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Developmental Biology

Inhibition optogénétique de la contractilité de l’actomyosine médiée par Rho1 couplée à la mesure de la tension épithéliale chez les embryons de drosophile

Published: April 14, 2023 doi: 10.3791/65314
Automatic Translation
1,2, 3, 1
1Department of Biological Sciences, Dartmouth College, 2School of Life Sciences, Westlake University, 3Department of Molecular Biology, Princeton University

Summary

La contractilité de l’actomyosine joue un rôle important dans la morphogenèse des cellules et des tissus. Cependant, il est difficile de manipuler la contractilité de l’actomyosine in vivo de manière aiguë. Ce protocole décrit un système optogénétique qui inhibe rapidement la contractilité de l’actomyosine médiée par Rho1 dans les embryons de drosophile , révélant la perte immédiate de la tension épithéliale après l’inactivation de l’actomyosine in vivo.

Abstract

Les forces contractiles générées par l’actine et la myosine II non musculaire (« contractilité de l’actomyosine ») sont essentielles pour les changements morphologiques des cellules et des tissus à plusieurs échelles de longueur, telles que la division cellulaire, la migration cellulaire, le repliement épithélial et la morphogenèse ramifiée. Une compréhension approfondie du rôle de la contractilité de l’actomyosine dans la morphogenèse nécessite des approches qui permettent l’inactivation rapide de l’actomyosine, ce qui est difficile à réaliser avec les approches génétiques ou pharmacologiques conventionnelles. Le protocole présenté démontre l’utilisation d’un système de dimérisation optogénétique basé sur CRY2-CIBN, Opto-Rho1DN, pour inhiber la contractilité de l’actomyosine dans les embryons de drosophile avec des contrôles temporels et spatiaux précis. Dans ce système, CRY2 est fusionné à la forme négative dominante de Rho1 (Rho1DN), tandis que CIBN est ancré à la membrane plasmique. La dimérisation médiée par la lumière bleue de CRY2 et de CIBN entraîne une translocation rapide de Rho1DN du cytoplasme à la membrane plasmique, où il inactive l’actomyosine en inhibant Rho1 endogène. De plus, cet article présente un protocole détaillé pour le couplage de l’inactivation de l’actomyosine médiée par l’Opto-Rho1DN avec l’ablation au laser afin d’étudier le rôle de l’actomyosine dans la génération de tension épithéliale lors de la formation du sillon ventral chez la drosophile . Ce protocole peut être appliqué à de nombreux autres processus morphologiques qui impliquent la contractilité de l’actomyosine chez les embryons de drosophile avec des modifications minimales. Dans l’ensemble, cet outil optogénétique est une approche puissante pour disséquer la fonction de contractilité de l’actomyosine dans le contrôle de la mécanique tissulaire lors du remodelage tissulaire dynamique.

Introduction

La contractilité de l’actomyosine, la force contractile exercée par la myosine II non musculaire (ci-après « myosine ») sur le réseau F-actine, est l’une des forces les plus importantes dans la modification de la forme cellulaire et la morphogenèse au niveau tissulaire 1,2. Par exemple, l’activation de la contractilité de l’actomyosine au niveau du domaine apical des cellules épithéliales entraîne une constriction apicale, ce qui facilite divers processus morphogénétiques, notamment le repliement épithélial, l’extrusion cellulaire, la délamination et la cicatrisation des plaies 3,4,5,6,7 . L’activation de la myosine nécessite la phosphorylation de sa chaîne légère régulatrice. Cette modification atténue la conformation inhibitrice des molécules de myosine, leur permettant de former des faisceaux de filaments de myosine bipolaires avec plusieurs domaines de tête aux deux extrémités. Les filaments bipolaires de myosine entraînent le mouvement anti-parallèle des filaments d’actine et entraînent la génération de la force contractile 1,8,9.

La petite GTPase RhoA (Rho1 chez la drosophile), conservée au cours de l’évolution, joue un rôle central dans l’activation de la contractilité de l’actomyosine dans divers contextes cellulaires10,11. Rho1 fonctionne comme un commutateur bimoléculaire en se liant soit au GTP (forme active), soit au GDP (forme inactive)12. Le cycle entre Rho1 lié au GTP ou au GDP est régulé par ses protéines activatrices de la GTPase (GAPs) et ses facteurs d’échange de nucléotides de guanine (GEF)13. Les FEM ont pour fonction de faciliter l’échange de PIB contre le GTP et d’activer ainsi l’activité de Rho1. Les GAPs, quant à eux, améliorent l’activité GTPase de Rho1 et désactivent ainsi Rho1. La Rho1 activée favorise la contractilité de l’actomyosine en interagissant avec et en activant ses effecteurs en aval, la kinase associée à la Rho (Rok) et la Diaphane14. Rok induit l’activation de la myosine et la contractilité de l’actomyosine en phosphorylant la chaîne légère régulatrice de la myosine15. En outre, Rok inhibe également la phosphatase à chaîne légère régulatrice de la myosine, et favorise donc davantage l’assemblage du filament de myosine16. Rok peut également phosphoryler les kinases LIM, qui, lorsqu’elles sont activées, empêchent le désassemblage de l’actine en phosphorylant et en inhibant le facteur de dépolymérisation de l’actine, la cofiline17,18. Diaphane est un nucléateur d’actine de la famille des formines qui favorise la polymérisation de l’actine, fournissant une base pour que la myosine interagisse avec 19,20,21.

Alors que les mécanismes cellulaires qui activent la contractilité de l’actomyosine ont été bien élucés, notre compréhension de sa fonction dans la régulation du remodelage dynamique des tissus reste incomplète. Pour combler cette lacune dans les connaissances, il faut des approches capables d’inactiver rapidement l’actomyosine dans des régions tissulaires spécifiques in vivo et d’enregistrer l’impact immédiat sur le comportement et les propriétés des tissus. Ce protocole décrit l’utilisation d’une approche optogénétique pour inhiber de manière aiguë la contractilité de l’actomyosine lors de l’invagination du mésoderme de la drosophile, suivie d’une mesure de la tension épithéliale par ablation laser. Au cours de la gastrulation de la drosophile, les cellules précurseurs du mésoderme localisées ventralement subissent une constriction apicale et s’invaginent à partir de la surface de l’embryon en formant un sillon orienté antéro-postérieur22,23. La formation des sillons ventraux a longtemps servi de modèle pour étudier le mécanisme du repliement épithélial. La formation du sillon ventral est administrée par le système de structuration dorsale-ventrale chez la drosophile24,25,26,27. L’expression de deux facteurs de transcription, Twist et Snail, situés sur la face ventrale de l’embryon, contrôle la formation du sillon ventral et spécifie le devenir des cellules mésodermiques28. Twist et Snail activent le recrutement du Rho1 GEF RhoGEF2 à l’apex des cellules précurseurs du mésoderme via une voie de récepteur couplé à la protéine G et une protéine adaptatrice RhoGEF2, T48 29,30,31,32,33. Ensuite, RhoGEF2 active la myosine sur toute la surface apicale du mésoderme potentiel par la voie de la kinase Rho-Rho 34,35,36,37,38,39. La myosine activée forme un réseau d’actomyosine supracellulaire sur toute la surface apicale du primordium du mésoderme, dont les contractions entraînent une constriction apicale et entraînent une augmentation rapide de la tension du tissu apical 14,37,40.

L’outil optogénétique décrit dans ce protocole, Opto-Rho1DN, inhibe la contractilité de l’actomyosine par le recrutement par membrane plasmique dépendante de la lumière bleue d’une forme négative dominante de Rho1 (Rho1DN)41. Une mutation T19N dans Rho1DN élimine la capacité de la protéine mutante à échanger du GDP contre du GTP et rend ainsi la protéine perpétuellement inactive34. Une mutation subséquente de Rho1DN, C189Y, élimine sa membrane naïve ciblant le signal42,43. Lorsque Rho1DN est perfusé à la membrane plasmique, il se lie aux GEF Rho1 et les retient aussi, bloquant ainsi l’activation de Rho1 ainsi que l’activation médiée par Rho1 de la myosine et de l’actine34,44. Le recrutement de Rho1DN par membrane plasmique est réalisé grâce à un module de dimérisation dépendant de la lumière dérivé de Cryptochrome 2 et de son partenaire de liaison CIB1. Le cryptochrome 2 est un photorécepteur du cryptochrome activé par la lumière bleue chez Arabidopsis thaliana45. Le cryptochrome 2 se lie à CIB1, une protéine basique hélice-boucle-hélice, uniquement dans son état photoexcité45. Il a été constaté plus tard que la région d’homologie de la photolyase (PHR) N-terminale conservée du cryptochrome 2 (CRY2PHR, ci-après dénommée CRY2) et le domaine N-terminal (aa 1-170) de CIB1 (ci-après CIBN) sont importants pour la dimérisation induite par la lumière46. Opto-Rho1DN contient deux composants. Le premier composant est la protéine CIBN fusionnée avec une ancre CAAX, qui localise la protéine dans la membrane plasmique47. Le deuxième composant est le CRY2 marqué mCherry fusionné avec Rho1DN41. En l’absence de lumière bleue, CRY2-Rho1DN reste dans le cytoplasme. Lors de la stimulation par la lumière bleue, CRY2-Rho1DN est ciblé sur la membrane plasmique grâce à l’interaction entre le CIBN ancré dans la membrane et le CRY2 excité. L’Opto-Rho1DN peut être activé par la lumière ultraviolette A (UVA) et la lumière bleue (400-500 nm, pic d’activation à 450-488 nm), ou par un laser pulsé de 830-980 nm lors de la stimulation à deux photons41,46,47,48. Par conséquent, l’Opto-Rho1DN est stimulé par des longueurs d’onde normalement utilisées pour exciter la GFP (488 nm pour l’imagerie à photon unique et 920 nm pour l’imagerie à deux photons). En revanche, les longueurs d’onde couramment utilisées pour exciter mCherry (561 nm pour l’imagerie à photon unique et 1 040 nm pour l’imagerie à deux photons) ne stimulent pas le module optogénétique et peuvent donc être utilisées pour l’imagerie de pré-stimulation. Le protocole décrit les approches utilisées pour minimiser le risque de stimulation non désirée lors de la manipulation de l’échantillon.

L’ablation au laser a été largement utilisée pour détecter et mesurer la tension dans les cellules et les tissus49. Des études antérieures ont montré que, lorsque l’intensité du laser est correctement contrôlée, l’ablation au laser à deux photons utilisant un laser femtoseconde proche infrarouge peut altérer physiquement certaines structures subcellulaires (par exemple, les réseaux corticaux d’actomyosine) sans provoquer d’extase de la membrane plasmique50,51. Si le tissu est sous tension, l’ablation au laser d’une région d’intérêt à l’intérieur du tissu entraîne un recul immédiat vers l’extérieur des cellules adjacentes à la région ablatée. La vitesse de recul est fonction de l’amplitude de la tension et de la viscosité du milieu (cytoplasme) entourant les structures subissant le recul49. En raison de la profondeur de pénétration supérieure des lasers dans le proche infrarouge et de la capacité à réaliser une ablation focale bien confinée, l’ablation laser à deux photons est particulièrement utile pour détecter la tension tissulaire in vivo. Comme démontré dans ce protocole, cette méthode peut être facilement combinée avec l’inactivation de la contractilité de l’actomyosine médiée par Opto-Rho1DN pour étudier l’impact direct de la contractilité cellulaire dépendante de Rho1 sur la mécanique tissulaire lors du remodelage dynamique des tissus.

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Protocol

1. Mise en place du croisement génétique et préparation du gobelet de collecte des ovules

  1. Sélectionner les mouches femelles (vierges) de la lignée optogénétique UASp-CIBNpm (I) ; UASp-CRY2-Rho1DN-mCherry (III) sur un tampon de CO2 sous un stéréomicroscope et mise en place d’un croisement avec des mouches mâles de la lignée maternelle GAL4 67 Sqh-mCherry ; 15 E-cadhérine-GFP.
    NOTE : Les 67 et 15 représentent la tubuline maternelle-GAL4 insérée dans les deuxième (II) et troisième (III) chromosomes, respectivement52. La lignée GAL4 utilisée dans ce protocole exprime également la chaîne légère régulatrice de myosine Sqh (courge spaghetti)37 marquée à la mCherry et l’E-cadhérine53 marquée à la GFP. Les mouches de la lignée optogénétique peuvent encore contenir des chromosomes équilibreurs FM7 et TM6. Les mouches de la lignée maternelle GAL4 peuvent encore contenir les chromosomes équilibreurs CyO et TM3.
  2. Après ~10 jours, sélectionner des mouches femelles F1 ayant le génotype suivant : UASp-CIBNpm/+ ; 67 m² Cerisier/+ ; 15 E-cadhérine-GFP/UASp-CRY2-Rho1DN-mCherry. Installez un gobelet de collecte d’œufs avec les mouches mâles.
    1. Assurez-vous que les mouches femelles avec le bon génotype ne contiennent pas de chromosomes équilibrants (c’est-à-dire qu’elles ne doivent pas contenir d’ailes bouclées [Cy], de poils courts [Sb], d’yeux en forme de barre ou de rein [B] ou de poils extra-huméraux [Hu]), qui sont des marqueurs pour les équilibreurs CyO, TM3, FM7 et TM6 utilisés dans la génération des stocks, respectivement. Couvrez la tasse d’une assiette de jus de pomme avec une teinte de pâte de levure fraîche sur la surface.
      REMARQUE : Chez les femelles F1, les composantes optogénétiques sont exprimées par la mère. Par conséquent, les femelles F1 utilisées pour la mise en place de la coupe n’ont pas besoin d’être vierges. Il est recommandé d’utiliser des mouches mâles de la même population F1 pour la coupe pour plus de commodité.
  3. Conservez le gobelet dans une boîte en carton recouverte de papier d’aluminium pour éviter toute fuite de lumière de l’environnement. Changez l’assiette de jus de pomme tous les jours pour les tasses conservées à température ambiante (~21-23 °C), ou tous les deux jours pour les tasses conservées à 18 °C.
    1. Immédiatement avant de changer la plaque, frappez la tasse sur une surface plane (par exemple, sur la paillasse) pour garder les mouches au fond de la tasse et les empêcher de s’échapper. Changez l’assiette de jus de pomme dans une pièce sombre et utilisez une lampe frontale à lumière rouge pour l’éclairage (voir le tableau des matériaux).
      REMARQUE : Pour augmenter l’expression des constructions qui sont sous le contrôle de la tubuline maternelle-GAL4 et de l’UASp, il est recommandé de conserver la coupe à 18 °C pendant au moins 3 jours avant le prélèvement d’embryons. Cette période d’incubation permet également aux mouches de s’adapter à la tasse et d’être bien nourries avec la pâte de levure pour obtenir une production optimale d’œufs.

2. Prélèvement d’embryons au stade souhaité et préparation à la stimulation optogénétique

REMARQUE : Toutes les étapes de prélèvement et de préparation des échantillons doivent être effectuées dans une pièce sombre, en utilisant une « lumière sûre » (p. ex., une lumière rouge) pour l’éclairage. Les composants optogénétiques sont extrêmement sensibles à la lumière ambiante. Même la moindre exposition à la lumière ambiante entraîne une stimulation prématurée de l’échantillon. En règle générale, les lumières de la gamme vert-rouge (>532 nm) ne provoquent pas de stimulation indésirable.

  1. Pour le prélèvement d’embryons au début de l’embryogenèse, placer une nouvelle assiette de jus de pomme sur la tasse 8 à 16 h avant le prélèvement d’embryons (à 18 °C).
  2. Au moment du prélèvement d’embryons, changez l’assiette de jus de pomme. Étiquetez la plaque retirée de la tasse et recouvrez la surface de la plaque d’une fine couche d’huile halocarbonée 27 (voir le tableau des matériaux). Attendez 30 à 60 s pour que la coquille d’œuf devienne transparente.
  3. Placez un bouclier en plastique rouge orangé (voir le tableau des matériaux) sur la scène d’un stéréoscope vertical. Le placement du bouclier orange-rouge empêche toute stimulation indésirable lors de l’éclairage de l’échantillon en bloquant les longueurs d’onde bleu-vert de la lumière transmise.
    REMARQUE : Dans ce protocole, un stéréoscope vertical est utilisé pour le prélèvement d’embryons (voir le tableau des matériaux).
  4. Placez l’assiette de jus de pomme sur le bouclier rouge orangé. Allumez la lumière transmise du stéréomicroscope pour éclairer l’échantillon. Prélever 5 à 15 embryons au stade approprié dans l’assiette de jus de pomme à l’aide d’une pince à épiler. Ne pressez pas les embryons avec la pince à épiler.
    REMARQUE : Dans ce protocole, l’embryon approprié doit être au stade de cellularisation précoce-moyen. À ce stade, l’embryon doit avoir un vitellus opaque foncé entouré d’une couche de périplasme claire et uniforme qui contient les cellules du blastoderme en formation. Le bord d’attaque des sillons de clivage (« front de cellularisation »), qui se présente sous la forme d’une ligne continue parallèle à la surface de l’embryon, ne doit pas dépasser la moitié de la profondeur du périplasme.
  5. Épongez doucement les embryons sur un morceau d’essuie-tout (~1,5 cm × 1,5 cm) pour éliminer l’excès d’huile des embryons à l’aide de la pince à épiler.
  6. Ajouter quelques gouttes d’eau de Javel à 40 % fraîchement préparée (~3 % d’hypochlorite de sodium ; voir le tableau des matériaux) à un nouveau petit morceau carré d’essuie-tout (~1,5 cm × 1,5 cm) à l’aide d’une pipette de transfert en plastique afin que l’essuie-tout soit recouvert d’une fine couche d’eau de Javel. Transférez l’embryon de l’essuie-tout sec à l’essuie-tout imbibé d’eau de Javel à l’aide de la pince à épiler et assurez-vous que les embryons sont imbibés d’eau de Javel. Attendez 2 à 4 minutes pour que l’embryon se détache.
  7. Après la déchorionation, utilisez la pince à épiler pour éponger l’essuie-tout carré sur un grand morceau de papier de soie afin d’enlever l’excès d’eau de Javel. Assurez-vous que le côté avec les embryons est orienté vers le haut.
  8. Pour rincer les embryons, utilisez la pince à épiler pour tremper doucement l’essuie-tout carré dans une goutte d’eau déminéralisée et épongez-la rapidement sur un grand morceau de papier de soie. Répétez ce processus huit fois pour vous assurer d’éliminer tout résidu d’eau de Javel.
  9. À l’aide d’un outil à cils, transférez l’embryon de l’essuie-tout dans une boîte à fond en verre de 35 mm (voir le tableau des matériaux). Ajoutez de l’eau déminéralisée dans le plat pour recouvrir entièrement les embryons. Ajustez la position et l’orientation des embryons à l’aide de l’outil cils.
    REMARQUE : Après la déchorionation, l’embryon a tendance à coller à la surface du verre et est immobile sans perturbation, il n’est donc pas nécessaire d’appliquer un traitement supplémentaire (comme de la colle) pour immobiliser l’embryon sur la boîte à fond en verre.
  10. Placez la boîte à fond en verre de 35 mm avec les embryons dans une boîte noire étanche à la lumière (voir tableau des matériaux) pour protéger l’échantillon de l’exposition à la lumière pendant le processus de transfert. Apportez la boîte dans la pièce avec le microscope multiphotonique.

3. Stimulation optogénétique, ablation au laser et imagerie de l’embryon

NOTE : Le système multiphotonique utilisé dans cette expérience (voir le tableau des matériaux) est capable d’imagerie simultanée à deux longueurs d’onde. Il contient également une unité de photostimulation avec un laser de 458 nm et un scanner galvanomètre séparé, permettant la photo-activation/stimulation dans une région d’intérêt définie (ROI). Il convient de noter que le laser de 920 nm, qui est utilisé pour exciter les protéines fluorescentes vert-jaune, stimulera l’Opto-Rho1DN, bien que plus lentement que la stimulation médiée par le laser bleu.

  1. Couvrez le microscope multiphotonique d’un chiffon noir résistant à la lumière (voir le tableau des matériaux) pour éviter toute stimulation indésirable des embryons lors de la configuration de l’échantillon et de l’imagerie.
    REMARQUE : La même approche est utilisée lors de l’imagerie multiphotonique régulière pour protéger les détecteurs sensibles à la lumière équipés sur le microscope.
  2. Éteignez la lumière de la pièce et les écrans d’ordinateur. Éteignez le contrôleur de l’écran tactile en cliquant sur OFF sous « Rétroéclairage du contrôleur de l’écran tactile » dans le logiciel. Assurez-vous qu’il n’y a pas d’autre lumière ambiante dans la pièce.
    1. Ouvrez la face avant du couvercle en tissu noir sur le microscope. Prenez la boîte à fond en verre de 35 mm de la boîte noire et placez-la sur la platine du microscope.
  3. Illuminez les embryons avec une lumière verte normalement utilisée comme lumière d’excitation pour l’épifluorescence. Pour ce faire, allumez l’unité d’éclairage par fluorescence, sélectionnez Ocular sous le panneau « Oculaire » du logiciel et changez la « Tourelle Cube » en 4 :TRITC. Utilisez l’oculaire pour identifier l’embryon d’intérêt et le mettre au point.
    REMARQUE : La visualisation de la lumière verte est obtenue en laissant passer une lumière blanche générée par l’unité d’éclairage à fluorescence à travers un cube de filtre TRITC standard intégré, qui contient un filtre d’excitation de 528 à 553 nm, un séparateur de faisceau de 565 nm et un filtre d’émission de 590 à 650 nm. D’autres lumières non bleues devraient également fonctionner correctement pour l’éclairage de l’échantillon. Il n’est pas nécessaire de porter une protection oculaire à cette étape, car la lumière d’excitation a une faible intensité et ne sera pas dirigée vers l’oculaire. L’embryon apparaîtra uniformément rouge en raison de l’autofluorescence.
  4. Fermez le couvercle en tissu noir afin que l’échantillon soit entièrement protégé de la lumière. Allumez l’écran de l’ordinateur pour accéder au logiciel qui contrôle le microscope. Changez l’oculaire en LSM dans le logiciel pour l’acquisition d’images.
  5. Effectuez l’ablation au laser sur des embryons témoins non stimulés à l’aide d’un objectif d’immersion dans l’eau 25x.
    1. Cliquez sur Bright Z, Sequence Manager et LSM Stimulation dans la « Fenêtre d’outils » du logiciel. Définissez le type de scanner sur Galvano et la taille de numérisation sur 512 × 512. Activez CH1 et CH3 dans le panneau « Réglage PMT » pour permettre l’utilisation du laser de 1 040 nm, puis cliquez sur Live × 4 pour visualiser l’embryon.
    2. Faites pivoter l’embryon à l’aide de la fonction Rotation du logiciel de manière à ce que l’axe antéro-postérieur de l’embryon soit orienté verticalement. Réglez le zoom sur 3. Dessinez une région d’intérêt (ROI) à l’aide de l’outil de forme sous « Paramètres de numérisation » et définissez la taille du ROI dans le panneau « Référence ». Définissez le retour sur investissement sur 512 pixels en largeur et 100 pixels en hauteur (171 × 33 μm2).
    3. Définissez les paramètres d’acquisition pour la pile Z de pré-ablation.
      1. Enregistrez la surface de l’embryon comme 0 sous la « section Z ». Définissez le début sur 0 et la fin sur 100 μm. Définissez la taille du pas sur 2 μm. Activez le mode d’acquisition Z en cochant Z sous l’onglet 'Série'.
      2. Réglez l’intensité du laser à 1 040 nm pour augmenter linéairement de 3 % à 7 % à l’aide de la fonction Bright Z .
      3. Enregistrez le paramètre d’imagerie actuel en tant que première tâche du pipeline en cliquant sur LSM dans « Gestionnaire de séquences ».
        REMARQUE : La pile Z de pré-ablation est obtenue pour confirmer le stade de l’embryon. Dans cette expérience, CRY2-Rho1DN-mCherry et Sqh-mCherry seront excités par le laser de 1 040 nm. Au cours de la constriction apicale, le signal Sqh-mCherry est renforcé au niveau de la région médioapicale des cellules mésodermiques ventrales, tandis que CRY2-Rho1DN-mCherry est cytosolique avant la stimulation. L’intensité laser utilisée pour l’imagerie pré et post-stimulation est déterminée empiriquement sur la base de l’équilibre entre le rapport signal/bruit optimal et l’évitement du photoblanchiment.
    4. Définissez les paramètres d’acquisition pour le film de pré-ablation.
      1. Supprimez tout retour sur investissement existant pour permettre l’imagerie de l’ensemble de la région de 512 × 512 pixels (171 × 171 μm 2, zoom 3x) près de la surface ventrale de l’embryon, comme décrit à l’étape 3.5.2. Réglez l’intensité du laser de 1 040 nm sur 3 %.
      2. Cochez la case Heure et décochez Z sous le panneau « Série ». Conservez l’intervalle en tant que FreeRun sous le panneau « Time Lapse ». Réglez le cycle sur 10.
      3. Enregistrez les paramètres actuels en tant que tâche suivante du pipeline en cliquant sur LSM dans « Gestionnaire de séquences ».
        REMARQUE : Le but de cette tâche est d’obtenir un film de pré-ablation à plan Z unique de 10 images avec un laser de 1 040 nm pour l’acquisition d’images. La vitesse d’acquisition de l’image est d’environ 1 s par image.
    5. Définissez les paramètres de l’ablation au laser.
      1. Définissez une région 3D allant immédiatement sous la membrane vitelline à ~20 μm de profondeur pour l’ablation laser (Figure 1A). Définissez le début de la pile Z comme le plan qui se trouve immédiatement sous la membrane vitelline et la fin comme étant 20 μm plus profond que le plan de départ. Définissez la taille du pas sur 1,5 μm.
        REMARQUE : Le retour sur investissement de la région ablée est de ~30 pixels en largeur et ~10 pixela en hauteur (~10 μm le long de l’axe médial-latéral et ~3,3 μm le long de l’axe A-P). Le but de l’ablation de l’échantillon à plusieurs plans Z est de s’assurer que la surface apicale des cellules ventrales est ablatée. Ceci est particulièrement important pour les embryons stimulés, car les cellules ventrales subissent une relaxation apicale rapide après l’inhibition de Rho1.
      2. Activez CH2 et CH4 sous le panneau « Réglage PMT » pour permettre l’utilisation du laser 920 nm. Réglez l’intensité du laser 920 nm sur 30 %. Réglez l’acquisition d’images avec le laser 920 nm pour une seule pile Z dans la région 3D définie à l’étape 3.5.5.1 pour l’ablation laser.
        REMARQUE : L’intensité du laser choisie dans cette étape est suffisante pour l’ablation du tissu (comme indiqué par le recul du tissu immédiatement après le traitement au laser) mais n’endommage pas évidemment la membrane plasmique (comme indiqué par l’absence de marques de brûlure sur la membrane cellulaire) (Figure 1B,C).
      3. Enregistrez le paramètre actuel en tant que tâche suivante du pipeline en cliquant sur LSM dans « Gestionnaire de séquences ».
    6. Définissez les paramètres d’acquisition pour le film post-ablation.
      1. Réglez l’acquisition d’images pour un film post-ablation à plan Z unique de 100 images à l’aide des lasers de 1 040 nm et de 920 nm. Réglez l’intensité du laser de 1 040 nm et du laser de 920 nm sur 3 % et 0,3 %, respectivement. La région spécifiée à l’étape 3.5.4 sera imagée avec une vitesse d’acquisition d’image identique.
      2. Enregistrez le paramètre actuel en tant que tâche suivante du pipeline en cliquant sur LSM dans « Gestionnaire de séquences ».
        REMARQUE : L’objectif de l’enregistrement des paramètres décrits aux étapes 3.5.3 à 3.5.6 en tant que tâches séquentielles dans le « Gestionnaire de séquences » avant toute acquisition réelle est d’assurer la capture de la réponse tissulaire immédiate après l’ablation au laser.
    7. Sélectionnez Séquence sous « Acquérir ». Modifiez le chemin d’enregistrement des données et le nom du fichier selon vos besoins. Cliquez sur Prêt et attendez que le logiciel initialise le pipeline. Cliquez ensuite sur Démarrer pour exécuter le pipeline.
  6. Effectuer l’ablation au laser dans les embryons stimulés.
    1. Définissez les paramètres d’acquisition de la pile Z de pré-ablation, comme décrit aux étapes 3.5.1 à 3.5.3. Enregistrez le paramètre actuel en tant que première tâche du pipeline en cliquant sur LSM dans « Gestionnaire de séquences ».
    2. Définissez les paramètres de la stimulation optogénétique dans le cadre d’un retour sur investissement défini.
      1. Changez le zoom sur 1 et sélectionnez un ROI qui couvre la surface ventrale de l’embryon (~512 × 300 μm2). Éteignez les détecteurs CH1-CH4 .
      2. Cliquez sur Stimulation LSM. Décochez la case Continu dans Durée et tapez 12 s. Vérifiez les 458 nm avec une intensité laser de 0,3 %.
      3. Enregistrez le paramètre actuel en tant que tâche suivante du pipeline en cliquant sur Stimulation dans « Gestionnaire de séquences ».
        REMARQUE : Une stimulation plus rapide peut être obtenue en augmentant l’intensité du laser de 458 nm. Cependant, lors de l’utilisation d’intensités laser plus élevées, la lumière laser diffusée peut stimuler la région adjacente au ROI, ce qui n’est pas idéal si une stimulation spatialement confinée est requise.
    3. Fixez un temps d’attente de 3 min après la stimulation pour assurer l’inactivation totale de la myosine et le désassemblage de la F-actine apicale, et pour obtenir une morphologie tissulaire statique avant l’ablation au laser. Pour ce faire, cliquez sur Attendre /Pause sous « Gestionnaire de séquences » et réglez le temps souhaité pour « Attendre ».
      REMARQUE : Le recrutement de CRY2-Rho1DN-mCherry sur la membrane causé par un seul cycle de stimulation (laser à 0,3 % 458 nm pendant 12 s) est clairement détectable 10 à 15 min après la stimulation. Ceci est en accord avec la mi-temps de dissociation publiée de ~9 min47.
    4. Définissez les paramètres d’acquisition pour le film de pré-ablation à plan Z unique, comme décrit à l’étape 3.5.4, sauf que les lasers de 1 040 nm et de 920 nm sont utilisés pour l’acquisition d’images. Allumez les détecteurs CH1-CH4 . Réglez l’intensité du laser de 1 040 nm et du laser de 920 nm sur 3 % et 0,3 %, respectivement. Enregistrez le paramètre actuel en tant que tâche suivante du pipeline en cliquant sur LSM dans « Gestionnaire de séquences ».
    5. Définissez les paramètres de l’ablation laser, comme décrit à l’étape 3.5.5. Enregistrez le paramètre actuel en tant que tâche suivante du pipeline en cliquant sur LSM dans « Gestionnaire de séquences ».
    6. Définissez les paramètres d’acquisition pour le film post-ablation à plan Z unique, comme décrit à l’étape 3.5.6. Enregistrez le paramètre actuel en tant que tâche suivante du pipeline en cliquant sur LSM dans « Gestionnaire de séquences ».
    7. Sélectionnez Séquence sous « Acquérir ». Modifiez le chemin d’enregistrement des données et le nom du fichier selon vos besoins. Cliquez sur Prêt et attendez que le logiciel initialise le pipeline. Cliquez ensuite sur Démarrer pour exécuter le pipeline.

4. Quantification du taux de recul des tissus après l’ablation au laser

  1. Ouvrez le film post-ablation dans ImageJ.
  2. Dessinez un petit ROI le long de la ligne médiane ventrale qui couvre la région ablée à l’aide de l’outil Sélection rectangulaire . La largeur du retour sur investissement est de neuf pixels. La hauteur du retour sur investissement est réglée de manière à ce que le retour sur investissement soit suffisamment grand pour couvrir toute la gamme de recul des tissus après l’ablation au laser.
    1. Cliquez sur Dupliquer sous l’onglet « Image ». Dans la fenêtre contextuelle, cochez la case Dupliquer la pile, puis cliquez sur OK pour dupliquer la pile dans le ROI sélectionné.
  3. Générez un montage à partir de la pile dupliquée à l’aide de l’option Piles d’images > > Créer un montage. Dans la fenêtre contextuelle, définissez le numéro de ligne sur 1 et le numéro de colonne sur le nombre total d’images dans la pile (100 dans ce cas).
  4. Mesurez la largeur A-P de la région ablée au fil du temps à partir du montage généré.
    1. Utilisez l’outil Multipoint d’ImageJ pour délimiter les limites A-P de la région ablée pour chaque point temporel du montage.
    2. Enregistrez les coordonnées des points marqués à l’aide de l’option Fichier > Enregistrer sous > Coordonnées XY.
    3. Importez les coordonnées XY mesurées dans MATLAB. Calculez la largeur A-P de la région ablée pour chaque point temporel en soustrayant la coordonnée Y de la limite supérieure de la coordonnée Y de la limite inférieure.
  5. Déterminez le taux de recul des tissus en ajustant les 20 premières secondes de la courbe « largeur dans le temps » dans une ligne à l’aide de la fonction « polyfit » de MATLAB. Indiquez la pente de la ligne ajustée comme le taux de recul des tissus.
  6. Effectuer des tests statistiques pour comparer le taux de recul tissulaire entre les échantillons stimulés et non stimulés.
    REMARQUE : Il est recommandé d’obtenir des données d’au moins cinq embryons par condition. Le test bilatéral de Wilcoxon et le test t bilatéral de Student peuvent être utilisés à des fins de comparaison statistique.

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Representative Results

Chez les embryons non stimulés subissant une constriction apicale, Sqh-mCherry s’est enrichi au niveau de la région médioapicale des cellules mésodermiques ventrales, tandis que CRY2-Rho1DN-mCherry était cytosolique (Figure 1A). L’ablation au laser dans le domaine de constriction a conduit à un recul rapide des tissus le long de l’axe A-P (Figure 1B,C). Dans les embryons stimulés, le signal CRY2-Rho1DN-mCherry est devenu localisé dans la membrane plasmique, tandis que le signal médiopapic de Sqh-mCherry a complètement disparu (Figure 1A). L’ablation au laser dans les embryons stimulés n’a pas entraîné de recul tissulaire évident, comme illustré dans les figures 1B, C et quantifié dans la figure 1D. Ces résultats indiquent que la génération de tension tissulaire nécessite une contractilité apicale active de l’actomyosine ; lorsque l’actomyosine devient inactive lors de l’inhibition de Rho1, la tension du tissu apical diminue également41. Ces observations sont cohérentes avec les résultats précédents selon lesquels l’activation de la contractilité apicale de la myosine dans les cellules mésodermiques ventrales entraîne une augmentation de la tension tissulaire à la surface ventrale de l’embryon40.

Figure 1
Figure 1 : La stimulation Opto-Rho1DN au cours de la constriction apicale entraîne une perte immédiate de la tension corticale à la surface ventrale de l’embryon. (A) Dessin animé illustrant le dispositif expérimental de l’ablation au laser pour détecter la tension corticale. Les régions ombrées en jaune indiquent les régions ablatées. Pour les embryons stimulés, l’activation par la lumière d’Opto-Rho1DN a été réalisée 3 min avant l’ablation au laser. En raison de la relaxation apicale après la stimulation, plusieurs plans z ont été ablatés (région ombrée en jaune) afin d’assurer l’ablation de la surface apicale même des cellules ventrales. (B,C) Comparaison entre les embryons non stimulés et stimulés. Aucun recul tissulaire évident n’a été observé chez les embryons stimulés (N = 6 pour les embryons non stimulés et N = 5 pour les embryons stimulés). (B) Vue de face des embryons ablatés au laser. Des cases ombrées en jaune marquent la région ablatée. (C) Kymographes représentant le changement de largeur de la région ablatée. Des pointillés jaunes indiquent le site d’ablation. (D) Changements de largeur de la région ablée le long de l’axe A-P au cours des 20 premières secondes après l’ablation laser. Un net recul tissulaire a été observé après découpe laser chez les embryons témoins non stimulés. En revanche, peu ou pas de recul tissulaire a été observé chez les embryons stimulés, ce qui indique un manque de tension apicale après l’inhibition de Rho1. La barre d’erreur est l’écart-type. La valeur de p a été calculée à l’aide d’un test de somme de rang de Wilcoxon à deux faces. Cette figure est réutilisée à partir de Guo et al.41. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Ce protocole décrivait l’utilisation combinée de l’optogénétique et de l’ablation au laser pour sonder les changements de tension tissulaire immédiatement après l’inactivation de la contractilité de l’actomyosine. L’outil optogénétique décrit ici tire parti de la forme négative dominante de Rho1 (Rho1DN) pour inhiber de manière aiguë la contractilité endogène de l’actomyosine dépendante de Rho1 et de Rho1. La caractérisation antérieure d’Opto-Rho1DN dans le contexte de la formation du sillon ventral de la drosophile a démontré que l’outil est très efficace pour médier l’inactivation rapide de la contractilité apicale de l’actomyosine par inactivation simultanée de la myosine et désassemblage de l’actine41. En particulier, la stimulation des embryons au moment de la constriction apicale a entraîné une réduction du signal de myosine apicale dans les 60 s dans les cellules subissant une constriction apicale41. Cette élimination rapide de la myosine corticale lors de l’inhibition de Rho1 est probablement due au cycle rapide de Rho1 et de la myosine à travers les états actifs et inactifs, causé par les activités des protéines activatrices de la GTPase (GAPs) pour les phosphatases à chaîne légère de Rho1 et de myosine, respectivement19,54. En accord avec l’impact sur l’actomyosine, le couplage de l’optogénétique avec l’ablation au laser a démontré que la stimulation de l’Opto-Rho1DN pendant la constriction apicale entraînait une perte immédiate de la tension épithéliale dans la région ventrale de l’embryon41 (Figure 1). Cette approche combinée nous a permis d’étudier la fonction de la contractilité cellulaire médiée par Rho1 dans la régulation de la mécanique tissulaire avec une précision spatiale et temporelle sans précédent, ce qui nous a permis de disséquer les impacts immédiats des effets à long terme difficiles à obtenir avec les approches génétiques conventionnelles.

Une considération technique importante lors de l’utilisation d’Opto-Rho1DN est que l’outil est très sensible à la lumière ambiante. Un problème fréquemment rencontré dans l’expérience est le recrutement de CRY2-mCherry-Rho1DN dans la membrane plasmique avant l’étape de stimulation, qui est généralement causé par une stimulation prématurée de l’échantillon au cours de l’une des étapes suivantes : préparation de l’échantillon, transfert de l’échantillon dans la salle du microscope, positionnement de l’échantillon sur la platine du microscope et acquisition d’images de pré-stimulation. Dans notre protocole, plusieurs procédures sont utilisées pour éviter toute stimulation indésirable, notamment la manipulation des ventouses et des embryons dans une pièce sombre sous lumière rouge, le filtrage des longueurs d’onde bleues de la lumière d’éclairage lors de la sélection et du montage des embryons sous le stéréomicroscope, et l’évitement de l’exposition des embryons à un laser de 400 à 500 nm (excitation à un photon) ou à un laser pulsé de 830 à 980 nm (excitation multiphotonique) avant la stimulation. Il est essentiel de pratiquer une attention particulière à plusieurs étapes de l’expérience afin d’éviter toute stimulation indésirable de l’échantillon. De plus, lors de l’utilisation d’Opto-Rho1DN pour inhiber Rho1 dans une région d’intérêt spécifique (ROI) de l’embryon41, il est recommandé d’utiliser l’intensité laser la plus faible qui peut obtenir une translocation robuste de CRY2-Rho1DN vers la membrane plasmique. Parce que l’Opto-Rho1DN est extrêmement sensible aux longueurs d’onde bleues, un laser bleu de haute intensité peut entraîner une stimulation indésirable dans les cellules en dehors du ROI ou même des embryons voisins en raison de la lumière diffusée.

Dans sa version actuelle, l’outil Opto-Rho1DN présente plusieurs limitations. Tout d’abord, pour les expériences décrites dans ce protocole, une ancre CIBN localisée dans la membrane plasmique a été utilisée pour recruter CRY2-Rho1DN activé du cytosol à la membrane plasmique41,47. De par cette conception, il est difficile d’effectuer une inhibition confinée de Rho1 dans un domaine spécifique de la membrane plasmique en raison de la diffusion des protéines CRY2-Rho1DN activées dans le cytosol. L’amélioration de la précision spatiale à l’échelle subcellulaire attend le développement de nouveaux ancrages CIBN qui ont des modèles de localisation subcellulaire plus spécifiques. Deuxièmement, Opto-Rho1DN est conçu pour inhiber Rho1 au cours de l’embryogenèse précoce. L’expression de CIBNpm et de CRY2-Rho1DN-mCherry est contrôlée par UASp, qui est standardisé pour l’expression dans les lignées germinales femelles 55. L’expression de ces modules dans les tissus somatiques au-delà de l’embryogenèse précoce peut nécessiter le remplacement de l’UASp par un promoteur plus efficace pour piloter l’expression somatique (par exemple, UASt56). Enfin, l’efficacité de l’Opto-Rho1DN dépend de l’abondance des protéines d’ancrage CIBN et CRY2-Rho1DN. Dans la version actuelle de l’outil, il est déterminé par la ligne de pilote GAL4 utilisée pour piloter l’expression des modules optogénétiques. Lors de l’utilisation du pilote maternel GAL4 décrit dans ce protocole, il est essentiel d’utiliser la lignée qui fournit deux copies du gène GAL4 (par exemple, 67 et 15) afin d’obtenir l’inhibition rapide et puissante de la contractilité de l’actomyosine. La réduction du nombre de copies de GAL4 maternel chez les femelles F1 de deux à une a considérablement réduit l’effet inhibiteur.

Par rapport aux approches génétiques conventionnelles, l’approche optogénétique décrite dans ce protocole est avantageuse pour disséquer le stade et la fonction tissulaire spécifique de Rho1 chez les embryons précoces de drosophile. La fonction de Rho1 dans l’embryogenèse précoce de la drosophile est en grande partie remplie par le produit génique chargé par la mère11. L’épuisement de Rho1 bloque l’ovogenèse57, empêchant l’étude de sa fonction au cours de l’embryogenèse précoce. Au cours des dernières années, plusieurs outils optogénétiques ont été développés pour réguler l’activité endogène de Rho1 chez les embryons de drosophile. Izquierdo et al. et Rich et al. ont tous deux développé des outils optogénétiques pour activer l’activité de Rho1 en régulant la localisation du domaine catalytique des GEFs Rho dans les embryons de drosophile 48,58. De plus, Herrera-Perez et al. ont développé deux outils optogénétiques utilisant soit RhoGEF2 pleine longueur (optoGEF), soit C-GAP pleine longueur (optoGAP) pour activer ou inhiber l’activité endogène de Rho1, respectivement59. Étant donné que l’optoGAP fonctionne en recrutant un GAP Rho1 sur la membrane plasmique, son application peut être sensible à la présence de GEFs Rho1 endogènes, qui peuvent compenser ou même annuler l’effet du recrutement ectopique du GAP. En revanche, en séquestrant directement les GEF Rho1, l’Opto-Rho1DN peut fournir un moyen plus robuste d’inhiber la contractilité endogène de l’actomyosine dépendante de Rho1 et de Rho1.

Compte tenu du large éventail de fonctions de Rho1 dans l’embryogenèse et le développement post-embryonnaire, le protocole présenté peut être facilement adapté pour étudier la fonction de Rho1 et des réorganisations cellulaires dépendantes de Rho1 dans un large éventail de processus morphogénétiques. En outre, une stratégie similaire peut, en principe, être utilisée pour restreindre sévèrement d’autres petites GTPases, telles que les GTPases Cdc42 et Rac de la famille Rho, car leurs formes négatives dominantes ont été largement utilisées pour inhiber la fonction endogène de ces protéines11. Enfin, comme l’illustre ce protocole, la combinaison des approches d’optogénétique et d’ablation au laser peut fournir un moyen efficace d’étudier l’impact immédiat de l’inactivation d’une protéine spécifique sur la dynamique et la mécanique tissulaires, ce qui nous apportera de nouvelles connaissances sur la morphogenèse tissulaire qui sont difficiles à découvrir à l’aide d’approches génétiques conventionnelles.

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Disclosures

Les auteurs déclarent que la recherche a été menée en l’absence de toute relation commerciale ou financière qui pourrait être interprétée comme un conflit d’intérêts potentiel.

Acknowledgments

Les auteurs remercient Ann Lavanway pour son soutien en matière d’imagerie. Les auteurs remercient le laboratoire Wieschaus et le laboratoire De Renzis pour le partage des réactifs et le Bloomington Drosophila Stock Center pour les stocks de mouches. Cette étude est soutenue par le NIGMS ESI-MIRA R35GM128745 et la subvention de recherche institutionnelle #IRG-82-003-33 de l’American Cancer Society à BH.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
35 mm glass-bottom dish MatTek P35G-1.5-10-C Used for sample preparation
60 mm × 15 mm Petri dish with lid Falcon 351007 Used for sample preparation
Black cloth for covering the microscope Online NA Used to avoid unwanted light stimulation
Clorox Ultra Germicadal Bleach (8.25% sodium hypochlorite) VWR 10028-048 Used for embryo dechorination
CO2 pad Genesee Scientific 59-114 Used for cross set-up
ddH2O NA NA Used for sample preparation
Dumont Style 5 tweezers VWR 102091-654 Used for sample preparation
Eyelash tool (made from pure red sable round brush #2) VWR 22940-834 Used for sample preparation
FluoView (Software) Olympus NA Used for image acquisition and optogenetic stimulation
Halocarbon oil 27 Sigma Aldrich H8773-100ML Used for embryo stage visualization
ImageJ/FIJI NIH NA Used for image analysis
MATLAB MathWorks NA Used for image analysis
Nikon SMZ-745 stereoscope Nikon NA Used for sample preparation
Olympus FVMPE-RS multiphoton microscope with InSight DS Dual-line Ultrafast Lasers for simultaneous dual-wavelength multiphoton imaging, , a 25x/NA1.05 water immersion objective (XLPLN25XWMP2), and an IR/VIS stimulation unit for photo-activation/stimulation. This system is also equipped with a TRITC filter (39005-BX3; AT-TRICT-REDSHFT 540/25x, 565BS, 620/60M), and a fluorescence illumination unit that emits white light. Olympus NA Used for image acquisition and optogenetic stimulation
SP Bel-Art 100-place polypropylene freezer storage box (Black, light-proof box for sample transfer) VWR 30621-392 Used to avoid unwanted light stimulation
UV Filter Shield for FM1403 Fluores (Orange-red plastic shield) Bolioptics FM14036151 Used to avoid unwanted light stimulation
VITCHELO V800 Headlamp with White and Red LED Lights Amazon NA Used to avoid unwanted light stimulation

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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Biologie du développement Numéro 194 optogénétique mécanique tissulaire Rho1 actomyosine ablation au laser constriction apicale gastrulation
Inhibition optogénétique de la contractilité de l’actomyosine médiée par Rho1 couplée à la mesure de la tension épithéliale chez les embryons de <em>drosophile</em>
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Guo, H., Swan, M., He, B.… More

Guo, H., Swan, M., He, B. Optogenetic Inhibition of Rho1-Mediated Actomyosin Contractility Coupled with Measurement of Epithelial Tension in Drosophila Embryos. J. Vis. Exp. (194), e65314, doi:10.3791/65314 (2023).

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