجنة داخل صندوق أسود مقاوم للضوء (انظر جدول المواد) لحماية العينة من التعرض للضوء أثناء عملية النقل. أحضر الصندوق إلى الغرفة باستخدام المجهر متعدد الفوتونات.

3. التحفيز البصري الوراثي والاستئصال بالليزر وتصوير الجنين

ملاحظة: نظام الفوتون المتعدد المستخدم في هذه التجربة (انظر جدول المواد) قادر على التصوير المتزامن بالطول الموجي المزدوج. كما يحتوي على وحدة تحفيز ضوئي مزودة بليزر 458 نانومتر وماسح جلفانومتر منفصل ، مما يسمح بالتنشيط / التحفيز الضوئي داخل منطقة اهتمام محددة (ROI). وتجدر الإشارة إلى أن الليزر 920 نانومتر ، والذي يستخدم لإثارة البروتينات الفلورية الخضراء والصفراء ، سيحفز Opto-Rho1DN ، وإن كان أبطأ مقارنة بالتحفيز بوساطة الليزر الأزرق.

  1. قم بتغطية المجهر متعدد الفوتونات بقطعة قماش سوداء مقاومة للضوء (انظر جدول المواد) لتجنب التحفيز غير المرغوب فيه للأجنة أثناء إعداد العينة والتصوير.
    ملاحظة: يتم استخدام نفس النهج أثناء التصوير العادي متعدد الفوتونات لحماية أجهزة الكشف الحساسة للضوء المزودة بالمجهر.
  2. أطفئ ضوء الغرفة وشاشات الكمبيوتر. قم بإيقاف تشغيل وحدة التحكم في لوحة اللمس بالنقر فوق إيقاف التشغيل ضمن "الإضاءة الخلفية لوحدة التحكم في لوحة اللمس" في البرنامج. تأكد من عدم وجود إضاءة محيطة أخرى في الغرفة.
    1. افتح الجانب الأمامي من غطاء القماش الأسود على المجهر. خذ الطبق ذو القاع الزجاجي 35 مم من الصندوق الأسود وضعه على مرحلة المجهر.
  3. إضاءة الأجنة بضوء أخضر يستخدم عادة كضوء إثارة للتألق. للقيام بذلك ، قم بتشغيل وحدة الإضاءة الفلورية ، وحدد Ocular أسفل لوحة "Ocular" في البرنامج ، وقم بتغيير "برج Cube" إلى 4: TRITC. استخدم العدسة لتحديد الجنين محل الاهتمام وجعله موضع تركيز.
    ملاحظة: يتم تحقيق تصور الضوء الأخضر من خلال السماح للضوء الأبيض الناتج عن وحدة الإضاءة الفلورية بالمرور عبر مكعب مرشح TRITC قياسي مدمج ، والذي يحتوي على مرشح إثارة 528-553 نانومتر ، ومقسم شعاع 565 نانومتر ، ومرشح انبعاث 590-650 نانومتر. يجب أن تعمل الأضواء غير الزرقاء الأخرى بشكل جيد لإضاءة العينة. ليس من الضروري ارتداء واقي العين في هذه الخطوة ، لأن ضوء الإثارة له كثافة منخفضة ولن يتم توجيهه إلى العدسة. سيظهر الجنين باللون الأحمر بشكل موحد بسبب التألق الذاتي.
  4. أغلق غطاء القماش الأسود بحيث تكون العينة محمية بالكامل من الضوء. قم بتشغيل شاشة الكمبيوتر للوصول إلى البرنامج الذي يتحكم في المجهر. قم بتغيير "Ocular" إلى LSM في البرنامج للحصول على الصور.
  5. قم بإجراء الاستئصال بالليزر في السيطرة على الأجنة غير المحفزة باستخدام هدف غمر الماء 25x.
    1. انقر فوق Bright Z و Sequence Manager و LSM Stimulation من "نافذة الأدوات" في البرنامج. اضبط نوع الماسحة الضوئية على أنه Galvano وحجم المسح الضوئي على أنه 512 × 512. قم بتشغيل CH1 و CH3 ضمن لوحة "إعداد PMT" للسماح باستخدام ليزر 1040 نانومتر ، وانقر فوق Live × 4 لتصور الجنين.
    2. قم بتدوير الجنين باستخدام وظيفة الدوران في البرنامج بحيث يكون المحور الأمامي الخلفي للجنين موجها رأسيا. اضبط التكبير/التصغير على 3. ارسم منطقة اهتمام (ROI) باستخدام أداة الشكل ضمن "إعدادات المسح الضوئي" واضبط حجم عائد الاستثمار في لوحة "المرجع". اضبط عائد الاستثمار على أنه 512 بكسل في العرض و 100 بكسل في الارتفاع (171 × 33 ميكرومتر2).
    3. قم بتعيين معلمات الاستحواذ لمكدس Z قبل الاستئصال.
      1. سجل سطح الجنين ك 0 تحت "القسم Z". اضبط البداية على 0 والنهاية على 100 ميكرومتر. اضبط حجم الخطوة على 2 ميكرومتر. قم بتنشيط وضع الاستحواذ Z عن طريق تحديد Z ضمن علامة التبويب "السلسلة".
      2. اضبط شدة الليزر 1040 نانومتر لزيادة خطيا من 3٪ إلى 7٪ باستخدام وظيفة Bright Z .
      3. احفظ إعداد التصوير الحالي كمهمة أولى لخط الأنابيب بالنقر فوق LSM في "إدارة التسلسل".
        ملاحظة: يتم الحصول على مكدس Z قبل الاستئصال لتأكيد مرحلة الجنين. في هذه التجربة ، سيتم إثارة CRY2-Rho1DN-mCherry و Sqh-mCherry بواسطة ليزر 1,040 نانومتر. أثناء الانقباض القمي ، يتم تعزيز إشارة Sqh-mCherry في المنطقة القمية المتوسطة لخلايا الأديم المتوسط البطني ، في حين أن CRY2-Rho1DN-mCherry هو خلوي قبل التحفيز. يتم تحديد شدة الليزر المستخدمة في التصوير قبل وبعد التحفيز تجريبيا بناء على التوازن بين نسبة الإشارة إلى الضوضاء المثلى وتجنب التبييض الضوئي.
    4. قم بتعيين معلمات الاستحواذ لفيلم ما قبل الاستئصال.
      1. احذف أي عائد استثمار موجود للسماح بتصوير منطقة 512 × 512 بكسل بأكملها (171 × 171 ميكرومتر 2 ، تكبير 3x) بالقرب من السطح البطني للجنين ، كما هو موضح في الخطوة 3.5.2. اضبط شدة الليزر 1,040 نانومتر على 3٪.
      2. تحقق من الوقت وقم بإلغاء تحديد Z ضمن لوحة "السلسلة". احتفظ ب "الفاصل الزمني" ك FreeRun ضمن لوحة "الفاصل الزمني". اضبط الدورة على 10.
      3. احفظ الإعدادات الحالية كمهمة تالية لخط الأنابيب بالنقر فوق LSM في "إدارة التسلسل".
        ملاحظة: الغرض من هذه المهمة هو الحصول على فيلم واحد من 10 إطارات Z-plane pre-ablation مع ليزر 1040 نانومتر للحصول على الصور. تبلغ سرعة الحصول على الصورة حوالي 1 ثانية لكل إطار.
    5. اضبط معلمات الاجتثاث بالليزر.
      1. حدد منطقة ثلاثية الأبعاد من أسفل غشاء vitelline مباشرة إلى عمق ~ 20 ميكرومتر للاجتثاث بالليزر (الشكل 1 أ). اضبط بداية مكدس Z على أنه المستوى الموجود أسفل غشاء vitelline مباشرة والنهاية على عمق 20 ميكرومتر من مستوى البداية. اضبط حجم الخطوة على 1.5 ميكرومتر.
        ملاحظة: عائد الاستثمار للمنطقة المجاذرة هو ~ 30 بكسل في العرض و ~ 10 بكسل في الارتفاع (~ 10 ميكرومتر على طول المحور الإنسي الجانبي و ~ 3.3 ميكرومتر على طول محور A-P). الغرض من إزالة العينة عند عدة مستويات Z هو التأكد من أن السطح القمي للخلايا البطنية قد تم استئصاله. هذا مهم بشكل خاص للأجنة المحفزة ، حيث تتعرض الخلايا البطنية للارتخاء القمي السريع بعد تثبيط Rho1.
      2. قم بتشغيل CH2 و CH4 ضمن لوحة "إعداد PMT" للسماح باستخدام ليزر 920 نانومتر. اضبط شدة الليزر 920 نانومتر على 30٪. اضبط الحصول على الصورة باستخدام ليزر 920 نانومتر لمكدس Z واحد داخل المنطقة ثلاثية الأبعاد المحددة في الخطوة 3.5.5.1 لاستئصال الليزر.
        ملاحظة: كثافة الليزر المختارة في هذه الخطوة كافية لاستئصال الأنسجة (كما هو موضح في ارتداد الأنسجة مباشرة بعد العلاج بالليزر) ولكن في الوقت نفسه لا تلحق الضرر الواضح بغشاء البلازما (كما يتضح من عدم وجود علامات حرق على غشاء الخلية) (الشكل 1B ، C).
      3. احفظ الإعداد الحالي كمهمة تالية لخط الأنابيب بالنقر فوق LSM في "إدارة التسلسل".
    6. تعيين معلمات الاستحواذ لفيلم ما بعد الاستئصال.
      1. قم بتعيين الحصول على صورة لفيلم واحد من 100 إطار Z-plane بعد الاجتثاث باستخدام كل من الليزر 1040 نانومتر و 920 نانومتر. اضبط شدة الليزر 1,040 نانومتر وليزر 920 نانومتر على 3٪ و 0.3٪ على التوالي. سيتم تصوير المنطقة المحددة في الخطوة 3.5.4 بسرعة الحصول على صور متطابقة.
      2. احفظ الإعداد الحالي كمهمة تالية لخط الأنابيب بالنقر فوق LSM في "إدارة التسلسل".
        ملاحظة: الغرض من تخزين المعلمات الموضحة في الخطوات 3.5.3-3.5.6 كمهام متسلسلة في "مدير التسلسل" قبل أي اكتساب فعلي هو ضمان التقاط استجابة الأنسجة الفورية بعد الاستئصال بالليزر.
    7. حدد تسلسل ضمن "اكتساب". قم بتغيير مسار حفظ البيانات واسم الملف حسب الحاجة. انقر فوق جاهز وانتظر حتى يقوم البرنامج بتهيئة خط الأنابيب. ثم انقر فوق ابدأ لتنفيذ خط الأنابيب.
  6. إجراء الاجتثاث بالليزر في الأجنة المحفزة.
    1. قم بتعيين معلمات الاستحواذ لمكدس Z قبل الاجتثاث ، كما هو موضح في الخطوات 3.5.1-3.5.3. احفظ الإعداد الحالي كمهمة أولى لخط الأنابيب بالنقر فوق LSM في "إدارة التسلسل".
    2. قم بتعيين معلمات للتحفيز البصري الوراثي ضمن عائد استثمار محدد.
      1. قم بتغيير التكبير إلى 1 وحدد عائد استثمار يغطي السطح البطني للجنين (~ 512 × 300 ميكرومتر2). قم بإيقاف تشغيل كاشفات CH1-CH4 .
      2. انقر فوق تحفيز LSM. قم بإلغاء تحديد مستمر خلال المدة واكتب 12 ثانية. تحقق من 458 نانومتر مع كثافة ليزر 0.3٪.
      3. احفظ الإعداد الحالي كمهمة تالية للمسار بالنقر فوق التحفيز في "مدير التسلسل ".
        ملاحظة: يمكن تحقيق تحفيز أسرع عن طريق زيادة شدة الليزر 458 نانومتر. ومع ذلك ، عند استخدام كثافة ليزر أعلى ، قد يحفز ضوء الليزر المتناثر المنطقة المجاورة لعائد الاستثمار ، وهو أمر غير مثالي إذا كان التحفيز المحصور مكانيا مطلوبا.
    3. اضبط وقت انتظار مدته 3 دقائق بعد التحفيز لضمان التعطيل التام للميوسين وتفكيك F-actin القمي ، ولتحقيق مورفولوجيا الأنسجة الثابتة قبل الاستئصال بالليزر. يتم تحقيق ذلك من خلال النقر على انتظار / إيقاف مؤقت ضمن "مدير التسلسل" وتحديد الوقت المطلوب ل "الانتظار".
      ملاحظة: يمكن اكتشاف تجنيد CRY2-Rho1DN-mCherry في الغشاء الناجم عن جولة واحدة من التحفيز (0.3٪ ليزر 458 نانومتر لمدة 12 ثانية) بوضوح بعد 10-15 دقيقة من التحفيز. هذا يتماشى مع نصف الوقت المنشور للتفكك ~ 9 دقيقة47.
    4. قم بتعيين معلمات الاستحواذ لفيلم ما قبل الاستئصال الفردي Z-plane ، كما هو موضح في الخطوة 3.5.4 ، باستثناء أنه يتم استخدام كل من ليزر 1040 نانومتر و 920 نانومتر للحصول على الصور. قم بتشغيل كاشفات CH1-CH4 . اضبط شدة الليزر 1,040 نانومتر وليزر 920 نانومتر على 3٪ و 0.3٪ على التوالي. احفظ الإعداد الحالي كمهمة تالية لخط الأنابيب بالنقر فوق LSM في "إدارة التسلسل".
    5. قم بتعيين معلمات الاستئصال بالليزر، كما هو موضح في الخطوة 3.5.5. احفظ الإعداد الحالي كمهمة تالية لخط الأنابيب بالنقر فوق LSM في "إدارة التسلسل".
    6. قم بتعيين معلمات الاستحواذ لفيلم ما بعد الاستئصال الفردي Z-plane ، كما هو موضح في الخطوة 3.5.6. احفظ الإعداد الحالي كمهمة تالية لخط الأنابيب بالنقر فوق LSM في "إدارة التسلسل".
    7. حدد تسلسل ضمن "اكتساب". قم بتغيير مسار حفظ البيانات واسم الملف حسب الحاجة. انقر فوق جاهز وانتظر حتى يقوم البرنامج بتهيئة خط الأنابيب. ثم انقر فوق ابدأ لتنفيذ خط الأنابيب.

4. تحديد معدل ارتداد الأنسجة بعد الاجتثاث بالليزر

  1. افتح فيلم ما بعد الاستئصال في ImageJ.
  2. ارسم عائد استثمار صغيرا على طول خط الوسط البطني الذي يغطي المنطقة المتجذرة باستخدام أداة تحديد المستطيل . عرض عائد الاستثمار هو تسعة بكسل. يتم تعيين ارتفاع عائد الاستثمار بحيث يكون عائد الاستثمار كبيرا بما يكفي لتغطية النطاق الكامل لارتداد الأنسجة بعد الاستئصال بالليزر.
    1. انقر على تكرار ضمن علامة التبويب "صورة". في النافذة المنبثقة ، تحقق من تكرار المكدس ثم انقر فوق موافق لتكرار المكدس ضمن عائد الاستثمار المحدد.
  3. قم بإنشاء مونتاج من المكدس المكرر من خلال مكدسات > الصور > إنشاء مونتاج. في النافذة المنبثقة ، اضبط رقم الصف على 1 ورقم العمود على إجمالي عدد الإطارات في المكدس (100 في هذه الحالة).
  4. قم بقياس عرض A-P للمنطقة المجاعة بمرور الوقت من المونتاج الذي تم إنشاؤه.
    1. استخدم أداة النقاط المتعددة في ImageJ لتمييز حدود A-P للمنطقة التي تم اجتثاثها لكل نقطة زمنية في المونتاج.
    2. احفظ إحداثيات النقاط المميزة باستخدام ملف > حفظ باسم > إحداثيات XY.
    3. قم باستيراد إحداثيات XY المقاسة إلى MATLAB. احسب عرض A-P للمنطقة المذابة لكل نقطة زمنية عن طريق طرح إحداثي Y للحد العلوي من إحداثي Y للحد السفلي.
  5. حدد معدل ارتداد الأنسجة عن طريق تركيب أول 20 ثانية من منحنى "العرض بمرور الوقت" في خط باستخدام وظيفة "polyfit" في MATLAB. أبلغ عن ميل الخط المجهز كمعدل ارتداد الأنسجة.
  6. إجراء اختبارات إحصائية لمقارنة معدل ارتداد الأنسجة بين العينات المحفزة وغير المحفزة.
    ملاحظة: يوصى بالحصول على بيانات من خمسة أجنة على الأقل لكل حالة. يمكن استخدام كل من اختبار مجموع رتبة ويلكوكسون على الوجهين واختبار t للطالب على الوجهين للمقارنة الإحصائية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

في الأجنة غير المحفزة التي تخضع للانقباض القمي ، أصبح Sqh-mCherry غنيا في المنطقة القمية المتوسطة لخلايا الأديم المتوسط البطني ، بينما كان CRY2-Rho1DN-mCherry خلويا (الشكل 1 أ). أدى الاجتثاث بالليزر داخل مجال الانقباض إلى ارتداد سريع للأنسجة على طول محور A-P (الشكل 1B ، C). في الأجنة المحفزة ، أصبحت إشارة CRY2-Rho1DN-mCherry غشاء بلازما موضعيا ، في حين اختفت الإشارة المتوسطة ل Sqh-mCherry تماما (الشكل 1 أ). لم يؤد الاستئصال بالليزر في الأجنة المحفزة إلى ارتداد واضح للأنسجة ، كما هو موضح في الشكل 1B ، C والكمي في الشكل 1D. تشير هذه النتائج إلى أن توليد توتر الأنسجة يتطلب انقباض أكتوميوسين قمي نشط. عندما يصبح أكتوميوسين غير نشط عند تثبيط Rho1 ، يتناقص توتر الأنسجة القمية أيضا41. تتوافق هذه الملاحظات مع النتائج السابقة التي تفيد بأن تنشيط انقباض الميوسين القمي في خلايا الأديم المتوسط البطني يؤدي إلى زيادة توتر الأنسجة على السطح البطني للجنين40.

Figure 1
الشكل 1: يؤدي تحفيز البصريات-Rho1DN أثناء الانقباض القمي إلى فقدان فوري للتوتر القشري على السطح البطني للجنين . (أ) رسم كاريكاتوري يصور الإعداد التجريبي للاستئصال بالليزر للكشف عن التوتر القشري. تشير المناطق المظللة باللون الأصفر إلى المناطق التي تم استئصالها. بالنسبة للأجنة المحفزة ، تم إجراء التنشيط الضوئي ل Opto-Rho1DN قبل 3 دقائق من الاستئصال بالليزر. بسبب الاسترخاء القمي بعد التحفيز ، تم استئصال العديد من طائرات z (المنطقة المظللة باللون الأصفر) من أجل ضمان استئصال السطح القمي جدا للخلايا البطنية. (ب، ج) مقارنة بين الأجنة غير المحفزة والمحفزة. لم يلاحظ أي ارتداد واضح للأنسجة في الأجنة المحفزة (N = 6 للأجنة غير المحفزة و N = 5 للأجنة المحفزة). ب: منظر الوجه للأجنة المستأصلة بالليزر. تشير الصناديق المظللة باللون الأصفر إلى المنطقة التي تم استئصالها. (ج) أجهزة قياس الكيموجراف التي تمثل تغير عرض المنطقة المقصوصة تشير الخطوط الصفراء المنقطة إلى موقع الاستئصال. (د) تغيرات عرض المنطقة المتجذرة على طول محور A-P خلال أول 20 ثانية بعد الاستئصال بالليزر. لوحظ ارتداد واضح للأنسجة بعد القطع بالليزر في أجنة التحكم غير المحفزة. في المقابل ، لوحظ ارتداد ضئيل أو معدوم في الأنسجة في الأجنة المحفزة ، مما يشير إلى نقص التوتر القمي بعد تثبيط Rho1. شريط الخطأ هو الانحراف المعياري. تم حساب القيمة p باستخدام اختبار مجموع رتبة ويلكوكسون على الوجهين. أعيد استخدام هذا الرقم من Guo et al.41. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وصف هذا البروتوكول الاستخدام المشترك لعلم البصريات الوراثي والاستئصال بالليزر لاستكشاف التغيرات في توتر الأنسجة مباشرة بعد تعطيل انقباض الأكتوميوسين. تستفيد الأداة البصرية الوراثية الموصوفة هنا من الشكل السلبي السائد ل Rho1 (Rho1DN) لتثبيط انقباض الأكتوميوسين الداخلي المنشأ Rho1 و Rho1 بشكل حاد. أظهر التوصيف السابق ل Opto-Rho1DN في سياق تكوين الأخدود البطني لذبابة الفاكهة أن الأداة فعالة للغاية في التوسط في التعطيل السريع لانقباض الأكتوميوسين القمي من خلال تعطيل الميوسين المتزامن وتفكيك الأكتين41. على وجه الخصوص ، أدى تحفيز الأجنة في وقت الانقباض القمي إلى تقليل إشارة الميوسين القمي في غضون 60 ثانية في الخلايا التي تمر بالانقباض القمي41. من المحتمل أن تكون هذه الإزالة السريعة للميوسين القشري عند تثبيط Rho1 بسبب الدوران السريع ل Rho1 و myosin من خلال الحالات النشطة وغير النشطة ، الناتجة عن أنشطة البروتينات المنشطة GTPase (GAPs) لفوسفاتاز سلسلة ضوء Rho1 و myosin ، على التوالي19,54. تماشيا مع التأثير على الأكتوميوسين ، أظهر اقتران علم البصريات الوراثي بالاستئصال بالليزر أن تحفيز Opto-Rho1DN أثناء الانقباض القمي أدى إلى فقدان فوري للتوتر الظهاري في المنطقة البطنية للجنين41 (الشكل 1). سمح لنا هذا النهج المشترك بالتحقيق في وظيفة الانقباض الخلوي بوساطة Rho1 في تنظيم ميكانيكا الأنسجة بدقة مكانية وزمانية غير مسبوقة ، مما يجعل من الممكن تشريح التأثيرات الفورية من التأثيرات طويلة المدى التي يصعب تحقيقها باستخدام الأساليب الجينية التقليدية.

أحد الاعتبارات الفنية المهمة عند استخدام Opto-Rho1DN هو أن الأداة حساسة للغاية للإضاءة المحيطة. من المشكلات الشائعة في التجربة تجنيد CRY2-mCherry-Rho1DN في غشاء البلازما قبل خطوة التحفيز ، والتي تحدث عادة بسبب التحفيز المبكر للعينة خلال إحدى الخطوات التالية: تحضير العينة ، ونقل العينة إلى غرفة المجهر ، ووضع العينة على مرحلة المجهر ، والحصول على صورة ما قبل التحفيز. في بروتوكولنا ، يتم استخدام إجراءات متعددة لمنع التحفيز غير المرغوب فيه ، بما في ذلك التعامل مع أكواب الذباب والأجنة في غرفة مظلمة تحت الضوء الأحمر ، وتصفية الأطوال الموجية الزرقاء من ضوء الإضاءة عند اختيار وتركيب الأجنة تحت المجهر المجسم ، وتجنب تعرض الأجنة لليزر 400-500 نانومتر (إثارة فوتون واحد) أو ليزر نابض 830-980 نانومتر (إثارة متعددة الفوتونات) قبل التحفيز. من الأهمية بمكان ممارسة المزيد من الاهتمام في خطوات متعددة من التجربة لمنع التحفيز غير المرغوب فيه للعينة. بالإضافة إلى ذلك ، عند استخدام Opto-Rho1DN لتثبيط Rho1 داخل منطقة معينة من الاهتمام (ROI) في الجنين41 ، يوصى باستخدام أقل كثافة ليزر يمكن أن تحقق إزفاء قويا ل CRY2-Rho1DN إلى غشاء البلازما. نظرا لأن Opto-Rho1DN حساس للغاية للأطوال الموجية الزرقاء ، يمكن أن يؤدي الليزر الأزرق عالي الكثافة إلى تحفيز غير مرغوب فيه في الخلايا خارج عائد الاستثمار أو حتى الأجنة المجاورة بسبب الضوء المتناثر.

في نسختها الحالية ، تحتوي أداة Opto-Rho1DN على العديد من القيود. أولا ، بالنسبة للتجارب الموصوفة في هذا البروتوكول ، تم استخدام مرساة CIBN المترجمة بغشاء البلازما لتجنيد CRY2-Rho1DN المنشط من السيتوسول إلى غشاء البلازما41,47. من خلال هذا التصميم ، من الصعب إجراء تثبيط Rho1 المحصور داخل مجال غشاء بلازما معين بسبب انتشار بروتينات CRY2-Rho1DN المنشطة في العصارة الخلوية. وينتظر زيادة تحسين الدقة المكانية على نطاق الخلايا الفرعية تطوير مراسي CIBN جديدة لها أنماط توطين تحت خلوية أكثر تحديدا. ثانيا ، تم تصميم Opto-Rho1DN لتثبيط Rho1 أثناء التطور الجنيني المبكر. يتم التحكم في تعبير CIBNpm و CRY2-Rho1DN-mCherry بواسطة UASp ، وهو موحد للتعبير في السلالات الجرثومية الأنثوية 55. قد يتطلب التعبير عن هذه الوحدات في الأنسجة الجسدية بعد التطور الجنيني المبكر استبدال UASp بمحفز أكثر فعالية لدفع التعبير الجسدي (على سبيل المثال ، UASt56). أخيرا ، تعتمد فعالية Opto-Rho1DN على وفرة مرساة CIBN وبروتينات CRY2-Rho1DN. في الإصدار الحالي من الأداة ، يتم تحديده بواسطة خط برنامج تشغيل GAL4 المستخدم لدفع التعبير عن الوحدات الضوئية الجينية. عند استخدام برنامج تشغيل GAL4 للأم الموصوف في هذا البروتوكول ، من الأهمية بمكان استخدام الخط الذي يوفر نسختين من جين GAL4 (على سبيل المثال ، كلاهما 67 و 15) من أجل تحقيق تثبيط سريع وقوي لانقباض الأكتوميوسين. تقليل عدد نسخ GAL4 الأمهات في الإناث F1 من اثنين إلى واحد يقلل بشكل كبير من التأثير المثبط.

بالمقارنة مع الأساليب الجينية التقليدية ، فإن النهج البصري الوراثي الموصوف في هذا البروتوكول مفيد في تشريح المرحلة والوظيفة الخاصة بالأنسجة ل Rho1 في أجنة ذبابة الفاكهة المبكرة. يتم تحقيق وظيفة Rho1 في التطور الجنيني المبكر لذبابة الفاكهة إلى حد كبير من خلال المنتج الجيني المحمل بالأم11. يؤدي استنفاد Rho1 إلى منع تكوين البويضة57 ، مما يمنع دراسة وظيفتها أثناء التطور الجنيني المبكر. في السنوات القليلة الماضية ، تم تطوير العديد من الأدوات البصرية الوراثية لتنظيم نشاط Rho1 الداخلي في أجنة ذبابة الفاكهة. طور كل من Izquierdo et al. و Rich et al. أدوات بصرية وراثية لتنشيط نشاط Rho1 من خلال تنظيم توطين المجال الحفاز ل Rho GEFs في أجنة ذبابة الفاكهة 48,58. بالإضافة إلى ذلك ، طور Herrera-Perez et al. أداتين من علم البصريات الوراثية باستخدام إما RhoGEF2 كامل الطول (optoGEF) أو C-GAP كامل الطول (optoGAP) لتنشيط أو تثبيط نشاط Rho1 الداخلي ، على التوالي59. نظرا لأن opttoGAP يعمل عن طريق تجنيد Rho1 GAP إلى غشاء البلازما ، فقد يكون تطبيقه حساسا لوجود Rho1 GEFs الداخلية ، والتي يمكن أن تعوض أو حتى تتجاوز تأثير التوظيف خارج الرحم ل GAP. في المقابل ، من خلال عزل Rho1 GEFs مباشرة ، قد يوفر Opto-Rho1DN طريقة أكثر قوة لتثبيط انقباض الأكتوميوسين الداخلي المعتمد على Rho1 و Rho1.

بالنظر إلى النطاق الواسع لوظائف Rho1 في التطور الجنيني والتطور بعد الجنيني ، يمكن تكييف البروتوكول المقدم بسهولة لدراسة وظيفة عمليات إعادة التنظيم الخلوية المعتمدة على Rho1 و Rho1 في مجموعة واسعة من العمليات المورفولوجية. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام استراتيجية مماثلة ، من حيث المبدأ ، لتقييد GTPases الصغيرة الأخرى بشدة ، مثل عائلة Rho GTPases Cdc42 و Rac ، حيث تم استخدام أشكالها السلبية المهيمنة على نطاق واسع لتثبيط الوظيفة الداخلية لهذه البروتينات11. أخيرا ، كما هو موضح في هذا البروتوكول ، يمكن أن يوفر الجمع بين علم البصريات الوراثي ونهج الاستئصال بالليزر طريقة فعالة للتحقيق في التأثير الفوري لتعطيل بروتين معين على ديناميكيات الأنسجة وميكانيكا الأنسجة ، مما سيجلب لنا رؤى جديدة حول تشكل الأنسجة التي يصعب الكشف عنها باستخدام الأساليب الجينية التقليدية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

يعلن المؤلفون أن البحث قد أجري في غياب أي علاقات تجارية أو مالية يمكن تفسيرها على أنها تضارب محتمل في المصالح.

Acknowledgments

يشكر المؤلفون آن لافانواي على دعم التصوير. يشكر المؤلفون مختبر Wieschaus ومختبر De Renzis لمشاركة الكواشف ومركز بلومنجتون ذبابة الفاكهة لمخزون الذباب. هذه الدراسة مدعومة من قبل NIGMS ESI-MIRA R35GM128745 ومنحة البحوث المؤسسية لجمعية السرطان الأمريكية #IRG-82-003-33 إلى BH.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
35 mm glass-bottom dish MatTek P35G-1.5-10-C Used for sample preparation
60 mm × 15 mm Petri dish with lid Falcon 351007 Used for sample preparation
Black cloth for covering the microscope Online NA Used to avoid unwanted light stimulation
Clorox Ultra Germicadal Bleach (8.25% sodium hypochlorite) VWR 10028-048 Used for embryo dechorination
CO2 pad Genesee Scientific 59-114 Used for cross set-up
ddH2O NA NA Used for sample preparation
Dumont Style 5 tweezers VWR 102091-654 Used for sample preparation
Eyelash tool (made from pure red sable round brush #2) VWR 22940-834 Used for sample preparation
FluoView (Software) Olympus NA Used for image acquisition and optogenetic stimulation
Halocarbon oil 27 Sigma Aldrich H8773-100ML Used for embryo stage visualization
ImageJ/FIJI NIH NA Used for image analysis
MATLAB MathWorks NA Used for image analysis
Nikon SMZ-745 stereoscope Nikon NA Used for sample preparation
Olympus FVMPE-RS multiphoton microscope with InSight DS Dual-line Ultrafast Lasers for simultaneous dual-wavelength multiphoton imaging, , a 25x/NA1.05 water immersion objective (XLPLN25XWMP2), and an IR/VIS stimulation unit for photo-activation/stimulation. This system is also equipped with a TRITC filter (39005-BX3; AT-TRICT-REDSHFT 540/25x, 565BS, 620/60M), and a fluorescence illumination unit that emits white light. Olympus NA Used for image acquisition and optogenetic stimulation
SP Bel-Art 100-place polypropylene freezer storage box (Black, light-proof box for sample transfer) VWR 30621-392 Used to avoid unwanted light stimulation
UV Filter Shield for FM1403 Fluores (Orange-red plastic shield) Bolioptics FM14036151 Used to avoid unwanted light stimulation
VITCHELO V800 Headlamp with White and Red LED Lights Amazon NA Used to avoid unwanted light stimulation

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vicente-Manzanares, M., Ma, X., Adelstein, R. S., Horwitz, A. R. Non-muscle myosin II takes centre stage in cell adhesion and migration. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 10 (11), 778-790 (2009).
  2. Munjal, A., Lecuit, T. Actomyosin networks and tissue morphogenesis. Development. 141 (9), 1789-1793 (2014).
  3. Sawyer, J. M., et al. Apical constriction: a cell shape change that can drive morphogenesis. Developmental Biology. 341 (1), 5-19 (2010).
  4. Nishimura, T., Honda, H., Takeichi, M. Planar cell polarity links axes of spatial dynamics in neural-tube closure. Cell. 149 (5), 1084-1097 (2012).
  5. Marinari, E., et al. Live-cell delamination counterbalances epithelial growth to limit tissue overcrowding. Nature. 484 (7395), 542-545 (2012).
  6. Slattum, G. M., Rosenblatt, J. Tumour cell invasion: an emerging role for basal epithelial cell extrusion. Nature Reviews. Cancer. 14 (7), 495-501 (2014).
  7. Antunes, M., Pereira, T., Cordeiro, J. V., Almeida, L., Jacinto, A. Coordinated waves of actomyosin flow and apical cell constriction immediately after wounding. The Journal of Cell Biology. 202 (2), 365-379 (2013).
  8. Yang, S., et al. The central role of the tail in switching off 10S myosin II activity. The Journal of General Physiology. 151 (9), 1081-1093 (2019).
  9. Yang, S., et al. Cryo-EM structure of the inhibited (10S) form of myosin II. Nature. 588 (7838), 521-525 (2020).
  10. Narumiya, S., Thumkeo, D. Rho signaling research: history, current status and future directions. FEBS Letters. 592 (11), 1763-1776 (2018).
  11. Johndrow, J. E., Magie, C. R., Parkhurst, S. M. Rho GTPase function in flies: insights from a developmental and organismal perspective. Biochemistry and Cell Biology. 82 (6), 643-657 (2004).
  12. Etienne-Manneville, S., Hall, A. Rho GTPases in cell biology. Nature. 420 (6916), 629-635 (2002).
  13. Hodge, R. G., Ridley, A. J. Regulating Rho GTPases and their regulators. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 17 (8), 496-510 (2016).
  14. Martin, A. C., Goldstein, B. Apical constriction: themes and variations on a cellular mechanism driving morphogenesis. Development. 141 (10), 1987-1998 (2014).
  15. Amano, M., Nakayama, M., Kaibuchi, K. Rho-kinase/ROCK: A key regulator of the cytoskeleton and cell polarity. Cytoskeleton. 67 (9), 545-554 (2010).
  16. Kimura, K., et al. Regulation of myosin phosphatase by Rho and Rho-associated kinase (Rho-kinase). Science. 273 (5272), 245-248 (1996).
  17. Maekawa, M., et al. Signaling from Rho to the actin cytoskeleton through protein kinases ROCK and LIM-kinase. Science. 285 (5429), 895-898 (1999).
  18. Ohashi, K., et al. Rho-associated kinase ROCK activates LIM-kinase 1 by phosphorylation at threonine 508 within the activation loop. The Journal of Biological Chemistry. 275 (5), 3577-3582 (2000).
  19. Coravos, J. S., Martin, A. C. Apical sarcomere-like actomyosin contracts nonmuscle drosophila epithelial cells. Developmental Cell. 39 (3), 346-358 (2016).
  20. Homem, C. C. F., Peifer, M. Diaphanous regulates myosin and adherens junctions to control cell contractility and protrusive behavior during morphogenesis. Development. 135 (6), 1005-1018 (2008).
  21. Goode, B. L., Eck, M. J. Mechanism and function of formins in the control of actin assembly. Annual Review of Biochemistry. 76, 593-627 (2007).
  22. Sweeton, D., Parks, S., Costa, M., Wieschaus, E. Gastrulation in Drosophila: the formation of the ventral furrow and posterior midgut invaginations. Development. 112 (3), 775-789 (1991).
  23. Leptin, M., Grunewald, B. Cell shape changes during gastrulation in Drosophila. Development. 110 (1), 73-84 (1990).
  24. Leptin, M. Gastrulation in Drosophila: the logic and the cellular mechanisms. The EMBO Journal. 18 (12), 3187-3192 (1999).
  25. Martin, A. C. The physical mechanisms of Drosophila gastrulation: mesoderm and endoderm invagination. Genetics. 214 (3), 543-560 (2020).
  26. Gilmour, D., Rembold, M., Leptin, M. From morphogen to morphogenesis and back. Nature. 541 (7637), 311-320 (2017).
  27. Gheisari, E., Aakhte, M., Müller, H. -A. J. Gastrulation in Drosophila melanogaster: Genetic control, cellular basis and biomechanics. Mechanisms of Development. 163, 103629 (2020).
  28. Leptin, M. Twist and snail as positive and negative regulators during Drosophila mesoderm development. Genes & Development. 5 (9), 1568-1576 (1991).
  29. Costa, M., Wilson, E. T., Wieschaus, E. A putative cell signal encoded by the folded gastrulation gene coordinates cell shape changes during Drosophila gastrulation. Cell. 76 (6), 1075-1089 (1994).
  30. Kerridge, S., et al. Modular activation of Rho1 by GPCR signalling imparts polarized myosin II activation during morphogenesis. Nature Cell Biology. 18 (3), 261-270 (2016).
  31. Kölsch, V., Seher, T., Fernandez-Ballester, G. J., Serrano, L., Leptin, M. Control of Drosophila gastrulation by apical localization of adherens junctions and RhoGEF2. Science. 315 (5810), 384-386 (2007).
  32. Manning, A. J., Peters, K. A., Peifer, M., Rogers, S. L. Regulation of epithelial morphogenesis by the G protein-coupled receptor mist and its ligand fog. Science Signaling. 6 (301), (2013).
  33. Parks, S., Wieschaus, E. The Drosophila gastrulation gene concertina encodes a G alpha-like protein. Cell. 64 (2), 447-458 (1991).
  34. Barrett, K., Leptin, M., Settleman, J. The Rho GTPase and a putative RhoGEF mediate a signaling pathway for the cell shape changes in Drosophila gastrulation. Cell. 91 (7), 905-915 (1997).
  35. Dawes-Hoang, R. E., et al. Folded gastrulation, cell shape change and the control of myosin localization. Development. 132 (18), 4165-4178 (2005).
  36. Häcker, U., Perrimon, N. DRhoGEF2 encodes a member of the Dbl family of oncogenes and controls cell shape changes during gastrulation in Drosophila. Genes & Development. 12 (2), 274-284 (1998).
  37. Martin, A. C., Kaschube, M., Wieschaus, E. F. Pulsed contractions of an actin-myosin network drive apical constriction. Nature. 457 (7228), 495-499 (2009).
  38. Mason, F. M., Tworoger, M., Martin, A. C. Apical domain polarization localizes actin-myosin activity to drive ratchet-like apical constriction. Nature Cell Biology. 15 (8), 926-936 (2013).
  39. Nikolaidou, K. K., Barrett, K. A Rho GTPase signaling pathway is used reiteratively in epithelial folding and potentially selects the outcome of Rho activation. Current Biology. 14 (20), 1822-1826 (2004).
  40. Martin, A. C., Gelbart, M., Fernandez-Gonzalez, R., Kaschube, M., Wieschaus, E. F. Integration of contractile forces during tissue invagination. The Journal of Cell Biology. 188 (5), 735-749 (2010).
  41. Guo, H., Swan, M., He, B. Optogenetic inhibition of actomyosin reveals mechanical bistability of the mesoderm epithelium during Drosophila mesoderm invagination. eLife. 11, e69082 (2022).
  42. Sebti, S. M., Der, C. J. Searching for the elusive targets of farnesyltransferase inhibitors. Nature Reviews. Cancer. 3 (12), 945-951 (2003).
  43. Roberts, P. J., et al. Rho family GTPase modification and dependence on CAAX motif-signaled posttranslational modification. The Journal of Biological Chemistry. 283 (37), 25150-25163 (2008).
  44. Feig, L. A., Cooper, G. M. Inhibition of NIH 3T3 cell proliferation by a mutant ras protein with preferential affinity for GDP. Molecular and Cellular Biology. 8 (8), 3235-3243 (1988).
  45. Liu, H., et al. Photoexcited CRY2 interacts with CIB1 to regulate transcription and floral initiation in Arabidopsis. Science. 322 (5907), 1535-1539 (2008).
  46. Kennedy, M. J., et al. Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in living cells. Nature Methods. 7 (12), 973-975 (2010).
  47. Guglielmi, G., Barry, J. D., Huber, W., De Renzis, S. An optogenetic method to modulate cell contractility during tissue morphogenesis. Developmental Cell. 35 (5), 646-660 (2015).
  48. Izquierdo, E., Quinkler, T., De Renzis, S. Guided morphogenesis through optogenetic activation of Rho signalling during early Drosophila embryogenesis. Nature Communications. 9 (1), 2366 (2018).
  49. Hutson, M. S., et al. Forces for morphogenesis investigated with laser microsurgery and quantitative modeling. Science. 300 (5616), 145-149 (2003).
  50. Rauzi, M., Lenne, P. -F. Probing cell mechanics with subcellular laser dissection of actomyosin networks in the early developing Drosophila embryo. Methods in Molecular Biology. 1189, 209-218 (2015).
  51. Rauzi, M., Verant, P., Lecuit, T., Lenne, P. -F. Nature and anisotropy of cortical forces orienting Drosophila tissue morphogenesis. Nature Cell Biology. 10 (12), 1401-1410 (2008).
  52. Hunter, C., Wieschaus, E. Regulated expression of nullo is required for the formation of distinct apical and basal adherens junctions in the Drosophila blastoderm. The Journal of Cell Biology. 150 (2), 391-401 (2000).
  53. Oda, H., Tsukita, S. Real-time imaging of cell-cell adherens junctions reveals that Drosophila mesoderm invagination begins with two phases of apical constriction of cells. Journal of Cell Science. 114, 493-501 (2001).
  54. Munjal, A., Philippe, J. -M., Munro, E., Lecuit, T. A self-organized biomechanical network drives shape changes during tissue morphogenesis. Nature. 524 (7565), 351-355 (2015).
  55. Rørth, P. Gal4 in the Drosophila female germline. Mechanisms of Development. 78 (1-2), 113-118 (1998).
  56. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  57. Magie, C. R., Meyer, M. R., Gorsuch, M. S., Parkhurst, S. M. Mutations in the Rho1 small GTPase disrupt morphogenesis and segmentation during early Drosophila development. Development. 126 (23), 5353-5364 (1999).
  58. Rich, A., Fehon, R. G., Glotzer, M. Rho1 activation recapitulates early gastrulation events in the ventral, but not dorsal, epithelium of Drosophila embryos. eLife. 9, e56893 (2020).
  59. Herrera-Perez, R. M., Cupo, C., Allan, C., Lin, A., Kasza, K. E. Using optogenetics to link myosin patterns to contractile cell behaviors during convergent extension. Biophysical Journal. 120 (19), 4214-4229 (2021).

Tags

علم الأحياء التنموي ، العدد 194 ، علم البصريات الوراثي ، ميكانيكا الأنسجة ، Rho1 ، أكتوميوسين ، الاجتثاث بالليزر ، انقباض قمي ، المعدة
تثبيط البصريات الوراثية لانقباض أكتوميوسين بوساطة Rho1 إلى جانب قياس التوتر الظهاري في أجنة <em>ذبابة الفاكهة</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Guo, H., Swan, M., He, B.… More

Guo, H., Swan, M., He, B. Optogenetic Inhibition of Rho1-Mediated Actomyosin Contractility Coupled with Measurement of Epithelial Tension in Drosophila Embryos. J. Vis. Exp. (194), e65314, doi:10.3791/65314 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter