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Developmental Biology

Inibição Optogenética da Contratilidade da Actomiosina Mediada por Rho1 Juntamente com a Medida da Tensão Epitelial em Embriões de Drosophila

Published: April 14, 2023 doi: 10.3791/65314
Automatic Translation
1,2, 3, 1
1Department of Biological Sciences, Dartmouth College, 2School of Life Sciences, Westlake University, 3Department of Molecular Biology, Princeton University

Summary

A contratilidade da actomiosina desempenha um papel importante na morfogênese celular e tecidual. No entanto, é um desafio manipular agudamente a contratilidade da actomiosina in vivo . Este protocolo descreve um sistema optogenético que inibe rapidamente a contratilidade da actomiosina mediada por Rho1 em embriões de Drosophila , revelando a perda imediata da tensão epitelial após a inativação da actomiosina in vivo.

Abstract

As forças contráteis geradas pela actina e pela miosina não muscular II ("contratilidade da actomiosina") são críticas para alterações morfológicas de células e tecidos em múltiplas escalas de comprimento, tais como divisão celular, migração celular, dobramento epitelial e morfogênese ramificada. Uma compreensão profunda do papel da contratilidade da actomiosina na morfogênese requer abordagens que permitam a rápida inativação da actomiosina, o que é difícil de ser alcançado usando abordagens genéticas ou farmacológicas convencionais. O protocolo apresentado demonstra o uso de um sistema de dimerização optogenética baseado em CRY2-CIBN, Opto-Rho1DN, para inibir a contratilidade da actomiosina em embriões de Drosophila com controles temporais e espaciais precisos. Neste sistema, CRY2 é fundido à forma negativa dominante de Rho1 (Rho1DN), enquanto CIBN é ancorado à membrana plasmática. A dimerização mediada pela luz azul de CRY2 e CIBN resulta em rápida translocação de Rho1DN do citoplasma para a membrana plasmática, onde inativa a actomiosina inibindo Rho1 endógeno. Além disso, este artigo apresenta um protocolo detalhado para acoplamento da inativação da actomiosina mediada por Opto-Rho1DN com ablação a laser para investigar o papel da actomiosina na geração de tensão epitelial durante a formação do sulco ventral de Drosophila . Este protocolo pode ser aplicado a muitos outros processos morfológicos que envolvem a contratilidade da actomiosina em embriões de Drosophila com modificações mínimas. Em geral, esta ferramenta optogenética é uma abordagem poderosa para dissecar a função da contratilidade da actomiosina no controle da mecânica tecidual durante o remodelamento dinâmico tecidual.

Introduction

A contratilidade da actomiosina, força contrátil exercida pela miosina II não muscular (doravante denominada "miosina") sobre a rede de actina-F, é uma das forças mais importantes na mudança da forma celular e na condução da morfogênese tecidual 1,2. Por exemplo, a ativação da contratilidade da actomiosina no domínio apical das células epiteliais resulta em constrição apical, o que facilita uma variedade de processos morfogenéticos, incluindo dobramento epitelial, extrusão celular, delaminação e cicatrização de feridas 3,4,5,6,7 . A ativação da miosina requer a fosforilação de sua cadeia leve reguladora. Essa modificação alivia a conformação inibitória das moléculas de miosina, permitindo que elas formem feixes filamentares de miosina bipolar com múltiplos domínios de cabeça em ambas as extremidades. Os filamentos bipolares de miosina conduzem o movimento antiparalelo dos filamentos de actina e resultam na geração de força contrátil 1,8,9.

A pequena GTPase RhoA (Rho1 em Drosophila) conservada evolutivamente desempenha um papel central na ativação da contratilidade da actomiosina em vários contextos celulares10,11. Rho1 funciona como um interruptor bimolecular, ligando-se a GTP (forma ativa) ou GDP (forma inativa)12. A ciclagem entre Rho1 ligado ao GTP ou GDP-bound é regulada por suas proteínas ativadoras de GTPase (GAPs) e fatores de troca de nucleotídeos guanina (GEFs)13. Os GEFs funcionam para facilitar a troca de PIB por GTP e, assim, ativar a atividade Rho1. Os GAPs, por outro lado, aumentam a atividade GTPase de Rho1 e, assim, desativam Rho1. O Rho1 ativado promove a contratilidade da actomiosina interagindo e ativando seus efetores a jusante, a quinase associada ao Rho (Rok) e a diáfana14. Rok induz a ativação da miosina e a contratilidade da actomiosina fosforilando a cadeia leve reguladora da miosina15. Além disso, Rok também inibe a fosfatase de cadeia leve reguladora da miosina e, portanto, promove ainda mais a montagem do filamento de miosina16. Rok também pode fosforilar LIM quinases, que, quando ativadas, impedem a desmontagem da actina fosforilando e inibindo o fator de despolimerização da actinacofilina 17,18. O diáfano é um nucleador de actina da família das forminas que promove a polimerização da actina, fornecendo uma base para a miosina interagir com 19,20,21.

Embora os mecanismos celulares que ativam a contratilidade da actomiosina tenham sido bem elucidados, nossa compreensão de sua função na regulação do remodelamento dinâmico tecidual permanece incompleta. O preenchimento dessa lacuna de conhecimento requer abordagens que possam inativar rapidamente a actomiosina em regiões específicas do tecido in vivo e registrar o impacto imediato no comportamento e nas propriedades teciduais. Este protocolo descreve o uso de uma abordagem optogenética para inibir agudamente a contratilidade da actomiosina durante a invaginação do mesoderma de Drosophila, seguida de medição da tensão epitelial usando ablação a laser. Durante a gastrulação de Drosophila, as células precursoras do mesoderma localizadas ventralmente sofrem constrição apical e invaginam a partir da superfície do embrião, formando um sulco orientado anteroposterior22,23. A formação de sulcos ventrais tem sido utilizada há muito tempo como modelo para o estudo do mecanismo de dobramento epitelial. A formação do sulco ventral é administrada pelo sistema de padronização dorso-ventral em Drosophila24,25,26,27. A expressão de dois fatores de transcrição, Twist e Snail, localizados na face ventral do embrião, controla a formação do sulco ventral e especifica o destino das células mesodérmicas28. Twist e Snail ativam o recrutamento do Rho1 GEF RhoGEF2 para o ápice das células precursoras do mesoderma através de uma via de receptor acoplado à proteína G e uma proteína adaptadora RhoGEF2, T48 29,30,31,32,33. Em seguida, o RhoGEF2 ativa a miosina em toda a superfície apical do mesoderma potencial através da via Rho-Rho quinase 34,35,36,37,38,39. A miosina ativada forma uma rede supracelular de actomiosina em toda a superfície apical do mesoderma primórdio, cujas contrações conduzem a constrição apical e resultam em rápido aumento da tensão tecidual apical14,37,40.

A ferramenta optogenética descrita neste protocolo, Opto-Rho1DN, inibe a contratilidade da actomiosina através do recrutamento da membrana plasmática dependente de luz azul de uma forma dominante negativa de Rho1 (Rho1DN)41. Uma mutação T19N em Rho1DN elimina a capacidade da proteína mutante de trocar GDP por GTP e, assim, torna a proteína perpetuamente inativa34. Uma mutação subsequente em Rho1DN, C189Y, elimina seu sinal de direcionamento de membrana virgens42,43. Quando Rho1DN é infundido à membrana plasmática, ele se liga e retém Rho1 GEFs, bloqueando assim a ativação de Rho1, bem como a ativação de miosina e actina mediada por Rho134,44. O recrutamento da membrana plasmática de Rho1DN é obtido através de um módulo de dimerização dependente de luz derivado do Cryptochrome 2 e seu parceiro de ligação CIB1. O criptocromo 2 é um fotorreceptor de criptocromo ativado pela luz azul em Arabidopsis thaliana45. O criptocromo 2 liga-se à CIB1, uma proteína básica hélice-alça-hélice, apenas em seu estado fotoexcitado45. Posteriormente, verificou-se que a região conservada N-terminal, fotoliase homologia (PHR), do Criptocromo 2 (CRY2PHR, doravante denominada CRY2) e o domínio N-terminal (aa 1-170) do CIB1 (doravante CIBN) são importantes para a dimerização induzida pela luz46. Opto-Rho1DN contém dois componentes. O primeiro componente é a proteína CIBN fusionada com uma âncora CAAX, que localiza a proteína na membrana plasmática47. O segundo componente é o mCherry-tagged CRY2 fundido com Rho1DN41. Na ausência de luz azul, CRY2-Rho1DN permanece no citoplasma. Após a estimulação com luz azul, o CRY2-Rho1DN é direcionado para a membrana plasmática através da interação entre CIBN ancorado na membrana e CRY2 excitado. Opto-Rho1DN pode ser ativado por luz ultravioleta A (UVA) e luz azul (400-500 nm, pico de ativação em 450-488 nm), ou por um laser pulsado de 830-980 nm ao realizar estimulação de dois fótons41,46,47,48. Portanto, Opto-Rho1DN é estimulado por comprimentos de onda normalmente usados para excitar GFP (488 nm para imagens de fóton único e 920 nm para imagens de dois fótons). Em contraste, comprimentos de onda comumente usados para excitar mCherry (561 nm para imagens de fóton único e 1.040 nm para imagens de dois fótons) não estimulam o módulo optogenético e, portanto, podem ser usados para imagens de pré-estimulação. O protocolo descreve as abordagens utilizadas para minimizar o risco de estimulação indesejada durante a manipulação da amostra.

A ablação a laser tem sido extensivamente empregada para detectar e medir a tensão em células e tecidos49. Estudos anteriores mostraram que, quando a intensidade do laser é adequadamente controlada, a ablação com laser de dois fótons empregando um laser infravermelho próximo de femtossegundo pode prejudicar fisicamente algumas estruturas subcelulares (por exemplo, redes de actomiosina cortical) sem causar arrebatamento da membrana plasmática50,51. Se o tecido estiver sob tensão, a ablação a laser de uma região de interesse dentro do tecido resulta em um recuo externo imediato das células adjacentes à região ablada. A velocidade de recuo é função da magnitude da tensão e da viscosidade do meio (citoplasma) que circunda as estruturas submetidas ao recuo49. Devido à profundidade de penetração superior dos lasers de infravermelho próximo e à capacidade de alcançar uma ablação focal bem confinada, a ablação a laser de dois fótons é particularmente útil para detectar tensão tecidual in vivo. Como demonstrado neste protocolo, este método pode ser facilmente combinado com a inativação da contratilidade da actomiosina mediada por Opto-Rho1DN para investigar o impacto direto da contratilidade celular Rho1-dependente na mecânica tecidual durante a remodelação dinâmica tecidual.

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Protocol

1. Montagem do cruzamento genético e preparo do copo de coleta de óvulos

  1. Selecionar moscas fêmeas (virgens) da linhagem optogenética UASp-CIBNpm (I); UASp-CRY2-Rho1DN-mCherry (III) em uma almofada de CO2 sob um estereomicroscópio e montou um cruzamento com moscas machos da linha de driver GAL4 materna 67 Sqh-mCherry; 15 E-caderina-GFP.
    NOTA: O 67 e o 15 significam GAL4 maternal-tubulina inserida no segundo (II) e terceiro (III) cromossomos, respectivamente52. A linha GAL4 utilizada neste protocolo também expressa a cadeia leve reguladora de miosina marcada com mCherry Sqh (Spaghetti squash)37 e a E-caderina53 marcada com GFP. Moscas da linhagem optogenética ainda podem conter cromossomos balanceadores FM7 e TM6. As moscas da linha de driver GAL4 materna ainda podem conter os cromossomos balanceadores CyO e TM3.
  2. Após ~10 dias, selecionar moscas fêmeas F1 com o seguinte genótipo: UASp-CIBNpm/+; 67 m²-cereja/+; 15 E-caderina-GFP/UASp-CRY2-Rho1DN-mCherry. Monte um copo de coleta de ovos com as moscas machos.
    1. Certifique-se de que as moscas fêmeas com o genótipo correto não contenham cromossomos balanceadores (ou seja, não devem conter asas encaracolados [Cy], cerdas curtas [Sb], olhos em forma de barra ou rim [B] ou cerdas extraumerais [Hu]), que são marcadores para os balanceadores CyO, TM3, FM7 e TM6 usados na geração dos estoques, respectivamente. Cubra o copo com um prato de suco de maçã com um toque de pasta de fermento fresco na superfície.
      NOTA: Nas fêmeas F1, os componentes optogenéticos são expressos maternalmente. Portanto, as fêmeas de F1 usadas para montar a taça não precisam ser virgens. Recomenda-se o uso de moscas machos da mesma população F1 para o copo por conveniência.
  3. Mantenha o copo em uma caixa de papelão coberta com papel alumínio para evitar qualquer possível vazamento de luz do ambiente. Troque o prato de suco de maçã todos os dias por xícaras mantidas à temperatura ambiente (~21-23 °C), ou a cada dois dias por xícaras mantidas a 18 °C.
    1. Imediatamente antes da troca do prato, bata o copo em uma superfície plana (por exemplo, bancada) para manter as moscas na parte inferior do copo e evitar que escapem. Troque o prato de suco de maçã em um quarto escuro e use um farol com luz vermelha para iluminação (consulte a Tabela de Materiais).
      OBS: Para aumentar a expressão dos construtos que estão sob o controle materno-tubulina-GAL4 e UASp, recomenda-se manter o copo a 18 °C por no mínimo 3 dias antes da coleta do embrião. Este período de incubação também permite que as moscas se adaptem à xícara e sejam bem alimentadas com a pasta de levedura para alcançar a produção ideal de ovos.

2. Coleta de embriões na fase desejada e preparo para estimulação optogenética

NOTA: Todas as etapas de coleta e preparação de amostras precisam ser realizadas em uma sala escura, usando uma "luz segura" (por exemplo, luz vermelha) para iluminação. Os componentes optogenéticos são imensamente sensíveis à luz ambiente. Mesmo a menor exposição à luz ambiente leva à estimulação prematura do espécime. Normalmente, as luzes na faixa verde-vermelha (>532 nm) não causam estimulação indesejada.

  1. Para a coleta de embriões no início da embriogênese, colocar um novo prato de suco de maçã no copo 8 a 16 h antes da coleta de embriões (a 18 °C).
  2. No momento da coleta do embrião, troque o prato de suco de maçã. Rotule o prato retirado do copo e cubra a superfície do prato com uma fina camada de óleo de Halocarbon 27 (ver Tabela de Materiais). Aguarde 30-60 s para que a casca do ovo fique transparente.
  3. Coloque um escudo de plástico laranja-vermelho (consulte Tabela de Materiais) no palco de um estereoscópio vertical. A colocação do escudo laranja-vermelho evita estímulos indesejáveis durante a iluminação da amostra, bloqueando os comprimentos de onda azul-esverdeados da luz transmitida.
    NOTA: Neste protocolo, um estereoscópio vertical é usado para a coleta de embriões (consulte a Tabela de Materiais).
  4. Coloque o prato de suco de maçã em cima do escudo vermelho-alaranjado. Ligue a luz transmitida do estereomicroscópio para iluminar a amostra. Colete 5-15 embriões no estágio apropriado da placa de suco de maçã usando uma pinça. Não esprema os embriões com a pinça.
    NOTA: Neste protocolo, o embrião apropriado deve estar na fase de celularização precoce-média. O embrião nesta fase deve ter uma gema escura opaca rodeada por uma camada de periplasma clara e uniforme que contenha as células blastodérmicas em formação. A borda dianteira dos sulcos de clivagem ("frente de celularização"), que aparece como uma linha contínua paralela à superfície do embrião, não deve ultrapassar metade da profundidade do periplasma.
  5. Esfregue suavemente os embriões em um pedaço de papel toalha (~1,5 cm × 1,5 cm) para remover o excesso de óleo dos embriões usando a pinça.
  6. Adicione várias gotas de água sanitária a 40% recém-preparada (~3% de hipoclorito de sódio; ver Tabela de Materiais) a um novo pedaço quadrado de papel toalha (~1,5 cm × 1,5 cm) usando uma pipeta de transferência de plástico para que a toalha de papel seja coberta com uma fina camada de água sanitária. Transfira o embrião da toalha de papel seca para a toalha de papel embebida em água sanitária usando a pinça e certifique-se de que os embriões estejam embebidos em água sanitária. Aguarde 2-4 min para que o embrião se descorione.
  7. Após a descorionação, use a pinça para manchar a toalha de papel quadrado em um pedaço grande de papel de seda para remover o excesso de água sanitária. Certifique-se de que o lado com os embriões está virado para cima.
  8. Para enxaguar os embriões, use a pinça para mergulhar suavemente a toalha de papel quadrada em uma gota de água deionizada e rapidamente borrá-la em um grande pedaço de papel de seda. Repita esse processo oito vezes para garantir a remoção de qualquer resíduo de água sanitária.
  9. Use uma ferramenta de cílios para transferir o embrião da toalha de papel para um prato com fundo de vidro de 35 mm (consulte a Tabela de Materiais). Adicione água deionizada ao prato para cobrir totalmente os embriões. Ajuste a posição e orientação dos embriões usando a ferramenta de cílios.
    NOTA: Após a descorionação, o embrião tende a grudar na superfície do vidro e fica imóvel sem perturbação, por isso não é necessário aplicar tratamento adicional (como cola) para imobilizar o embrião na placa de fundo de vidro.
  10. Coloque a placa com fundo de vidro de 35 mm com os embriões dentro de uma caixa preta à prova de luz (ver Tabela de Materiais) para proteger a amostra da exposição à luz durante o processo de transferência. Traga a caixa para a sala com o microscópio multifóton.

3. Estimulação optogenética, ablação a laser e imagem do embrião

NOTA: O sistema multifóton usado neste experimento (ver Tabela de Materiais) é capaz de obter imagens simultâneas de comprimento de onda duplo. Ele também contém uma unidade de fotoestimulação com um laser de 458 nm e um scanner de galvanômetro separado, permitindo a fotoativação/estimulação dentro de uma região de interesse (ROI) definida. É importante notar que o laser de 920 nm, que é usado para excitar proteínas fluorescentes verde-amarelas, estimulará Opto-Rho1DN, embora mais lentamente em comparação com a estimulação mediada por laser azul.

  1. Cubra o microscópio multifóton com um pano preto à prova de luz (ver Tabela de Materiais) para evitar a estimulação indesejada dos embriões durante a configuração da amostra e a obtenção de imagens.
    NOTA: A mesma abordagem é usada durante imagens regulares de multifótons para proteger os detectores sensíveis à luz equipados no microscópio.
  2. Desligue a luz da sala e as telas do computador. Desligue o controlador do painel de toque clicando em OFF em 'Luz de fundo do controlador do painel de toque' no software. Certifique-se de que não há outra luz ambiente na sala.
    1. Abra a parte frontal da capa de pano preta no microscópio. Pegue o prato de fundo de vidro de 35 mm da caixa preta e coloque-o no palco do microscópio.
  3. Iluminar embriões com uma luz verde normalmente usada como luz de excitação para epifluorescência. Para fazer isso, ligue a unidade de iluminação de fluorescência, selecione Ocular no painel 'Ocular' no software e altere a 'Torre do cubo' para 4:TRITC. Use a ocular para identificar o embrião de interesse e colocá-lo em foco.
    NOTA: A visualização da luz verde é obtida permitindo que uma luz branca gerada pela unidade de iluminação de fluorescência passe através de um cubo de filtro TRITC padrão integrado, que contém um filtro de excitação de 528-553 nm, um divisor de feixe de 565 nm e um filtro de emissão de 590-650 nm. Outras luzes não azuis também devem funcionar bem para iluminação de amostras. Não é necessário usar proteção ocular nesta etapa, já que a luz de excitação tem baixa intensidade e não será direcionada para a ocular. O embrião aparecerá uniformemente vermelho devido à autofluorescência.
  4. Feche a tampa de pano preta para que a amostra esteja totalmente protegida da luz. Ligue a tela do computador para acessar o software que controla o microscópio. Alterar o 'Ocular' para LSM no software para aquisição das imagens.
  5. Realizar ablação a laser em embriões controlados e não estimulados usando uma objetiva de imersão em água 25x.
    1. Clique em Bright Z, Sequence Manager e LSM Stimulation na 'Janela de ferramentas' no software. Defina o tipo de scanner como Galvano e o tamanho da varredura como 512 × 512. Ligue CH1 e CH3 no painel 'Configuração de PMT' para permitir o uso do laser de 1.040 nm e clique em Live × 4 para visualizar o embrião.
    2. Gire o embrião usando a função Rotação no software para que o eixo anteroposterior do embrião seja orientado verticalmente. Defina o zoom como 3. Desenhe uma região de interesse (ROI) usando a ferramenta de forma em 'Configurações de digitalização' e defina o tamanho do ROI no painel 'Referência'. Defina o ROI como 512 pixels de largura e 100 pixels de altura (171 × 33 μm2).
    3. Definir parâmetros de aquisição para a pilha Z pré-ablação.
      1. Registar a superfície do embrião como 0 na «Secção Z». Defina o início como 0 e o final como 100 μm. Defina o tamanho do passo como 2 μm. Ative o modo de aquisição Z marcando Z na guia 'Série'.
      2. Ajuste a intensidade do laser de 1.040 nm para aumentar linearmente de 3% para 7% usando a função Bright Z .
      3. Salve a configuração de imagem atual como a primeira tarefa do pipeline clicando em LSM em 'Gerenciador de sequência'.
        NOTA: A pilha Z de pré-ablação é obtida para confirmar o estágio do embrião. Neste experimento, CRY2-Rho1DN-mCherry e Sqh-mCherry serão excitados pelo laser de 1.040 nm. Durante a constrição apical, o sinal Sqh-mCherry é realçado na região medioapical das células mesodérmicas ventrais, enquanto CRY2-Rho1DN-mCherry é citosólico antes da estimulação. A intensidade do laser empregada nas imagens pré e pós-estimulação é decidida empiricamente com base no equilíbrio entre a ótima relação sinal-ruído e a evitação do fotoclareamento.
    4. Definir parâmetros de aquisição para o filme pré-ablação.
      1. Exclua qualquer ROI existente para permitir a obtenção de imagens de toda a região de 512 × 512 pixels (zoom de 171 × 171 μm 2, 3x) perto da superfície ventral do embrião, conforme descrito na etapa 3.5.2. Ajuste a intensidade do laser de 1.040 nm para 3%.
      2. Marque Hora e desmarque Z no painel 'Série'. Mantenha o 'Intervalo' como FreeRun no painel 'Time Lapse'. Defina o ciclo como 10.
      3. Salve as configurações atuais como a próxima tarefa do pipeline clicando em LSM em 'Gerenciador de sequências'.
        NOTA: O objetivo desta tarefa é obter um filme de pré-ablação de 10 quadros de plano Z único com um laser de 1.040 nm para aquisição de imagens. A velocidade de aquisição da imagem é de aproximadamente 1 s por quadro.
    5. Defina os parâmetros para ablação a laser.
      1. Defina uma região 3D imediatamente abaixo da membrana vitelínica até ~20 μm de profundidade para ablação a laser (Figura 1A). Defina o início da pilha Z como o plano que está imediatamente abaixo da membrana vitelínica, e o final como 20 μm mais profundo do que o plano inicial. Defina o tamanho do passo como 1,5 μm.
        NOTA: O ROI da região ablada é de ~30 pixels de largura e ~10 pixels de altura (~10 μm ao longo do eixo médio-lateral e ~3,3 μm ao longo do eixo A-P). O objetivo da ablação da amostra em múltiplos planos Z é garantir que a superfície apical das células ventrais seja ablida. Isso é especificamente importante para os embriões estimulados, pois as células ventrais experimentam rápido relaxamento apical após a inibição de Rho1.
      2. Ligue CH2 e CH4 no painel 'Configuração PMT' para permitir o uso do laser de 920 nm. Ajuste a intensidade do laser de 920 nm para 30%. Ajuste a aquisição de imagens com o laser de 920 nm para uma única pilha Z dentro da região 3D definida na etapa 3.5.5.1 para ablação a laser.
        NOTA: A intensidade do laser escolhida nesta etapa é suficiente para aplacar o tecido (como indicado pelo recuo tecidual imediatamente após o tratamento com laser), mas enquanto isso obviamente não danifica a membrana plasmática (como indicado pela falta de marcas de queimadura na membrana celular) (Figura 1B,C).
      3. Salve a configuração atual como a próxima tarefa do pipeline clicando em LSM em 'Gerenciador de sequência'.
    6. Definir parâmetros de aquisição para o filme pós-ablação.
      1. Ajuste a aquisição de imagens para um filme pós-ablação de 100 quadros em um único plano Z usando os lasers de 1.040 nm e 920 nm. Ajuste a intensidade do laser de 1.040 nm e do laser de 920 nm para 3% e 0,3%, respectivamente. A região especificada na etapa 3.5.4 será fotografada com velocidade de aquisição de imagem idêntica.
      2. Salve a configuração atual como a próxima tarefa do pipeline clicando em LSM em 'Gerenciador de sequência'.
        NOTA: O objetivo de armazenar os parâmetros descritos nas etapas 3.5.3-3.5.6 como tarefas sequenciais no 'Gerenciador de Sequências' antes de qualquer aquisição real é garantir a captura da resposta tecidual imediata após a ablação a laser.
    7. Selecione Sequência em 'Adquirir'. Altere o caminho de salvamento de dados e o nome do arquivo conforme necessário. Clique em Pronto e aguarde até que o software inicialize o pipeline. Em seguida, clique em Iniciar para executar o pipeline.
  6. Realizar ablação a laser em embriões estimulados.
    1. Defina os parâmetros de aquisição para a pilha Z pré-ablação, conforme descrito nas etapas 3.5.1-3.5.3. Salve a configuração atual como a primeira tarefa do pipeline clicando em LSM em 'Gerenciador de sequências'.
    2. Definir parâmetros para estimulação optogenética dentro de uma ROI definida.
      1. Altere o zoom para 1 e selecione uma ROI que cubra a superfície ventral do embrião (~512 × 300 μm2). Desligue os detectores CH1-CH4 .
      2. Clique em Estimulação LSM. Desmarque Contínuo dentro de Duração e digite 12 s. Verifique os 458 nm com 0,3% de intensidade do laser.
      3. Salve a configuração atual como a próxima tarefa do pipeline clicando em Estimulação em 'Gerenciador de sequências'.
        NOTA: Uma estimulação mais rápida pode ser obtida aumentando a intensidade do laser de 458 nm. No entanto, ao utilizar intensidades de laser mais elevadas, a luz laser espalhada pode estimular a região adjacente à ROI, o que não é ideal se for necessária uma estimulação espacialmente confinada.
    3. Defina um tempo de espera de 3 minutos após a estimulação para garantir a inativação total da miosina e a desmontagem da F-actina apical, e para alcançar uma morfologia tecidual estática antes da ablação a laser. Isso é conseguido clicando em Esperar/Pausar em 'Gerenciador de Sequência' e definindo o tempo desejado para 'Esperar'.
      NOTA: O recrutamento de CRY2-Rho1DN-mCherry para a membrana causado por uma única rodada de estimulação (laser 0,3% 458 nm por 12 s) é claramente detectável 10-15 min após a estimulação. Isso está alinhado com o intervalo de dissociação publicado de ~9 min47.
    4. Definir parâmetros de aquisição para o filme pré-ablação no plano Z único, conforme descrito na etapa 3.5.4, exceto que ambos os lasers de 1.040 nm e 920 nm são usados para aquisição de imagens. Ligue os detectores CH1-CH4 . Ajuste a intensidade do laser de 1.040 nm e do laser de 920 nm para 3% e 0,3%, respectivamente. Salve a configuração atual como a próxima tarefa do pipeline clicando em LSM em 'Gerenciador de sequência'.
    5. Defina parâmetros para ablação a laser, conforme descrito na etapa 3.5.5. Salve a configuração atual como a próxima tarefa do pipeline clicando em LSM em 'Gerenciador de sequência'.
    6. Defina os parâmetros de aquisição para o único filme pós-ablação no plano Z, conforme descrito na etapa 3.5.6. Salve a configuração atual como a próxima tarefa do pipeline clicando em LSM em 'Gerenciador de sequência'.
    7. Selecione Sequência em 'Adquirir'. Altere o caminho de salvamento de dados e o nome do arquivo conforme necessário. Clique em Pronto e aguarde até que o software inicialize o pipeline. Em seguida, clique em Iniciar para executar o pipeline.

4. Quantificação da taxa de recolhimento tecidual após ablação a laser

  1. Abra o filme pós-ablação no ImageJ.
  2. Desenhe uma pequena ROI ao longo da linha média ventral que cobre a região ablida, usando a ferramenta Seleção de retângulo . A largura do ROI é de nove pixels. A altura da ROI é definida de tal forma que a ROI é grande o suficiente para cobrir toda a faixa de recuo do tecido após a ablação a laser.
    1. Clique em Duplicar na guia 'Imagem'. Na janela pop-up, marque Pilha duplicada e clique em OK para duplicar a pilha dentro do ROI selecionado.
  3. Gere uma montagem a partir da pilha duplicada através de Image > Stacks > Make Montage. Na janela pop-up, defina o número da linha como 1 e o número da coluna como o número total de quadros na pilha (100 neste caso).
  4. Meça a largura A-P da região ablida, ao longo do tempo, a partir da montagem gerada.
    1. Use a ferramenta Multiponto no ImageJ para marcar os limites A-P da região ablated para cada ponto de tempo na montagem.
    2. Salve as coordenadas dos pontos marcados usando Arquivo > Salvar como > Coordenadas XY.
    3. Importe as coordenadas XY medidas para o MATLAB. Calcule a largura A-P da região ablada para cada ponto de tempo subtraindo a coordenada Y do limite superior da coordenada Y do limite inferior.
  5. Determine a taxa de recuo do tecido ajustando os primeiros 20 s da curva "largura ao longo do tempo" em uma linha usando a função "polyfit" no MATLAB. Relate a inclinação da linha ajustada como a taxa de recuo do tecido.
  6. Realizar testes estatísticos para comparar a taxa de recolhimento tecidual entre as amostras estimuladas e não estimuladas.
    NOTA: Recomenda-se obter dados de pelo menos cinco embriões por condição. Tanto o teste da soma de postos de Wilcoxon bicaudal quanto o teste t de Student bicaudal podem ser usados para comparação estatística.

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Representative Results

Nos embriões não estimulados submetidos à constrição apical, o Sqh-mCherry enriqueceu-se na região medioapical das células mesodérmicas ventrais, enquanto o CRY2-Rho1DN-mCherry foi citosólico (Figura 1A). A ablação a laser dentro do domínio de constrição levou a um rápido recuo tecidual ao longo do eixo A-P (Figura 1B,C). Nos embriões estimulados, o sinal CRY2-Rho1DN-mCherry tornou-se localizado na membrana plasmática, enquanto o sinal medioapical de Sqh-mCherry desapareceu completamente (Figura 1A). A ablação a laser nos embriões estimulados não resultou em evidente recuo tecidual, como exemplificado na Figura 1B,C e quantificado na Figura 1D. Esses resultados indicam que a geração de tensão tecidual requer contratilidade ativa da actomiosina apical; quando a actomiosina se torna inativa com a inibição de Rho1, a tensão tecidual apical também diminui41. Essas observações são consistentes com os achados anteriores de que a ativação da contratilidade da miosina apical em células mesodérmicas ventrais resulta em aumento da tensão tecidual na superfície ventral do embrião40.

Figure 1
Figura 1: A estimulação com Opto-Rho1DN durante a constrição apical resulta em perda imediata da tensão cortical na superfície ventral do embrião . (A) Desenho animado mostrando a configuração experimental para ablação a laser para detectar tensão cortical. Regiões sombreadas de amarelo indicam as regiões ablados. Para embriões estimulados, a ativação luminosa de Opto-Rho1DN foi realizada 3 minutos antes da ablação a laser. Devido ao relaxamento apical após a estimulação, múltiplos planos z foram ablados (região amarelada) para garantir a ablação da própria superfície apical das células ventrais. (B,C) Comparação entre embriões não estimulados e estimulados. Não foi observada recuo tecidual evidente nos embriões estimulados (N = 6 para embriões não estimulados e N = 5 para embriões estimulados). (B) Vista panorâmica dos embriões ablados. Caixas sombreadas de amarelo marcam a região ablada. (C) Quimografias que representam a mudança de largura da região ablada. Linhas pontilhadas amarelas indicam o local da ablação. (D) Mudanças de largura da região ablada ao longo do eixo A-P durante os primeiros 20 s após a ablação a laser. Um nítido recuo tecidual foi observado após o corte a laser nos embriões controles não estimulados. Em contraste, pouca ou nenhuma retração tecidual foi observada nos embriões estimulados, indicando ausência de tensão apical após a inibição de Rho1. A barra de erro é o desvio padrão. O valor de p foi calculado por meio do teste de Wilcoxon bicaudal. Esse valor é reutilizado de Guo et al.41. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Este protocolo descreveu o uso combinado de optogenética e ablação a laser para sondar mudanças na tensão tecidual imediatamente após a inativação da contratilidade da actomiosina. A ferramenta optogenética aqui descrita aproveita a forma negativa dominante de Rho1 (Rho1DN) para inibir agudamente a contratilidade endógena de Rho1 e actomiosina dependente de Rho1. A caracterização prévia do Opto-Rho1DN no contexto da formação do sulco ventral de Drosophila demonstrou que a ferramenta é altamente eficaz em mediar a rápida inativação da contratilidade apical da actomiosina através da inativação simultânea da miosina e desmontagem da actina41. Em particular, a estimulação dos embriões no momento da constrição apical resultou em redução do sinal da miosina apical dentro de 60 s em células submetidas à constrição apical41. Essa rápida remoção da miosina cortical após a inibição da Rho1 deve-se provavelmente à rápida ciclagem de Rho1 e miosina através dos estados ativo e inativo, causada pelas atividades das proteínas ativadoras da GTPase (GAPs) para as fosfatases de cadeia leve de Rho1 e miosina, respectivamente19,54. Consistente com o impacto na actomiosina, o acoplamento da optogenética com a ablação a laser demonstrou que a estimulação com Opto-Rho1DN durante a constrição apical resultou em perda imediata da tensão epitelial na região ventral do embrião41 (Figura 1). Essa abordagem combinada nos permitiu investigar a função da contratilidade celular mediada por Rho1 na regulação da mecânica tecidual com precisão espacial e temporal sem precedentes, tornando possível dissecar impactos imediatos de efeitos de longo prazo que são difíceis de alcançar usando abordagens genéticas convencionais.

Uma consideração técnica importante ao usar o Opto-Rho1DN é que a ferramenta é altamente sensível à luz ambiente. Um problema comumente encontrado no experimento é o recrutamento de CRY2-mCherry-Rho1DN para a membrana plasmática antes da etapa de estimulação, que é tipicamente causada pela estimulação prematura da amostra durante uma das seguintes etapas: preparação da amostra, transferência da amostra para a sala do microscópio, posicionamento da amostra no estágio do microscópio e aquisição da imagem pré-estimulação. Em nosso protocolo, múltiplos procedimentos são empregados para prevenir a estimulação indesejada, incluindo o manuseio das taças de mosca e embriões em uma sala escura sob luz vermelha, filtrando comprimentos de onda azuis da luz de iluminação ao selecionar e montar embriões sob o estereomicroscópio e evitando a exposição dos embriões a um laser de 400-500 nm (excitação de fóton único) ou a um laser pulsado de 830-980 nm (excitação multifóton) antes da estimulação. É fundamental praticar atenção extra em várias etapas do experimento para evitar a estimulação indesejada da amostra. Além disso, ao usar Opto-Rho1DN para inibir Rho1 dentro de uma região específica de interesse (ROI) no embrião41, recomenda-se usar a menor intensidade de laser que possa obter uma translocação robusta de CRY2-Rho1DN para a membrana plasmática. Como o Opto-Rho1DN é extremamente sensível a comprimentos de onda azuis, um laser azul de alta intensidade pode resultar em estimulação indesejada em células fora da ROI ou mesmo embriões vizinhos devido à luz espalhada.

Em sua versão atual, a ferramenta Opto-Rho1DN tem várias limitações. Primeiramente, para os experimentos descritos neste protocolo, uma âncora CIBN localizada na membrana plasmática foi usada para recrutar CRY2-Rho1DN ativado do citosol para a membrana plasmática41,47. Por este projeto, é difícil realizar a inibição Rho1 confinada dentro de um domínio específico da membrana plasmática devido à difusão de proteínas CRY2-Rho1DN ativadas no citosol. Melhorar ainda mais a precisão espacial na escala subcelular aguarda o desenvolvimento de novas âncoras CIBN que tenham padrões de localização subcelular mais específicos. Em segundo lugar, Opto-Rho1DN é projetado para inibir Rho1 durante a embriogênese inicial. A expressão de CIBNpm e CRY2-Rho1DN-mCherry é controlada por UASp, que é padronizado para expressão em linhagens germinativasfemininas55. A expressão desses módulos em tecidos somáticos além da embriogênese inicial pode exigir a substituição de UASp por um promotor que seja mais eficaz para conduzir a expressão somática (por exemplo, UASt56). Finalmente, a eficácia de Opto-Rho1DN é dependente da abundância da âncora CIBN e das proteínas CRY2-Rho1DN. Na versão atual da ferramenta, ela é determinada pela linha de driver GAL4 usada para acionar a expressão dos módulos optogenéticos. Ao usar o driver GAL4 materno descrito neste protocolo, é fundamental usar a linha que fornece duas cópias do gene GAL4 (por exemplo, 67 e 15) para alcançar a rápida e potente inibição da contratilidade da actomiosina. A redução do número de cópias de GAL4 materna nas fêmeas F1 de dois para um reduziu significativamente o efeito inibitório.

Comparada às abordagens genéticas convencionais, a abordagem optogenética descrita neste protocolo é vantajosa na dissecção do estágio e função tecido-específica de Rho1 em embriões iniciais de Drosophila. A função de Rho1 na embriogênese inicial de Drosophila é amplamente cumprida pelo produto gênico carregado maternalmente11. O esgotamento materno de Rho1 bloqueia a oogênese57, impedindo o estudo de sua função durante o início da embriogênese. Nos últimos anos, várias ferramentas optogenéticas têm sido desenvolvidas para regular a atividade endógena de Rho1 em embriões de Drosophila. desenvolveram ferramentas optogenéticas para ativar a atividade de Rho1, regulando a localização do domínio catalítico de GEFs Rho em embriões de Drosophila 48,58. Além disso, Herrera-Perez e col. desenvolveram duas ferramentas optogenéticas usando RhoGEF2 (optoGEF) ou C-GAP completo (optoGAP) para ativar ou inibir a atividade endógena de Rho1, respectivamente59. Como o optoGAP funciona recrutando um GAP Rho1 para a membrana plasmática, sua aplicação pode ser sensível à presença de GEFs Rho1 endógenos, o que pode compensar ou mesmo anular o efeito do recrutamento ectópico do GAP. Em contraste, ao sequestrar diretamente os GEFs Rho1, o Opto-Rho1DN pode fornecer uma maneira mais robusta de inibir a contratilidade endógena de Rho1 e Rho1-dependente de actomiosina.

Dada a ampla gama de funções de Rho1 na embriogênese e desenvolvimento pós-embrionário, o protocolo apresentado pode ser facilmente adaptado para estudar a função de reorganizações celulares dependentes de Rho1 e Rho1 em uma ampla gama de processos morfogenéticos. Além disso, uma estratégia semelhante pode, em princípio, ser usada para restringir severamente outras GTPases pequenas, como as GTPases da família Rho Cdc42 e Rac, uma vez que suas formas negativas dominantes têm sido amplamente utilizadas para inibir a função endógena dessas proteínas11. Finalmente, como exemplificado neste protocolo, a combinação de optogenética e abordagens de ablação a laser pode fornecer uma maneira eficaz de investigar o impacto imediato da inativação de uma proteína específica na dinâmica tecidual e mecânica tecidual, o que nos trará novos conhecimentos sobre a morfogênese tecidual que são difíceis de descobrir usando abordagens genéticas convencionais.

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Disclosures

Os autores declaram que a pesquisa foi conduzida na ausência de quaisquer relações comerciais ou financeiras que pudessem ser interpretadas como um potencial conflito de interesses.

Acknowledgments

Os autores agradecem a Ann Lavanway pelo suporte de imagem. Os autores agradecem ao laboratório Wieschaus e ao laboratório De Renzis pelo compartilhamento de reagentes e ao Bloomington Drosophila Stock Center pelos estoques de moscas. Este estudo é apoiado pelo R35GM128745 NIGMS ESI-MIRA e American Cancer Society Institutional Research Grant #IRG-82-003-33 para BH.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
35 mm glass-bottom dish MatTek P35G-1.5-10-C Used for sample preparation
60 mm × 15 mm Petri dish with lid Falcon 351007 Used for sample preparation
Black cloth for covering the microscope Online NA Used to avoid unwanted light stimulation
Clorox Ultra Germicadal Bleach (8.25% sodium hypochlorite) VWR 10028-048 Used for embryo dechorination
CO2 pad Genesee Scientific 59-114 Used for cross set-up
ddH2O NA NA Used for sample preparation
Dumont Style 5 tweezers VWR 102091-654 Used for sample preparation
Eyelash tool (made from pure red sable round brush #2) VWR 22940-834 Used for sample preparation
FluoView (Software) Olympus NA Used for image acquisition and optogenetic stimulation
Halocarbon oil 27 Sigma Aldrich H8773-100ML Used for embryo stage visualization
ImageJ/FIJI NIH NA Used for image analysis
MATLAB MathWorks NA Used for image analysis
Nikon SMZ-745 stereoscope Nikon NA Used for sample preparation
Olympus FVMPE-RS multiphoton microscope with InSight DS Dual-line Ultrafast Lasers for simultaneous dual-wavelength multiphoton imaging, , a 25x/NA1.05 water immersion objective (XLPLN25XWMP2), and an IR/VIS stimulation unit for photo-activation/stimulation. This system is also equipped with a TRITC filter (39005-BX3; AT-TRICT-REDSHFT 540/25x, 565BS, 620/60M), and a fluorescence illumination unit that emits white light. Olympus NA Used for image acquisition and optogenetic stimulation
SP Bel-Art 100-place polypropylene freezer storage box (Black, light-proof box for sample transfer) VWR 30621-392 Used to avoid unwanted light stimulation
UV Filter Shield for FM1403 Fluores (Orange-red plastic shield) Bolioptics FM14036151 Used to avoid unwanted light stimulation
VITCHELO V800 Headlamp with White and Red LED Lights Amazon NA Used to avoid unwanted light stimulation

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Biologia do Desenvolvimento Edição 194 optogenética mecânica tecidual Rho1 actomiosina ablação a laser constrição apical gastrulação
Inibição Optogenética da Contratilidade da Actomiosina Mediada por Rho1 Juntamente com a Medida da Tensão Epitelial em Embriões de <em>Drosophila</em>
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Guo, H., Swan, M., He, B. Optogenetic Inhibition of Rho1-Mediated Actomyosin Contractility Coupled with Measurement of Epithelial Tension in Drosophila Embryos. J. Vis. Exp. (194), e65314, doi:10.3791/65314 (2023).

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