Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

עיכוב אופטוגנטי של התכווצות אקטומיוזין בתיווך Rho1 יחד עם מדידת מתח אפיתל בעוברי דרוזופילה

Published: April 14, 2023 doi: 10.3791/65314
Automatic Translation
1,2, 3, 1
1Department of Biological Sciences, Dartmouth College, 2School of Life Sciences, Westlake University, 3Department of Molecular Biology, Princeton University

Summary

התכווצות אקטומיוזין ממלאת תפקיד חשוב במורפוגנזה של תאים ורקמות. עם זאת, זה מאתגר לתפעל התכווצות actomyosin in vivo בחריפות. פרוטוקול זה מתאר מערכת אופטוגנטית המעכבת במהירות את התכווצות האקטומיוזין בתיווך Rho1 בעוברי דרוזופילה , וחושפת את האובדן המיידי של מתח אפיתל לאחר השבתת אקטומיוזין in vivo.

Abstract

כוחות התכווצות הנוצרים על ידי אקטין ומיוזין שאינו שריר II ("התכווצות אקטומיוזין") הם קריטיים לשינויים מורפולוגיים של תאים ורקמות בסקאלות אורך מרובות, כגון חלוקת תאים, נדידת תאים, קיפול אפיתל ומורפוגנזה מסתעפת. הבנה מעמיקה של תפקיד התכווצות האקטומיוזין במורפוגנזה דורשת גישות המאפשרות השבתה מהירה של אקטומיוזין, דבר שקשה להשיג באמצעות גישות גנטיות או פרמקולוגיות קונבנציונליות. הפרוטוקול המוצג מדגים את השימוש במערכת דימריזציה אופטוגנטית מבוססת CRY2-CIBN, Opto-Rho1DN, כדי לעכב התכווצות אקטומיוזין בעוברי דרוזופילה עם בקרות זמניות ומרחביות מדויקות. במערכת זו, CRY2 מאוחה לצורה השלילית הדומיננטית של Rho1 (Rho1DN), בעוד CIBN מעוגן לקרום הפלזמה. דימריזציה בתיווך אור כחול של CRY2 ו-CIBN גורמת לטרנסלוקציה מהירה של Rho1DN מהציטופלסמה לקרום הפלזמה, שם הוא משבית אקטומיוזין על ידי עיכוב Rho1 אנדוגני. בנוסף, מאמר זה מציג פרוטוקול מפורט לצימוד אי-הפעלה בתיווך Opto-Rho1DN של אקטומיוזין עם אבלציה בלייזר כדי לחקור את תפקידו של אקטומיוזין ביצירת מתח אפיתל במהלך היווצרות תלמים גחונים של דרוזופילה . פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על תהליכים מורפולוגיים רבים אחרים הכוללים התכווצות אקטומיוזין בעוברי דרוזופילה עם שינויים מינימליים. בסך הכל, כלי אופטוגנטי זה הוא גישה רבת עוצמה לנתח את הפונקציה של התכווצות אקטומיוזין בשליטה על מכניקת רקמות במהלך עיצוב מחדש דינמי של רקמות.

Introduction

התכווצות אקטומיוזין, כוח ההתכווצות המופעל על ידי מיוזין שאינו שריר II (להלן "מיוזין") ברשת F-actin, הוא אחד הכוחות החשובים ביותר בשינוי צורת התא ובהנעת מורפוגנזהברמת הרקמה 1,2. לדוגמה, הפעלת התכווצות אקטומיוזין בתחום האפי של תאי האפיתל גורמת להתכווצות אפיקלית, המאפשרת מגוון תהליכים מורפוגנטיים, כולל קיפול אפיתל, שחול תאים, דלמינציה וריפוי פצעים 3,4,5,6,7 . הפעלת מיוזין דורשת זרחן של שרשרת האור הרגולטורית שלו. שינוי זה מקל על הקונפורמציה המעכבת של מולקולות המיוזין, ומאפשר להן ליצור צרורות חוטי מיוזין דו-קוטביים עם תחומי ראש מרובים בשני הקצוות. חוטי המיוזין הדו-קוטביים מניעים את התנועה האנטי-מקבילה של חוטי האקטין ומביאים ליצירת כוח התכווצות 1,8,9.

GTPase RhoA הקטן ממשפחת Rho (Rho1 בדרוזופילה) ממלא תפקיד מרכזי בהפעלת התכווצות אקטומיוזין בהקשרים תאיים שונים10,11. Rho1 מתפקד כמתג דו-מולקולרי על ידי קשירת GTP (צורה פעילה) או GDP (צורה לא פעילה)12. המחזור בין Rho1 הקשור ל-GTP או לתמ"ג מווסת על-ידי חלבונים משפעלי GTPase (GAPs) וגורמי חילוף נוקלאוטידים בגואנין (GEFs)13. GEFs פועלים כדי להקל על חילופי התמ"ג עבור GTP ובכך להפעיל את פעילות Rho1. GAPs, לעומת זאת, משפרים את פעילות GTPase של Rho1 ובכך משביתים את Rho1. Rho1 מופעל מקדם התכווצות אקטומיוזין באמצעות אינטראקציה והפעלה של המשפיעים במורד הזרם, קינאז הקשור ל-Rho (Rok) ו-Diaphanous14. Rok גורם להפעלת מיוזין והתכווצות אקטומיוזין על ידי זרחון שרשרת האור הרגולטורית של מיוזין15. בנוסף, Rok גם מעכב את פוספטאז שרשרת האור הרגולטורית מיוזין, ולכן מקדם עוד יותר הרכבת חוט מיוזין16. Rok יכול גם phosphorylate LIM kinases, אשר, כאשר מופעל, למנוע פירוק אקטין על ידי phosphorylating ועיכוב גורם depolymerization actincofilin 17,18. Diaphanous הוא נוקלייטור אקטין ממשפחת הפורמינים המקדם פילמור אקטין ומספק בסיס למיוזין לאינטראקציה עם 19,20,21.

בעוד שהמנגנונים התאיים המפעילים את התכווצות האקטומיוזין הובהרו היטב, הבנתנו את תפקידה בוויסות עיצוב מחדש דינמי של רקמות נותרה חלקית. מילוי פער הידע הזה דורש גישות שיכולות להשבית במהירות אקטומיוזין באזורי רקמה ספציפיים in vivo ולתעד את ההשפעה המיידית על התנהגות הרקמה ותכונותיה. פרוטוקול זה מתאר את השימוש בגישה אופטוגנטית כדי לעכב בחריפות את התכווצות האקטומיוזין במהלך פלישת דרוזופילה מזודרם, ולאחר מכן מדידת מתח אפיתל באמצעות אבלציה בלייזר. במהלך גסטרולציה של דרוזופילה, תאי מבשר המזודרם הממוקמים בגחון עוברים התכווצות אפית ופולשים מפני השטח של העובר על ידי יצירת תלם קדמי-אחורי22,23. היווצרות תלמים גחונים כבר זמן רב משמש מודל לחקר מנגנון קיפול אפיתל. היווצרות התלם הגחוני מנוהלת על ידי מערכת הדפוס הגבית-גחונית בדרוזופילה24,25,26,27. הביטוי של שני גורמי שעתוק, פיתול וחלזון, הממוקם בצד הגחוני של העובר, שולט בהיווצרות התלם הגחוני ומציין את גורל התא המזודרמלי28. Twist ו-Snail מפעילים את הגיוס של Rho1 GEF RhoGEF2 לקודקוד של תאי קודמן מזודרם באמצעות מסלול קולטן מצומד לחלבון G וחלבון מתאם RhoGEF2, T48 29,30,31,32,33. לאחר מכן, RhoGEF2 מפעיל מיוזין בכל פני השטח האפיקליים של המזודרם הפוטנציאלי דרך מסלול Rho-Rho קינאז 34,35,36,37,38,39. מיוזין מופעל יוצר רשת אקטומיוזין על-תאית לאורך פני השטח האפי של המזודרם פרימורדיום, שהתכווצויותיה מניעות התכווצות אפית וגורמות לעלייה מהירה במתח הרקמה האפיקלית 14,37,40.

הכלי האופטוגנטי המתואר בפרוטוקול זה, Opto-Rho1DN, מעכב התכווצות אקטומיוזין באמצעות גיוס קרום פלזמה תלוי אור כחול של צורה שלילית דומיננטית של Rho1 (Rho1DN)41. מוטציה ב-T19N ב-Rho1DN מבטלת את יכולתו של החלבון המוטנטי להחליף תמ"ג ב-GTP ובכך הופכת את החלבון ללא פעיל באופן תמידי34. מוטציה עוקבת ב-Rho1DN, C189Y, מבטלת את אות המיקוד הנאיבי של הממברנה 42,43. כאשר Rho1DN מוחדר לקרום הפלזמה, הוא נקשר ל-Rho1 GEFs ומטיל אותו, ובכך חוסם את ההפעלה של Rho1 וכן את ההפעלה בתיווך Rho1 של מיוזין ואקטין34,44. גיוס קרום הפלזמה של Rho1DN מושג באמצעות מודול דימריזציה תלוי אור הנגזר מקריפטוכרום 2 ושותפו הקושר CIB1. Cryptochrome 2 הוא פוטורצפטור Cryptochrome מופעל אור כחול ב Arabidopsis thaliana45. קריפטוכרום 2 נקשר ל-CIB1, חלבון סליל-לולאה-סליל בסיסי, רק במצבו המעורר לאור45. מאוחר יותר נמצא כי אזור הומולוגיה N-terminal, photolyase (PHR), מקריפטוכרום 2 (CRY2PHR, להלן CRY2) ותחום N-terminal (aa 1-170) של CIB1 (להלן CIBN) חשובים לדימריזציה הנגרמת על ידי אור46. Opto-Rho1DN מכיל שני רכיבים. המרכיב הראשון הוא חלבון CIBN המאוחה עם עוגן CAAX, אשר ממקם את החלבון לקרום פלזמה47. הרכיב השני הוא mCherry-tagged CRY2 המשולב עם Rho1DN41. בהיעדר אור כחול, CRY2-Rho1DN נשאר בציטופלסמה. לאחר גירוי אור כחול, CRY2-Rho1DN מכוון לקרום הפלזמה באמצעות אינטראקציה בין CIBN מעוגן קרום ו- CRY2 נרגש. Opto-Rho1DN יכול להיות מופעל על ידי אור אולטרה סגול A (UVA) ואור כחול (400-500 ננומטר, הפעלת שיא ב 450-488 ננומטר), או על ידי לייזר פועם 830-980 ננומטר בעת ביצוע גירוי שני פוטונים41,46,47,48. לכן, Opto-Rho1DN מגורה על ידי אורכי גל המשמשים בדרך כלל עבור GFP מרגש (488 ננומטר עבור דימות פוטון בודד ו 920 ננומטר עבור דימות שני פוטונים). לעומת זאת, אורכי גל המשמשים בדרך כלל לדימות mCherry מרגש (561 ננומטר לדימות פוטון בודד ו-1,040 ננומטר לדימות שני פוטונים) אינם מעוררים את המודול האופטוגנטי ולכן ניתן להשתמש בהם לדימות טרום גירוי. הפרוטוקול מתאר את הגישות המשמשות למזעור הסיכון לגירוי לא רצוי במהלך מניפולציה של דגימה.

אבלציה בלייזר שימשה באופן נרחב כדי לזהות ולמדוד מתח בתאים וברקמות49. מחקרים קודמים הראו כי, כאשר עוצמת הלייזר נשלטת כראוי, אבלציה לייזר של שני פוטונים באמצעות לייזר פמטו-שנייה קרוב לאינפרא-אדום יכולה לפגוע פיזית בכמה מבנים תת-תאיים (למשל, רשתות אקטומיוזין בקליפת המוח) מבלי לגרום להתפרצות קרום פלזמה50,51. אם הרקמה נמצאת תחת מתח, אבלציה בלייזר של אזור עניין בתוך הרקמה גורמת לרתיעה מיידית כלפי חוץ של התאים הסמוכים לאזור האבלאט. מהירות הרתיעה היא פונקציה של עוצמת המתח והצמיגות של המדיה (ציטופלסמה) המקיפה את המבנים העוברים רתיעה49. בגלל עומק החדירה המעולה של לייזרים אינפרא אדום קרוב והיכולת להשיג אבלציה מוקדית מוגבלת היטב, אבלציה לייזר של שני פוטונים שימושית במיוחד לגילוי מתח רקמות in vivo. כפי שהודגם בפרוטוקול זה, ניתן לשלב שיטה זו בקלות עם אי-הפעלה בתיווך Opto-Rho1DN של התכווצות אקטומיוזין כדי לחקור את ההשפעה הישירה של התכווצות תאית תלוית Rho1 על מכניקת הרקמה במהלך עיצוב מחדש דינמי של רקמות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הגדרת הצלב הגנטי והכנת איסוף הביציות

  1. נקבות זבובים נבחרות (בתולות) מהקו האופטוגנטי UASp-CIBNpm (I); UASp-CRY2-Rho1DN-mCherry (III) על כרית CO2 תחת סטריאומיקרוסקופ והציב צלב עם זבובים זכרים מקו הנהג האימהי GAL4 67 Sqh-mCherry; 15 E-cadherin-GFP.
    הערה: 67 ו-15 מייצגים טובולין-GAL4 אימהי המוכנס לכרומוזומים השני (II) והשלישי (III), בהתאמה52. קו GAL4 המשמש בפרוטוקול זה מבטא גם את שרשרת האור הרגולטורית של מיוזין מתויג mCherry Sqh (דלעת ספגטי)37 ואת E-cadherin53 המתויג GFP. זבובים מהקו האופטוגנטי עשויים עדיין להכיל כרומוזומי איזון FM7 ו-TM6. זבובים מקו הנהג האימהי GAL4 עשויים עדיין להכיל את כרומוזומי האיזון CyO ו-TM3.
  2. לאחר ~10 ימים, בחר נקבות F1 בעלות הגנוטיפ הבא: UASp-CIBNpm/+; 67 מ"ר-mCherry/+; 15 E-cadherin-GFP/UASp-CRY2-Rho1DN-mCherry. הקימו איסוף ביצים עם הזבובים הזכרים.
    1. ודא שנקבות הזבובים עם הגנוטיפ הנכון אינן מכילות כרומוזומי איזון כלשהם (כלומר, הן לא צריכות להכיל כנפיים מסולסלות [Cy], זיפים קצרים [Sb], עיניים בצורת בר או כליה [B], או זיפים הומרליים נוספים [Hu]), שהם סמנים למאזני CyO, TM3, FM7 ו-TM6 המשמשים ליצירת המלאי, בהתאמה. מכסים את הכוס בצלחת מיץ תפוחים עם גוון של ממרח שמרים טריים על פני השטח.
      הערה: אצל נקבות F1, המרכיבים האופטוגנטיים באים לידי ביטוי אימהי. לכן, נקבות הפורמולה 1 המשמשות להקמת הגביע אינן חייבות להיות בתולות. מומלץ להשתמש בזבובים זכרים מאותה אוכלוסיית F1 לנוחותכם.
  3. שמור את הכוס בקופסת קרטון מכוסה ברדיד אלומיניום כדי למנוע דליפת אור אפשרית מהסביבה. החליפו את צלחת מיץ התפוחים כל יום לכוסות שנשמרו בטמפרטורת החדר (~ 21-23 מעלות צלזיוס), או כל יומיים לכוסות שנשמרו ב -18 מעלות צלזיוס.
    1. מיד לפני החלפת הצלחת, דפקו את הספל על משטח ישר (למשל, ראש ספסל) כדי לשמור על הזבובים בתחתית הכוס ולמנוע מהם לברוח. החליפו את צלחת מיץ התפוחים בחדר חשוך והשתמשו בפנס ראש עם אור אדום לתאורה (ראו טבלת חומרים).
      הערה: כדי להגביר את הביטוי של המבנים הנמצאים בשליטת האם-טובולין-GAL4 ו- UASp, מומלץ לשמור את הגביע ב -18 מעלות צלזיוס למשך 3 ימים לפחות לפני איסוף העוברים. תקופת דגירה זו גם מאפשרת לזבובים להסתגל לכוס ולהאכיל היטב את משחת השמרים כדי להשיג ייצור ביצים אופטימלי.

2. איסוף עוברים בשלב הרצוי והכנתם לגירוי אופטוגנטי

הערה: כל שלבי איסוף הדגימות והכנתם צריכים להתבצע בחדר חשוך, תוך שימוש ב"אור בטוח" (למשל, אור אדום) לתאורה. המרכיבים האופטוגנטיים רגישים מאוד לאור הסביבה. אפילו החשיפה הקלה ביותר לאור הסביבה מובילה לגירוי מוקדם מדי של הדגימה. בדרך כלל, אורות בטווח הירוק-אדום (>532 ננומטר) אינם גורמים לגירוי לא רצוי.

  1. לאיסוף עוברים בשלב מוקדם של אמבריוגנזה, הניחו צלחת מיץ תפוחים חדשה על הכוס 8 עד 16 שעות לפני איסוף העוברים (בטמפרטורה של 18°C).
  2. בזמן איסוף העוברים, לשנות את צלחת מיץ תפוחים. מסמנים את הצלחת שהוסרה מהכוס ומכסים את פני הצלחת בשכבה דקה של שמן הלוקרבון 27 (ראו טבלת חומרים). חכו 30-60 שניות עד שקליפת הביצה תהפוך לשקופה.
  3. הניחו מגן פלסטיק כתום-אדום (ראו טבלת חומרים) על במת סטריאוסקופ זקוף. מיקום המגן הכתום-אדום מונע גירוי בלתי רצוי במהלך תאורת הדגימה על ידי חסימת אורכי הגל הכחולים-ירוקים מהאור המשודר.
    הערה: בפרוטוקול זה, סטריאוסקופ זקוף משמש לאיסוף עוברים (ראה טבלת חומרים).
  4. מניחים את צלחת מיץ התפוחים על גבי המגן הכתום-אדום. הפעל את האור המשודר של המיקרוסקופ הסטריאוסקופי כדי להאיר את הדגימה. אספו 5-15 עוברים בשלב המתאים מצלחת מיץ התפוחים באמצעות זוג פינצטה. אין לסחוט את העוברים עם הפינצטה.
    הערה: בפרוטוקול זה, העובר המתאים צריך להיות בשלב הצלולריזציה המוקדם-אמצעי. העובר בשלב זה צריך להיות חלמון אטום כהה מוקף שכבת periplasm ברורה ואחידה המכילה את תאי blastoderm יוצר. הקצה המוביל של תלמי המחשוף ("חזית הצלולריזציה"), המופיע כקו רציף מקביל לפני השטח של העובר, לא אמור לעבור מחצית מעומק הפריפלסמה.
  5. כתם בעדינות את העוברים על פיסת מגבת נייר (~ 1.5 ס"מ × 1.5 ס"מ) כדי להסיר עודפי שומן מהעוברים באמצעות הפינצטה.
  6. הוסף מספר טיפות של אקונומיקה טרייה 40% (~ 3% נתרן היפוכלוריט; ראה טבלת חומרים) לחתיכה מרובעת קטנה חדשה של מגבת נייר (~ 1.5 ס"מ × 1.5 ס"מ) באמצעות פיפטת העברה מפלסטיק כך שמגבת הנייר מכוסה בשכבה דקה של אקונומיקה. מעבירים את העובר ממגבת הנייר היבשה למגבת הנייר הספוגה באקונומיקה באמצעות הפינצטה ומוודאים שהעוברים ספוגים באקונומיקה. יש להמתין 2-4 דקות עד שהעובר יעבור דה-כוריוניזציה.
  7. לאחר הדקוריון, השתמשו בפינצטה כדי לכתם את מגבת הנייר המרובעת על פיסת נייר טישו גדולה כדי להסיר עודפי אקונומיקה. ודא שהצד עם העוברים פונה כלפי מעלה.
  8. כדי לשטוף את העוברים, השתמשו בפינצטה כדי להשרות בעדינות את מגבת הנייר המרובעת בטיפת מים נטולי יונים, ולטפטף אותה במהירות על פיסת נייר טישו גדולה. חזור על תהליך זה שמונה פעמים כדי להבטיח הסרה של שאריות אקונומיקה.
  9. השתמשו בכלי ריסים כדי להעביר את העובר ממגבת הנייר לצלחת בעלת תחתית זכוכית בקוטר 35 מ"מ (ראו טבלת חומרים). הוסיפו מים שעברו דה-יוניזציה לצלחת כדי לכסות את העוברים לחלוטין. כוונן את המיקום והכיוון של העוברים באמצעות כלי הריסים.
    הערה: לאחר דכוריוניציה, העובר נוטה להידבק על פני הזכוכית והוא חסר תנועה ללא הפרעה, ולכן אין צורך ליישם טיפול נוסף (כגון דבק) כדי לשתק את העובר על צלחת תחתית הזכוכית.
  10. הניחו את צלחת תחתית הזכוכית בקוטר 35 מ"מ עם העוברים בתוך קופסה שחורה חסינת אור (ראו טבלת חומרים) כדי להגן על הדגימה מפני חשיפה לאור במהלך תהליך ההחזרה. הביאו את הקופסה לחדר עם מיקרוסקופ מולטיפוטון.

3. גירוי אופטוגנטי, אבלציה בלייזר והדמיית העובר

הערה: מערכת המולטיפוטונים ששימשה בניסוי זה (ראה טבלת חומרים) מסוגלת לבצע הדמיה סימולטנית באורך גל כפול. הוא מכיל גם יחידת פוטוטימולציה עם לייזר 458 ננומטר וסורק גלוונומטר נפרד, המאפשר הפעלת / גירוי צילום בתוך אזור עניין מוגדר (ROI). יש לציין כי לייזר 920 ננומטר, המשמש לעורר חלבונים פלואורסצנטיים ירוקים-צהובים, יעורר את Opto-Rho1DN, אם כי לאט יותר בהשוואה לגירוי בתיווך לייזר כחול.

  1. כסו את המיקרוסקופ הרב-פוטוני בבד שחור חסין אור (ראו טבלת חומרים) כדי למנוע גירוי לא רצוי של העוברים במהלך הגדרת הדגימה וההדמיה.
    הערה: אותה גישה משמשת במהלך הדמיה רגילה של מולטיפוטונים כדי להגן על הגלאים הרגישים לאור המצוידים במיקרוסקופ.
  2. כבו את תאורת החדר ואת מסכי המחשב. כבה את בקר לוח המגע על ידי לחיצה על OFF תחת 'תאורה אחורית של בקר לוח מגע' בתוכנה. ודא שאין תאורת סביבה אחרת בחדר.
    1. פתח את הצד הקדמי של כיסוי הבד השחור במיקרוסקופ. קחו את צלחת תחתית הזכוכית בקוטר 35 מ"מ מהקופסה השחורה והניחו אותה על במת המיקרוסקופ.
  3. להאיר עוברים באור ירוק המשמש בדרך כלל כאור עירור לאפיפלואורסצנציה. לשם כך, הפעל את יחידת התאורה הפלואורסצנטית, בחר Ocular תחת לוח 'Ocular' בתוכנה, ושנה את 'צריח הקוביה' ל- 4:TRITC. השתמש בעינית כדי לזהות את העובר המעניין ולהביא אותו למיקוד.
    הערה: הדמיה של אור ירוק מושגת על-ידי מתן אפשרות לאור לבן שנוצר על-ידי יחידת התאורה הפלואורסצנטית לעבור דרך קוביית מסנן TRITC סטנדרטית מובנית, המכילה מסנן עירור של 528-553 ננומטר, מפצל קרן של 565 ננומטר ומסנן פליטה של 590-650 ננומטר. נורות אחרות שאינן כחולות אמורות גם הן לעבוד מצוין עבור תאורת דגימה. אין צורך ללבוש הגנה על העיניים בשלב זה, שכן אור העירור יש עוצמה נמוכה ולא יופנה אל העינית. העובר ייראה אדום אחיד עקב אוטופלואורסצנציה.
  4. סגור את כיסוי הבד השחור כך שהדגימה תהיה מוגנת לחלוטין מפני אור. הפעל את מסך המחשב כדי לגשת לתוכנה השולטת במיקרוסקופ. שנה את 'Ocular' ל - LSM בתוכנה לרכישת תמונה.
  5. בצע אבלציה בלייזר בשליטה על עוברים ללא גירוי באמצעות יעד טבילה במים פי 25.
    1. לחץ על Bright Z, Sequence Manager ו-LSM Stimulation מתוך 'חלון הכלים' בתוכנה. הגדר את סוג הסורק כ- Galvano ואת גודל הסריקה כ- 512 × 512. הפעל את CH1 ו- CH3 בחלונית 'הגדרת PMT' כדי לאפשר שימוש בלייזר של 1,040 ננומטר, ולחץ על Live × 4 כדי לדמיין את העובר.
    2. סובב את העובר באמצעות פונקציית הסיבוב בתוכנה כך שהציר הקדמי-אחורי של העובר יהיה בכיוון אנכי. הגדר את גודל התצוגה ל - 3. ציירו אזור עניין (ROI) באמצעות כלי הצורה תחת 'הגדרות סריקה' והגדירו את גודל החזר ההשקעה בחלונית 'הפניה'. הגדר את החזר ההשקעה כרוחב של 512 פיקסלים וגובה של 100 פיקסלים (171 × 33 מיקרומטר2).
    3. הגדר פרמטרי רכישה עבור מחסנית Z טרום-אבלציה.
      1. רשום את פני השטח של העובר כ- 0 תחת 'חתך Z'. הגדר את ההתחלה כ - 0 ואת הסוף כ- 100 מיקרומטר. הגדר את גודל המדרגה כ- 2 מיקרומטר. הפעל את מצב הרכישה Z על ידי סימון Z תחת הכרטיסייה 'סדרה'.
      2. הגדר עוצמת לייזר של 1,040 ננומטר כדי להגדיל באופן ליניארי מ- 3% ל- 7% באמצעות הפונקציה Bright Z .
      3. שמור את הגדרת ההדמיה הנוכחית כמשימה הראשונה של הצינור על ידי לחיצה על LSM ב'מנהל הרצפים'.
        הערה: מחסנית Z טרום אבלציה מתקבלת כדי לאשר את השלב של העובר. בניסוי זה, CRY2-Rho1DN-mCherry ו-Sqh-mCherry יתלהבו מהלייזר של 1,040 ננומטר. במהלך התכווצות אפיקלית, אות Sqh-mCherry משופר באזור הבינוני של תאי מזודרמיס הגחון, בעוד CRY2-Rho1DN-mCherry הוא ציטוסולי לפני גירוי. עוצמת הלייזר המשמשת להדמיית גירוי לפני ואחרי נקבעת אמפירית בהתבסס על האיזון בין יחס האות לרעש האופטימלי לבין הימנעות מהלבנת אור.
    4. הגדר פרמטרי רכישה עבור הסרט שלפני אבלציה.
      1. מחק כל החזר השקעה קיים כדי לאפשר הדמיה של כל אזור 512 × 512 פיקסלים (171 × 171 מיקרומטר 2, זום 3x) ליד המשטח הגחוני של העובר, כמתואר בשלב 3.5.2. הגדר את עוצמת הלייזר של 1,040 ננומטר ל- 3%.
      2. סמן את השעה ובטל את הסימון של Z בחלונית 'סדרה'. שמור על 'מרווח' כ- FreeRun בחלונית 'Time Lapse'. הגדר מחזור כ- 10.
      3. שמור את ההגדרות הנוכחיות כמשימה הבאה של הצינור על ידי לחיצה על LSM ב'מנהל הרצפים'.
        הערה: מטרת משימה זו היא להשיג סרט קדם-אבלציה יחיד של 10 פריימים במישור Z עם לייזר של 1,040 ננומטר לרכישת תמונה. מהירות רכישת התמונה היא בערך 1 שניות לפריים.
    5. הגדר את הפרמטרים עבור אבלציה בלייזר.
      1. הגדירו אזור תלת-ממדי מעומק של ~20 מיקרומטר עבור אבלציה בלייזר (איור 1A). הגדר את תחילת ערימת Z כמישור שנמצא ממש מתחת לקרום ויטלין ואת הסוף כעמוק ב-20 מיקרומטר ממישור ההתחלה. הגדר את גודל המדרגה כ- 1.5 מיקרומטר.
        הערה: החזר ההשקעה על האזור הבטל הוא ~ 30 פיקסלים ברוחב ו~ 10 פיקסלים בגובה (~ 10 מיקרומטר לאורך הציר האמצעי-צדדי ו~ 3.3 מיקרומטר לאורך ציר A-P). מטרת הדגימה במספר מישורי Z היא להבטיח כי פני השטח האפיקליים של תאי הגחון יהיו אבלטים. זה חשוב במיוחד עבור עוברים מגורה, כמו התאים הגחון לחוות הרפיה אפית מהירה לאחר עיכוב Rho1.
      2. הפעל את CH2 ו- CH4 תחת לוח 'הגדרת PMT' כדי לאפשר שימוש בלייזר 920 ננומטר. הגדר את עוצמת הלייזר של 920 ננומטר ל- 30%. הגדר רכישת תמונה באמצעות לייזר של 920 ננומטר עבור ערימת Z יחידה באזור התלת-ממדי שהוגדר בשלב 3.5.5.1 עבור אבלציה בלייזר.
        הערה: עוצמת הלייזר שנבחרה בשלב זה מספיקה כדי לעבד את הרקמה (כפי שמצוין על ידי רתיעת הרקמה מיד לאחר טיפול הלייזר), אך בינתיים אינה פוגעת באופן ברור בקרום הפלזמה (כפי שמצוין על ידי היעדר סימני כוויה על קרום התא) (איור 1B,C).
      3. שמור את ההגדרה הנוכחית כמשימה הבאה של הצינור על ידי לחיצה על LSM ב'מנהל הרצפים'.
    6. הגדר פרמטרים של רכישה עבור הסרט שלאחר אבלציה.
      1. הגדר רכישת תמונה עבור סרט יחיד בן 100 פריימים במישור Z לאחר אבלציה באמצעות לייזר של 1,040 ננומטר ולייזר של 920 ננומטר. הגדר את העוצמה של לייזר 1,040 ננומטר ולייזר 920 ננומטר ל- 3% ו- 0.3%, בהתאמה. האזור שצוין בשלב 3.5.4 יצולם במהירות רכישת תמונה זהה.
      2. שמור את ההגדרה הנוכחית כמשימה הבאה של הצינור על ידי לחיצה על LSM ב'מנהל הרצפים'.
        הערה: מטרת אחסון הפרמטרים המתוארים בשלבים 3.5.3-3.5.6 כמשימות רציפות ב'מנהל הרצף' לפני כל רכישה בפועל היא להבטיח את לכידת תגובת הרקמה המיידית לאחר אבלציה בלייזר.
    7. בחר רצף תחת 'רכישה'. שנה את הנתיב לשמירת נתונים ואת שם הקובץ לפי הצורך. לחץ על מוכן והמתן עד שהתוכנה תאתחל את הצינור. לאחר מכן לחץ על התחל כדי לבצע את הצינור.
  6. ביצוע אבלציה בלייזר בעוברים מגורים.
    1. הגדר פרמטרי רכישה עבור מחסנית Z טרום-אבלציה, כמתואר בשלבים 3.5.1-3.5.3. שמור את ההגדרה הנוכחית כמשימה הראשונה של הצינור על ידי לחיצה על LSM ב'מנהל הרצפים'.
    2. הגדר פרמטרים לגירוי אופטוגנטי בתוך החזר השקעה מוגדר.
      1. שנה את גודל התצוגה ל- 1 ובחר החזר השקעה המכסה את פני השטח הגחונים של העובר (~ 512 × 300 מיקרומטר2). כבה את גלאי CH1-CH4 .
      2. לחץ על גירוי LSM. בטל את הסימון באפשרות רציף בתוך משך והקלד 12 s. בדוק את 458 ננומטר עם עוצמת לייזר של 0.3%.
      3. שמור את ההגדרה הנוכחית כמשימה הבאה של הצינור על ידי לחיצה על גירוי ב'מנהל הרצפים'.
        הערה: גירוי מהיר יותר עשוי להיות מושג על ידי הגדלת עוצמת לייזר 458 ננומטר. עם זאת, בעת שימוש בעוצמות לייזר גבוהות יותר, אור הלייזר המפוזר עשוי לגרות את האזור הסמוך ל- ROI, שאינו אידיאלי אם נדרש גירוי מוגבל מרחבית.
    3. הגדר זמן המתנה של 3 דקות לאחר הגירוי כדי להבטיח השבתה מוחלטת של מיוזין ופירוק של F-actin אפיקלי, וכדי להשיג מורפולוגיה סטטית של רקמה לפני אבלציה בלייזר. זה מושג על ידי לחיצה על המתנה /השהיה תחת 'מנהל רצפים' והגדרת הזמן הרצוי עבור 'המתנה'.
      הערה: גיוס של CRY2-Rho1DN-mCherry לממברנה הנגרמת על ידי סבב גירוי יחיד (לייזר 0.3% 458 ננומטר עבור 12 שניות) ניתן לזיהוי בבירור 10-15 דקות לאחר הגירוי. זה עולה בקנה אחד עם הדיסוציאציה שפורסמה במחצית הזמן של ~9 דקות47.
    4. הגדר פרמטרים לרכישה עבור סרט קדם-אבלציה יחיד במישור Z, כמתואר בשלב 3.5.4, פרט לכך שגם לייזר 1,040 ננומטר וגם לייזר 920 ננומטר משמשים לרכישת תמונה. הפעל את גלאי CH1-CH4 . הגדר את העוצמה של לייזר 1,040 ננומטר ולייזר 920 ננומטר ל- 3% ו- 0.3%, בהתאמה. שמור את ההגדרה הנוכחית כמשימה הבאה של הצינור על ידי לחיצה על LSM ב'מנהל הרצפים'.
    5. הגדר פרמטרים עבור אבלציה בלייזר, כמתואר בשלב 3.5.5. שמור את ההגדרה הנוכחית כמשימה הבאה של הצינור על ידי לחיצה על LSM ב'מנהל הרצפים'.
    6. הגדר פרמטרי רכישה עבור הסרט היחיד במישור Z לאחר אבלציה, כמתואר בשלב 3.5.6. שמור את ההגדרה הנוכחית כמשימה הבאה של הצינור על ידי לחיצה על LSM ב'מנהל הרצפים'.
    7. בחר רצף תחת 'רכישה'. שנה את הנתיב לשמירת נתונים ואת שם הקובץ לפי הצורך. לחץ על מוכן והמתן עד שהתוכנה תאתחל את הצינור. לאחר מכן, לחץ על התחל כדי לבצע את הצינור.

4. כימות קצב רתיעת הרקמה לאחר אבלציה בלייזר

  1. פתח את הסרט שלאחר אבלציה ב- ImageJ.
  2. צייר החזר השקעה קטן לאורך קו האמצע הגחוני המכסה את האזור הבטל באמצעות הכלי בחירת מלבנים . רוחב החזר ההשקעה הוא תשעה פיקסלים. גובה החזר ההשקעה נקבע כך שההחזר על ההשקעה גדול מספיק כדי לכסות את כל טווח רתיעת הרקמה לאחר אבלציה בלייזר.
    1. לחץ על שכפל תחת הכרטיסייה 'תמונה'. בחלון המוקפץ, סמן את האפשרות שכפל אוסף ולאחר מכן לחץ על אישור כדי לשכפל את הערימה בתוך החזר ההשקעה שנבחר.
  3. צור מונטאז' מהערימה המשוכפלת באמצעות Image > Stacks >- Make Montage. בחלון המוקפץ, הגדר את מספר השורה ל - 1 ואת מספר העמודה למספר הכולל של מסגרות בערימה (100 במקרה זה).
  4. מדוד את רוחב A-P של האזור ablated לאורך זמן מהמונטאז' שנוצר.
    1. השתמשו בכלי Multi-point ב-ImageJ כדי לסמן את גבולות A-P של האזור המבוטל עבור כל נקודת זמן במונטאז'.
    2. שמור את הקואורדינטות של הנקודות המסומנות באמצעות קואורדינטות File > Save as >- XY.
    3. ייבאו את קואורדינטות XY הנמדדות ל-MATLAB. חשב את רוחב A-P של האזור הבטל עבור כל נקודת זמן על-ידי הפחתת קואורדינטת Y של הגבול העליון מקואורדינטת Y של הגבול התחתון.
  5. קבע את קצב רתיעת הרקמה על ידי התאמת 20 השניות הראשונות של עקומת "רוחב לאורך זמן" לקו באמצעות הפונקציה 'polyfit' ב- MATLAB. דווח על שיפוע הקו המותאם כקצב רתיעת הרקמות.
  6. בצע בדיקות סטטיסטיות כדי להשוות את קצב רתיעת הרקמה בין הדגימות המגורות והלא מגורות.
    הערה: מומלץ לקבל נתונים מלפחות חמישה עוברים בכל מצב. ניתן להשתמש הן במבחן Wilcoxon rank-sum הדו-צדדי והן במבחן t הדו-צדדי של התלמיד לצורך השוואה סטטיסטית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

בעוברים לא מגורים שעברו כיווץ אפיקלי, Sqh-mCherry הועשר באזור הבינוני של התאים המזודרמליים הגחונים, בעוד ש-CRY2-Rho1DN-mCherry היה ציטוסולי (איור 1A). אבלציה בלייזר בתחום ההתכווצות הובילה לרתיעה מהירה של רקמות לאורך ציר A-P (איור 1B,C). בעוברים המגורים, האות CRY2-Rho1DN-mCherry הפך לקרום פלזמה מקומי, בעוד שהאות הבינוני של Sqh-mCherry נעלם לחלוטין (איור 1A). אבלציה בלייזר בעוברים המגוריים לא גרמה לרתיעה ברורה של הרקמות, כפי שמודגם באיור 1B,C וכומת באיור 1D. תוצאות אלה מצביעות על כך שיצירת מתח רקמות דורשת התכווצות אקטומיוזין אפית פעילה; כאשר אקטומיוזין הופך ללא פעיל על עיכוב Rho1, מתח הרקמה האפיקלית פוחת גם41. תצפיות אלה עולות בקנה אחד עם הממצאים הקודמים לפיהם הפעלת התכווצות המיוזין האפי בתאי מזודרמיס גחוני גורמת לעלייה במתח הרקמה על פני השטח הגחוני של העובר40.

Figure 1
איור 1: גירוי Opto-Rho1DN במהלך התכווצות אפיקלית גורם לאובדן מיידי של מתח קליפת המוח על פני השטח הגחונים של העובר . (A) קריקטורה המתארת את מערך הניסוי של אבלציה בלייזר לזיהוי מתח קליפת המוח. אזורים צהובים מוצלים מציינים את האזורים האבלטים. עבור עוברים מגורים, הפעלת אור של Opto-Rho1DN בוצעה 3 דקות לפני אבלציה לייזר. בשל הרפיה אפית לאחר גירוי, מספר מישורי z הופעלו (אזור צהוב-מוצלל) על מנת להבטיח אבלציה של פני השטח האפיקליים מאוד של תאי הגחון. (ב,ג) השוואה בין עוברים לא מגורים ועוברים מגורים. לא נצפתה רתיעה ברורה של רקמות בעוברים המגורה (N = 6 עבור עוברים לא מגורים ו- N = 5 עבור עוברים מגורים). (B) מבט פנים אל פנים של העוברים שעברו אבלציה בלייזר. תיבות בגוון צהוב מסמנות את האזור המוכה. (C) קימוגרפים המייצגים את שינוי הרוחב של האזור האבלאטי. קווים צהובים מנוקדים מציינים את אתר האבלציה. (D) שינויי רוחב של האזור האבלאטי לאורך ציר A-P במהלך 20 השניות הראשונות לאחר אבלציה בלייזר. רתיעה ברורה של רקמות נצפתה לאחר חיתוך לייזר בעוברי הבקרה הבלתי מגורים. לעומת זאת, רתיעה מועטה או כלל לא נצפתה בעוברים המגורים, מה שמצביע על חוסר מתח אפיקלי לאחר עיכוב Rho1. סרגל השגיאה הוא סטיית תקן. ערך ה-p חושב באמצעות מבחן דו-צדדי Wilcoxon rank-sum. נעשה שימוש חוזר בנתון זה מתוך Guo et al.41. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

פרוטוקול זה תיאר את השימוש המשולב באופטוגנטיקה ובאבלציה בלייזר כדי לבחון שינויים במתח הרקמה מיד לאחר השבתת התכווצות האקטומיוזין. הכלי האופטוגנטי המתואר כאן מנצל את הצורה השלילית הדומיננטית של Rho1 (Rho1DN) כדי לעכב בחריפות את התכווצות האקטומיוזין האנדוגנית Rho1 והתלויה ב-Rho1. אפיון קודם של Opto-Rho1DN בהקשר של היווצרות תלמים גחונים של דרוזופילה הראה כי הכלי יעיל ביותר בתיווך ההשבתה המהירה של התכווצות אקטומיוזין אפיקלי באמצעות הפעלה סימולטנית של מיוזין ופירוק אקטין41. בפרט, גירוי העוברים בזמן ההתכווצות האפיקלית הביא להפחתה של אות המיוזין האפי בתוך 60 שניות בתאים שעברו התכווצות אפית41. הסרה מהירה זו של מיוזין קליפת המוח עם עיכוב Rho1 נובעת ככל הנראה מהמחזור המהיר של Rho1 ומיוזין דרך מצבים פעילים ולא פעילים, הנגרמת על ידי פעילותם של חלבונים מפעילי GTPase (GAPs) עבור Rho1 ופוספטזות שרשרת אור מיוזין, בהתאמה19,54. בהתאם להשפעה על אקטומיוזין, צימוד אופטוגנטיקה עם אבלציה בלייזר הראה כי גירוי Opto-Rho1DN במהלך התכווצות אפית הביא לאובדן מיידי של מתח אפיתל באזור הגחון של העובר41 (איור 1). גישה משולבת זו אפשרה לנו לחקור את הפונקציה של כיווץ תאי בתיווך Rho1 בוויסות מכניקת רקמות בדיוק מרחבי וזמני חסר תקדים, מה שמאפשר לנתח השפעות מיידיות מהשפעות ארוכות טווח שקשה להשיג באמצעות גישות גנטיות קונבנציונליות.

שיקול טכני חשוב בעת השימוש ב- Opto-Rho1DN הוא שהכלי רגיש מאוד לאור הסביבה. בעיה נפוצה בניסוי היא גיוס CRY2-mCherry-Rho1DN לקרום הפלזמה לפני שלב הגירוי, אשר נגרם בדרך כלל על ידי גירוי מוקדם מדי של הדגימה במהלך אחד מהשלבים הבאים: הכנת דגימה, העברת דגימה לחדר המיקרוסקופ, מיקום הדגימה בשלב המיקרוסקופ ורכישת תמונה לפני גירוי. בפרוטוקול שלנו, הליכים מרובים משמשים למניעת גירוי בלתי רצוי, כולל טיפול בגביעי הזבוב ובעוברים בחדר חשוך תחת אור אדום, סינון אורכי גל כחולים מאור ההארה בעת בחירה והרכבה של עוברים מתחת לסטריאומיקרוסקופ, והימנעות מחשיפת עוברים ללייזר 400-500 ננומטר (עירור פוטון יחיד) או לייזר פועם 830-980 ננומטר (עירור מולטיפוטון) לפני הגירוי. זה קריטי לתרגל תשומת לב נוספת בשלבים מרובים של הניסוי כדי למנוע גירוי לא רצוי של הדגימה. בנוסף, בעת שימוש ב- Opto-Rho1DN לעיכוב Rho1 באזור עניין מסוים (ROI) בעובר41, מומלץ להשתמש בעוצמת הלייזר הנמוכה ביותר שיכולה להשיג טרנסלוקציה חזקה של CRY2-Rho1DN לקרום הפלזמה. מכיוון ש-Opto-Rho1DN רגיש מאוד לאורכי גל כחולים, לייזר כחול בעוצמה גבוהה עלול לגרום לגירוי לא רצוי בתאים מחוץ ל-ROI או אפילו בעוברים שכנים עקב פיזור אור.

בגרסתו הנוכחית, לכלי Opto-Rho1DN יש מספר מגבלות. ראשית, עבור הניסויים המתוארים בפרוטוקול זה, נעשה שימוש בעוגן CIBN מקומי של קרום פלזמה כדי לגייס CRY2-Rho1DN מופעל מהציטוזול לקרום הפלזמה41,47. לפי תכנון זה, קשה לבצע עיכוב Rho1 מוגבל בתחום ספציפי של קרום הפלזמה עקב דיפוזיה של חלבוני CRY2-Rho1DN פעילים בציטוזול. שיפור נוסף של הדיוק המרחבי בקנה מידה תת-תאי ממתין לפיתוח עוגני CIBN חדשים בעלי דפוסי לוקליזציה תת-תאיים ספציפיים יותר. שנית, Opto-Rho1DN נועד לעכב Rho1 במהלך אמבריוגנזה מוקדמת. הביטוי של CIBNpm ו- CRY2-Rho1DN-mCherry נשלט על ידי UASp, אשר מתוקנן לביטוי בתאי נבט נשיים 55. הביטוי של מודולים אלה ברקמות סומטיות מעבר לאמבריוגנזה מוקדמת עשוי לדרוש החלפה של UASp במקדם יעיל יותר להנעת ביטוי סומטי (למשל,UASt 56). לבסוף, היעילות של Opto-Rho1DN מותנית בשפע של עוגן CIBN וחלבוני CRY2-Rho1DN. בגרסה הנוכחית של הכלי, הוא נקבע על ידי קו הדרייברים GAL4 המשמש להנעת הביטוי של המודולים האופטוגנטיים. בעת שימוש בדרייבר GAL4 האימהי המתואר בפרוטוקול זה, קריטי להשתמש בקו המספק שני עותקים של הגן GAL4 (למשל, הן 67 והן 15) על מנת להשיג את העיכוב המהיר והחזק של התכווצות אקטומיוזין. הפחתת מספר העותקים של GAL4 אימהי בנקבות F1 משתיים לאחד הפחיתה משמעותית את ההשפעה המעכבת.

בהשוואה לגישות גנטיות קונבנציונליות, הגישה האופטוגנטית המתוארת בפרוטוקול זה מועילה בניתוח השלב והתפקוד הספציפי לרקמות של Rho1 בעוברי דרוזופילה מוקדמים. הפונקציה של Rho1 באמבריוגנזה מוקדמת של דרוזופילה מתמלאת במידה רבה על ידי תוצר הגן הטעון על ידי האם11. דלדול Rho1 חוסם את האוגנזה57 באופן אימהי, ומונע את חקר תפקודה במהלך האמבריוגנזה המוקדמת. בשנים האחרונות פותחו מספר כלים אופטוגנטיים לוויסות פעילות אנדוגנית של Rho1 בעוברי דרוזופילה. הן Izquierdo et al. והן Rich et al. פיתחו כלים אופטוגנטיים להפעלת פעילות Rho1 על ידי ויסות הלוקליזציה של התחום הקטליטי של Rho GEFs בעוברי דרוזופילה 48,58. בנוסף, הררה-פרז ועמיתיו פיתחו שני כלים אופטוגנטיים המשתמשים ב-RhoGEF2 באורך מלא (optoGEF) או ב-C-GAP באורך מלא (optoGAP) כדי להפעיל או לעכב פעילות אנדוגנית של Rho1, בהתאמה59. מכיוון ש-optoGAP פועל על ידי גיוס Rho1 GAP לקרום הפלזמה, היישום שלו עשוי להיות רגיש לנוכחות של Rho1 GEFs אנדוגניים, אשר יכולים לקזז או אפילו לעקוף את ההשפעה של גיוס חוץ רחמי של הפער. לעומת זאת, על ידי בידוד ישיר של Rho1 GEFs, Opto-Rho1DN עשוי לספק דרך חזקה יותר לעכב התכווצות אקטומיוזין אנדוגנית התלויה ב-Rho1 וב-Rho1.

בהתחשב במגוון הרחב של הפונקציות של Rho1 באמבריוגנזה ובהתפתחות פוסט-עוברית, ניתן להתאים בקלות את הפרוטוקול המוצג לחקר הפונקציה של ארגון מחדש תאי תלוי Rho1 ו-Rho1 במגוון רחב של תהליכים מורפוגנטיים. בנוסף, אסטרטגיה דומה יכולה, באופן עקרוני, לשמש כדי להגביל באופן חמור GTPases קטנים אחרים, כגון משפחת Rho GTPases Cdc42 ו Rac, שכן צורות שליליות דומיננטיות שלהם כבר בשימוש נרחב כדי לעכב את הפונקציה האנדוגנית של חלבונים אלה11. לבסוף, כפי שמודגם בפרוטוקול זה, שילוב של אופטוגנטיקה וגישות אבלציה בלייזר יכול לספק דרך יעילה לחקור את ההשפעה המיידית של השבתה של חלבון ספציפי על דינמיקת רקמות ומכניקת רקמות, מה שיביא לנו תובנות חדשות על מורפוגנזה של רקמות שקשה לחשוף באמצעות גישות גנטיות קונבנציונליות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי המחקר נערך בהיעדר קשרים מסחריים או פיננסיים שיכולים להתפרש כניגוד עניינים פוטנציאלי.

Acknowledgments

המחברים מודים לאן לבנוויי על תמיכתה בהדמיה. המחברים מודים למעבדת וישאוס ולמעבדת דה רנזיס על שיתוף ריאגנטים ולמרכז המניות בלומינגטון דרוזופילה למניות זבובים. מחקר זה נתמך על ידי NIGMS ESI-MIRA R35GM128745 ומענק מחקר מוסדי של האגודה האמריקאית לסרטן #IRG-82-003-33 ל- BH.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
35 mm glass-bottom dish MatTek P35G-1.5-10-C Used for sample preparation
60 mm × 15 mm Petri dish with lid Falcon 351007 Used for sample preparation
Black cloth for covering the microscope Online NA Used to avoid unwanted light stimulation
Clorox Ultra Germicadal Bleach (8.25% sodium hypochlorite) VWR 10028-048 Used for embryo dechorination
CO2 pad Genesee Scientific 59-114 Used for cross set-up
ddH2O NA NA Used for sample preparation
Dumont Style 5 tweezers VWR 102091-654 Used for sample preparation
Eyelash tool (made from pure red sable round brush #2) VWR 22940-834 Used for sample preparation
FluoView (Software) Olympus NA Used for image acquisition and optogenetic stimulation
Halocarbon oil 27 Sigma Aldrich H8773-100ML Used for embryo stage visualization
ImageJ/FIJI NIH NA Used for image analysis
MATLAB MathWorks NA Used for image analysis
Nikon SMZ-745 stereoscope Nikon NA Used for sample preparation
Olympus FVMPE-RS multiphoton microscope with InSight DS Dual-line Ultrafast Lasers for simultaneous dual-wavelength multiphoton imaging, , a 25x/NA1.05 water immersion objective (XLPLN25XWMP2), and an IR/VIS stimulation unit for photo-activation/stimulation. This system is also equipped with a TRITC filter (39005-BX3; AT-TRICT-REDSHFT 540/25x, 565BS, 620/60M), and a fluorescence illumination unit that emits white light. Olympus NA Used for image acquisition and optogenetic stimulation
SP Bel-Art 100-place polypropylene freezer storage box (Black, light-proof box for sample transfer) VWR 30621-392 Used to avoid unwanted light stimulation
UV Filter Shield for FM1403 Fluores (Orange-red plastic shield) Bolioptics FM14036151 Used to avoid unwanted light stimulation
VITCHELO V800 Headlamp with White and Red LED Lights Amazon NA Used to avoid unwanted light stimulation

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vicente-Manzanares, M., Ma, X., Adelstein, R. S., Horwitz, A. R. Non-muscle myosin II takes centre stage in cell adhesion and migration. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 10 (11), 778-790 (2009).
  2. Munjal, A., Lecuit, T. Actomyosin networks and tissue morphogenesis. Development. 141 (9), 1789-1793 (2014).
  3. Sawyer, J. M., et al. Apical constriction: a cell shape change that can drive morphogenesis. Developmental Biology. 341 (1), 5-19 (2010).
  4. Nishimura, T., Honda, H., Takeichi, M. Planar cell polarity links axes of spatial dynamics in neural-tube closure. Cell. 149 (5), 1084-1097 (2012).
  5. Marinari, E., et al. Live-cell delamination counterbalances epithelial growth to limit tissue overcrowding. Nature. 484 (7395), 542-545 (2012).
  6. Slattum, G. M., Rosenblatt, J. Tumour cell invasion: an emerging role for basal epithelial cell extrusion. Nature Reviews. Cancer. 14 (7), 495-501 (2014).
  7. Antunes, M., Pereira, T., Cordeiro, J. V., Almeida, L., Jacinto, A. Coordinated waves of actomyosin flow and apical cell constriction immediately after wounding. The Journal of Cell Biology. 202 (2), 365-379 (2013).
  8. Yang, S., et al. The central role of the tail in switching off 10S myosin II activity. The Journal of General Physiology. 151 (9), 1081-1093 (2019).
  9. Yang, S., et al. Cryo-EM structure of the inhibited (10S) form of myosin II. Nature. 588 (7838), 521-525 (2020).
  10. Narumiya, S., Thumkeo, D. Rho signaling research: history, current status and future directions. FEBS Letters. 592 (11), 1763-1776 (2018).
  11. Johndrow, J. E., Magie, C. R., Parkhurst, S. M. Rho GTPase function in flies: insights from a developmental and organismal perspective. Biochemistry and Cell Biology. 82 (6), 643-657 (2004).
  12. Etienne-Manneville, S., Hall, A. Rho GTPases in cell biology. Nature. 420 (6916), 629-635 (2002).
  13. Hodge, R. G., Ridley, A. J. Regulating Rho GTPases and their regulators. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 17 (8), 496-510 (2016).
  14. Martin, A. C., Goldstein, B. Apical constriction: themes and variations on a cellular mechanism driving morphogenesis. Development. 141 (10), 1987-1998 (2014).
  15. Amano, M., Nakayama, M., Kaibuchi, K. Rho-kinase/ROCK: A key regulator of the cytoskeleton and cell polarity. Cytoskeleton. 67 (9), 545-554 (2010).
  16. Kimura, K., et al. Regulation of myosin phosphatase by Rho and Rho-associated kinase (Rho-kinase). Science. 273 (5272), 245-248 (1996).
  17. Maekawa, M., et al. Signaling from Rho to the actin cytoskeleton through protein kinases ROCK and LIM-kinase. Science. 285 (5429), 895-898 (1999).
  18. Ohashi, K., et al. Rho-associated kinase ROCK activates LIM-kinase 1 by phosphorylation at threonine 508 within the activation loop. The Journal of Biological Chemistry. 275 (5), 3577-3582 (2000).
  19. Coravos, J. S., Martin, A. C. Apical sarcomere-like actomyosin contracts nonmuscle drosophila epithelial cells. Developmental Cell. 39 (3), 346-358 (2016).
  20. Homem, C. C. F., Peifer, M. Diaphanous regulates myosin and adherens junctions to control cell contractility and protrusive behavior during morphogenesis. Development. 135 (6), 1005-1018 (2008).
  21. Goode, B. L., Eck, M. J. Mechanism and function of formins in the control of actin assembly. Annual Review of Biochemistry. 76, 593-627 (2007).
  22. Sweeton, D., Parks, S., Costa, M., Wieschaus, E. Gastrulation in Drosophila: the formation of the ventral furrow and posterior midgut invaginations. Development. 112 (3), 775-789 (1991).
  23. Leptin, M., Grunewald, B. Cell shape changes during gastrulation in Drosophila. Development. 110 (1), 73-84 (1990).
  24. Leptin, M. Gastrulation in Drosophila: the logic and the cellular mechanisms. The EMBO Journal. 18 (12), 3187-3192 (1999).
  25. Martin, A. C. The physical mechanisms of Drosophila gastrulation: mesoderm and endoderm invagination. Genetics. 214 (3), 543-560 (2020).
  26. Gilmour, D., Rembold, M., Leptin, M. From morphogen to morphogenesis and back. Nature. 541 (7637), 311-320 (2017).
  27. Gheisari, E., Aakhte, M., Müller, H. -A. J. Gastrulation in Drosophila melanogaster: Genetic control, cellular basis and biomechanics. Mechanisms of Development. 163, 103629 (2020).
  28. Leptin, M. Twist and snail as positive and negative regulators during Drosophila mesoderm development. Genes & Development. 5 (9), 1568-1576 (1991).
  29. Costa, M., Wilson, E. T., Wieschaus, E. A putative cell signal encoded by the folded gastrulation gene coordinates cell shape changes during Drosophila gastrulation. Cell. 76 (6), 1075-1089 (1994).
  30. Kerridge, S., et al. Modular activation of Rho1 by GPCR signalling imparts polarized myosin II activation during morphogenesis. Nature Cell Biology. 18 (3), 261-270 (2016).
  31. Kölsch, V., Seher, T., Fernandez-Ballester, G. J., Serrano, L., Leptin, M. Control of Drosophila gastrulation by apical localization of adherens junctions and RhoGEF2. Science. 315 (5810), 384-386 (2007).
  32. Manning, A. J., Peters, K. A., Peifer, M., Rogers, S. L. Regulation of epithelial morphogenesis by the G protein-coupled receptor mist and its ligand fog. Science Signaling. 6 (301), (2013).
  33. Parks, S., Wieschaus, E. The Drosophila gastrulation gene concertina encodes a G alpha-like protein. Cell. 64 (2), 447-458 (1991).
  34. Barrett, K., Leptin, M., Settleman, J. The Rho GTPase and a putative RhoGEF mediate a signaling pathway for the cell shape changes in Drosophila gastrulation. Cell. 91 (7), 905-915 (1997).
  35. Dawes-Hoang, R. E., et al. Folded gastrulation, cell shape change and the control of myosin localization. Development. 132 (18), 4165-4178 (2005).
  36. Häcker, U., Perrimon, N. DRhoGEF2 encodes a member of the Dbl family of oncogenes and controls cell shape changes during gastrulation in Drosophila. Genes & Development. 12 (2), 274-284 (1998).
  37. Martin, A. C., Kaschube, M., Wieschaus, E. F. Pulsed contractions of an actin-myosin network drive apical constriction. Nature. 457 (7228), 495-499 (2009).
  38. Mason, F. M., Tworoger, M., Martin, A. C. Apical domain polarization localizes actin-myosin activity to drive ratchet-like apical constriction. Nature Cell Biology. 15 (8), 926-936 (2013).
  39. Nikolaidou, K. K., Barrett, K. A Rho GTPase signaling pathway is used reiteratively in epithelial folding and potentially selects the outcome of Rho activation. Current Biology. 14 (20), 1822-1826 (2004).
  40. Martin, A. C., Gelbart, M., Fernandez-Gonzalez, R., Kaschube, M., Wieschaus, E. F. Integration of contractile forces during tissue invagination. The Journal of Cell Biology. 188 (5), 735-749 (2010).
  41. Guo, H., Swan, M., He, B. Optogenetic inhibition of actomyosin reveals mechanical bistability of the mesoderm epithelium during Drosophila mesoderm invagination. eLife. 11, e69082 (2022).
  42. Sebti, S. M., Der, C. J. Searching for the elusive targets of farnesyltransferase inhibitors. Nature Reviews. Cancer. 3 (12), 945-951 (2003).
  43. Roberts, P. J., et al. Rho family GTPase modification and dependence on CAAX motif-signaled posttranslational modification. The Journal of Biological Chemistry. 283 (37), 25150-25163 (2008).
  44. Feig, L. A., Cooper, G. M. Inhibition of NIH 3T3 cell proliferation by a mutant ras protein with preferential affinity for GDP. Molecular and Cellular Biology. 8 (8), 3235-3243 (1988).
  45. Liu, H., et al. Photoexcited CRY2 interacts with CIB1 to regulate transcription and floral initiation in Arabidopsis. Science. 322 (5907), 1535-1539 (2008).
  46. Kennedy, M. J., et al. Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in living cells. Nature Methods. 7 (12), 973-975 (2010).
  47. Guglielmi, G., Barry, J. D., Huber, W., De Renzis, S. An optogenetic method to modulate cell contractility during tissue morphogenesis. Developmental Cell. 35 (5), 646-660 (2015).
  48. Izquierdo, E., Quinkler, T., De Renzis, S. Guided morphogenesis through optogenetic activation of Rho signalling during early Drosophila embryogenesis. Nature Communications. 9 (1), 2366 (2018).
  49. Hutson, M. S., et al. Forces for morphogenesis investigated with laser microsurgery and quantitative modeling. Science. 300 (5616), 145-149 (2003).
  50. Rauzi, M., Lenne, P. -F. Probing cell mechanics with subcellular laser dissection of actomyosin networks in the early developing Drosophila embryo. Methods in Molecular Biology. 1189, 209-218 (2015).
  51. Rauzi, M., Verant, P., Lecuit, T., Lenne, P. -F. Nature and anisotropy of cortical forces orienting Drosophila tissue morphogenesis. Nature Cell Biology. 10 (12), 1401-1410 (2008).
  52. Hunter, C., Wieschaus, E. Regulated expression of nullo is required for the formation of distinct apical and basal adherens junctions in the Drosophila blastoderm. The Journal of Cell Biology. 150 (2), 391-401 (2000).
  53. Oda, H., Tsukita, S. Real-time imaging of cell-cell adherens junctions reveals that Drosophila mesoderm invagination begins with two phases of apical constriction of cells. Journal of Cell Science. 114, 493-501 (2001).
  54. Munjal, A., Philippe, J. -M., Munro, E., Lecuit, T. A self-organized biomechanical network drives shape changes during tissue morphogenesis. Nature. 524 (7565), 351-355 (2015).
  55. Rørth, P. Gal4 in the Drosophila female germline. Mechanisms of Development. 78 (1-2), 113-118 (1998).
  56. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  57. Magie, C. R., Meyer, M. R., Gorsuch, M. S., Parkhurst, S. M. Mutations in the Rho1 small GTPase disrupt morphogenesis and segmentation during early Drosophila development. Development. 126 (23), 5353-5364 (1999).
  58. Rich, A., Fehon, R. G., Glotzer, M. Rho1 activation recapitulates early gastrulation events in the ventral, but not dorsal, epithelium of Drosophila embryos. eLife. 9, e56893 (2020).
  59. Herrera-Perez, R. M., Cupo, C., Allan, C., Lin, A., Kasza, K. E. Using optogenetics to link myosin patterns to contractile cell behaviors during convergent extension. Biophysical Journal. 120 (19), 4214-4229 (2021).

Tags

ביולוגיה התפתחותית גיליון 194 אופטוגנטיקה מכניקת רקמות Rho1 אקטומיוזין אבלציה בלייזר כיווץ אפיקלי גסטרולציה
עיכוב אופטוגנטי של התכווצות אקטומיוזין בתיווך Rho1 יחד עם מדידת מתח אפיתל בעוברי <em>דרוזופילה</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Guo, H., Swan, M., He, B.… More

Guo, H., Swan, M., He, B. Optogenetic Inhibition of Rho1-Mediated Actomyosin Contractility Coupled with Measurement of Epithelial Tension in Drosophila Embryos. J. Vis. Exp. (194), e65314, doi:10.3791/65314 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter