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Developmental Biology

ショウ ジョウバエ 胚におけるRho1を介したアクトミオシン収縮性の光遺伝学的阻害と上皮圧の測定

Published: April 14, 2023 doi: 10.3791/65314
Automatic Translation
1,2, 3, 1
1Department of Biological Sciences, Dartmouth College, 2School of Life Sciences, Westlake University, 3Department of Molecular Biology, Princeton University

Summary

アクトミオシンの収縮性は、細胞および組織の形態形成において重要な役割を果たす。しかし、 生体内で アクトミオシンの収縮性を鋭く操作することは困難である。このプロトコルは、 ショウジョウバエ 胚におけるRho1を介したアクトミオシン収縮性を迅速に阻害する光遺伝学的システムを記述し、 in vivoでのアクトミオシンの不活性化後の上皮張力の即時喪失を明らかにしています。

Abstract

アクチンおよび非筋肉ミオシンIIによって生成される収縮力(「アクトミオシン収縮性」)は、細胞分裂、細胞遊走、上皮折り畳み、分岐形態形成など、複数の長さスケールでの細胞および組織の形態学的変化にとって重要です。形態形成におけるアクトミオシン収縮性の役割を深く理解するには、従来の遺伝学的または薬理学的アプローチでは達成が困難なアクトミオシンの迅速な不活性化を可能にするアプローチが必要です。提示されたプロトコルは、CRY2-CIBNベースの光遺伝学的二量体化システムであるOpto-Rho1DNを使用して、ショ ウジョウバエ 胚のアクトミオシン収縮性を阻害し、正確な時間的および空間的制御を行うことを実証しています。このシステムでは、CRY2はドミナントネガティブ型のRho1(Rho1DN)に融合し、CIBNは原形質膜に固定されています。CRY2とCIBNの青色光を介した二量体化は、細胞質から原形質膜へのRho1DNの急速な移行をもたらし、内因性Rho1を阻害することによってアクトミオシンを不活性化します。さらに、この記事では、ショウ ジョウバエ 腹側溝形成中の上皮張力の生成におけるアクトミオシンの役割を調査するために、Opto-Rho1DNを介したアクトミオシンの不活性化とレーザーアブレーションを組み合わせるための詳細なプロトコルを紹介します。このプロトコルは、ショ ウジョウバエ 胚におけるアクトミオシン収縮性を含む他の多くの形態学的プロセスに最小限の修飾で適用することができる。全体として、この光遺伝学的ツールは、動的組織リモデリング中の組織力学の制御におけるアクトミオシン収縮性の機能を分析するための強力なアプローチです。

Introduction

アクトミオシンの収縮性は、非筋ミオシンII(以下、ミオシン)がF-アクチンネットワークに及ぼす収縮力であり、細胞の形状を変化させ、組織レベルの形態形成を促進する上で最も重要な力の1つです1,2。例えば、上皮細胞の頂端ドメインにおけるアクトミオシン収縮性の活性化は、頂端狭窄をもたらし、これは、上皮折り畳み、細胞押し出し、層間剥離、および創傷治癒を含む様々な形態形成プロセスを促進する3,4,5,6,7 .ミオシンの活性化は、その調節軽鎖のリン酸化を必要とする。この修飾は、ミオシン分子の阻害的立体配座を緩和し、それらが両端に複数のヘッドドメインを有する双極性ミオシンフィラメントバンドルを形成することを可能にする。バイポーラミオシンフィラメントは、アクチンフィラメントの反平行運動を駆動し、収縮力の生成をもたらします1,8,9。

進化的に保存されたRhoファミリーの小型GTPase RhoA(ショウジョウバエのRho1)は、さまざまな細胞状況におけるアクトミオシン収縮性の活性化において中心的な役割を果たしています10,11。Rho1は、GTP(活性型)またはGDP(不活性型)のいずれかに結合することにより、二分子スイッチとして機能します12。GTPまたはGDPに結合したRho1間の循環は、GTPアーゼ活性化タンパク質(GAP)とグアニンヌクレオチド交換因子(GEF)によって調節されています13。GEFは、GDPとGTPの交換を促進し、Rho1活性を活性化するように機能します。一方、GAPはRho1のGTPアーゼ活性を増強し、Rho1を不活性化します。活性化されたRho1は、その下流のエフェクターであるRho関連キナーゼ(Rok)およびDiaphanous14と相互作用して活性化することにより、アクトミオシンの収縮性を促進します。Rokは、ミオシン15の調節軽鎖をリン酸化することによりミオシン活性化およびアクトミオシン収縮性を誘導する。加えて、Rokはまた、ミオシン調節軽鎖ホスファターゼを阻害し、したがってミオシンフィラメント集合体をさらに促進する16。Rokはまた、LIMキナーゼをリン酸化することができ、活性化されると、アクチン解重合因子コフィリン17,18をリン酸化および阻害することにより、アクチンの分解を防ぎます。Diaphaousは、アクチン重合を促進するホルミンファミリーアクチン核物質であり、ミオシンが19,20,21と相互作用するための塩基を提供します。

アクトミオシンの収縮性を活性化する細胞機構は十分に解明されていますが、動的組織リモデリングの制御におけるアクトミオシンの機能についての理解は未完了です。この知識のギャップを埋めるには、in vivoの特定の組織領域でアクトミオシンを迅速に不活性化し、組織の挙動と特性への即時の影響を記録できるアプローチが必要です。このプロトコルは、ショウジョウバエ中胚葉陥入中のアクトミオシン収縮性を急性に阻害するための光遺伝学的アプローチの使用と、それに続くレーザーアブレーションを使用した上皮張力の測定について説明しています。ショウジョウバエ原腸形成の間、腹側に局在する中胚葉前駆細胞は、前後向きの溝を形成することによって胚の表面から頂端狭窄を受け、陥入する22,23。腹側の溝の形成は、上皮折り畳みのメカニズムを研究するためのモデルとして長い間使用されてきました。腹側溝形成は、ショウジョウバエ24,25,26,27の背側-腹側パターンシステムによって管理されます。胚の腹側に位置する2つの転写因子、ツイストとカタツムリの発現は、腹側の溝の形成を制御し、中胚葉細胞の運命を特定します28。ツイストとカタツムリは、Gタンパク質共役受容体経路とRhoGEF2アダプタータンパク質T48を介して、中胚葉前駆細胞の頂点へのRho1 GEF RhoGEF2の動員を活性化しますT48 29,30,31,32,33.次に、RhoGEF2は、Rho−Rhoキナーゼ経路34、35、36、37、38、39を介して、潜在的な中胚葉の頂端表面全体にわたってミオシンを活性化する。活性化されたミオシンは、中胚葉原基の頂端表面全体に細胞上アクトミオシンネットワークを形成し、その収縮は頂端狭窄を引き起こし、頂端組織の張力の急速な増加をもたらす14,37,40。

このプロトコルに記載されている光遺伝学的ツールであるOpto-Rho1DNは、優性陰性のRho1(Rho1DN)41の青色光依存性原形質膜動員を介してアクトミオシン収縮性を阻害します。Rho1DNのT19N変異は、変異タンパク質がGDPをGTPと交換する能力を排除し、したがってタンパク質を永久に不活性にします34。その後のRho1DNの変異であるC189Yは、そのナイーブ膜ターゲティングシグナル42,43を排除します。Rho1DNが原形質膜に注入されると、Rho1 GEFに結合して包囲し、それによってRho1の活性化とミオシンおよびアクチンのRho1を介した活性化をブロックします34,44。Rho1DNの原形質膜動員は、クリプトクロム2とその結合パートナーであるCIB1に由来する光依存性二量体化モジュールによって達成されます。クリプトクロム2は、シロイヌナズナ45の青色光活性化クリプトクロム光受容体である。クリプトクロム2は、光励起状態でのみ、塩基性らせん-ループ-らせんタンパク質であるCIB1に結合します45。その後、クリプトクロム2(CRY2PHR、以下CRY2と呼ぶ)とCIB1(以下CIBN)のN末端ドメイン(aa 1-170)から保存されたN末端フォトリアーゼ相同性領域(PHR)が光誘起二量体化に重要であることが判明した46。Opto-Rho1DNには2つのコンポーネントが含まれています。第1の構成要素は、CAAXアンカーと融合したCIBNタンパク質であり、これは、タンパク質を原形質膜47に局在化する。2番目のコンポーネントは、Rho1DN41と融合したmCherryタグ付きCRY2です。青色光がない場合、CRY2-Rho1DNは細胞質内に残ります。青色光刺激により、CRY2-Rho1DNは、膜固定CIBNと励起CRY2との間の相互作用を介して原形質膜に標的化される。Opto-Rho1DNは、紫外線A(UVA)光と青色光(400-500 nm、450-488 nmでのピーク活性化)、または2光子刺激を行う場合は830-980 nmパルスレーザーによって活性化することができます41,46,47,48。したがって、Opto-Rho1DNは、GFPの励起に通常使用される波長(単一光子イメージングでは488 nm、2光子イメージングでは920 nm)によって刺激されます。対照的に、mCherryの励起に一般的に使用される波長(単一光子イメージングの場合は561 nm、2光子イメージングの場合は1,040 nm)は、光遺伝学的モジュールを刺激しないため、刺激前のイメージングに使用できます。このプロトコルは、サンプル操作中の不要な刺激のリスクを最小限に抑えるために使用されるアプローチを説明しています。

レーザーアブレーションは、細胞および組織における張力を検出および測定するために広く用いられている49。以前の研究では、レーザー強度が適切に制御されている場合、フェムト秒近赤外レーザーを用いた2光子レーザーアブレーションは、原形質膜の歓喜を引き起こすことなく、いくつかの細胞内構造(例えば、皮質アクトミオシンネットワーク)を物理的に損なう可能性があることが示されています50,51。組織が張力下にある場合、組織内の関心領域のレーザーアブレーションは、切除領域に隣接する細胞の即時外向きの反動をもたらす。反跳速度は、反跳49を受ける構造を取り囲む媒体(細胞質)の張力および粘度の大きさの関数である。近赤外レーザーの優れた浸透深さと十分に閉じ込められた焦点アブレーションを達成する能力のために、二光子レーザーアブレーションはin vivoでの組織張力を検出するのに特に有用です。このプロトコルで実証されているように、この方法は、Opto-Rho1DNを介したアクトミオシン収縮性の不活性化と簡単に組み合わせて、動的組織リモデリング中の組織力学に対するRho1依存性細胞収縮性の直接的な影響を調べることができます。

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Protocol

1.遺伝子交配の設定と採卵カップの準備

  1. 光遺伝学系統UASp-CIBNpm(I)から雌のハエ(処女)を選択する。実体顕微鏡下のCO2 パッド上にUASp-CRY2-Rho1DN-mCherry(III)を設置し、母方のGAL4ドライバーライン67Sqh-mCherryからのオスのハエとの交配を設置した。15 E-カドヘリン-GFP。
    注:67と15は、それぞれ2番目(II)と3番目(III)の染色体に挿入された母体チューブリン-GAL4を表します52。このプロトコルで使用されるGAL4系統は、mCherryタグ付きミオシン調節軽鎖Sqh(スパゲッティスカッシュ)37 およびGFPタグ付きE-カドヘリン53も発現します。光遺伝学的系統からのハエは、依然としてFM7およびTM6バランサー染色体を含み得る。母体のGAL4ドライバー系統からのハエは、依然としてCyOおよびTM3バランサー染色体を含む可能性があります。
  2. ~10日後、次の遺伝子型を持つF1メスのハエを選択します:UASp-CIBNpm/+;67平方mチェリー/+;15 E-カドヘリン-GFP/UASp-CRY2-Rho1DN-mCherry.オスのハエと一緒に卵収集カップを設置します。
    1. 正しい遺伝子型のメスのハエに、株の生成に使用されるCyO、TM3、FM7、およびTM6バランサーのマーカーであるバランサー染色体が含まれていないことを確認してください(つまり、巻き毛[Cy]、短い剛毛[Sb]、棒状または腎臓形の目[B]、または上腕骨余分な剛毛[Hu]を含まないようにする必要があります)。表面に新鮮なイーストペーストの色合いが付いたリンゴジュースプレートでカップを覆います。
      注:F1の女性では、光遺伝学的成分は母性に発現しています。したがって、カップのセットアップに使用されるF1の女性は処女である必要はありません。便宜上、カップには同じF1集団のオスのハエを使用することをお勧めします。
  3. 環境からの光漏れを防ぐために、カップをアルミホイルで覆われた段ボール箱に保管してください。リンゴジュースプレートは、室温(~21-23°C)に保たれたカップの場合は毎日、18°Cに保たれたカップの場合は2日ごとに交換します。
    1. プレート交換の直前に、カップを平らな面(ベンチトップなど)にたたき、ハエをカップの底に置き、ハエが逃げないようにします。暗い部屋でリンゴジュースプレートを交換し、照明に赤色光のヘッドランプを使用します( 材料表を参照)。
      注:母体チューブリン-GAL4およびUASpの制御下にあるコンストラクトの発現を増加させるために、胚採取前にカップを最低18日間3°Cに保つことをお勧めします。この潜伏期間はまた、ハエがカップに順応し、最適な卵生産を達成するためにイーストペーストを十分に供給することを可能にする。

2.所望の段階での胚の収集と光遺伝学的刺激のためのそれらの準備

注意: すべてのサンプル収集および準備手順は、照明用の「安全なライト」(赤色ライトなど)を使用して、暗い部屋で実行する必要があります。光遺伝学的成分は、周囲光に非常に敏感です。周囲光に少しでもさらされると、試料が早期に刺激されます。通常、緑〜赤の範囲(>532 nm)の光は不要な刺激を引き起こしません。

  1. 初期胚発生時に胚を採取するには、胚採取の8〜16時間前(18°C)に新しいリンゴジュースプレートをカップに置きます。
  2. 胚採取時に、リンゴジュースプレートを交換してください。カップから取り出したプレートにラベルを付け、プレートの表面をハロカーボンオイル27の薄層で覆います( 材料表を参照)。卵殻が透明になるまで30〜60秒待ちます。
  3. 直立したステレオスコープのステージにオレンジレッドのプラスチックシールド( 材料表を参照)を置きます。橙赤色のシールドの配置は、透過光から青緑色の波長を遮断することにより、サンプル照明中の望ましくない刺激を防ぎます。
    注:このプロトコルでは、胚の収集に直立ステレオスコープが使用されます( 材料表を参照)。
  4. リンゴジュースプレートをオレンジ - 赤の盾の上に置きます。実体顕微鏡の透過光をオンにして、サンプルを照らします。ピンセットを使用して、リンゴジュースプレートから適切な段階で5〜15個の胚を収集します。ピンセットで胚を絞らないでください。
    注:このプロトコルでは、適切な胚は初期中期の細胞形成段階にある必要があります。この段階の胚は、形成する胚盤葉細胞を含む透明で均一なペリプラズム層に囲まれた暗くて不透明な卵黄を有するべきである。胚の表面に平行な連続線として現れる卵割溝の前縁(「細胞化前線」)は、ペリプラズムの深さの半分を通過してはならない。
  5. ピンセットを使用して胚をペーパータオル(~1.5 cm×1.5 cm)でそっと拭き取り、胚から余分な油を取り除きます。
  6. プラスチック製のトランスファーピペットを使用して、新しい小さな正方形のペーパータオル(~1.5 cm×1.5 cm)に、新たに調製した40%漂白剤(~3%次亜塩素酸ナトリウム、 材料表を参照)を数滴加え、ペーパータオルを漂白剤の薄い層で覆います。ピンセットを使用して、乾いたペーパータオルから漂白剤に浸したペーパータオルに胚を移し、胚が漂白剤に浸されていることを確認します。胚が脱絨毛するまで2〜4分待ちます。
  7. デコリオン後、ピンセットを使用して正方形のペーパータオルを大きなティッシュペーパーに拭き取り、余分な漂白剤を取り除きます。胚のある側が上を向いていることを確認してください。
  8. 胚をすすぐには、ピンセットを使用して正方形のペーパータオルを一滴の脱イオン水にそっと浸し、大きなティッシュペーパーですばやく拭きます。このプロセスを8回繰り返して、残留漂白剤を確実に除去します。
  9. まつげツールを使用して、胚をペーパータオルから35 mmのガラス底皿に移します( 材料表を参照)。胚を完全に覆うために皿に脱イオン水を加えます。まつげツールを使用して胚の位置と向きを微調整します。
    注:脱絨毛後、胚はガラスの表面にくっつく傾向があり、摂動することなく動かないため、ガラス底皿に胚を固定するために追加の処理(接着剤など)を適用する必要はありません。
  10. 胚の入った35mmのガラス底皿を遮光ブラックボックス( 材料表を参照)の中に置き、転写プロセス中の光への暴露からサンプルを保護します。箱を多光子顕微鏡で部屋に持って行きます。

3. 光遺伝学的刺激、レーザーアブレーション、胚のイメージング

注:この実験で使用した多光子システム( 材料表を参照)は、同時2波長イメージングが可能です。また、458nmレーザーを備えた光刺激ユニットと独立したガルバノスキャナーが含まれており、定義された関心領域(ROI)内で光活性化/刺激を行うことができます。注目すべきは、緑黄色蛍光タンパク質を励起するために使用される920nmレーザーは、青色レーザーを介した刺激と比較してより遅いものの、Opto-Rho1DNを刺激することです。

  1. 多光子顕微鏡を遮光性の黒い布( 材料表を参照)で覆い、サンプルのセットアップおよびイメージング中に胚が望ましくない刺激を受けないようにします。
    注:顕微鏡に装備された感光性検出器を保護するために、通常の多光子イメージングでも同じアプローチが使用されます。
  2. 部屋の照明とコンピュータ画面をオフにします。ソフトウェアの「タッチパネルコントローラーのバックライト」の下にある OFF をクリックして、タッチパネルコントローラーの電源を切ります。部屋に他の周囲光がないことを確認してください。
    1. 顕微鏡の黒い布カバーの前面を開きます。ブラックボックスから35mmのガラス底皿を取り出し、顕微鏡ステージに置きます。
  3. 落射蛍光の励起光として通常使用される緑色の光で胚を照らします。これを行うには、蛍光照明ユニットをオンにし、ソフトウェアの「接眼」パネルで「接眼レンズ」を選択し、「キューブタレット」を4:TRITCに変更します。接眼レンズを使用して、目的の胚を識別し、焦点を合わせます。
    注:緑色光の視覚化は、蛍光照明ユニットによって生成された白色光が、528〜553nmの励起フィルター、565nmのビームスプリッター、および590〜650nmの発光フィルターを含む内蔵の標準TRITCフィルターキューブを通過させることによって実現されます。他の青色以外のライトもサンプル照明で正常に機能するはずです。励起光は強度が低く、接眼レンズに向けられないため、このステップでは目の保護具を着用する必要はありません。胚は自家蛍光のために均一に赤く見えます。
  4. 黒い布カバーを閉じて、サンプルが光から完全に保護されるようにします。コンピュータ画面の電源を入れて、顕微鏡を制御するソフトウェアにアクセスします。画像取得用のソフトウェアで「接眼レンズ」を LSM に変更します。
  5. 25倍の水浸対物レンズを使用して、対照の非刺激胚でレーザーアブレーションを実行します。
    1. ソフトウェアの「ツールウィンドウ」から明るいZ、シーケンスマネージャー、およびLSM刺激をクリックします。スキャナーの種類を Galvano に設定し、スキャン サイズを 512 × 512 に設定します。「PMT設定」パネルでCH1とCH3をオンにして1,040 nmレーザーの使用を許可し、ライブ×4をクリックして胚を視覚化します。
    2. ソフトウェアの 回転 機能を使用して胚を回転させ、胚の前後軸が垂直になるようにします。ズームを 3 に設定します。[スキャン設定]の下のシェイプツールを使用して関心領域(ROI)を描画し、[参照]パネルでROIのサイズを設定します。ROI を幅 512 ピクセル、高さ 100 ピクセル (171 × 33 μm2) に設定します。
    3. アブレーション前のZスタックの取得パラメータを設定します。
      1. 胚の表面を「Zセクション」の下に 0 として登録します。始点を 0 、終点を 100 μm に設定します。ステップサイズを 2μmに設定します。[シリーズ]タブの[Z]をチェックして、 Z 取得モードをアクティブにします。
      2. Bright Z機能を使用して、1,040nmのレーザー強度を3%から7%に直線的に増加するように設定します。
      3. [シーケンス マネージャー] で [LSM ] をクリックして、現在のイメージング設定をパイプラインの最初のタスクとして保存します。
        注:アブレーション前のZスタックは、胚の段階を確認するために得られます。この実験では、CRY2-Rho1DN-mCherryとSqh-mCherryが1,040nmレーザーによって励起されます。頂端狭窄の間、Sqh-mCherryシグナルは腹側中胚葉細胞の中頂領域で増強されますが、CRY2-Rho1DN-mCherryは刺激前に細胞質ゾルです。刺激前後のイメージングに使用されるレーザー強度は、最適な信号対雑音比と光退色の回避のバランスに基づいて経験的に決定されます。
    4. アブレーション前動画の取得パラメータを設定します。
      1. ステップ3.5.2で説明したように、既存のROIを削除して、胚の腹面近くの512×512ピクセル領域全体(171×171μm2、3倍ズーム)のイメージングを可能にします。1,040 nmのレーザー強度を3%に設定します。
      2. [時間]をチェックし、[シリーズ]パネルの下にある[Z]のチェックを外します。「タイムラプス」パネルの下の「間隔」をフリーランとして保持します。サイクルを 10 に設定します。
      3. [シーケンス マネージャー] で [LSM ] をクリックして、パイプラインの次のタスクとして現在の設定を保存します。
        注:このタスクの目的は、画像取得用の1,040nmレーザーを使用して10フレームのシングルZプレーンプリアブレーションムービーを取得することです。画像取得速度は、フレームあたり約1秒です。
    5. レーザーアブレーションのパラメータを設定します。
      1. レーザーアブレーションのために、卵子膜の直下から~20 μmの深さまでの3D領域を定義します(図1A)。Zスタックの始点をビテリン膜の直下の平面に設定し、終点を開始面より20μm深く設定します。ステップサイズを1.5μmに設定します。
        注:アブレーション領域のROIは、幅~30ピクセル、高さ~10ピクセル(内側-外側軸に沿って~10μm、A-P軸に沿って~3.3μm)です。複数のZ平面でサンプルをアブレーションする目的は、腹側細胞の頂端表面が確実にアブレーションされるようにすることです。これは、腹側細胞がRho1阻害後に急速な頂端弛緩を経験するため、刺激された胚にとって特に重要です。
      2. 「PMT設定」パネルで CH2とCH4 をオンにして、920nmレーザーの使用を許可します。 920 nmレーザーの強度を30%に設定します。レーザーアブレーションの手順3.5.5.1で定義した3D領域内の単一のZスタックに対して、920 nmレーザーによる画像取得を設定します。
        注:このステップで選択されたレーザー強度は、組織を切除するのに十分ですが(レーザー治療直後の組織の反動によって示されるように)、その間、原形質膜を明らかに損傷しません(細胞膜に火傷がないことによって示されるように)(図1B、C)。
      3. [シーケンス マネージャー] で [LSM ] をクリックして、現在の設定をパイプラインの次のタスクとして保存します。
    6. アブレーション後の動画の取得パラメータを設定します。
      1. 1,040 nmと920 nmの両方のレーザーを使用して、100フレームのシングルZ平面ポストアブレーションムービーの画像取得を設定します。1,040nmレーザーと920nmレーザーの強度をそれぞれ3%と0.3%に設定します。手順3.5.4で指定した領域は、同じ画像取得速度で画像化されます。
      2. [シーケンス マネージャー] で [LSM] をクリックして、現在の設定をパイプラインの次のタスクとして保存します。
        注:実際の取得前に、手順3.5.3〜3.5.6で説明されているパラメーターをシーケンシャルタスクとして「シーケンスマネージャー」に保存する目的は、レーザーアブレーション後の即時の組織応答を確実にキャプチャすることです。
    7. 「取得」の下の シーケンス を選択します。必要に応じて、データ保存パスとファイル名を変更します。[ 準備完了 ] をクリックし、ソフトウェアがパイプラインを初期化するのを待ちます。次に、[ 開始 ] をクリックしてパイプラインを実行します。
  6. 刺激された胚でレーザーアブレーションを行います。
    1. ステップ3.5.1-3.5.3で説明されているように、アブレーション前のZスタックの取得パラメータを設定します。[シーケンス マネージャー] で [LSM] をクリックして、パイプラインの最初のタスクとして現在の設定を保存します。
    2. 定義されたROI内で光遺伝学的刺激のパラメータを設定します。
      1. ズームを 1 に変更し、胚の腹面をカバーする ROI を選択します (~512 × 300 μm2)。 CH1-CH4 検出器をオフにします。
      2. LSM刺激をクリックします。[期間内に連続] のチェックを外し、「12 秒」と入力します。0.3%のレーザー強度で458nmを確認してください。
      3. 現在の設定をパイプラインの次のタスクとして保存するには、[シーケンス マネージャー] の [刺激 ] をクリックします。
        注:458nmのレーザー強度を上げることで、より迅速な刺激が得られる場合があります。しかしながら、より高いレーザー強度を使用する場合、散乱レーザー光はROIに隣接する領域を刺激する可能性があり、これは空間的に限定された刺激が必要な場合には理想的ではない。
    3. ミオシンの完全な不活性化と頂端F-アクチンの分解を確実にし、レーザーアブレーションの前に静的な組織形態を達成するために、刺激後の3分の待機時間を設定します。これは、「シーケンスマネージャー」の下の 「待機/一時停止 」をクリックし、「待機」の希望時間を設定することで実現されます。
      注:1回の刺激(0.3%458 nmレーザーで12秒間)によって引き起こされる膜へのCRY2-Rho1DN-mCherryの動員は、刺激の10〜15分後に明確に検出できます。これは、公表されている解離ハーフタイムの~9分47と一致しています。
    4. 1,040nmと920nmの両方のレーザーが画像取得に使用されることを除いて、手順3.5.4で説明したように、単一のZ平面プリアブレーションムービーの取得パラメータを設定します。 CH1-CH4 検出器の電源を入れます。1,040nmレーザーと920nmレーザーの強度をそれぞれ3%と0.3%に設定します。[シーケンス マネージャー] で [LSM ] をクリックして、現在の設定をパイプラインの次のタスクとして保存します。
    5. ステップ3.5.5の説明に従って、レーザーアブレーションのパラメータを設定します。[シーケンス マネージャー] で [LSM ] をクリックして、現在の設定をパイプラインの次のタスクとして保存します。
    6. 手順3.5.6で説明したように、単一のZ平面アブレーション後のムービーの取得パラメータを設定します。[シーケンス マネージャー] で [LSM ] をクリックして、現在の設定をパイプラインの次のタスクとして保存します。
    7. 「取得」の下の シーケンス を選択します。必要に応じて、データ保存パスとファイル名を変更します。[ 準備完了 ] をクリックし、ソフトウェアがパイプラインを初期化するのを待ちます。次に、[開始] をクリックしてパイプラインを実行します。

4.レーザーアブレーション後の組織反跳速度の定量化

  1. アブレーション後の動画をImageJで開きます。
  2. 矩形選択ツールを使用して、切除領域をカバーする腹側正中線に沿って小さなROIを描画します。ROI の幅は 9 ピクセルです。ROIの高さは、ROIがレーザーアブレーション後の組織反跳の全範囲をカバーするのに十分な大きさになるように設定されます。
    1. [画像]タブの[複製]をクリックします。ポップアップウィンドウで、[スタックの複製]をオンにし、[OK]をクリックして、選択したROI内にスタックを複製します。
  3. 複製されたスタックからモンタージュを生成する には、「画像スタック>スタック>モンタージュを作成」を使用します。ポップアップウィンドウで、行番号を 1 に設定し、列番号をスタック内のフレームの総数(この場合は100 )に設定します。
  4. 生成されたモンタージュから経時的にアブレーション領域のA-P幅を測定します。
    1. ImageJ の マルチポイント ツールを使用して、モンタージュ上の各時点のアブレーション領域の A-P 境界をマークします。
    2. [ ファイル] > [XY 座標として保存] を使用して、マークされたドット>座標を保存します。
    3. 測定された XY 座標を MATLAB にインポートします。下側の境界のY座標から上側の境界のY座標を減算して、各時点のアブレーション領域のA−P幅を算出する。
  5. MATLABの「ポリフィット」関数を使用して、「時間の経過に伴う幅」曲線の最初の20秒を線に当てはめることにより、組織の反動率を決定します。適合線の傾きを組織の反動率として報告します。
  6. 統計的検定を実行して、刺激されたサンプルと刺激されていないサンプルの間の組織反動の速度を比較します。
    注:条件ごとに少なくとも5つの胚からデータを取得することをお勧めします。両側ウィルコクソン順位和検定と両側スチューデントt検定の両方を統計的比較に使用できます。

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Representative Results

頂端狭窄を受けた無刺激胚では、Sqh-mCherryは腹側中胚葉細胞の中頂部で濃縮されたのに対し、CRY2-Rho1DN-mCherryは細胞質ゾルであった(図1A)。狭窄領域内でのレーザーアブレーションは、A-P軸に沿った急速な組織反動をもたらしました(図1B、C)。刺激された胚では、CRY2-Rho1DN-mCherryシグナルは原形質膜に局在するようになりましたが、Sqh-mCherryの平凰端シグナルは完全に消失しました(図1A)。刺激された胚におけるレーザーアブレーションは、図1B、Cに例示され、図1Dに定量化されたように、明らかな組織反跳をもたらさなかった。これらの結果は、組織張力の生成には活発な頂端アクトミオシン収縮性が必要であることを示しています。Rho1阻害時にアクトミオシンが不活性になると、頂端組織の緊張も減少します41。これらの観察結果は、腹側中胚葉細胞における頂端ミオシン収縮性の活性化が胚の腹側表面における組織張力の増加をもたらすという以前の知見と一致する40。

Figure 1
図1:頂端狭窄中のOpto-Rho1DN刺激は、胚の腹面で 皮質張力の即時喪失をもたらす。 (A)皮質張力を検出するためのレーザーアブレーションの実験セットアップを描いた漫画。黄色の影付きの領域は切除された領域を示します。刺激された胚については、レーザーアブレーションの3分前にOpto-Rho1DNの光活性化が行われました。刺激後の頂端弛緩のために、腹側細胞の非常に頂端表面の切除を確実にするために、複数のz平面がアブレーションされた(黄色の網掛け領域)。(B,C)無刺激胚と刺激胚の比較。刺激胚では明らかな組織反跳は観察されなかった(非刺激胚ではN = 6、刺激胚ではN = 5)。(B)レーザー切除胚の顔面図。黄色の影付きのボックスは、切除された領域を示します。(C)切除領域の幅変化を表すキモグラフ。黄色の点線はアブレーション部位を示す。(D)レーザーアブレーション後の最初の20秒間のA-P軸に沿ったアブレーション領域の幅の変化。無刺激対照胚においてレーザー切断後に明瞭な組織反跳が観察された。対照的に、刺激された胚では組織反跳がほとんどまたはまったく観察されず、Rho1阻害後の頂端張力の欠如を示しています。エラーバーは標準偏差です。 p値は、両側ウィルコクソン順位和検定を用いて計算した。この図はGuo et al.41から再利用されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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Discussion

このプロトコルは、アクトミオシン収縮性の不活性化直後の組織張力の変化をプローブするためのオプトジェネティクスとレーザーアブレーションの併用について説明しました。ここで説明する光遺伝学的ツールは、Rho1(Rho1DN)のドミナントネガティブ型を利用して、内因性Rho1およびRho1依存性アクトミオシン収縮性を急激に阻害します。ショウジョウバエ腹側溝形成の文脈におけるOpto-Rho1DNの以前の特性評価は、このツールがミオシン不活性化とアクチン分解の同時による頂端アクトミオシン収縮性の急速な不活性化を媒介するのに非常に効果的であることを示しました41。特に、頂端狭窄時の胚の刺激は、頂端狭窄を受けている細胞において60秒以内に頂端ミオシンシグナルの減少をもたらした41。Rho1阻害時の皮質ミオシンのこの急速な除去は、それぞれRho1およびミオシン軽鎖ホスファターゼに対するGTPase活性化タンパク質(GAP)の活性によって引き起こされる、活性状態および不活性状態を介したRho1およびミオシンの高速サイクルによるものと考えられます19,54。アクトミオシンへの影響と一致して、オプトジェネティクスとレーザーアブレーションを組み合わせることで、頂端狭窄中のOpto-Rho1DN刺激が胚の腹側領域で上皮張力の即時喪失をもたらすことが実証されました41(図1)。この組み合わせたアプローチにより、Rho1を介した細胞収縮性が組織力学の制御にこれまでにない空間的および時間的精度で機能を調べることができ、従来の遺伝的アプローチでは達成が困難な長期的な影響から即時の影響を分析することが可能になりました。

Opto-Rho1DNを使用する際の重要な技術的考慮事項は、ツールが周囲光に非常に敏感であることです。実験でよく遭遇する問題は、刺激ステップの前にCRY2-mCherry-Rho1DNが原形質膜に動員されることであり、これは通常、サンプル調製、顕微鏡室へのサンプル移し替え、顕微鏡ステージ上でのサンプル位置決め、および刺激前の画像取得のいずれかのステップにおけるサンプルの早期刺激によって引き起こされます。私たちのプロトコルでは、赤色光の下で暗い部屋でフライカップと胚を取り扱う、実体顕微鏡下で胚を選択してマウントするときに照明光から青色の波長をフィルタリングする、刺激前に胚を400〜500nmレーザー(単一光子励起)または830〜980nmパルスレーザー(多光子励起)にさらさないようにするなど、望ましくない刺激を防ぐために複数の手順が採用されています。サンプルの不要な刺激を防ぐために、実験の複数のステップで特別な注意を払うことが重要です。さらに、Opto-Rho1DNを使用して胚41の特定の関心領域(ROI)内のRho1を阻害する場合、原形質膜へのCRY2-Rho1DNの堅牢な転座を達成できる最も低いレーザー強度を使用することをお勧めします。Opto-Rho1DNは青色波長に非常に敏感であるため、高強度の青色レーザーは、散乱光により、ROIの外側の細胞や隣接する胚にさえ望ましくない刺激をもたらす可能性があります。

現在のバージョンでは、Opto-Rho1DNツールにはいくつかの制限があります。まず、このプロトコルに記載されている実験のために、原形質膜局在CIBNアンカーを使用して、活性化されたCRY2-Rho1DNを細胞質ゾルから原形質膜41、47に動員しました。この設計では、細胞質ゾル中の活性化CRY2-Rho1DNタンパク質の拡散により、特定の原形質膜ドメイン内に閉じ込められたRho1阻害を行うことは困難である。細胞内スケールでの空間精度をさらに向上させるには、より特異的な細胞内局在パターンを持つ新しいCIBNアンカーの開発が待たれています。第二に、Opto-Rho1DNは、初期の胚発生中にRho1を阻害するように設計されています。CIBNpmおよびCRY2-Rho1DN-mCherryの発現は、雌性生殖細胞系列における発現が標準化されているUASpによって制御されている5 5。初期胚発生を超えた体細胞組織におけるこれらのモジュールの発現は、体細胞発現を駆動するのにより効果的なプロモーター(例えば、UASt56)によるUASpの置換を必要とし得る。最後に、Opto-Rho1DNの有効性は、CIBNアンカーおよびCRY2-Rho1DNタンパク質の豊富さに左右されます。ツールの現在のバージョンでは、光遺伝学的モジュールの発現を駆動するために使用されるGAL4ドライバーラインによって決定されます。このプロトコルに記載されている母体GAL4ドライバーを使用する場合、アクトミオシン収縮性の迅速かつ強力な阻害を達成するために、GAL4遺伝子の2つのコピー(例えば、67および15の両方)を提供する系統を使用することが重要です。F1雌の母体GAL4のコピー数を2から1に減らすと、阻害効果が有意に低下した。

従来の遺伝学的アプローチと比較して、このプロトコルに記載されている光遺伝学的アプローチは、初期のショウジョウバエ胚におけるRho1の病期および組織特異的機能を解剖するのに有利である。ショウジョウバエの初期胚発生におけるRho1の機能は、母性に負荷された遺伝子産物11によって大部分が満たされています。Rho1を枯渇させると、母性的に卵形成57がブロックされ、初期胚形成中のその機能の研究が妨げられます。過去数年間で、ショウジョウバエ胚の内因性Rho1活性を制御するためのいくつかの光遺伝学的ツールが開発されてきました。IzquierdoらとRichらは、ショウジョウバエ胚におけるRho GEFの触媒ドメインの局在を調節することによってRho1活性を活性化する光遺伝学的ツールを開発しました48,58。さらに、Herrera-Perezらは、内因性Rho1活性をそれぞれ活性化または阻害するために、完全長RhoGEF2(optoGEF)または完全長C-GAP(optoGAP)のいずれかを使用して2つの光遺伝学的ツールを開発しました59。optoGAPはRho1 GAPを原形質膜に動員することによって機能するため、その適用は内因性Rho1 GEFの存在に敏感である可能性があり、GAPの異所性動員の影響を相殺または無効にする可能性があります。対照的に、Opto-Rho1DNは、Rho1 GEFを直接隔離することにより、内因性Rho1およびRho1依存性アクトミオシン収縮性を阻害するより堅牢な方法を提供する可能性があります。

胚発生および胚発生後の発生におけるRho1の幅広い機能を考えると、提示されたプロトコルは、幅広い形態形成プロセスにおけるRho1およびRho1依存性細胞再編成の機能を研究するために容易に適合させることができます。さらに、同様の戦略は、原則として、RhoファミリーGTPアーゼCdc42およびRacなどの他の小さなGTPアーゼを厳しく制限するために使用できます。最後に、このプロトコルで例示されているように、オプトジェネティクスとレーザーアブレーションアプローチを組み合わせることで、特定のタンパク質の不活性化が組織動態と組織力学に及ぼす直接的な影響を調べる効果的な方法が提供され、従来の遺伝的アプローチでは明らかにすることが困難であった組織形態形成に関する新しい洞察が得られます。

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Disclosures

著者らは、この研究は、潜在的な利益相反と解釈される可能性のある商業的または金銭的関係がない状態で実施されたと宣言しています。

Acknowledgments

著者らは、画像のサポートについてAnn Lavanwayに感謝しています。著者らは、試薬を共有してくれたヴィーシャウス研究所とデ・レンツィス研究所、フライストックについてブルーミントンショウジョウバエストックセンターに感謝しています。この研究は、NIGMS ESI-MIRA R35GM128745および米国癌協会機関研究助成金 #IRG-82-003-33からBHの支援を受けています。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
35 mm glass-bottom dish MatTek P35G-1.5-10-C Used for sample preparation
60 mm × 15 mm Petri dish with lid Falcon 351007 Used for sample preparation
Black cloth for covering the microscope Online NA Used to avoid unwanted light stimulation
Clorox Ultra Germicadal Bleach (8.25% sodium hypochlorite) VWR 10028-048 Used for embryo dechorination
CO2 pad Genesee Scientific 59-114 Used for cross set-up
ddH2O NA NA Used for sample preparation
Dumont Style 5 tweezers VWR 102091-654 Used for sample preparation
Eyelash tool (made from pure red sable round brush #2) VWR 22940-834 Used for sample preparation
FluoView (Software) Olympus NA Used for image acquisition and optogenetic stimulation
Halocarbon oil 27 Sigma Aldrich H8773-100ML Used for embryo stage visualization
ImageJ/FIJI NIH NA Used for image analysis
MATLAB MathWorks NA Used for image analysis
Nikon SMZ-745 stereoscope Nikon NA Used for sample preparation
Olympus FVMPE-RS multiphoton microscope with InSight DS Dual-line Ultrafast Lasers for simultaneous dual-wavelength multiphoton imaging, , a 25x/NA1.05 water immersion objective (XLPLN25XWMP2), and an IR/VIS stimulation unit for photo-activation/stimulation. This system is also equipped with a TRITC filter (39005-BX3; AT-TRICT-REDSHFT 540/25x, 565BS, 620/60M), and a fluorescence illumination unit that emits white light. Olympus NA Used for image acquisition and optogenetic stimulation
SP Bel-Art 100-place polypropylene freezer storage box (Black, light-proof box for sample transfer) VWR 30621-392 Used to avoid unwanted light stimulation
UV Filter Shield for FM1403 Fluores (Orange-red plastic shield) Bolioptics FM14036151 Used to avoid unwanted light stimulation
VITCHELO V800 Headlamp with White and Red LED Lights Amazon NA Used to avoid unwanted light stimulation

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発生生物学、第194号、光遺伝学、組織力学、Rho1、アクトミオシン、レーザーアブレーション、頂端狭窄、原腸形成
ショウ <em>ジョウバエ</em> 胚におけるRho1を介したアクトミオシン収縮性の光遺伝学的阻害と上皮圧の測定
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Guo, H., Swan, M., He, B. Optogenetic Inhibition of Rho1-Mediated Actomyosin Contractility Coupled with Measurement of Epithelial Tension in Drosophila Embryos. J. Vis. Exp. (194), e65314, doi:10.3791/65314 (2023).

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