Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Optogenetisk hæmning af rho1-medieret actomyosinkontraktilitet kombineret med måling af epitelspænding i Drosophila-embryoner

Published: April 14, 2023 doi: 10.3791/65314
Automatic Translation
1,2, 3, 1
1Department of Biological Sciences, Dartmouth College, 2School of Life Sciences, Westlake University, 3Department of Molecular Biology, Princeton University

Summary

Actomyosin kontraktilitet spiller en vigtig rolle i celle- og vævsmorfogenese. Det er imidlertid udfordrende at manipulere actomyosinkontraktilitet in vivo akut. Denne protokol beskriver et optogenetisk system, der hurtigt hæmmer Rho1-medieret actomyosinkontraktilitet i Drosophila-embryoner , hvilket afslører det øjeblikkelige tab af epitelspænding efter inaktivering af actomyosin in vivo.

Abstract

Kontraktile kræfter genereret af actin og ikke-muskelmyosin II ("actomyosin kontraktilitet") er kritiske for morfologiske ændringer af celler og væv på flere længdeskalaer, såsom celledeling, cellemigration, epitelfoldning og forgrening af morfogenese. En dybdegående forståelse af actomyosinkontraktilitetens rolle i morfogenese kræver tilgange, der muliggør hurtig inaktivering af actomyosin, hvilket er vanskeligt at opnå ved anvendelse af konventionelle genetiske eller farmakologiske tilgange. Den præsenterede protokol demonstrerer brugen af et CRY2-CIBN-baseret optogenetisk dimeriseringssystem, Opto-Rho1DN, til at hæmme actomyosinkontraktilitet i Drosophila-embryoner med præcise tidsmæssige og rumlige kontroller. I dette system smeltes CRY2 sammen med den dominerende negative form af Rho1 (Rho1DN), mens CIBN er forankret til plasmamembranen. Blå lysmedieret dimerisering af CRY2 og CIBN resulterer i hurtig translokation af Rho1DN fra cytoplasmaet til plasmamembranen, hvor det inaktiverer actomyosin ved at hæmme endogen Rho1. Derudover præsenterer denne artikel en detaljeret protokol til kobling af Opto-Rho1DN-medieret inaktivering af actomyosin med laserablation for at undersøge actomyosins rolle i generering af epitelspænding under dannelse af Drosophila ventral fure. Denne protokol kan anvendes på mange andre morfologiske processer, der involverer actomyosin kontraktilitet i Drosophila-embryoner med minimale modifikationer. Samlet set er dette optogenetiske værktøj en kraftfuld tilgang til at dissekere funktionen af actomyosinkontraktilitet til styring af vævsmekanik under dynamisk vævsremodellering.

Introduction

Actomyosin kontraktilitet, den kontraktile kraft, der udøves af ikke-muskelmyosin II (herefter 'myosin') på F-actin-netværket, er en af de vigtigste kræfter i at ændre celleform og drive morfogenese på vævsniveau 1,2. For eksempel resulterer aktiveringen af actomyosinkontraktilitet ved epitelcellernes apikale domæne i apikal indsnævring, hvilket letter en række morfogenetiske processer, herunder epitelfoldning, celleekstrudering, delaminering og sårheling 3,4,5,6,7 . Aktiveringen af myosin kræver phosphorylering af dens regulatoriske lyskæde. Denne modifikation lindrer den hæmmende konformation af myosinmolekylerne, så de kan danne bipolære myosinfilamentbundter med flere hoveddomæner i begge ender. De bipolære myosinfilamenter driver den antiparallelle bevægelse af actinfilamenter og resulterer i generering af kontraktil kraft 1,8,9.

Den evolutionært bevarede Rho-familie lille GTPase RhoA (Rho1 i Drosophila) spiller en central rolle i aktiveringen af actomyosinkontraktilitet i forskellige cellulære sammenhænge10,11. Rho1 fungerer som en bimolekylær switch ved at binde enten GTP (aktiv form) eller BNP (inaktiv form)12. Kredsløbet mellem GTP- eller GDP-bundet Rho1 reguleres af dets GTPase-aktiverende proteiner (GAPs) og guaninnukleotidbytterfaktorer (GEF'er)13. GEF'er fungerer til at lette udvekslingen af BNP for GTP og dermed aktivere Rho1-aktivitet. GAPs forbedrer derimod GTPase-aktiviteten af Rho1 og deaktiverer således Rho1. Aktiveret Rho1 fremmer actomyosin kontraktilitet gennem interaktion med og aktivering af dets downstream effektorer, Rho-associeret kinase (Rok) og Diaphanous14. Rok inducerer myosinaktivering og actomyosinkontraktilitet ved phosphorylering af den regulatoriske lyskæde af myosin15. Derudover hæmmer Rok også myosinregulatorisk lyskædefosfatase og fremmer dermed yderligere myosinfilamentsamling16. Rok kan også phosphorylere LIM-kinaser, som, når de aktiveres, forhindrer aktinadskillelse ved phosphorylating og hæmmer actin-depolymeriseringsfaktoren cofilin17,18. Diaphanous er en forminfamilie actinnukleator, der fremmer actinpolymerisation, hvilket giver en base for myosin at interagere med 19,20,21.

Mens de cellulære mekanismer, der aktiverer actomyosinkontraktilitet, er blevet godt belyst, forbliver vores forståelse af dens funktion i regulering af dynamisk vævsremodellering ufuldstændig. At udfylde dette videnshul kræver tilgange, der hurtigt kan inaktivere actomyosin på specifikke vævsregioner in vivo og registrere den umiddelbare indvirkning på vævsadfærd og egenskaber. Denne protokol beskriver brugen af en optogenetisk tilgang til akut hæmme actomyosinkontraktilitet under Drosophila mesoderm invagination, efterfulgt af måling af epitelspænding ved hjælp af laserablation. Under Drosophila gastrulation gennemgår de ventralt lokaliserede mesoderm-forløberceller apikal indsnævring og invaginat fra embryoets overflade ved at danne en anterior-posteriort orienteret fure22,23. Dannelsen af ventrale furer har længe været brugt som en model til undersøgelse af mekanismen for epitelfoldning. Ventral furedannelse administreres af det dorsal-ventrale mønstersystem i Drosophila24,25,26,27. Ekspressionen af to transkriptionsfaktorer, Twist og Snail, placeret på den ventrale side af embryoet, styrer ventral furedannelse og specificerer mesodermal celleskæbne28. Twist and Snail aktiverer rekrutteringen af Rho1 GEF RhoGEF2 til toppen af mesoderm-forløbercellerne via en G-proteinkoblet receptorvej og et RhoGEF2-adaptorprotein, T48 29,30,31,32,33. Dernæst aktiverer RhoGEF2 myosin gennem den apikale overflade af den potentielle mesoderm gennem Rho-Rho-kinasevejen 34,35,36,37,38,39. Aktiveret myosin danner et supracellulært actomyosinnetværk gennem den apikale overflade af mesoderm primordium, hvis sammentrækninger driver apikal indsnævring og resulterer i en hurtig stigning i apikal vævsspænding 14,37,40.

Det optogenetiske værktøj beskrevet i denne protokol, Opto-Rho1DN, hæmmer actomyosinkontraktilitet gennem blålysafhængig plasmamembranrekruttering af en dominerende negativ form af Rho1 (Rho1DN)41. En T19N-mutation i Rho1DN eliminerer det mutante proteins evne til at udveksle BNP med GTP og gør dermed proteinet evigt inaktivt34. En efterfølgende mutation i Rho1DN, C189Y, eliminerer dets naive membranmålretningssignal42,43. Når Rho1DN infunderes til plasmamembranen, binder det sig til og beslaglægger Rho1 GEF'er og blokerer derved aktiveringen af Rho1 såvel som Rho1-medieret aktivering af myosin og actin34,44. Plasmamembranrekrutteringen af Rho1DN opnås gennem et lysafhængigt dimeriseringsmodul afledt af Cryptochrome 2 og dets bindingspartner CIB1. Cryptochrome 2 er en blå-lys aktiveret Cryptochrome fotoreceptor i Arabidopsis thaliana45. Cryptochrome 2 binder kun til CIB1, et basisk helix-loop-helix-protein, i sin fotoexciterede tilstand45. Det blev senere konstateret, at den konserverede N-terminale, fotolyasehomologiske region (PHR), fra Cryptochrome 2 (CRY2PHR, i det følgende benævnt CRY2) og det N-terminale domæne (aa 1-170) af CIB1 (herefter CIBN) er vigtige for lysinduceret dimerisering46. Opto-Rho1DN indeholder to komponenter. Den første komponent er CIBN-proteinet fusioneret med et CAAX-anker, som lokaliserer proteinet til plasmamembranen47. Den anden komponent er mCherry-tagget CRY2 smeltet sammen med Rho1DN41. I mangel af blåt lys forbliver CRY2-Rho1DN i cytoplasmaet. Ved stimulering af blåt lys målrettes CRY2-Rho1DN mod plasmamembranen gennem interaktionen mellem membranforankret CIBN og exciteret CRY2. Opto-Rho1DN kan aktiveres af ultraviolet A (UVA) lys og blåt lys (400-500 nm, maksimal aktivering ved 450-488 nm) eller af en 830-980 nm pulserende laser, når der udføres to-fotonstimulering41,46,47,48. Derfor stimuleres Opto-Rho1DN af bølgelængder, der normalt bruges til spændende GFP (488 nm til enkeltfotonbilleddannelse og 920 nm til to-fotonbilleddannelse). I modsætning hertil stimulerer bølgelængder, der almindeligvis anvendes til spændende mCherry (561 nm til enkeltfotonbilleddannelse og 1.040 nm til to-fotonbilleddannelse) ikke det optogenetiske modul og kan derfor bruges til præstimuleringsbilleddannelse. Protokollen beskriver de tilgange, der anvendes til at minimere risikoen for uønsket stimulering under prøvemanipulation.

Laserablation er blevet anvendt i vid udstrækning til at detektere og måle spændinger i celler og væv49. Tidligere undersøgelser har vist, at når laserintensiteten kontrolleres korrekt, kan to-foton laserablation, der anvender en femtosekund nær-infrarød laser, fysisk forringe nogle subcellulære strukturer (f.eks. Kortikale actomyosinnetværk) uden at forårsage plasmamembranhenrykkelse50,51. Hvis vævet er under spænding, resulterer laserablation af et område af interesse i vævet i en øjeblikkelig udadgående rekyl af cellerne ved siden af det ablerede område. Rekylhastigheden er en funktion af størrelsen af spændingen og viskositeten af mediet (cytoplasma), der omgiver de strukturer, der gennemgår rekyl49. På grund af den overlegne penetrationsdybde af de nær-infrarøde lasere og evnen til at opnå godt begrænset fokal ablation er to-foton laserablation særlig nyttig til påvisning af vævsspænding in vivo. Som demonstreret i denne protokol kan denne metode let kombineres med Opto-Rho1DN-medieret inaktivering af actomyosinkontraktilitet for at undersøge den direkte virkning af Rho1-afhængig cellulær kontraktilitet på vævsmekanik under dynamisk vævsremodellering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Opsætning af det genetiske kryds og klargøring af ægopsamlingskoppen

  1. Vælg hunfluer (jomfru) fra den optogenetiske linje UASp-CIBNpm (I); UASp-CRY2-Rho1DN-mCherry (III) på en CO2 -pude under et stereomikroskop og opsatte et kryds med hanfluer fra moderens GAL4 -førerlinje 67 Sqh-mCherry; 15 E-cadherin-GFP.
    BEMÆRK: 67 og 15 står for moder-Tubulin-GAL4 indsat i henholdsvis anden (II) og tredje (III) kromosomer,52. GAL4-linjen, der anvendes i denne protokol, udtrykker også den mCherry-mærkede myosinregulatoriske lyskæde Sqh (Spaghetti squash)37 og GFP-mærket E-cadherin53. Fluer fra den optogenetiske linje kan stadig indeholde FM7- og TM6-balancekromosomer. Fluer fra moderens GAL4-driverlinje kan stadig indeholde CyO- og TM3-balancekromosomerne.
  2. Efter ~10 dage skal du vælge F1-hunfluer med følgende genotype: UASp-CIBNpm/+; 67 kvm-kirsebær/+; 15 E-cadherin-GFP/UASp-CRY2-Rho1DN-mCherry. Opret en ægopsamlingskop med hanfluerne.
    1. Sørg for, at hunfluerne med den korrekte genotype ikke indeholder nogen balancekromosomer (dvs. de bør ikke indeholde krøllede vinger [Cy], korte børster [Sb], stang- eller nyreformede øjne [B] eller ekstra humerale børster [Hu]), som er markører for henholdsvis CyO-, TM3-, FM7- og TM6-balancere, der bruges til at generere lagrene. Dæk koppen med en æblejuiceplade med et skær af frisk gærpasta på overfladen.
      BEMÆRK: Hos F1-kvinder udtrykkes de optogenetiske komponenter moderligt. Derfor behøver de F1-kvinder, der bruges til opsætning af koppen, ikke at være jomfruer. Det anbefales at bruge hanfluer fra samme F1-population til koppen for nemheds skyld.
  3. Opbevar koppen i en papkasse dækket med aluminiumsfolie for at undgå mulig lyslækage fra miljøet. Skift æblejuicepladen hver dag for kopper, der opbevares ved stuetemperatur (~ 21-23 ° C), eller hver anden dag for kopper, der opbevares ved 18 ° C.
    1. Umiddelbart før pladeskift skal du banke koppen på en plan overflade (f.eks. Bænk) for at holde fluerne i bunden af koppen og forhindre dem i at undslippe. Skift æblejuicepladen i et mørkt rum, og brug en pandelampe med rødt lys til belysning (se Materialetabel).
      BEMÆRK: For at øge ekspressionen af de konstruktioner, der er under kontrol af maternal-Tubulin-GAL4 og UASp, anbefales det at opbevare koppen ved 18 °C i mindst 3 dage før embryoopsamling. Denne inkubationsperiode gør det også muligt for fluerne at tilpasse sig koppen og blive godt fodret med gærpastaen for at opnå optimal ægproduktion.

2. Indsamling af embryoner på det ønskede stadium og forberedelse af dem til optogenetisk stimulering

BEMÆRK: Alle prøveindsamlings- og forberedelsestrin skal udføres i et mørkt rum ved hjælp af et "sikkert lys" (f.eks. Rødt lys) til belysning. De optogenetiske komponenter er uhyre følsomme over for omgivende lys. Selv den mindste eksponering for omgivende lys fører til for tidlig stimulering af prøven. Typisk forårsager lys i det grøn-røde område (>532 nm) ikke uønsket stimulering.

  1. Til opsamling af embryoner tidligt i embryogenesen anbringes en ny æblejuicetallerken på koppen 8 til 16 timer før embryoopsamling (ved 18 °C).
  2. På tidspunktet for embryoopsamling skal du ændre æblejuicepladen. Mærk pladen, der tages af koppen, og dæk pladens overflade med et tyndt lag halocarbonolie 27 (se materialetabel). Vent i 30-60 s på, at æggeskallen bliver gennemsigtig.
  3. Placer et orangerødt plastskjold (se materialetabel) på scenen i et opretstående stereoskop. Placeringen af det orangerøde skjold forhindrer uønsket stimulering under prøvebelysning ved at blokere de blågrønne bølgelængder fra det transmitterede lys.
    BEMÆRK: I denne protokol anvendes et opretstående stereoskop til embryoopsamling (se materialetabel).
  4. Læg æblejuicepladen oven på det orangerøde skjold. Tænd stereomikroskopets transmitterede lys for at belyse prøven. Saml 5-15 embryoner på det passende tidspunkt fra æblesaftpladen ved hjælp af en pincet. Klem ikke embryonerne med pincetten.
    BEMÆRK: I denne protokol skal det passende embryo være på det tidlige midterste cellulariseringsstadium. Embryoet på dette stadium skal have en mørk uigennemsigtig æggeblomme omgivet af et klart, ensartet periplasmalag, der indeholder de dannende blastodermceller. Forkanten af spaltningsfurerne ("cellulariseringsfront"), der fremstår som en kontinuerlig linje parallelt med embryoets overflade, bør ikke passere halvdelen af periplasmaets dybde.
  5. Tør forsigtigt embryonerne på et stykke køkkenrulle (~ 1,5 cm × 1,5 cm) for at fjerne overskydende olie fra embryonerne ved hjælp af pincetten.
  6. Tilsæt flere dråber frisklavet 40% blegemiddel (~3% natriumhypochlorit; se materialetabel) til et nyt lille firkantet stykke køkkenrulle (~1,5 cm × 1,5 cm) ved hjælp af en plastikoverførselspipette, så køkkenrullen er dækket af et tyndt lag blegemiddel. Overfør embryoet fra det tørre køkkenrulle til det blegemiddelgennemblødte køkkenrulle ved hjælp af pincetten, og sørg for, at embryonerne er gennemblødt i blegemiddel. Vent 2-4 minutter på, at embryoet bliver dechorioneret.
  7. Efter dechorionation skal du bruge pincetten til at blotte det firkantede papirhåndklæde på et stort stykke silkepapir for at fjerne overskydende blegemiddel. Sørg for, at siden med embryonerne vender opad.
  8. For at skylle embryonerne skal du bruge pincetten til forsigtigt at suge det firkantede papirhåndklæde i en dråbe deioniseret vand og hurtigt tørre det på et stort stykke silkepapir. Gentag denne proces otte gange for at sikre fjernelse af eventuelle rester af blegemiddel.
  9. Brug et øjenvippeværktøj til at overføre embryoet fra køkkenrullen til et 35 mm fad med glasbund (se materialetabellen). Tilsæt deioniseret vand til skålen for at dække embryonerne helt. Finjuster embryonernes position og orientering ved hjælp af øjenvippeværktøjet.
    BEMÆRK: Efter dechorionation har embryoet tendens til at holde fast på overfladen af glasset og er immobilt uden forstyrrelse, så det er ikke nødvendigt at anvende yderligere behandling (såsom lim) for at immobilisere embryoet på glasbundskålen.
  10. Anbring 35 mm glasbundsskålen med embryonerne i en lystæt sort boks (se materialetabellen) for at beskytte prøven mod lyseksponering under overførselsprocessen. Bring kassen til rummet med multifotonmikroskopet.

3. Optogenetisk stimulering, laserablation og billeddannelse af embryoet

BEMÆRK: Multifotonsystemet, der anvendes i dette eksperiment (se materialetabel), er i stand til samtidig dobbeltbølgelængdebilleddannelse. Den indeholder også en fotostimuleringsenhed med en 458 nm laser og en separat galvanometerscanner, der muliggør fotoaktivering / stimulering inden for et defineret interesseområde (ROI). Det skal bemærkes, at 920 nm-laseren, som bruges til at excitere grøngule fluorescerende proteiner, vil stimulere Opto-Rho1DN, omend langsommere sammenlignet med blå lasermedieret stimulering.

  1. Dæk multifotonmikroskopet med en lystæt sort klud (se materialetabel) for at undgå uønsket stimulering af embryonerne under prøveopsætning og billeddannelse.
    BEMÆRK: Den samme fremgangsmåde anvendes under regelmæssig multifotonbilleddannelse for at beskytte de lysfølsomme detektorer, der er udstyret på mikroskopet.
  2. Sluk lyset i rummet og computerskærmene. Sluk for berøringspanelcontrolleren ved at klikke på OFF under 'Baggrundsbelysning af berøringspanelcontroller' i softwaren. Sørg for, at der ikke er andet omgivende lys i rummet.
    1. Åbn forsiden af det sorte kluddæksel på mikroskopet. Tag 35 mm glasbundskålen fra den sorte boks og læg den på mikroskoptrinnet.
  3. Belys embryoner med et grønt lys, der normalt bruges som excitationslys for epifluorescens. For at gøre dette skal du tænde fluorescensbelysningsenheden, vælge Okulær under panelet 'Okulær' i softwaren og ændre 'Cube tårn' til 4: TRITC. Brug okularet til at identificere embryoet af interesse og bringe det i fokus.
    BEMÆRK: Den grønne lysvisualisering opnås ved at lade et hvidt lys, der genereres af fluorescensbelysningsenheden, passere gennem en indbygget standard TRITC-filterkube, som indeholder et 528-553 nm excitationsfilter, en 565 nm strålesplitter og et 590-650 nm emissionsfilter. Andre ikke-blå lys skal også fungere fint til prøvebelysning. Det er ikke nødvendigt at bære øjenbeskyttelse på dette trin, da excitationslyset har en lav intensitet og ikke vil blive rettet mod okularet. Embryoet vises ensartet rødt på grund af autofluorescens.
  4. Luk det sorte kluddæksel, så prøven er helt beskyttet mod lys. Tænd computerskærmen for at få adgang til softwaren, der styrer mikroskopet. Skift 'Ocular' til LSM i softwaren til billedoptagelse.
  5. Udfør laserablation i kontrol, ustimulerede embryoner ved hjælp af et 25x vandnedsænkningsmål.
    1. Klik på Bright Z, Sequence Manager og LSM Stimulation fra 'Tool Window' i softwaren. Indstil scannertypen som Galvano og scanningsstørrelsen til 512 × 512. Tænd CH1 og CH3 under panelet 'PMT-indstilling' for at tillade brugen af 1.040 nm-laseren, og klik på Live × 4 for at visualisere embryoet.
    2. Drej embryoet ved hjælp af rotationsfunktionen i softwaren, så embryoets forreste bageste akse er lodret orienteret. Indstil zoom til 3. Tegn et interesseområde (ROI) ved hjælp af formværktøjet under 'Scanningsindstillinger', og indstil størrelsen på ROI i panelet 'Reference'. Indstil ROI til 512 pixels i bredden og 100 pixels i højden (171 × 33 μm2).
    3. Indstil anskaffelsesparametre for præ-ablation Z-stakken.
      1. Embryonets overflade registreres som 0 under »Z-snittet«. Indstil starten som 0 og slutningen som 100 μm. Indstil trinstørrelsen til 2 μm. Aktivér Z-anskaffelsestilstanden ved at markere Z under fanen 'Serie'.
      2. Indstil 1.040 nm laserintensitet for at øge lineært fra 3% til 7% ved hjælp af Bright Z-funktionen .
      3. Gem den aktuelle billedbehandlingsindstilling som den første opgave i pipelinen ved at klikke på LSM i 'Sequence Manager'.
        BEMÆRK: Forablation Z-stakken opnås for at bekræfte embryoets stadium. I dette eksperiment vil CRY2-Rho1DN-mCherry og Sqh-mCherry blive begejstret af 1.040 nm laseren. Under apikal indsnævring forbedres Sqh-mCherry-signalet i det middelmådige område af de ventrale mesodermale celler, mens CRY2-Rho1DN-mCherry er cytosolisk før stimulering. Den laserintensitet, der anvendes til billeddannelse før og efter stimulering, bestemmes empirisk baseret på balancen mellem det optimale signal-støjforhold og undgåelse af fotoblegning.
    4. Indstil anskaffelsesparametre for filmen før ablation.
      1. Slet alle eksisterende ROI for at muliggøre billeddannelse af hele området 512 × 512 pixel (171 × 171 μm 2, 3x zoom) nær embryoets ventrale overflade som beskrevet i trin 3.5.2. Indstil laserintensiteten på 1.040 nm til 3 %.
      2. Kontroller tid , og fjern markeringen af Z under panelet 'Serie'. Behold 'Interval' som FreeRun under panelet 'Time Lapse'. Indstil cyklus til 10.
      3. Gem de aktuelle indstillinger som den næste opgave i pipelinen ved at klikke på LSM i 'Sequence Manager'.
        BEMÆRK: Formålet med denne opgave er at opnå en 10-frame enkelt Z-plan pre-ablation film med en 1.040 nm laser til billedoptagelse. Billedoptagelseshastigheden er ca. 1 s pr. Ramme.
    5. Indstil parametrene for laserablation.
      1. Definer et 3D-område fra umiddelbart under vitellinmembranen til ~20 μm dyb for laserablation (figur 1A). Indstil starten af Z-stakken som det plan, der er umiddelbart under vitellinmembranen, og slutningen som 20 μm dybere end startplanet. Indstil trinstørrelsen til 1,5 μm.
        BEMÆRK: ROI for det ablerede område er ~30 pixel i bredden og ~10 pixela i højden (~10 μm langs den mediale-laterale akse og ~3,3 μm langs A-P-aksen). Formålet med at ablere prøven ved flere Z-planer er at sikre, at den apikale overflade af de ventrale celler ableres. Dette er især vigtigt for de stimulerede embryoner, da de ventrale celler oplever hurtig apikal afslapning efter Rho1-hæmning.
      2. Tænd CH2 og CH4 under panelet 'PMT-indstilling' for at tillade brug af 920 nm-laseren. Indstil intensiteten af 920 nm laseren til 30%. Indstil billedoptagelse med 920 nm-laseren til en enkelt Z-stak inden for det 3D-område, der er defineret i trin 3.5.5.1 til laserablation.
        BEMÆRK: Den laserintensitet, der vælges i dette trin, er tilstrækkelig til at ablatere vævet (som angivet ved vævsrekyl umiddelbart efter laserbehandlingen), men beskadiger i mellemtiden ikke plasmamembranen åbenlyst (som indikeret ved manglen på brændemærker på cellemembranen) (figur 1B, C).
      3. Gem den aktuelle indstilling som den næste opgave i pipelinen ved at klikke på LSM i 'Sequence Manager'.
    6. Indstil anskaffelsesparametre for filmen efter ablation.
      1. Indstil billedoptagelse til en 100-frame enkelt Z-plan post-ablation-film ved hjælp af både 1.040 nm og 920 nm lasere. Indstil intensiteten af 1.040 nm laseren og 920 nm laseren til henholdsvis 3% og 0,3%. Det område, der er angivet i trin 3.5.4, afbildes med samme billedoptagelseshastighed.
      2. Gem den aktuelle indstilling som den næste opgave i pipelinen ved at klikke på LSM i 'Sequence Manager'.
        BEMÆRK: Formålet med at lagre parametrene beskrevet i trin 3.5.3-3.5.6 som sekventielle opgaver i 'Sequence Manager' før enhver faktisk erhvervelse er at sikre opfangning af det umiddelbare vævsrespons efter laserablation.
    7. Vælg Sekvens under 'Erhverv'. Skift datalagringsstien og filnavnet efter behov. Klik på Klar , og vent på, at softwaren initialiserer pipelinen. Klik derefter på Start for at udføre pipelinen.
  6. Udfør laserablation i stimulerede embryoner.
    1. Angiv anskaffelsesparametre for præ-ablation Z-stakken som beskrevet i trin 3.5.1-3.5.3. Gem den aktuelle indstilling som den første opgave i pipelinen ved at klikke på LSM i 'Sequence Manager'.
    2. Indstil parametre for optogenetisk stimulering inden for et defineret ROI.
      1. Skift zoom til 1 , og vælg et investeringsafkast, der dækker embryoets ventrale overflade (~ 512 × 300 μm2). Sluk for CH1-CH4-detektorerne .
      2. Klik på LSM-stimulering. Fjern markeringen af Kontinuerlig inden for varighed, og skriv 12 s. Kontroller 458 nm med 0.3% laserintensitet.
      3. Gem den aktuelle indstilling som den næste opgave i pipelinen ved at klikke på Stimulering i 'Sequence Manager'.
        BEMÆRK: En hurtigere stimulering kan opnås ved at øge laserintensiteten på 458 nm. Ved brug af højere laserintensiteter kan det spredte laserlys imidlertid stimulere området ved siden af ROI, hvilket ikke er ideelt, hvis der kræves en rumligt begrænset stimulering.
    3. Indstil en 3 minutters ventetid efter stimulering for at sikre total inaktivering af myosin og demontering af apikal F-actin og for at opnå en statisk vævsmorfologi før laserablation. Dette opnås ved at klikke på Vent /pause under 'Sequence Manager' og indstille det ønskede tidspunkt for 'Vent'.
      BEMÆRK: Rekruttering af CRY2-Rho1DN-mCherry til membranen forårsaget af en enkelt stimuleringsrunde (0,3% 458 nm laser i 12 s) kan tydeligt påvises 10-15 minutter efter stimuleringen. Dette er i overensstemmelse med den offentliggjorte dissociationshalvtid på ~ 9 min47.
    4. Indstil optagelsesparametre for den enkelte Z-plan pre-ablation-film som beskrevet i trin 3.5.4, bortset fra at både 1.040 nm- og 920 nm-lasere bruges til billedoptagelse. Tænd for CH1-CH4-detektorerne . Indstil intensiteten af 1.040 nm laseren og 920 nm laseren til henholdsvis 3% og 0,3%. Gem den aktuelle indstilling som den næste opgave i pipelinen ved at klikke på LSM i 'Sequence Manager'.
    5. Indstil parametre for laserablation som beskrevet i trin 3.5.5. Gem den aktuelle indstilling som den næste opgave i pipelinen ved at klikke på LSM i 'Sequence Manager'.
    6. Angiv optagelsesparametre for den enkelte Z-plan post-ablationsfilm som beskrevet i trin 3.5.6. Gem den aktuelle indstilling som den næste opgave i pipelinen ved at klikke på LSM i 'Sequence Manager'.
    7. Vælg Sekvens under 'Erhverv'. Skift datalagringsstien og filnavnet efter behov. Klik på Klar , og vent på, at softwaren initialiserer pipelinen. Klik derefter på Start for at udføre pipelinen.

4. Kvantificering af hastigheden af vævsrekyl efter laserablation

  1. Åbn post-ablationsfilmen i ImageJ.
  2. Tegn et lille investeringsafkast langs den ventrale midterlinje, der dækker det ablerede område ved hjælp af værktøjet Rektangelmarkering . Bredden af ROI er ni pixels. Højden af ROI er indstillet således, at ROI er stor nok til at dække hele spektret af vævsrekyl efter laserablation.
    1. Klik på Dupliker under fanen 'Billede'. I pop op-vinduet skal du markere Dupliker stak og derefter klikke på OK for at duplikere stakken inden for det valgte investeringsafkast.
  3. Generer en montage fra den duplikerede stak gennem Image > Stacks > Make Montage. I pop op-vinduet skal du indstille rækkenummeret til 1 og kolonnenummeret til det samlede antal billeder i stakken (100 i dette tilfælde).
  4. Mål A-P-bredden af det ablerede område over tid fra den genererede montage.
    1. Brug flerpunktsværktøjet i ImageJ til at markere A-P-grænserne for det ablerede område for hvert tidspunkt på montagen.
    2. Gem koordinaterne for de markerede prikker ved hjælp af File > Save as > XY Coordinates.
    3. Importer de målte XY-koordinater til MATLAB. Beregn A-P-bredden af det ablerede område for hvert tidspunkt ved at trække Y-koordinaten for den øvre grænse fra Y-koordinaten for den nedre grænse.
  5. Bestem hastigheden af vævsrekyl ved at montere de første 20 s af kurven "bredde over tid" i en linje ved hjælp af funktionen 'polyfit' i MATLAB. Rapporter hældningen af den monterede linje som hastigheden af vævsrekyl.
  6. Udfør statistiske tests for at sammenligne hastigheden af vævsrekyl mellem de stimulerede og ikke-stimulerede prøver.
    BEMÆRK: Det anbefales at indhente data fra mindst fem embryoner pr. Tilstand. Både den tosidede Wilcoxon rangsumstest og den tosidede elev-t-test kan bruges til statistisk sammenligning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I de ustimulerede embryoner, der gennemgik apikal indsnævring, blev Sqh-mCherry beriget i den medioapikale region af de ventrale mesodermale celler, mens CRY2-Rho1DN-mCherry var cytosolisk (figur 1A). Laserablation inden for indsnævringsdomænet førte til en hurtig vævsrekyl langs A-P-aksen (figur 1B, C). I de stimulerede embryoner blev CRY2-Rho1DN-mCherry-signalet plasmamembranlokaliseret, mens det medioapiske signal fra Sqh-mCherry forsvandt fuldstændigt (figur 1A). Laserablation i de stimulerede embryoner resulterede ikke i tydelig vævsrekyl, som eksemplificeret i figur 1B,C og kvantificeret i figur 1D. Disse resultater indikerer, at dannelsen af vævsspænding kræver aktiv apikal actomyosinkontraktilitet; når actomyosin bliver inaktiv ved Rho1-hæmning, mindsker den apikale vævsspænding også41. Disse observationer er i overensstemmelse med de tidligere resultater, at aktivering af apikal myosinkontraktilitet i ventrale mesodermale celler resulterer i en stigning i vævsspænding på embryoets ventrale overflade40.

Figure 1
Figur 1: Opto-Rho1DN-stimulering under apikal indsnævring resulterer i et øjeblikkeligt tab af kortikal spænding på embryoets ventrale overflade . (A) Tegneserie, der viser den eksperimentelle opsætning til laserablation til detektering af kortikal spænding. Gulskraverede områder angiver de ablerede områder. For stimulerede embryoner blev lysaktivering af Opto-Rho1DN udført 3 minutter før laserablationen. På grund af apikal afslapning efter stimulering blev flere z-planer ableret (gulskygget region) for at sikre ablation af den meget apikale overflade af de ventrale celler. (B,C) Sammenligning mellem ustimulerede og stimulerede embryoner. Der blev ikke observeret nogen tydelig vævsrekyl i de stimulerede embryoner (N = 6 for ustimulerede embryoner og N = 5 for stimulerede embryoner). B) Et ansigtsbillede af laserablerede embryoner. Gulskyggede kasser markerer det ablerede område. C) Kymografer, der repræsenterer breddeændringen i det ablerede område. Gule stiplede linjer angiver ablationsstedet. (D) Breddeændringer i det ablerede område langs A-P-aksen i løbet af de første 20 s efter laserablation. En klar vævsrekyl blev observeret efter laserskæring i de ustimulerede kontrolembryoner. I modsætning hertil blev der observeret lidt eller ingen vævsrekyl i de stimulerede embryoner, hvilket indikerer en mangel på apikal spænding efter Rho1-hæmning. Fejlbjælke er standardafvigelse. P-værdien blev beregnet ved hjælp af en tosidet Wilcoxon-rangsumstest. Denne figur er genbrugt fra Guo et al.41. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokol beskrev den kombinerede anvendelse af optogenetik og laserablation til sondeændringer i vævsspænding umiddelbart efter inaktivering af actomyosinkontraktilitet. Det optogenetiske værktøj, der beskrives her, udnytter den dominerende negative form af Rho1 (Rho1DN) til akut at hæmme endogen Rho1 og Rho1-afhængig actomyosinkontraktilitet. Tidligere karakterisering af Opto-Rho1DN i forbindelse med Drosophila ventral furedannelse viste, at værktøjet er yderst effektivt til at formidle den hurtige inaktivering af apikal actomyosinkontraktilitet gennem samtidig myosininaktivering og actindemontering41. Især resulterede stimuleringen af embryoner på tidspunktet for apikal indsnævring i reduktion af det apikale myosinsignal inden for 60 s i celler, der gennemgik apikal indsnævring41. Denne hurtige fjernelse af kortikal myosin ved Rho1-hæmning skyldes sandsynligvis den hurtige cyklus af Rho1 og myosin gennem aktive og inaktive tilstande forårsaget af aktiviteterne af GTPase-aktiverende proteiner (GAP'er) for henholdsvis Rho1 og myosin letkædephosphataser19,54. I overensstemmelse med virkningen på actomyosin viste kobling af optogenetik med laserablation, at Opto-Rho1DN-stimulering under apikal indsnævring resulterede i et øjeblikkeligt tab af epitelspænding i embryoets ventrale region41 (figur 1). Denne kombinerede tilgang gjorde det muligt for os at undersøge funktionen af Rho1-medieret cellulær kontraktilitet i regulering af vævsmekanik med hidtil uset rumlig og tidsmæssig præcision, hvilket gjorde det muligt at dissekere umiddelbare virkninger fra langsigtede effekter, der er vanskelige at opnå ved hjælp af konventionelle genetiske tilgange.

En vigtig teknisk overvejelse ved brug af Opto-Rho1DN er, at værktøjet er meget følsomt over for omgivende lys. Et almindeligt forekommende problem i eksperimentet er rekruttering af CRY2-mCherry-Rho1DN til plasmamembranen før stimuleringstrinnet, hvilket typisk skyldes for tidlig stimulering af prøven under et af følgende trin: prøveforberedelse, prøveoverførsel til mikroskoprummet, prøvepositionering på mikroskopstadiet og præstimuleringsbilledoptagelse. I vores protokol anvendes flere procedurer for at forhindre uønsket stimulering, herunder håndtering af fluekopper og embryoner i et mørkt rum under rødt lys, filtrering af blå bølgelængder fra belysningslyset, når embryoner vælges og monteres under stereomikroskopet, og undgå eksponering af embryoner for en 400-500 nm laser (enkelt fotonexcitation) eller en 830-980 nm pulserende laser (multifotonexcitation) før stimulering. Det er afgørende at øve ekstra opmærksomhed på flere trin i eksperimentet for at forhindre uønsket stimulering af prøven. Når Opto-Rho1DN anvendes til at hæmme Rho1 inden for et bestemt interesseområde (ROI) i embryoet41, anbefales det desuden at anvende den laveste laserintensitet, der kan opnå en robust translokation af CRY2-Rho1DN til plasmamembranen. Fordi Opto-Rho1DN er ekstremt følsom over for blå bølgelængder, kan en højintensiv blå laser resultere i uønsket stimulering i celler uden for ROI eller endda nærliggende embryoner på grund af spredt lys.

I sin nuværende version har Opto-Rho1DN-værktøjet flere begrænsninger. For det første blev der til eksperimenterne beskrevet i denne protokol anvendt et plasmamembranlokaliseret CIBN-anker til at rekruttere aktiveret CRY2-Rho1DN fra cytosolen til plasmamembranen41,47. Ved dette design er det vanskeligt at udføre begrænset Rho1-hæmning inden for et specifikt plasmamembrandomæne på grund af diffusionen af aktiverede CRY2-Rho1DN-proteiner i cytosolen. Yderligere forbedring af den rumlige præcision på subcellulær skala afventer udviklingen af nye CIBN-ankre, der har mere specifikke subcellulære lokaliseringsmønstre. For det andet er Opto-Rho1DN designet til at hæmme Rho1 under tidlig embryogenese. Ekspressionen af CIBNpm og CRY2-Rho1DN-mCherry styres af UASp, som er standardiseret til ekspression i kvindelige kimlinjer 55. Ekspressionen af disse moduler i somatisk væv ud over tidlig embryogenese kan kræve udskiftning af UASp med en promotor, der er mere effektiv til at drive somatisk ekspression (f.eks. UASt56). Endelig afhænger effektiviteten af Opto-Rho1DN af mængden af CIBN-ankeret og CRY2-Rho1DN-proteinerne. I den aktuelle version af værktøjet bestemmes det af GAL4-driverlinjen, der bruges til at drive ekspressionen af de optogenetiske moduler. Når du bruger moderens GAL4-driver beskrevet i denne protokol, er det afgørende at bruge linjen, der giver to kopier af GAL4-genet (f.eks. Både 67 og 15) for at opnå hurtig og potent hæmning af actomyosinkontraktilitet. Reduktion af kopiantallet af moderens GAL4 hos F1-hunnerne fra to til en reducerede signifikant den hæmmende virkning.

Sammenlignet med konventionelle genetiske tilgange er den optogenetiske tilgang, der er beskrevet i denne protokol, fordelagtig ved dissekering af fase og vævsspecifik funktion af Rho1 i tidlige Drosophila-embryoner. Funktionen af Rho1 i tidlig Drosophila embryogenese er stort set opfyldt af det maternelt belastede genprodukt11. Nedbrydning af Rho1 blokerer moderligt oogenese57 og forhindrer undersøgelsen af dens funktion under tidlig embryogenese. I de sidste par år er der udviklet flere optogenetiske værktøjer til regulering af endogen Rho1-aktivitet i Drosophila-embryoner. Både Izquierdo et al. og Rich et al. udviklede optogenetiske værktøjer til at aktivere Rho1-aktivitet ved at regulere lokaliseringen af det katalytiske domæne af Rho GEF'er i Drosophila-embryoner 48,58. Derudover udviklede Herrera-Perez et al. to optogenetiske værktøjer ved hjælp af enten fuld længde RhoGEF2 (optoGEF) eller fuld længde C-GAP (optoGAP) til at aktivere eller hæmme endogen Rho1-aktivitet, henholdsvis59. Da optoGAP fungerer ved at rekruttere en Rho1 GAP til plasmamembranen, kan dens anvendelse være følsom over for tilstedeværelsen af endogene Rho1 GEF'er, som kan opveje eller endda tilsidesætte effekten af ektopisk rekruttering af GAP. I modsætning hertil kan Opto-Rho1DN ved direkte sekvestrering af Rho1 GEF'er give en mere robust måde at hæmme endogen Rho1 og Rho1-afhængig actomyosinkontraktilitet.

I betragtning af den brede vifte af funktioner af Rho1 i embryogenese og postembryonal udvikling kan den præsenterede protokol let tilpasses til at studere funktionen af Rho1 og Rho1-afhængige cellulære omorganiseringer i en lang række morfogenetiske processer. Derudover kan en lignende strategi i princippet anvendes til alvorligt at begrænse andre små GTPaser, såsom Rho-familien GTPaser Cdc42 og Rac, da deres dominerende negative former i vid udstrækning er blevet brugt til at hæmme den endogene funktion af disse proteiner11. Endelig, som eksemplificeret i denne protokol, kan kombination af optogenetik og laserablationsmetoder give en effektiv måde at undersøge den umiddelbare virkning af inaktivering af et specifikt protein på vævsdynamik og vævsmekanik, hvilket vil give os ny indsigt i vævsmorfogenese, der er vanskelige at afdække ved hjælp af konventionelle genetiske tilgange.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at forskningen blev udført i mangel af kommercielle eller finansielle forbindelser, der kunne fortolkes som en potentiel interessekonflikt.

Acknowledgments

Forfatterne takker Ann Lavanway for billedbehandling. Forfatterne takker Wieschaus-laboratoriet og De Renzis-laboratoriet for at dele reagenser og Bloomington Drosophila Stock Center for fluebestande. Denne undersøgelse er støttet af NIGMS ESI-MIRA R35GM128745 og American Cancer Society Institutional Research Grant #IRG-82-003-33 til BH.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
35 mm glass-bottom dish MatTek P35G-1.5-10-C Used for sample preparation
60 mm × 15 mm Petri dish with lid Falcon 351007 Used for sample preparation
Black cloth for covering the microscope Online NA Used to avoid unwanted light stimulation
Clorox Ultra Germicadal Bleach (8.25% sodium hypochlorite) VWR 10028-048 Used for embryo dechorination
CO2 pad Genesee Scientific 59-114 Used for cross set-up
ddH2O NA NA Used for sample preparation
Dumont Style 5 tweezers VWR 102091-654 Used for sample preparation
Eyelash tool (made from pure red sable round brush #2) VWR 22940-834 Used for sample preparation
FluoView (Software) Olympus NA Used for image acquisition and optogenetic stimulation
Halocarbon oil 27 Sigma Aldrich H8773-100ML Used for embryo stage visualization
ImageJ/FIJI NIH NA Used for image analysis
MATLAB MathWorks NA Used for image analysis
Nikon SMZ-745 stereoscope Nikon NA Used for sample preparation
Olympus FVMPE-RS multiphoton microscope with InSight DS Dual-line Ultrafast Lasers for simultaneous dual-wavelength multiphoton imaging, , a 25x/NA1.05 water immersion objective (XLPLN25XWMP2), and an IR/VIS stimulation unit for photo-activation/stimulation. This system is also equipped with a TRITC filter (39005-BX3; AT-TRICT-REDSHFT 540/25x, 565BS, 620/60M), and a fluorescence illumination unit that emits white light. Olympus NA Used for image acquisition and optogenetic stimulation
SP Bel-Art 100-place polypropylene freezer storage box (Black, light-proof box for sample transfer) VWR 30621-392 Used to avoid unwanted light stimulation
UV Filter Shield for FM1403 Fluores (Orange-red plastic shield) Bolioptics FM14036151 Used to avoid unwanted light stimulation
VITCHELO V800 Headlamp with White and Red LED Lights Amazon NA Used to avoid unwanted light stimulation

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vicente-Manzanares, M., Ma, X., Adelstein, R. S., Horwitz, A. R. Non-muscle myosin II takes centre stage in cell adhesion and migration. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 10 (11), 778-790 (2009).
  2. Munjal, A., Lecuit, T. Actomyosin networks and tissue morphogenesis. Development. 141 (9), 1789-1793 (2014).
  3. Sawyer, J. M., et al. Apical constriction: a cell shape change that can drive morphogenesis. Developmental Biology. 341 (1), 5-19 (2010).
  4. Nishimura, T., Honda, H., Takeichi, M. Planar cell polarity links axes of spatial dynamics in neural-tube closure. Cell. 149 (5), 1084-1097 (2012).
  5. Marinari, E., et al. Live-cell delamination counterbalances epithelial growth to limit tissue overcrowding. Nature. 484 (7395), 542-545 (2012).
  6. Slattum, G. M., Rosenblatt, J. Tumour cell invasion: an emerging role for basal epithelial cell extrusion. Nature Reviews. Cancer. 14 (7), 495-501 (2014).
  7. Antunes, M., Pereira, T., Cordeiro, J. V., Almeida, L., Jacinto, A. Coordinated waves of actomyosin flow and apical cell constriction immediately after wounding. The Journal of Cell Biology. 202 (2), 365-379 (2013).
  8. Yang, S., et al. The central role of the tail in switching off 10S myosin II activity. The Journal of General Physiology. 151 (9), 1081-1093 (2019).
  9. Yang, S., et al. Cryo-EM structure of the inhibited (10S) form of myosin II. Nature. 588 (7838), 521-525 (2020).
  10. Narumiya, S., Thumkeo, D. Rho signaling research: history, current status and future directions. FEBS Letters. 592 (11), 1763-1776 (2018).
  11. Johndrow, J. E., Magie, C. R., Parkhurst, S. M. Rho GTPase function in flies: insights from a developmental and organismal perspective. Biochemistry and Cell Biology. 82 (6), 643-657 (2004).
  12. Etienne-Manneville, S., Hall, A. Rho GTPases in cell biology. Nature. 420 (6916), 629-635 (2002).
  13. Hodge, R. G., Ridley, A. J. Regulating Rho GTPases and their regulators. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 17 (8), 496-510 (2016).
  14. Martin, A. C., Goldstein, B. Apical constriction: themes and variations on a cellular mechanism driving morphogenesis. Development. 141 (10), 1987-1998 (2014).
  15. Amano, M., Nakayama, M., Kaibuchi, K. Rho-kinase/ROCK: A key regulator of the cytoskeleton and cell polarity. Cytoskeleton. 67 (9), 545-554 (2010).
  16. Kimura, K., et al. Regulation of myosin phosphatase by Rho and Rho-associated kinase (Rho-kinase). Science. 273 (5272), 245-248 (1996).
  17. Maekawa, M., et al. Signaling from Rho to the actin cytoskeleton through protein kinases ROCK and LIM-kinase. Science. 285 (5429), 895-898 (1999).
  18. Ohashi, K., et al. Rho-associated kinase ROCK activates LIM-kinase 1 by phosphorylation at threonine 508 within the activation loop. The Journal of Biological Chemistry. 275 (5), 3577-3582 (2000).
  19. Coravos, J. S., Martin, A. C. Apical sarcomere-like actomyosin contracts nonmuscle drosophila epithelial cells. Developmental Cell. 39 (3), 346-358 (2016).
  20. Homem, C. C. F., Peifer, M. Diaphanous regulates myosin and adherens junctions to control cell contractility and protrusive behavior during morphogenesis. Development. 135 (6), 1005-1018 (2008).
  21. Goode, B. L., Eck, M. J. Mechanism and function of formins in the control of actin assembly. Annual Review of Biochemistry. 76, 593-627 (2007).
  22. Sweeton, D., Parks, S., Costa, M., Wieschaus, E. Gastrulation in Drosophila: the formation of the ventral furrow and posterior midgut invaginations. Development. 112 (3), 775-789 (1991).
  23. Leptin, M., Grunewald, B. Cell shape changes during gastrulation in Drosophila. Development. 110 (1), 73-84 (1990).
  24. Leptin, M. Gastrulation in Drosophila: the logic and the cellular mechanisms. The EMBO Journal. 18 (12), 3187-3192 (1999).
  25. Martin, A. C. The physical mechanisms of Drosophila gastrulation: mesoderm and endoderm invagination. Genetics. 214 (3), 543-560 (2020).
  26. Gilmour, D., Rembold, M., Leptin, M. From morphogen to morphogenesis and back. Nature. 541 (7637), 311-320 (2017).
  27. Gheisari, E., Aakhte, M., Müller, H. -A. J. Gastrulation in Drosophila melanogaster: Genetic control, cellular basis and biomechanics. Mechanisms of Development. 163, 103629 (2020).
  28. Leptin, M. Twist and snail as positive and negative regulators during Drosophila mesoderm development. Genes & Development. 5 (9), 1568-1576 (1991).
  29. Costa, M., Wilson, E. T., Wieschaus, E. A putative cell signal encoded by the folded gastrulation gene coordinates cell shape changes during Drosophila gastrulation. Cell. 76 (6), 1075-1089 (1994).
  30. Kerridge, S., et al. Modular activation of Rho1 by GPCR signalling imparts polarized myosin II activation during morphogenesis. Nature Cell Biology. 18 (3), 261-270 (2016).
  31. Kölsch, V., Seher, T., Fernandez-Ballester, G. J., Serrano, L., Leptin, M. Control of Drosophila gastrulation by apical localization of adherens junctions and RhoGEF2. Science. 315 (5810), 384-386 (2007).
  32. Manning, A. J., Peters, K. A., Peifer, M., Rogers, S. L. Regulation of epithelial morphogenesis by the G protein-coupled receptor mist and its ligand fog. Science Signaling. 6 (301), (2013).
  33. Parks, S., Wieschaus, E. The Drosophila gastrulation gene concertina encodes a G alpha-like protein. Cell. 64 (2), 447-458 (1991).
  34. Barrett, K., Leptin, M., Settleman, J. The Rho GTPase and a putative RhoGEF mediate a signaling pathway for the cell shape changes in Drosophila gastrulation. Cell. 91 (7), 905-915 (1997).
  35. Dawes-Hoang, R. E., et al. Folded gastrulation, cell shape change and the control of myosin localization. Development. 132 (18), 4165-4178 (2005).
  36. Häcker, U., Perrimon, N. DRhoGEF2 encodes a member of the Dbl family of oncogenes and controls cell shape changes during gastrulation in Drosophila. Genes & Development. 12 (2), 274-284 (1998).
  37. Martin, A. C., Kaschube, M., Wieschaus, E. F. Pulsed contractions of an actin-myosin network drive apical constriction. Nature. 457 (7228), 495-499 (2009).
  38. Mason, F. M., Tworoger, M., Martin, A. C. Apical domain polarization localizes actin-myosin activity to drive ratchet-like apical constriction. Nature Cell Biology. 15 (8), 926-936 (2013).
  39. Nikolaidou, K. K., Barrett, K. A Rho GTPase signaling pathway is used reiteratively in epithelial folding and potentially selects the outcome of Rho activation. Current Biology. 14 (20), 1822-1826 (2004).
  40. Martin, A. C., Gelbart, M., Fernandez-Gonzalez, R., Kaschube, M., Wieschaus, E. F. Integration of contractile forces during tissue invagination. The Journal of Cell Biology. 188 (5), 735-749 (2010).
  41. Guo, H., Swan, M., He, B. Optogenetic inhibition of actomyosin reveals mechanical bistability of the mesoderm epithelium during Drosophila mesoderm invagination. eLife. 11, e69082 (2022).
  42. Sebti, S. M., Der, C. J. Searching for the elusive targets of farnesyltransferase inhibitors. Nature Reviews. Cancer. 3 (12), 945-951 (2003).
  43. Roberts, P. J., et al. Rho family GTPase modification and dependence on CAAX motif-signaled posttranslational modification. The Journal of Biological Chemistry. 283 (37), 25150-25163 (2008).
  44. Feig, L. A., Cooper, G. M. Inhibition of NIH 3T3 cell proliferation by a mutant ras protein with preferential affinity for GDP. Molecular and Cellular Biology. 8 (8), 3235-3243 (1988).
  45. Liu, H., et al. Photoexcited CRY2 interacts with CIB1 to regulate transcription and floral initiation in Arabidopsis. Science. 322 (5907), 1535-1539 (2008).
  46. Kennedy, M. J., et al. Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in living cells. Nature Methods. 7 (12), 973-975 (2010).
  47. Guglielmi, G., Barry, J. D., Huber, W., De Renzis, S. An optogenetic method to modulate cell contractility during tissue morphogenesis. Developmental Cell. 35 (5), 646-660 (2015).
  48. Izquierdo, E., Quinkler, T., De Renzis, S. Guided morphogenesis through optogenetic activation of Rho signalling during early Drosophila embryogenesis. Nature Communications. 9 (1), 2366 (2018).
  49. Hutson, M. S., et al. Forces for morphogenesis investigated with laser microsurgery and quantitative modeling. Science. 300 (5616), 145-149 (2003).
  50. Rauzi, M., Lenne, P. -F. Probing cell mechanics with subcellular laser dissection of actomyosin networks in the early developing Drosophila embryo. Methods in Molecular Biology. 1189, 209-218 (2015).
  51. Rauzi, M., Verant, P., Lecuit, T., Lenne, P. -F. Nature and anisotropy of cortical forces orienting Drosophila tissue morphogenesis. Nature Cell Biology. 10 (12), 1401-1410 (2008).
  52. Hunter, C., Wieschaus, E. Regulated expression of nullo is required for the formation of distinct apical and basal adherens junctions in the Drosophila blastoderm. The Journal of Cell Biology. 150 (2), 391-401 (2000).
  53. Oda, H., Tsukita, S. Real-time imaging of cell-cell adherens junctions reveals that Drosophila mesoderm invagination begins with two phases of apical constriction of cells. Journal of Cell Science. 114, 493-501 (2001).
  54. Munjal, A., Philippe, J. -M., Munro, E., Lecuit, T. A self-organized biomechanical network drives shape changes during tissue morphogenesis. Nature. 524 (7565), 351-355 (2015).
  55. Rørth, P. Gal4 in the Drosophila female germline. Mechanisms of Development. 78 (1-2), 113-118 (1998).
  56. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  57. Magie, C. R., Meyer, M. R., Gorsuch, M. S., Parkhurst, S. M. Mutations in the Rho1 small GTPase disrupt morphogenesis and segmentation during early Drosophila development. Development. 126 (23), 5353-5364 (1999).
  58. Rich, A., Fehon, R. G., Glotzer, M. Rho1 activation recapitulates early gastrulation events in the ventral, but not dorsal, epithelium of Drosophila embryos. eLife. 9, e56893 (2020).
  59. Herrera-Perez, R. M., Cupo, C., Allan, C., Lin, A., Kasza, K. E. Using optogenetics to link myosin patterns to contractile cell behaviors during convergent extension. Biophysical Journal. 120 (19), 4214-4229 (2021).

Tags

Udviklingsbiologi udgave 194 optogenetik vævsmekanik Rho1 actomyosin laserablation apikal indsnævring gastrulation
Optogenetisk hæmning af rho1-medieret actomyosinkontraktilitet kombineret med måling af epitelspænding i <em>Drosophila-embryoner</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Guo, H., Swan, M., He, B.… More

Guo, H., Swan, M., He, B. Optogenetic Inhibition of Rho1-Mediated Actomyosin Contractility Coupled with Measurement of Epithelial Tension in Drosophila Embryos. J. Vis. Exp. (194), e65314, doi:10.3791/65314 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter