Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Optogenetische remming van Rho1-gemedieerde actomyosinecontractiliteit in combinatie met meting van epitheliale spanning in Drosophila-embryo's

Published: April 14, 2023 doi: 10.3791/65314
Automatic Translation
1,2, 3, 1
1Department of Biological Sciences, Dartmouth College, 2School of Life Sciences, Westlake University, 3Department of Molecular Biology, Princeton University

Summary

Actomyosine contractiliteit speelt een belangrijke rol in cel- en weefselmorfogenese. Het is echter een uitdaging om actomyosinecontractiliteit in vivo acuut te manipuleren. Dit protocol beschrijft een optogenetisch systeem dat snel Rho1-gemedieerde actomyosinecontractiliteit in Drosophila-embryo's remt, waardoor het onmiddellijke verlies van epitheliale spanning na de inactivatie van actomyosine in vivo wordt onthuld.

Abstract

Contractiele krachten gegenereerd door actine en niet-spiermyosine II ("actomyosine contractiliteit") zijn van cruciaal belang voor morfologische veranderingen van cellen en weefsels op meerdere lengteschalen, zoals celdeling, celmigratie, epitheliale vouwing en vertakkende morfogenese. Een diepgaand begrip van de rol van actomyosinecontractiliteit in morfogenese vereist benaderingen die de snelle inactivatie van actomyosine mogelijk maken, wat moeilijk te bereiken is met conventionele genetische of farmacologische benaderingen. Het gepresenteerde protocol demonstreert het gebruik van een op CRY2-CIBN gebaseerd optogenetisch dimerisatiesysteem, Opto-Rho1DN, om actomyosinecontractiliteit in Drosophila-embryo's te remmen met nauwkeurige temporele en ruimtelijke controles. In dit systeem wordt CRY2 gefuseerd met de dominante negatieve vorm van Rho1 (Rho1DN), terwijl CIBN is verankerd aan het plasmamembraan. Blauw licht-gemedieerde dimerisatie van CRY2 en CIBN resulteert in een snelle translocatie van Rho1DN van het cytoplasma naar het plasmamembraan, waar het actomyosine inactiveert door endogene Rho1 te remmen. Daarnaast presenteert dit artikel een gedetailleerd protocol voor het koppelen van Opto-Rho1DN-gemedieerde inactivatie van actomyosine met laserablatie om de rol van actomyosine te onderzoeken bij het genereren van epitheliale spanning tijdens Drosophila ventrale groefvorming. Dit protocol kan worden toegepast op vele andere morfologische processen waarbij actomyosinecontractiliteit in Drosophila-embryo's betrokken is met minimale modificaties. Over het algemeen is dit optogenetische hulpmiddel een krachtige benadering om de functie van actomyosinecontractiliteit te ontleden bij het beheersen van weefselmechanica tijdens dynamische weefselremodellering.

Introduction

Actomyosinecontractiliteit, de contractiele kracht die wordt uitgeoefend door niet-spiermyosine II (hierna 'myosine') op het F-actinenetwerk, is een van de belangrijkste krachten bij het veranderen van de celvorm en het aansturen van morfogeneseop weefselniveau 1,2. De activering van actomyosinecontractiliteit op het apicale domein van de epitheelcellen resulteert bijvoorbeeld in apicale vernauwing, die een verscheidenheid aan morfogenetische processen vergemakkelijkt, waaronder epitheliale vouwing, celextrusie, delaminatie en wondgenezing 3,4,5,6,7 . De activering van myosine vereist fosforylering van de regulerende lichte keten. Deze modificatie verlicht de remmende conformatie van de myosinemoleculen, waardoor ze bipolaire myosinefilamentbundels kunnen vormen met meerdere hoofddomeinen aan beide uiteinden. De bipolaire myosinefilamenten drijven de anti-parallelle beweging van actinefilamenten aan en resulteren in het genereren van contractiele kracht 1,8,9.

De evolutionair geconserveerde Rho-familie kleine GTPase RhoA (Rho1 in Drosophila) speelt een centrale rol in de activering van actomyosinecontractiliteit in verschillende cellulaire contexten10,11. Rho1 functioneert als een bimoleculaire switch door gtp (actieve vorm) of bbp (inactieve vorm)12 te binden. De cyclus tussen GTP- of GDP-gebonden Rho1 wordt gereguleerd door zijn GTPase-activerende eiwitten (GAPs) en guanine-nucleotide-uitwisselingsfactoren (GEF's)13. GEF's functioneren om de uitwisseling van BBP voor GTP te vergemakkelijken en zo Rho1-activiteit te activeren. GAPs daarentegen verbeteren de GTPase-activiteit van Rho1 en deactiveren zo Rho1. Geactiveerd Rho1 bevordert actomyosine contractiliteit door interactie met en activering van de downstream effectoren, Rho-geassocieerde kinase (Rok) en Diaphanous14. Rok induceert myosine-activering en actomyosinecontractiliteit door fosforylering van de regulerende lichte keten van myosine15. Daarnaast remt Rok ook de myosineregulerende lichte ketenfosfatase, en bevordert zo de myosinefilamentassemblageverder 16. Rok kan ook LIM-kinasen fosforyleren, die, wanneer geactiveerd, actinedemontage voorkomen door de actine-depolymerisatiefactor cofiline17,18 te fosforyleren en te remmen. Doorschijnend is een formine familie actine nucleator die actine polymerisatie bevordert, het verstrekken van een basis voor myosine te interageren met 19,20,21.

Hoewel de cellulaire mechanismen die actomyosinecontractiliteit activeren goed zijn opgehelderd, blijft ons begrip van de functie ervan bij het reguleren van dynamische weefselremodellering onvolledig. Het opvullen van deze kenniskloof vereist benaderingen die actomyosine snel kunnen inactiveren bij specifieke weefselregio's in vivo en de onmiddellijke impact op weefselgedrag en -eigenschappen kunnen registreren. Dit protocol beschrijft het gebruik van een optogenetische benadering om actomyosinecontractiliteit acuut te remmen tijdens Drosophila mesoderm invaginatie, gevolgd door meting van epitheliale spanning met behulp van laserablatie. Tijdens Drosophila gastrulatie ondergaan de ventraal gelokaliseerde mesoderm-voorlopercellen apicale vernauwing en invaginaleren van het oppervlak van het embryo door een voorste-posterieur georiënteerde groefte vormen 22,23. De vorming van ventrale groeven wordt al lang gebruikt als model voor het bestuderen van het mechanisme van epitheliale vouwing. Ventrale groefvorming wordt toegediend door het dorsaal-ventrale patroonsysteem in Drosophila24,25,26,27. De expressie van twee transcriptiefactoren, Twist en Snail, gelegen aan de ventrale zijde van het embryo, regelt de ventrale groefvorming en specificeert het lot van mesodermale cellen28. Twist en Snail activeren de rekrutering van de Rho1 GEF RhoGEF2 naar de top van de mesodermvoorlopercellen via een G-eiwit gekoppelde receptorroute en een RhoGEF2-adaptoreiwit, T48 29,30,31,32,33. Vervolgens activeert RhoGEF2 myosine in het apicale oppervlak van het potentiële mesoderm via de Rho-Rho-kinaseroute 34,35,36,37,38,39. Geactiveerd myosine vormt een supracellulair actomyosinenetwerk door het apicale oppervlak van het mesoderm primordium, waarvan de samentrekkingen apicale vernauwing veroorzaken en resulteren in een snelle toename van de apicale weefselspanning 14,37,40.

De optogenetische tool beschreven in dit protocol, Opto-Rho1DN, remt actomyosine contractiliteit door blauw-licht afhankelijke plasmamembraan rekrutering van een dominante negatieve vorm van Rho1 (Rho1DN)41. Een T19N-mutatie in Rho1DN elimineert het vermogen van het gemuteerde eiwit om GDP in te ruilen voor GTP en maakt het eiwit dus voortdurend inactief34. Een volgende mutatie in Rho1DN, C189Y, elimineert het naïeve membraanrichtsignaal42,43. Wanneer Rho1DN wordt toegediend aan het plasmamembraan, bindt het zich aan Rho1 GEF's en neemt het het vast, waardoor de activering van Rho1 en Rho1-gemedieerde activering van myosine en actine34,44 wordt geblokkeerd. De plasmamembraanrekrutering van Rho1DN wordt bereikt door een lichtafhankelijke dimerisatiemodule afgeleid van Cryptochrome 2 en zijn bindingspartner CIB1. Cryptochrome 2 is een blauwlicht geactiveerde Cryptochrome fotoreceptor in Arabidopsis thaliana45. Cryptochroom 2 bindt aan CIB1, een basisch helix-loop-helix-eiwit, alleen in zijn foto-geëxciteerde toestand45. Later bleek dat het geconserveerde N-terminale, fotolyase homologiegebied (PHR), van Cryptochrome 2 (CRY2PHR, hierna CRY2 genoemd) en het N-terminale domein (aa 1-170) van CIB1 (hierna CIBN) belangrijk zijn voor lichtgeïnduceerde dimerisatie46. Opto-Rho1DN bevat twee componenten. De eerste component is het CIBN-eiwit gefuseerd met een CAAX-anker, dat het eiwit lokaliseert naar het plasmamembraan47. De tweede component is mCherry-tagged CRY2 gefuseerd met Rho1DN41. Bij afwezigheid van blauw licht blijft CRY2-Rho1DN in het cytoplasma. Bij stimulatie van blauw licht wordt CRY2-Rho1DN gericht op het plasmamembraan door de interactie tussen membraanverankerde CIBN en geëxciteerde CRY2. Opto-Rho1DN kan worden geactiveerd door ultraviolet A (UVA) licht en blauw licht (400-500 nm, piekactivering bij 450-488 nm), of door een 830-980 nm gepulseerde laser bij het uitvoeren van twee-foton stimulatie41,46,47,48. Daarom wordt Opto-Rho1DN gestimuleerd door golflengten die normaal worden gebruikt voor opwindende GFP (488 nm voor beeldvorming met één foton en 920 nm voor beeldvorming met twee fotonen). Daarentegen stimuleren golflengten die gewoonlijk worden gebruikt voor opwindende mCherry (561 nm voor beeldvorming met één foton en 1.040 nm voor beeldvorming met twee fotonen) de optogenetische module niet en kunnen daarom worden gebruikt voor pre-stimulatiebeeldvorming. Het protocol beschrijft de benaderingen die worden gebruikt om het risico op ongewenste stimulatie tijdens monstermanipulatie te minimaliseren.

Laserablatie is op grote schaal gebruikt om spanning in cellen en weefsels te detecteren en te meten49. Eerdere studies hebben aangetoond dat, wanneer de laserintensiteit op de juiste manier wordt gecontroleerd, twee-foton laserablatie met behulp van een femtoseconde nabij-infrarode laser sommige subcellulaire structuren (bijv. Corticale actomyosinenetwerken) fysiek kan aantasten zonder plasmamembraanopname50,51 te veroorzaken. Als het weefsel onder spanning staat, resulteert laserablatie van een interessant gebied in het weefsel in een onmiddellijke uitwendige terugslag van de cellen naast het geableerde gebied. De terugslagsnelheid is een functie van de grootte van de spanning en de viscositeit van de media (cytoplasma) rond de structuren die terugslag ondergaan49. Vanwege de superieure penetratiediepte van de nabij-infrarode lasers en het vermogen om goed begrensde focale ablatie te bereiken, is twee-foton laserablatie bijzonder nuttig voor het detecteren van weefselspanning in vivo. Zoals aangetoond in dit protocol, kan deze methode gemakkelijk worden gecombineerd met Opto-Rho1DN-gemedieerde inactivatie van actomyosinecontractiliteit om de directe impact van Rho1-afhankelijke cellulaire contractiliteit op weefselmechanica tijdens dynamische weefselremodellering te onderzoeken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Het instellen van het genetische kruis en het voorbereiden van de eicelverzamelbeker

  1. Selecteer vrouwelijke vliegen (maagd) uit de optogenetische lijn UASp-CIBNpm (I); UASp-CRY2-Rho1DN-mCherry (III) op een CO2-pad onder een stereomicroscoop en zet een kruising op met mannelijke vliegen van de moederlijke GAL4-driverlijn 67 Sqh-mCherry; 15 E-cadherine-GFP.
    OPMERKING: De 67 en 15 staan voor maternale-Tubuline-GAL4 ingebracht in de tweede (II) en derde (III) chromosomen, respectievelijk52. De GAL4-lijn die in dit protocol wordt gebruikt, drukt ook de mCherry-gelabelde myosine regulerende lichte keten Sqh (Spaghetti squash)37 en GFP-gelabelde E-cadherine53 uit. Vliegen uit de optogenetische lijn kunnen nog steeds FM7- en TM6-balancerchromosomen bevatten. Vliegen uit de maternale GAL4-driverlijn kunnen nog steeds de CyO- en TM3-balancerchromosomen bevatten.
  2. Selecteer na ~10 dagen F1-vrouwelijke vliegen met het volgende genotype: UASp-CIBNpm/+; 67 m²-mCherry/+; 15 E-cadherine-GFP/UASp-CRY2-Rho1DN-mCherry. Zet een eierverzamelbeker op met de mannelijke vliegen.
    1. Zorg ervoor dat de vrouwelijke vliegen met het juiste genotype geen balancerchromosomen bevatten (d.w.z. ze mogen geen krullende vleugels [Cy], korte borstelharen [Sb], staaf- of niervormige ogen [B] of extra humerusharen [Hu] bevatten), die markers zijn voor respectievelijk de CyO-, TM3-, FM7- en TM6-balancers die worden gebruikt bij het genereren van de voorraden. Bedek het kopje met een appelsapplaat met een vleugje verse gistpasta op het oppervlak.
      OPMERKING: Bij F1-vrouwen worden de optogenetische componenten moederlijk tot expressie gebracht. Daarom hoeven de F1-vrouwtjes die worden gebruikt voor het opzetten van de beker geen maagden te zijn. Het wordt aanbevolen om mannelijke vliegen uit dezelfde F1-populatie voor het gemak te gebruiken voor de beker.
  3. Bewaar de beker in een kartonnen doos bedekt met aluminiumfolie om mogelijke lichtlekkage uit de omgeving te voorkomen. Vervang de appelsapplaat elke dag voor kopjes die op kamertemperatuur worden bewaard (~ 21-23 ° C), of om de twee dagen voor kopjes die op 18 ° C worden bewaard.
    1. Klop de beker vlak voor het wisselen van de plaat op een plat oppervlak (bijvoorbeeld op de bank) om de vliegen aan de onderkant van de beker te houden en te voorkomen dat ze ontsnappen. Vervang de appelsapplaat in een donkere kamer en gebruik een koplamp met rood licht voor verlichting (zie Materiaaltabel).
      OPMERKING: Om de expressie van de constructen die onder controle staan van maternale-Tubuline-GAL4 en UASp te vergroten, wordt aanbevolen om de cup minimaal 3 dagen vóór het verzamelen van het embryo op 18 °C te houden. Deze incubatietijd stelt de vliegen ook in staat om zich aan te passen aan de beker en goed gevoed te worden met de gistpasta om een optimale eiproductie te bereiken.

2. Verzameling van embryo's in het gewenste stadium en voorbereiding op optogenetische stimulatie

OPMERKING: Alle monsterverzamelings- en voorbereidingsstappen moeten worden uitgevoerd in een donkere kamer, met behulp van een "veilig licht" (bijv. Rood licht) voor verlichting. De optogenetische componenten zijn enorm gevoelig voor omgevingslicht. Zelfs de geringste blootstelling aan omgevingslicht leidt tot voortijdige stimulatie van het monster. Doorgaans veroorzaken lichten in het groen-rode bereik (>532 nm) geen ongewenste stimulatie.

  1. Voor het verzamelen van embryo's bij vroege embryogenese, plaatst u een nieuwe appelsapplaat op de beker 8 tot 16 uur voorafgaand aan het verzamelen van het embryo (bij 18 °C).
  2. Verander op het moment van embryoverzameling de appelsapplaat. Label de plaat die uit de beker is gehaald en bedek het oppervlak van de plaat met een dunne laag Halocarbon-olie 27 (zie materiaaltabel). Wacht 30-60 s tot de eierschaal transparant is.
  3. Plaats een oranjerood plastic schild (zie Materiaaltabel) op het podium van een rechtopstaande stereoscoop. De plaatsing van het oranjerode schild voorkomt ongewenste stimulatie tijdens de belichting van het monster door de blauwgroene golflengten van het doorgelaten licht te blokkeren.
    OPMERKING: In dit protocol wordt een rechtopstaande stereoscoop gebruikt voor het verzamelen van embryo's (zie tabel met materialen).
  4. Leg de appelsapplaat bovenop het oranjerode schild. Schakel het doorgelaten licht van de stereomicroscoop in om het monster te verlichten. Verzamel 5-15 embryo's in het juiste stadium van de appelsapplaat met een pincet. Knijp de embryo's niet uit met het pincet.
    OPMERKING: In dit protocol moet het juiste embryo zich in het vroege celularisatiestadium bevinden. Het embryo moet in dit stadium een donkere ondoorzichtige dooier hebben, omringd door een heldere, uniforme periplasmalaag die de vormende blastodermcellen bevat. De voorrand van de splitsingsgroeven ("cellularisatiefront"), die verschijnt als een doorlopende lijn parallel aan het oppervlak van het embryo, mag niet de helft van de diepte van het periplasma passeren.
  5. Dep de embryo's voorzichtig op een stuk keukenpapier (~1,5 cm × 1,5 cm) om overtollige olie uit de embryo's te verwijderen met behulp van het pincet.
  6. Voeg enkele druppels vers bereid 40% bleekmiddel (~3% natriumhypochloriet; zie Materiaaltabel) toe aan een nieuw klein vierkant stukje keukenpapier (~1,5 cm × 1,5 cm) met behulp van een plastic transferpipet zodat het keukenpapier bedekt is met een dun laagje bleekmiddel. Breng het embryo met behulp van het pincet over van het droge keukenpapier naar het met bleekmiddel gedrenkte keukenpapier en zorg ervoor dat de embryo's in bleekmiddel zijn gedrenkt. Wacht 2-4 minuten totdat het embryo is gedechorioneerd.
  7. Gebruik na dechorionatie het pincet om het vierkante keukenpapier op een groot stuk tissuepapier te deppen om overtollig bleekmiddel te verwijderen. Zorg ervoor dat de kant met de embryo's naar boven is gericht.
  8. Om de embryo's af te spoelen, gebruikt u het pincet om het vierkante keukenpapier voorzichtig te weken in een druppel gedeïoniseerd water en snel op een groot stuk tissuepapier te deppen. Herhaal dit proces acht keer om ervoor te zorgen dat eventuele restbleekmiddel wordt verwijderd.
  9. Gebruik een wimpergereedschap om het embryo van het keukenpapier over te brengen naar een schaal met glazen bodem van 35 mm (zie materiaaltabel). Voeg gedeïoniseerd water toe aan de schaal om de embryo's volledig te bedekken. Verfijn de positie en oriëntatie van de embryo's met behulp van het wimpergereedschap.
    OPMERKING: Na dechorionatie heeft het embryo de neiging om op het oppervlak van het glas te blijven plakken en is het onbeweeglijk zonder verstoring, dus het is niet nodig om aanvullende behandeling (zoals lijm) toe te passen om het embryo op de schaal met glazen bodem te immobiliseren.
  10. Plaats de schaal met glazen bodem van 35 mm met de embryo's in een lichtdichte zwarte doos (zie materiaaltabel) om het monster te beschermen tegen blootstelling aan licht tijdens het overdrachtsproces. Breng de doos naar de kamer met de multifotonenmicroscoop.

3. Optogenetische stimulatie, laserablatie en beeldvorming van het embryo

OPMERKING: Het multifotonensysteem dat in dit experiment wordt gebruikt (zie Materiaaltabel) is in staat tot gelijktijdige beeldvorming met twee golflengten. Het bevat ook een fotostimulatie-eenheid met een 458 nm-laser en een aparte galvanometerscanner, waardoor foto-activering / stimulatie binnen een gedefinieerde interesseregio (ROI) mogelijk is. Van belang is dat de 920 nm-laser, die wordt gebruikt om groengele fluorescerende eiwitten te prikkelen, Opto-Rho1DN zal stimuleren, zij het langzamer in vergelijking met blauwe lasergemedieerde stimulatie.

  1. Bedek de multifotonenmicroscoop met een lichtdichte zwarte doek (zie materiaaltabel) om ongewenste stimulatie van de embryo's tijdens het samenstellen van het monster en beeldvorming te voorkomen.
    OPMERKING: Dezelfde aanpak wordt gebruikt tijdens reguliere multifotonbeeldvorming om de lichtgevoelige detectoren op de microscoop te beschermen.
  2. Doe het kamerlicht en de computerschermen uit. Schakel de touch panel controller uit door in de software op UIT te klikken onder 'Backlight of touch panel controller'. Zorg ervoor dat er geen ander omgevingslicht in de kamer is.
    1. Open de voorkant van de zwarte doekkap op de microscoop. Neem de schaal met glazen bodem van 35 mm uit de zwarte doos en plaats deze op het microscooppodium.
  3. Verlicht embryo's met een groen licht dat normaal wordt gebruikt als excitatielicht voor epifluorescentie. Schakel hiervoor de fluorescentieverlichting in, selecteer Ocular onder het paneel 'Oculair' in de software en wijzig het 'Cube turret' in 4:TRITC. Gebruik het oculair om het embryo van belang te identificeren en in beeld te brengen.
    OPMERKING: De visualisatie van groen licht wordt bereikt door een wit licht dat door de fluorescentieverlichtingseenheid wordt gegenereerd, door een ingebouwde standaard TRITC-filterkubus te laten gaan, die een excitatiefilter van 528-553 nm, een straalsplitter van 565 nm en een emissiefilter van 590-650 nm bevat. Andere niet-blauwe lichten zouden ook prima moeten werken voor monsterverlichting. Het is niet nodig om bij deze stap oogbescherming te dragen, omdat het excitatielicht een lage intensiteit heeft en niet op het oculair wordt gericht. Het embryo zal uniform rood lijken als gevolg van autofluorescentie.
  4. Sluit het deksel van het zwarte doek zodat het monster volledig tegen licht wordt beschermd. Schakel het computerscherm in om toegang te krijgen tot de software die de microscoop bestuurt. Verander de 'Ocular' naar LSM in de software voor beeldacquisitie.
  5. Voer laserablatie uit in controle, niet-gestimuleerde embryo's met behulp van een 25x wateronderdompelingsobjectief.
    1. Klik op Bright Z, Sequence Manager en LSM Stimulation in het 'Tool Window' in de software. Stel het scannertype in op Galvano en de scangrootte op 512 × 512. Schakel CH1 en CH3 in onder het paneel 'PMT-instelling' om het gebruik van de 1.040 nm-laser toe te staan en klik op Live × 4 om het embryo te visualiseren.
    2. Roteer het embryo met behulp van de rotatiefunctie in de software, zodat de voorste-achterste as van het embryo verticaal georiënteerd is. Stel de zoom in op 3. Teken een interessegebied (ROI) met het vormgereedschap onder 'Scaninstellingen' en stel de grootte van de ROI in het deelvenster 'Referentie' in. Stel de ROI in op 512 pixels in de breedte en 100 pixels in de hoogte (171 × 33 μm2).
    3. Stel acquisitieparameters in voor de pre-ablatie Z-stack.
      1. Registreer het oppervlak van het embryo als 0 onder de 'Z-sectie'. Stel het begin in op 0 en het einde op 100 μm. Stel de stapgrootte in op 2 μm. Activeer de Z-acquisitiemodus door Z aan te vinken onder het tabblad 'Serie'.
      2. Stel de laserintensiteit van 1.040 nm in om lineair te verhogen van 3% naar 7% met behulp van de Bright Z-functie .
      3. Sla de huidige afbeeldingsinstelling op als de eerste taak van de pijplijn door op LSM te klikken in 'Sequence Manager'.
        OPMERKING: De pre-ablatie Z-stack wordt verkregen om het stadium van het embryo te bevestigen. In dit experiment zullen CRY2-Rho1DN-mCherry en Sqh-mCherry worden geëxciteerd door de 1.040 nm laser. Tijdens apicale vernauwing wordt het Sqh-mCherry-signaal versterkt in het medioapische gebied van de ventrale mesodermale cellen, terwijl CRY2-Rho1DN-mCherry cytosolisch is vóór stimulatie. De laserintensiteit die wordt gebruikt voor beeldvorming vóór en na stimulatie wordt empirisch bepaald op basis van de balans tussen de optimale signaal-ruisverhouding en het vermijden van fotobleaching.
    4. Stel acquisitieparameters in voor de pre-ablatiefilm.
      1. Verwijder eventuele bestaande ROI om beeldvorming mogelijk te maken van het volledige gebied van 512 × 512 pixels (171 × 171 μm 2, 3x zoom) in de buurt van het ventrale oppervlak van het embryo, zoals beschreven in stap 3.5.2. Stel de laserintensiteit van 1.040 nm in op 3%.
      2. Controleer Tijd en schakel Z uit onder het paneel 'Serie'. Houd het 'Interval' als FreeRun onder het paneel 'Time Lapse'. Stel de cyclus in als 10.
      3. Sla de huidige instellingen op als de volgende taak van de pijplijn door op LSM te klikken in 'Sequence Manager'.
        OPMERKING: Het doel van deze taak is het verkrijgen van een 10-frame enkele Z-plane pre-ablatie film met een 1.040 nm laser voor beeldacquisitie. De beeldacquisitiesnelheid is ongeveer 1 s per frame.
    5. Stel de parameters voor laserablatie in.
      1. Definieer een 3D-gebied van direct onder het vitellinemembraan tot ~20 μm diep voor laserablatie (figuur 1A). Stel het begin van de Z-stack in als het vlak dat zich direct onder het vitellinemembraan bevindt en het einde als 20 μm dieper dan het beginvlak. Stel de stapgrootte in op 1,5 μm.
        OPMERKING: De ROI van het geableerde gebied is ~30 pixels breed en ~10 pixela hoog (~10 μm langs de mediaal-laterale as en ~3,3 μm langs de A-P-as). Het doel van het aborteren van het monster op meerdere Z-vlakken is ervoor te zorgen dat het apicale oppervlak van de ventrale cellen wordt geableerd. Dit is vooral belangrijk voor de gestimuleerde embryo's, omdat de ventrale cellen een snelle apicale ontspanning ervaren na Rho1-remming.
      2. Schakel CH2 en CH4 in onder het paneel 'PMT-instelling' om het gebruik van de 920 nm-laser mogelijk te maken. Stel de intensiteit van de 920 nm laser in op 30%. Stel beeldacquisitie in met de 920 nm-laser voor een enkele Z-stack binnen het 3D-gebied dat is gedefinieerd in stap 3.5.5.1 voor laserablatie.
        OPMERKING: De laserintensiteit die in deze stap is gekozen, is voldoende om het weefsel te aborteren (zoals aangegeven door weefselterugslag onmiddellijk na de laserbehandeling), maar beschadigt ondertussen niet duidelijk het plasmamembraan (zoals aangegeven door het ontbreken van brandplekken op het celmembraan) (figuur 1B, C).
      3. Sla de huidige instelling op als de volgende taak van de pijplijn door op LSM te klikken in 'Sequence Manager'.
    6. Stel acquisitieparameters in voor de post-ablatiefilm.
      1. Stel beeldacquisitie in voor een 100-frame enkele Z-vlak post-ablatiefilm met behulp van zowel de 1.040 nm- als de 920 nm-lasers. Stel de intensiteit van de 1.040 nm laser en de 920 nm laser in op respectievelijk 3% en 0,3%. Het gebied dat in stap 3.5.4 is opgegeven, wordt met identieke beeldacquisitiesnelheid weergegeven.
      2. Sla de huidige instelling op als de volgende taak van de pijplijn door op LSM te klikken in 'Sequence Manager'.
        OPMERKING: Het doel van het opslaan van de parameters beschreven in stap 3.5.3-3.5.6 als sequentiële taken in 'Sequence Manager' voordat een daadwerkelijke acquisitie plaatsvindt, is om ervoor te zorgen dat de onmiddellijke weefselrespons na laserablatie wordt vastgelegd.
    7. Selecteer Volgorde onder 'Verwerven'. Wijzig indien nodig het pad en de bestandsnaam voor gegevensopslag. Klik op Gereed en wacht tot de software de pijplijn heeft geïnitialiseerd. Klik vervolgens op Start om de pijplijn uit te voeren.
  6. Voer laserablatie uit in gestimuleerde embryo's.
    1. Stel acquisitieparameters in voor de pre-ablatie Z-stack, zoals beschreven in stappen 3.5.1-3.5.3. Sla de huidige instelling op als de eerste taak van de pijplijn door op LSM te klikken in 'Sequence Manager'.
    2. Stel parameters in voor optogenetische stimulatie binnen een gedefinieerde ROI.
      1. Wijzig de zoom in 1 en selecteer een ROI die het ventrale oppervlak van het embryo bedekt (~512 × 300 μm2). Schakel de CH1-CH4-detectoren uit.
      2. Klik op LSM-stimulatie. Verwijder het vinkje bij Continu binnen Duur en typ 12 s. Controleer de 458 nm met 0,3% laserintensiteit.
      3. Sla de huidige instelling op als de volgende taak van de pijplijn door te klikken op Stimulatie in 'Sequence Manager'.
        OPMERKING: Een snellere stimulatie kan worden bereikt door de laserintensiteit van 458 nm te verhogen. Bij gebruik van hogere laserintensiteiten kan het verstrooide laserlicht echter het gebied naast de ROI stimuleren, wat niet ideaal is als een ruimtelijk beperkte stimulatie vereist is.
    3. Stel een wachttijd van 3 minuten in na stimulatie om totale inactivatie van myosine en demontage van apicale F-actine te garanderen en om een statische weefselmorfologie vóór laserablatie te bereiken. Dit wordt bereikt door onder 'Sequence Manager' op Wait /Pause te klikken en de gewenste tijd voor 'Wait' in te stellen.
      OPMERKING: Rekrutering van CRY2-Rho1DN-mCherry naar het membraan veroorzaakt door een enkele stimulatieronde (0,3% 458 nm laser gedurende 12 s) is duidelijk detecteerbaar 10-15 minuten na de stimulatie. Dit is in lijn met de gepubliceerde dissociatie half-time van ~9 min47.
    4. Stel acquisitieparameters in voor de enkele Z-plane pre-ablatiefilm, zoals beschreven in stap 3.5.4, behalve dat zowel de 1.040 nm- als de 920 nm-lasers worden gebruikt voor beeldacquisitie. Schakel de CH1-CH4-detectoren in. Stel de intensiteit van de 1.040 nm laser en de 920 nm laser in op respectievelijk 3% en 0,3%. Sla de huidige instelling op als de volgende taak van de pijplijn door op LSM te klikken in 'Sequence Manager'.
    5. Stel parameters in voor laserablatie, zoals beschreven in stap 3.5.5. Sla de huidige instelling op als de volgende taak van de pijplijn door op LSM te klikken in 'Sequence Manager'.
    6. Stel acquisitieparameters in voor de enkele Z-plane post-ablatiefilm, zoals beschreven in stap 3.5.6. Sla de huidige instelling op als de volgende taak van de pijplijn door op LSM te klikken in 'Sequence Manager'.
    7. Selecteer Volgorde onder 'Verwerven'. Wijzig indien nodig het pad en de bestandsnaam voor gegevensopslag. Klik op Gereed en wacht tot de software de pijplijn heeft geïnitialiseerd. Klik vervolgens op Start om de pijplijn uit te voeren.

4. Kwantificeren van de snelheid van weefselterugslag na laserablatie

  1. Open de film na ablatie in ImageJ.
  2. Teken een kleine ROI langs de ventrale middellijn die het geableerde gebied bedekt met het gereedschap Rechthoekselectie . De breedte van de ROI is negen pixels. De hoogte van de ROI is zo ingesteld dat de ROI groot genoeg is om het volledige bereik van weefselterugslag na laserablatie te dekken.
    1. Klik op Dupliceren onder het tabblad 'Afbeelding'. Schakel in het pop-upvenster Stack dupliceren in en klik vervolgens op OK om de stack binnen de geselecteerde ROI te dupliceren.
  3. Genereer een montage van de gedupliceerde stapel via Afbeelding > Stapels > Montage maken. Stel in het pop-upvenster het rijnummer in op 1 en het kolomnummer op het totale aantal frames in de stapel (in dit geval 100 ).
  4. Meet de A-P-breedte van het geablateerde gebied in de loop van de tijd van de gegenereerde montage.
    1. Gebruik het gereedschap Multipoint in ImageJ om de A-P-grenzen van het ablated gebied voor elk tijdstip op de montage te markeren.
    2. Sla de coördinaten van de gemarkeerde stippen op met Bestand > Opslaan als > XY-coördinaten.
    3. Importeer de gemeten XY-coördinaten in MATLAB. Bereken de A-P-breedte van het geableerde gebied voor elk tijdspunt door de Y-coördinaat van de bovengrens af te trekken van de Y-coördinaat van de ondergrens.
  5. Bepaal de snelheid van weefselterugslag door de eerste 20 s van de curve "breedte in de tijd" in een lijn te plaatsen met behulp van de functie 'polyfit' in MATLAB. Rapporteer de helling van de aangebrachte lijn als de snelheid van weefselterugslag.
  6. Voer statistische tests uit om de snelheid van weefselterugslag tussen de gestimuleerde en niet-gestimuleerde monsters te vergelijken.
    OPMERKING: Het wordt aanbevolen om gegevens te verkrijgen van ten minste vijf embryo's per aandoening. Zowel de tweezijdige Wilcoxon rank-sum test als de tweezijdige student t-test kunnen worden gebruikt voor statistische vergelijking.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

In de niet-gestimuleerde embryo's die apicale vernauwing ondergingen, werd Sqh-mCherry verrijkt in het medioapische gebied van de ventrale mesodermale cellen, terwijl CRY2-Rho1DN-mCherry cytosolisch was (figuur 1A). Laserablatie binnen het vernauwingsdomein leidde tot een snelle weefselterugslag langs de A-P-as (figuur 1B,C). In de gestimuleerde embryo's werd het CRY2-Rho1DN-mCherry-signaal plasmamembraan gelokaliseerd, terwijl het medioapische signaal van Sqh-mCherry volledig verdween (figuur 1A). Laserablatie in de gestimuleerde embryo's resulteerde niet in duidelijke weefselterugslag, zoals geïllustreerd in figuur 1B,C en gekwantificeerd in figuur 1D. Deze resultaten geven aan dat het genereren van weefselspanning actieve apicale actomyosinecontractiliteit vereist; wanneer actomyosine inactief wordt bij Rho1-remming, neemt de apicale weefselspanning ook af41. Deze observaties komen overeen met de eerdere bevindingen dat activering van apicale myosinecontractiliteit in ventrale mesodermale cellen resulteert in een toename van de weefselspanning aan het ventrale oppervlak van het embryo40.

Figure 1
Figuur 1: Opto-Rho1DN stimulatie tijdens apicale vernauwing resulteert in een onmiddellijk verlies van corticale spanning aan het ventrale oppervlak van het embryo . (A) Cartoon met de experimentele opstelling voor laserablatie om corticale spanning te detecteren. Geel gearceerde gebieden geven de geableerde gebieden aan. Voor gestimuleerde embryo's werd lichtactivering van Opto-Rho1DN 3 minuten vóór de laserablatie uitgevoerd. Vanwege apicale ontspanning na stimulatie werden meerdere z-vlakken geablateerd (geel gearceerd gebied) om de ablatie van het zeer apicale oppervlak van de ventrale cellen te garanderen. (B,C) Vergelijking tussen niet-gestimuleerde en gestimuleerde embryo's. Er werd geen duidelijke weefselterugslag waargenomen bij de gestimuleerde embryo's (N = 6 voor niet-gestimuleerde embryo's en N = 5 voor gestimuleerde embryo's). (B) En-face view van de laser-ablated embryo's. Geel gearceerde vakken markeren het geableerde gebied. (C) Kymografen die de breedteverandering van het geableerde gebied weergeven. Gele stippellijnen geven de ablatieplaats aan. (D) Breedteveranderingen van het geableerde gebied langs de A-P-as gedurende de eerste 20 s na laserablatie. Een duidelijke weefselterugslag werd waargenomen na lasersnijden in de niet-gestimuleerde controle-embryo's. Daarentegen werd weinig tot geen weefselterugslag waargenomen in de gestimuleerde embryo's, wat wijst op een gebrek aan apicale spanning na Rho1-remming. Foutbalk is standaarddeviatie. De p-waarde werd berekend met behulp van een tweezijdige Wilcoxon rank-sum test. Deze figuur is hergebruikt uit Guo et al.41. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dit protocol beschreef het gecombineerde gebruik van optogenetica en laserablatie om veranderingen in weefselspanning onmiddellijk na de inactivatie van actomyosinecontractiliteit te onderzoeken. De hier beschreven optogenetische tool maakt gebruik van de dominante negatieve vorm van Rho1 (Rho1DN) om endogene Rho1- en Rho1-afhankelijke actomyosinecontractiliteit acuut te remmen. Eerdere karakterisering van Opto-Rho1DN in de context van Drosophila ventrale groefvorming toonde aan dat de tool zeer effectief is in het bemiddelen van de snelle inactivatie van apicale actomyosinecontractiliteit door gelijktijdige myosine-inactivatie en actinedemontage41. In het bijzonder resulteerde de stimulatie van embryo's op het moment van apicale vernauwing in een vermindering van het apicale myosinesignaal binnen 60 s in cellen die apicale vernauwing ondergingen41. Deze snelle verwijdering van corticale myosine bij Rho1-remming is waarschijnlijk te wijten aan de snelle cyclus van Rho1 en myosine door actieve en inactieve toestanden, veroorzaakt door de activiteiten van GTPase-activerende eiwitten (GAPs) voor Rho1 en myosine lichte keten fosfatasen, respectievelijk19,54. In overeenstemming met de impact op actomyosine toonde de koppeling van optogenetica met laserablatie aan dat Opto-Rho1DN-stimulatie tijdens apicale vernauwing resulteerde in een onmiddellijk verlies van epitheliale spanning in het ventrale gebied van het embryo41 (figuur 1). Deze gecombineerde aanpak stelde ons in staat om de functie van Rho1-gemedieerde cellulaire contractiliteit te onderzoeken bij het reguleren van weefselmechanica met ongekende ruimtelijke en temporele precisie, waardoor het mogelijk werd om onmiddellijke effecten van langetermijneffecten te ontleden die moeilijk te bereiken zijn met conventionele genetische benaderingen.

Een belangrijke technische overweging bij het gebruik van Opto-Rho1DN is dat het gereedschap zeer gevoelig is voor omgevingslicht. Een veel voorkomend probleem in het experiment is de rekrutering van CRY2-mCherry-Rho1DN naar het plasmamembraan vóór de stimulatiestap, die meestal wordt veroorzaakt door voortijdige stimulatie van het monster tijdens een van de volgende stappen: monstervoorbereiding, monsteroverdracht naar de microscoopkamer, monsterpositionering op het microscoopstadium en pre-stimulatiebeeldacquisitie. In ons protocol worden meerdere procedures gebruikt om ongewenste stimulatie te voorkomen, waaronder het hanteren van de vliegenbekers en embryo's in een donkere kamer onder rood licht, het filteren van blauwe golflengten uit het verlichtingslicht bij het selecteren en monteren van embryo's onder de stereomicroscoop, en het vermijden van blootstelling van embryo's aan een 400-500 nm laser (enkele foton excitatie) of een 830-980 nm gepulseerde laser (multifoton excitatie) voorafgaand aan stimulatie. Het is van cruciaal belang om extra aandacht te oefenen bij meerdere stappen van het experiment om ongewenste stimulatie van het monster te voorkomen. Bovendien wordt bij het gebruik van Opto-Rho1DN om Rho1 te remmen binnen een specifiek interessegebied (ROI) in het embryo41, aanbevolen om de laagste laserintensiteit te gebruiken die een robuuste translocatie van CRY2-Rho1DN naar het plasmamembraan kan bereiken. Omdat Opto-Rho1DN extreem gevoelig is voor blauwe golflengten, kan een blauwe laser met hoge intensiteit resulteren in ongewenste stimulatie in cellen buiten de ROI of zelfs naburige embryo's als gevolg van verstrooid licht.

In de huidige versie heeft de Opto-Rho1DN-tool verschillende beperkingen. Ten eerste werd voor de in dit protocol beschreven experimenten een plasmamembraan gelokaliseerd CIBN-anker gebruikt om geactiveerd CRY2-Rho1DN van het cytosol naar het plasmamembraan41,47 te rekruteren. Door dit ontwerp is het moeilijk om beperkte Rho1-remming uit te voeren binnen een specifiek plasmamembraandomein vanwege de diffusie van geactiveerde CRY2-Rho1DN-eiwitten in het cytosol. Verdere verbetering van de ruimtelijke precisie op subcellulaire schaal wacht op de ontwikkeling van nieuwe CIBN-ankers met meer specifieke subcellulaire lokalisatiepatronen. Ten tweede is Opto-Rho1DN ontworpen om Rho1 te remmen tijdens vroege embryogenese. De expressie van CIBNpm en CRY2-Rho1DN-mCherry wordt gecontroleerd door UASp, dat gestandaardiseerd is voor expressie in vrouwelijke kiembanen 55. De expressie van deze modules in somatische weefsels na vroege embryogenese kan de vervanging van UASp door een promotor vereisen die effectiever is voor het aansturen van somatische expressie (bijv. UASt56). Ten slotte is de effectiviteit van Opto-Rho1DN afhankelijk van de overvloed aan het CIBN-anker en CRY2-Rho1DN-eiwitten. In de huidige versie van de tool wordt deze bepaald door de GAL4-driverlijn die wordt gebruikt om de expressie van de optogenetische modules aan te sturen. Bij het gebruik van de maternale GAL4-driver die in dit protocol wordt beschreven, is het van cruciaal belang om de lijn te gebruiken die twee kopieën van het GAL4-gen levert (bijv. Zowel 67 als 15) om de snelle en krachtige remming van actomyosinecontractiliteit te bereiken. Het verminderen van het aantal kopieën van maternale GAL4 bij de F1-vrouwtjes van twee naar één verminderde het remmende effect aanzienlijk.

In vergelijking met conventionele genetische benaderingen is de optogenetische benadering die in dit protocol wordt beschreven voordelig bij het ontleden van het stadium en de weefselspecifieke functie van Rho1 in vroege Drosophila-embryo's. De functie van Rho1 in de vroege Drosophila embryogenese wordt grotendeels vervuld door het maternaal geladen genproduct11. Het uitputten van Rho1 blokkeert oogenese57 op moederbasis, waardoor de studie van zijn functie tijdens vroege embryogenese wordt voorkomen. In de afgelopen jaren zijn verschillende optogenetische hulpmiddelen ontwikkeld om de endogene Rho1-activiteit in Drosophila-embryo's te reguleren. Zowel Izquierdo et al. als Rich et al. ontwikkelden optogenetische hulpmiddelen om Rho1-activiteit te activeren door de lokalisatie van het katalytische domein van Rho GEF's in Drosophila-embryo's te reguleren48,58. Daarnaast ontwikkelden Herrera-Perez et al. twee optogenetische hulpmiddelen met behulp van ofwel full-length RhoGEF2 (optoGEF) of full-length C-GAP (optoGAP) om endogene Rho1-activiteit te activeren of te remmen, respectievelijk59. Aangezien optoGAP functioneert door een Rho1 GAP naar het plasmamembraan te rekruteren, kan de toepassing ervan gevoelig zijn voor de aanwezigheid van endogene Rho1 GEF's, die het effect van ectopische rekrutering van de GAP kunnen compenseren of zelfs opheffen. Door Rho1 GEF's direct vast te leggen, kan Opto-Rho1DN daarentegen een robuustere manier bieden om endogene Rho1- en Rho1-afhankelijke actomyosinecontractiliteit te remmen.

Gezien het brede scala aan functies van Rho1 in embryogenese en postembryonale ontwikkeling, kan het gepresenteerde protocol gemakkelijk worden aangepast om de functie van Rho1 en Rho1-afhankelijke cellulaire reorganisaties in een breed scala van morfogenetische processen te bestuderen. Bovendien kan een vergelijkbare strategie in principe worden gebruikt om andere kleine GTPases, zoals de Rho-familie GTPases Cdc42 en Rac, ernstig te beperken, omdat hun dominante negatieve vormen op grote schaal zijn gebruikt om de endogene functie van deze eiwitten te remmen11. Ten slotte, zoals geïllustreerd in dit protocol, kan het combineren van optogenetica en laserablatiebenaderingen een effectieve manier zijn om de onmiddellijke impact van de inactivatie van een specifiek eiwit op weefseldynamica en weefselmechanica te onderzoeken, wat ons nieuwe inzichten zal brengen in weefselmorfogenese die moeilijk te ontdekken zijn met behulp van conventionele genetische benaderingen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren dat het onderzoek werd uitgevoerd in afwezigheid van commerciële of financiële relaties die kunnen worden opgevat als een potentieel belangenconflict.

Acknowledgments

De auteurs bedanken Ann Lavanway voor de ondersteuning van beeldvorming. De auteurs bedanken het Wieschaus-lab en het De Renzis-lab voor het delen van reagentia en het Bloomington Drosophila Stock Center voor vliegenvoorraden. Deze studie wordt ondersteund door NIGMS ESI-MIRA R35GM128745 en American Cancer Society Institutional Research Grant #IRG-82-003-33 aan BH.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
35 mm glass-bottom dish MatTek P35G-1.5-10-C Used for sample preparation
60 mm × 15 mm Petri dish with lid Falcon 351007 Used for sample preparation
Black cloth for covering the microscope Online NA Used to avoid unwanted light stimulation
Clorox Ultra Germicadal Bleach (8.25% sodium hypochlorite) VWR 10028-048 Used for embryo dechorination
CO2 pad Genesee Scientific 59-114 Used for cross set-up
ddH2O NA NA Used for sample preparation
Dumont Style 5 tweezers VWR 102091-654 Used for sample preparation
Eyelash tool (made from pure red sable round brush #2) VWR 22940-834 Used for sample preparation
FluoView (Software) Olympus NA Used for image acquisition and optogenetic stimulation
Halocarbon oil 27 Sigma Aldrich H8773-100ML Used for embryo stage visualization
ImageJ/FIJI NIH NA Used for image analysis
MATLAB MathWorks NA Used for image analysis
Nikon SMZ-745 stereoscope Nikon NA Used for sample preparation
Olympus FVMPE-RS multiphoton microscope with InSight DS Dual-line Ultrafast Lasers for simultaneous dual-wavelength multiphoton imaging, , a 25x/NA1.05 water immersion objective (XLPLN25XWMP2), and an IR/VIS stimulation unit for photo-activation/stimulation. This system is also equipped with a TRITC filter (39005-BX3; AT-TRICT-REDSHFT 540/25x, 565BS, 620/60M), and a fluorescence illumination unit that emits white light. Olympus NA Used for image acquisition and optogenetic stimulation
SP Bel-Art 100-place polypropylene freezer storage box (Black, light-proof box for sample transfer) VWR 30621-392 Used to avoid unwanted light stimulation
UV Filter Shield for FM1403 Fluores (Orange-red plastic shield) Bolioptics FM14036151 Used to avoid unwanted light stimulation
VITCHELO V800 Headlamp with White and Red LED Lights Amazon NA Used to avoid unwanted light stimulation

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vicente-Manzanares, M., Ma, X., Adelstein, R. S., Horwitz, A. R. Non-muscle myosin II takes centre stage in cell adhesion and migration. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 10 (11), 778-790 (2009).
  2. Munjal, A., Lecuit, T. Actomyosin networks and tissue morphogenesis. Development. 141 (9), 1789-1793 (2014).
  3. Sawyer, J. M., et al. Apical constriction: a cell shape change that can drive morphogenesis. Developmental Biology. 341 (1), 5-19 (2010).
  4. Nishimura, T., Honda, H., Takeichi, M. Planar cell polarity links axes of spatial dynamics in neural-tube closure. Cell. 149 (5), 1084-1097 (2012).
  5. Marinari, E., et al. Live-cell delamination counterbalances epithelial growth to limit tissue overcrowding. Nature. 484 (7395), 542-545 (2012).
  6. Slattum, G. M., Rosenblatt, J. Tumour cell invasion: an emerging role for basal epithelial cell extrusion. Nature Reviews. Cancer. 14 (7), 495-501 (2014).
  7. Antunes, M., Pereira, T., Cordeiro, J. V., Almeida, L., Jacinto, A. Coordinated waves of actomyosin flow and apical cell constriction immediately after wounding. The Journal of Cell Biology. 202 (2), 365-379 (2013).
  8. Yang, S., et al. The central role of the tail in switching off 10S myosin II activity. The Journal of General Physiology. 151 (9), 1081-1093 (2019).
  9. Yang, S., et al. Cryo-EM structure of the inhibited (10S) form of myosin II. Nature. 588 (7838), 521-525 (2020).
  10. Narumiya, S., Thumkeo, D. Rho signaling research: history, current status and future directions. FEBS Letters. 592 (11), 1763-1776 (2018).
  11. Johndrow, J. E., Magie, C. R., Parkhurst, S. M. Rho GTPase function in flies: insights from a developmental and organismal perspective. Biochemistry and Cell Biology. 82 (6), 643-657 (2004).
  12. Etienne-Manneville, S., Hall, A. Rho GTPases in cell biology. Nature. 420 (6916), 629-635 (2002).
  13. Hodge, R. G., Ridley, A. J. Regulating Rho GTPases and their regulators. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 17 (8), 496-510 (2016).
  14. Martin, A. C., Goldstein, B. Apical constriction: themes and variations on a cellular mechanism driving morphogenesis. Development. 141 (10), 1987-1998 (2014).
  15. Amano, M., Nakayama, M., Kaibuchi, K. Rho-kinase/ROCK: A key regulator of the cytoskeleton and cell polarity. Cytoskeleton. 67 (9), 545-554 (2010).
  16. Kimura, K., et al. Regulation of myosin phosphatase by Rho and Rho-associated kinase (Rho-kinase). Science. 273 (5272), 245-248 (1996).
  17. Maekawa, M., et al. Signaling from Rho to the actin cytoskeleton through protein kinases ROCK and LIM-kinase. Science. 285 (5429), 895-898 (1999).
  18. Ohashi, K., et al. Rho-associated kinase ROCK activates LIM-kinase 1 by phosphorylation at threonine 508 within the activation loop. The Journal of Biological Chemistry. 275 (5), 3577-3582 (2000).
  19. Coravos, J. S., Martin, A. C. Apical sarcomere-like actomyosin contracts nonmuscle drosophila epithelial cells. Developmental Cell. 39 (3), 346-358 (2016).
  20. Homem, C. C. F., Peifer, M. Diaphanous regulates myosin and adherens junctions to control cell contractility and protrusive behavior during morphogenesis. Development. 135 (6), 1005-1018 (2008).
  21. Goode, B. L., Eck, M. J. Mechanism and function of formins in the control of actin assembly. Annual Review of Biochemistry. 76, 593-627 (2007).
  22. Sweeton, D., Parks, S., Costa, M., Wieschaus, E. Gastrulation in Drosophila: the formation of the ventral furrow and posterior midgut invaginations. Development. 112 (3), 775-789 (1991).
  23. Leptin, M., Grunewald, B. Cell shape changes during gastrulation in Drosophila. Development. 110 (1), 73-84 (1990).
  24. Leptin, M. Gastrulation in Drosophila: the logic and the cellular mechanisms. The EMBO Journal. 18 (12), 3187-3192 (1999).
  25. Martin, A. C. The physical mechanisms of Drosophila gastrulation: mesoderm and endoderm invagination. Genetics. 214 (3), 543-560 (2020).
  26. Gilmour, D., Rembold, M., Leptin, M. From morphogen to morphogenesis and back. Nature. 541 (7637), 311-320 (2017).
  27. Gheisari, E., Aakhte, M., Müller, H. -A. J. Gastrulation in Drosophila melanogaster: Genetic control, cellular basis and biomechanics. Mechanisms of Development. 163, 103629 (2020).
  28. Leptin, M. Twist and snail as positive and negative regulators during Drosophila mesoderm development. Genes & Development. 5 (9), 1568-1576 (1991).
  29. Costa, M., Wilson, E. T., Wieschaus, E. A putative cell signal encoded by the folded gastrulation gene coordinates cell shape changes during Drosophila gastrulation. Cell. 76 (6), 1075-1089 (1994).
  30. Kerridge, S., et al. Modular activation of Rho1 by GPCR signalling imparts polarized myosin II activation during morphogenesis. Nature Cell Biology. 18 (3), 261-270 (2016).
  31. Kölsch, V., Seher, T., Fernandez-Ballester, G. J., Serrano, L., Leptin, M. Control of Drosophila gastrulation by apical localization of adherens junctions and RhoGEF2. Science. 315 (5810), 384-386 (2007).
  32. Manning, A. J., Peters, K. A., Peifer, M., Rogers, S. L. Regulation of epithelial morphogenesis by the G protein-coupled receptor mist and its ligand fog. Science Signaling. 6 (301), (2013).
  33. Parks, S., Wieschaus, E. The Drosophila gastrulation gene concertina encodes a G alpha-like protein. Cell. 64 (2), 447-458 (1991).
  34. Barrett, K., Leptin, M., Settleman, J. The Rho GTPase and a putative RhoGEF mediate a signaling pathway for the cell shape changes in Drosophila gastrulation. Cell. 91 (7), 905-915 (1997).
  35. Dawes-Hoang, R. E., et al. Folded gastrulation, cell shape change and the control of myosin localization. Development. 132 (18), 4165-4178 (2005).
  36. Häcker, U., Perrimon, N. DRhoGEF2 encodes a member of the Dbl family of oncogenes and controls cell shape changes during gastrulation in Drosophila. Genes & Development. 12 (2), 274-284 (1998).
  37. Martin, A. C., Kaschube, M., Wieschaus, E. F. Pulsed contractions of an actin-myosin network drive apical constriction. Nature. 457 (7228), 495-499 (2009).
  38. Mason, F. M., Tworoger, M., Martin, A. C. Apical domain polarization localizes actin-myosin activity to drive ratchet-like apical constriction. Nature Cell Biology. 15 (8), 926-936 (2013).
  39. Nikolaidou, K. K., Barrett, K. A Rho GTPase signaling pathway is used reiteratively in epithelial folding and potentially selects the outcome of Rho activation. Current Biology. 14 (20), 1822-1826 (2004).
  40. Martin, A. C., Gelbart, M., Fernandez-Gonzalez, R., Kaschube, M., Wieschaus, E. F. Integration of contractile forces during tissue invagination. The Journal of Cell Biology. 188 (5), 735-749 (2010).
  41. Guo, H., Swan, M., He, B. Optogenetic inhibition of actomyosin reveals mechanical bistability of the mesoderm epithelium during Drosophila mesoderm invagination. eLife. 11, e69082 (2022).
  42. Sebti, S. M., Der, C. J. Searching for the elusive targets of farnesyltransferase inhibitors. Nature Reviews. Cancer. 3 (12), 945-951 (2003).
  43. Roberts, P. J., et al. Rho family GTPase modification and dependence on CAAX motif-signaled posttranslational modification. The Journal of Biological Chemistry. 283 (37), 25150-25163 (2008).
  44. Feig, L. A., Cooper, G. M. Inhibition of NIH 3T3 cell proliferation by a mutant ras protein with preferential affinity for GDP. Molecular and Cellular Biology. 8 (8), 3235-3243 (1988).
  45. Liu, H., et al. Photoexcited CRY2 interacts with CIB1 to regulate transcription and floral initiation in Arabidopsis. Science. 322 (5907), 1535-1539 (2008).
  46. Kennedy, M. J., et al. Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in living cells. Nature Methods. 7 (12), 973-975 (2010).
  47. Guglielmi, G., Barry, J. D., Huber, W., De Renzis, S. An optogenetic method to modulate cell contractility during tissue morphogenesis. Developmental Cell. 35 (5), 646-660 (2015).
  48. Izquierdo, E., Quinkler, T., De Renzis, S. Guided morphogenesis through optogenetic activation of Rho signalling during early Drosophila embryogenesis. Nature Communications. 9 (1), 2366 (2018).
  49. Hutson, M. S., et al. Forces for morphogenesis investigated with laser microsurgery and quantitative modeling. Science. 300 (5616), 145-149 (2003).
  50. Rauzi, M., Lenne, P. -F. Probing cell mechanics with subcellular laser dissection of actomyosin networks in the early developing Drosophila embryo. Methods in Molecular Biology. 1189, 209-218 (2015).
  51. Rauzi, M., Verant, P., Lecuit, T., Lenne, P. -F. Nature and anisotropy of cortical forces orienting Drosophila tissue morphogenesis. Nature Cell Biology. 10 (12), 1401-1410 (2008).
  52. Hunter, C., Wieschaus, E. Regulated expression of nullo is required for the formation of distinct apical and basal adherens junctions in the Drosophila blastoderm. The Journal of Cell Biology. 150 (2), 391-401 (2000).
  53. Oda, H., Tsukita, S. Real-time imaging of cell-cell adherens junctions reveals that Drosophila mesoderm invagination begins with two phases of apical constriction of cells. Journal of Cell Science. 114, 493-501 (2001).
  54. Munjal, A., Philippe, J. -M., Munro, E., Lecuit, T. A self-organized biomechanical network drives shape changes during tissue morphogenesis. Nature. 524 (7565), 351-355 (2015).
  55. Rørth, P. Gal4 in the Drosophila female germline. Mechanisms of Development. 78 (1-2), 113-118 (1998).
  56. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  57. Magie, C. R., Meyer, M. R., Gorsuch, M. S., Parkhurst, S. M. Mutations in the Rho1 small GTPase disrupt morphogenesis and segmentation during early Drosophila development. Development. 126 (23), 5353-5364 (1999).
  58. Rich, A., Fehon, R. G., Glotzer, M. Rho1 activation recapitulates early gastrulation events in the ventral, but not dorsal, epithelium of Drosophila embryos. eLife. 9, e56893 (2020).
  59. Herrera-Perez, R. M., Cupo, C., Allan, C., Lin, A., Kasza, K. E. Using optogenetics to link myosin patterns to contractile cell behaviors during convergent extension. Biophysical Journal. 120 (19), 4214-4229 (2021).

Tags

Ontwikkelingsbiologie optogenetica weefselmechanica Rho1 actomyosine laserablatie apicale vernauwing gastrulatie
Optogenetische remming van Rho1-gemedieerde actomyosinecontractiliteit in combinatie met meting van epitheliale spanning in <em>Drosophila-embryo's</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Guo, H., Swan, M., He, B.… More

Guo, H., Swan, M., He, B. Optogenetic Inhibition of Rho1-Mediated Actomyosin Contractility Coupled with Measurement of Epithelial Tension in Drosophila Embryos. J. Vis. Exp. (194), e65314, doi:10.3791/65314 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter