Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Optogenetisk hemming av rho1-mediert aktomyosinkontraktilitet kombinert med måling av epitelspenning i Drosophila-embryoer

Published: April 14, 2023 doi: 10.3791/65314
Automatic Translation
1,2, 3, 1
1Department of Biological Sciences, Dartmouth College, 2School of Life Sciences, Westlake University, 3Department of Molecular Biology, Princeton University

Summary

Actomyosin kontraktilitet spiller en viktig rolle i celle og vev morfogenese. Det er imidlertid utfordrende å manipulere aktomyosinkontraktiliteten in vivo akutt. Denne protokollen beskriver et optogenetisk system som raskt hemmer Rho1-mediert aktomyosinkontraktilitet i Drosophila-embryoer , og avslører det umiddelbare tapet av epitelspenning etter inaktivering av aktomyosin in vivo.

Abstract

Kontraktile krefter generert av aktin og ikke-muskelmyosin II ("actomyosinkontraktilitet") er kritiske for morfologiske endringer av celler og vev på flere lengdeskalaer, slik som celledeling, cellemigrasjon, epitelfolding og forgreningsmorfogenese. En grundig forståelse av rollen som aktomyosinkontraktilitet i morfogenese krever tilnærminger som tillater rask inaktivering av aktomyosin, noe som er vanskelig å oppnå ved bruk av konvensjonelle genetiske eller farmakologiske tilnærminger. Den presenterte protokollen demonstrerer bruken av et CRY2-CIBN-basert optogenetisk dimeriseringssystem, Opto-Rho1DN, for å hemme actomyosinkontraktilitet i Drosophila-embryoer med presise tidsmessige og romlige kontroller. I dette systemet er CRY2 smeltet sammen med den dominerende negative formen av Rho1 (Rho1DN), mens CIBN er forankret til plasmamembranen. Blålysmediert dimerisering av CRY2 og CIBN resulterer i rask translokasjon av Rho1DN fra cytoplasma til plasmamembranen, hvor den inaktiverer actomyosin ved å hemme endogen Rho1. I tillegg presenterer denne artikkelen en detaljert protokoll for kobling av Opto-Rho1DN-mediert inaktivering av aktomyosin med laserablasjon for å undersøke rollen til aktomyosin i generering av epitelspenning under Drosophila ventralfuredannelse. Denne protokollen kan brukes på mange andre morfologiske prosesser som involverer aktomyosinkontraktilitet i Drosophila-embryoer med minimale modifikasjoner. Samlet sett er dette optogenetiske verktøyet en kraftig tilnærming til å dissekere funksjonen av aktomyosinkontraktilitet ved å kontrollere vevsmekanikk under dynamisk vevsremodellering.

Introduction

Aktomyosinkontraktilitet, kontraktilkraften som utøves av ikke-muskelmyosin II (heretter 'myosin') på F-aktinnettverket, er en av de viktigste kreftene i å endre celleform og drive vevsnivå morfogenese 1,2. For eksempel resulterer aktiveringen av aktomyosinkontraktilitet ved epitelcellens apikale domene i apikal innsnevring, noe som letter en rekke morfogenetiske prosesser, inkludert epitelfolding, celleekstrudering, delaminering og sårheling 3,4,5,6,7 . Aktiveringen av myosin krever fosforylering av dets regulatoriske lykjede. Denne modifikasjonen lindrer den hemmende konformasjonen av myosinmolekylene, slik at de kan danne bipolare myosinfilamentbunter med flere hodedomener i begge ender. De bipolare myosinfilamentene driver den anti-parallelle bevegelsen av aktinfilamenter og resulterer i generering av kontraktil kraft 1,8,9.

Den evolusjonært bevarte Rho-familiens lille GTPase RhoA (Rho1 i Drosophila) spiller en sentral rolle i aktiveringen av aktomyosinkontraktilitet i ulike cellulære sammenhenger10,11. Rho1 fungerer som en bimolekylær bryter ved å binde enten GTP (aktiv form) eller GDP (inaktiv form)12. Syklusen mellom GTP- eller GDP-bundet Rho1 reguleres av dens GTPase-aktiverende proteiner (GAPs) og guaninnukleotid-utvekslingsfaktorer (GEFs)13. GEFs funksjon for å lette utvekslingen av BNP for GTP og dermed aktivere Rho1-aktivitet. GAPs, derimot, forbedrer GTPase-aktiviteten til Rho1 og deaktiverer dermed Rho1. Aktivert Rho1 fremmer aktomyosinkontraktilitet gjennom interaksjon med og aktivering av nedstrøms effektorer, Rho-assosiert kinase (Rok) og Diaphanous14. Rok induserer myosinaktivering og aktomyosinkontraktilitet ved fosforylering av den regulatoriske lyskjeden til myosin15. I tillegg hemmer Rok også myosin-regulatorisk lyskjedefosfatase, og fremmer dermed myosinfilamentmontering16 ytterligere. Rok kan også fosforylere LIM-kinaser, som, når de aktiveres, forhindrer aktindemontering ved fosforylering og hemming av aktin-depolymeriseringsfaktoren kofilin17,18. Diafanøs er en aktinnukleator i forminfamilien som fremmer aktinpolymerisasjon, noe som gir en base for myosin å interagere med 19,20,21.

Mens de cellulære mekanismene som aktiverer actomyosinkontraktilitet er godt belyst, er vår forståelse av dens funksjon i regulering av dynamisk vevsremodellering fortsatt ufullstendig. Å fylle dette kunnskapsgapet krever tilnærminger som raskt kan inaktivere actomyosin i spesifikke vevsregioner in vivo og registrere den umiddelbare effekten på vevsadferd og egenskaper. Denne protokollen beskriver bruk av en optogenetisk tilnærming for akutt å hemme actomyosinkontraktilitet under Drosophila mesoderminvaginasjon, etterfulgt av måling av epitelspenning ved bruk av laserablasjon. Under Drosophila gastrulering gjennomgår de ventralt lokaliserte mesodermforløpercellene apikal innsnevring og invasitt fra overflaten av embryoet ved å danne en fremre-posteriort orientert fure22,23. Dannelsen av ventrale furer har lenge vært brukt som en modell for å studere mekanismen for epitelfolding. Ventral furedannelse administreres av det dorsal-ventrale mønstersystemet i Drosophila24,25,26,27. Uttrykket av to transkripsjonsfaktorer, Twist og Snail, lokalisert på ventralsiden av embryoet, styrer ventral furedannelse og spesifiserer mesodermal celleskjebne28. Twist and Snail aktiverer rekrutteringen av Rho1 GEF RhoGEF2 til toppunktet av mesodermforløpercellene via en G-proteinkoblet reseptorvei og et RhoGEF2-adapterprotein, T48 29,30,31,32,33. Deretter aktiverer RhoGEF2 myosin gjennom den apikale overflaten av potensiell mesoderm gjennom Rho-Rho kinasebanen 34,35,36,37,38,39. Aktivert myosin danner et supracellulært actomyosinnettverk gjennom den apikale overflaten av mesoderm primordium, hvis sammentrekninger driver apikal innsnevring og resulterer i en rask økning i apikal vevspenning 14,37,40.

Det optogenetiske verktøyet beskrevet i denne protokollen, Opto-Rho1DN, hemmer aktomyosinkontraktilitet gjennom rekruttering av blålysavhengige plasmamembraner av en dominant negativ form for Rho1 (Rho1DN)41. En T19N-mutasjon i Rho1DN eliminerer mutantproteinets evne til å bytte BNP mot GTP og gjør dermed proteinet evig inaktivt34. En påfølgende mutasjon i Rho1DN, C189Y, eliminerer dens naive membranmålrettingssignal42,43. Når Rho1DN infunderes til plasmamembranen, binder den seg til og impounds Rho1 GEFs, og blokkerer dermed aktiveringen av Rho1 samt Rho1-mediert aktivering av myosin og aktin34,44. Plasmamembranrekrutteringen til Rho1DN oppnås gjennom en lysavhengig dimeriseringsmodul avledet fra Cryptochrome 2 og dens bindingspartner CIB1. Cryptochrome 2 er en blålysaktivert kryptokrom fotoreseptor i Arabidopsis thaliana45. Kryptokrom 2 binder seg til CIB1, et grunnleggende helix-loop-helix-protein, bare i sin fotoeksiterte tilstand45. Det ble senere funnet at den konserverte N-terminale, fotolyase homologiregionen (PHR), fra Cryptochrome 2 (CRY2PHR, heretter referert til som CRY2) og det N-terminale domenet (aa 1-170) til CIB1 (heretter CIBN) er viktige for lysindusert dimerisering46. Opto-Rho1DN inneholder to komponenter. Den første komponenten er CIBN-proteinet smeltet sammen med et CAAX-anker, som lokaliserer proteinet til plasmamembranen47. Den andre komponenten er mCherry-merket CRY2 smeltet sammen med Rho1DN41. I fravær av blått lys forblir CRY2-Rho1DN i cytoplasma. Ved blålysstimulering målrettes CRY2-Rho1DN mot plasmamembranen gjennom samspillet mellom membranforankret CIBN og eksitert CRY2. Opto-Rho1DN kan aktiveres av ultrafiolett A (UVA) lys og blått lys (400-500 nm, maksimal aktivering ved 450-488 nm), eller av en 830-980 nm pulserende laser når du utfører to-foton stimulering41,46,47,48. Derfor stimuleres Opto-Rho1DN av bølgelengder som normalt brukes til spennende GFP (488 nm for enkeltfotonavbildning og 920 nm for to-foton avbildning). I motsetning til dette stimulerer bølgelengder som vanligvis brukes til spennende mCherry (561 nm for enkeltfotonavbildning og 1,040 nm for to-foton avbildning) ikke den optogenetiske modulen og kan derfor brukes til pre-stimuleringsavbildning. Protokollen beskriver tilnærmingene som brukes for å minimere risikoen for uønsket stimulering under prøvemanipulering.

Laserablasjon har vært mye brukt til å oppdage og måle spenning i celler og vev49. Tidligere studier har vist at når laserintensiteten er riktig kontrollert, kan to-foton laserablasjon ved bruk av en femtosekund nær-infrarød laser fysisk svekke noen subcellulære strukturer (f.eks. Kortikale actomyosinnettverk) uten å forårsake plasmamembranraptur50,51. Hvis vevet er under spenning, resulterer laserablasjon av et område av interesse i vevet i en umiddelbar utadgående rekyl av cellene ved siden av det ablerte området. Rekylhastigheten er en funksjon av størrelsen på spenningen og viskositeten til mediet (cytoplasma) som omgir strukturene som gjennomgår rekyl49. På grunn av den overlegne penetrasjonsdybden til de nær-infrarøde lasere og evnen til å oppnå godt begrenset fokal ablasjon, er to-foton laserablasjon spesielt nyttig for å oppdage vevspenning in vivo. Som demonstrert i denne protokollen, kan denne metoden enkelt kombineres med Opto-Rho1DN-mediert inaktivering av aktomyosinkontraktilitet for å undersøke den direkte effekten av Rho1-avhengig cellulær kontraktilitet på vevsmekanikk under dynamisk vevsremodellering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Sette opp det genetiske korset og forberede egginnsamlingskoppen

  1. Velg kvinnelige fluer (jomfru) fra den optogenetiske linjen UASp-CIBNpm (I); UASp-CRY2-Rho1DN-mCherry (III) på en CO2 -pute under et stereomikroskop og satt opp et kryss med mannlige fluer fra mors GAL4 driverlinje 67 Sqh-mCherry; 15 E-cadherin-GFP.
    MERK: 67 og 15 står for mor-Tubulin-GAL4 satt inn i henholdsvis andre (II) og tredje (III) kromosomer, henholdsvis52. GAL4-linjen som brukes i denne protokollen uttrykker også den mCherry-merkede myosin-regulatoriske lyskjeden Sqh (Spaghetti squash)37 og GFP-merket E-cadherin53. Fluer fra optogenetisk linje kan fortsatt inneholde FM7 og TM6 balansekromosomer. Fluer fra mors GAL4-driverlinje kan fortsatt inneholde CyO- og TM3-balanserkromosomene.
  2. Etter ~10 dager, velg F1 hunnfluer som har følgende genotype: UASp-CIBNpm/+; 67 kvm-mCherry/+; 15 E-cadherin-GFP/UASp-CRY2-Rho1DN-mCherry. Sett opp en eggesamlingskopp med hannfluene.
    1. Forsikre deg om at hunnfluene med riktig genotype ikke inneholder noen balanserkromosomer (dvs. de skal ikke inneholde krøllete vinger [Cy], korte børster [Sb], bar- eller nyreformede øyne [B] eller ekstra humerale børster [Hu]), som er markører for henholdsvis CyO-, TM3-, FM7- og TM6-balansererne som brukes til å generere aksjene. Dekk koppen med en eplejuiceplate med et skjær av fersk gjærpasta på overflaten.
      MERK: Hos F1-hunner uttrykkes de optogenetiske komponentene maternalt. Derfor trenger ikke F1-hunnene som brukes til å sette opp koppen å være jomfruer. Det anbefales å bruke mannlige fluer fra samme F1-populasjon for koppen for enkelhets skyld.
  3. Oppbevar koppen i en pappeske dekket med aluminiumsfolie for å unngå mulig lyslekkasje fra miljøet. Bytt eplejuicetallerkenen hver dag for kopper som oppbevares i romtemperatur (~21-23 °C), eller annenhver dag for kopper som oppbevares ved 18 °C.
    1. Umiddelbart før plateskift, bank koppen på et flatt underlag (f.eks. benkplate) for å holde fluene i bunnen av koppen og forhindre at de slipper ut. Bytt eplejuicetallerken i et mørkt rom og bruk en hodelykt med rødt lys for belysning (se Materialfortegnelse).
      MERK: For å øke uttrykket av konstruksjonene som er under kontroll av maternal-Tubulin-GAL4 og UASp, anbefales det å holde koppen ved 18 ° C i minst 3 dager før embryoinnsamling. Denne inkubasjonsperioden gjør det også mulig for fluene å tilpasse seg koppen og bli godt matet på gjærpastaen for å oppnå optimal eggproduksjon.

2. Innsamling av embryoer på ønsket stadium og forberede dem for optogenetisk stimulering

MERK: Alle prøveinnsamlings- og forberedelsestrinn må utføres i et mørkt rom, ved hjelp av et "sikkert lys" (f.eks. rødt lys) for belysning. De optogenetiske komponentene er svært følsomme for omgivelseslys. Selv den minste eksponering for omgivelseslys fører til for tidlig stimulering av prøven. Vanligvis forårsaker lys i det grønn-røde området (>532 nm) ikke uønsket stimulering.

  1. For å samle embryoer ved tidlig embryogenese, legg en ny eplejuiceplate på koppen 8 til 16 timer før embryoinnsamling (ved 18 ° C).
  2. På tidspunktet for embryosamlingen, bytt eplejuiceplaten. Merk platen som er tatt av koppen og dekk platens overflate med et tynt lag halokarbonolje 27 (se materialfortegnelse). Vent i 30-60 s til eggeskallet blir gjennomsiktig.
  3. Plasser et oransje-rødt plastskjold (se materialfortegnelse) på scenen av et oppreist stereoskop. Plasseringen av det oransje-røde skjoldet forhindrer uønsket stimulering under prøvebelysning ved å blokkere de blågrønne bølgelengdene fra det overførte lyset.
    MERK: I denne protokollen brukes et oppreist stereoskop for embryoinnsamling (se materialfortegnelse).
  4. Legg eplejuiceplaten på toppen av det oransje-røde skjoldet. Slå på det overførte lyset fra stereomikroskopet for å belyse prøven. Samle 5-15 embryoer på riktig stadium fra eplejuiceplaten ved hjelp av en pinsett. Ikke klem embryoene med pinsetten.
    MERK: I denne protokollen bør det aktuelle embryoet være på tidlig-midten av cellulariseringsstadiet. Embryoet på dette stadiet skal ha en mørk ugjennomsiktig eggeplomme omgitt av et klart, jevnt periplasmalag som inneholder de dannende blastodermcellene. Forkanten av spaltningsfurene ("cellulariseringsfront"), som fremstår som en kontinuerlig linje parallelt med overflaten av embryoet, bør ikke passere halvparten av dybden av periplasma.
  5. Fjern embryoene forsiktig på et stykke papirhåndkle (~ 1,5 cm × 1,5 cm) for å fjerne overflødig olje fra embryoene ved hjelp av pinsetten.
  6. Tilsett flere dråper nylaget 40% blekemiddel (~ 3% natriumhypokloritt; se materialfortegnelse) til et nytt lite firkantet papirhåndkle (~ 1,5 cm × 1,5 cm) ved hjelp av en plastoverføringspipett slik at papirhåndkleet er dekket med et tynt lag blekemiddel. Overfør embryoet fra det tørre papirhåndkleet til det blekemiddel-gjennomvåt papirhåndkleet ved hjelp av pinsetten og sørg for at embryoene er gjennomvåt i blekemiddel. Vent 2-4 min til embryoet blir dekorionert.
  7. Etter dekorionering, bruk pinsetten til å fjerne det firkantede papirhåndkleet på et stort stykke silkepapir for å fjerne overflødig blekemiddel. Sørg for at siden med embryoene vender opp.
  8. For å skylle embryoene, bruk pinsetten til å forsiktig suge det firkantede papirhåndkleet i en dråpe avionisert vann og raskt blett det på et stort stykke silkepapir. Gjenta denne prosessen åtte ganger for å sikre fjerning av restblekemiddel.
  9. Bruk et øyenvippeverktøy for å overføre embryoet fra papirhåndkleet til en 35 mm glassbunnsfat (se materialtabellen). Tilsett avionisert vann i fatet for å dekke embryoene helt. Finjuster posisjonen og orienteringen til embryoene ved hjelp av øyenvippeverktøyet.
    MERK: Etter deforhorionering har embryoen en tendens til å holde seg på overflaten av glasset og er immobile uten forstyrrelse, så det er ikke nødvendig å bruke ytterligere behandling (for eksempel lim) for å immobilisere embryoet på glassbunnsfatet.
  10. Plasser 35 mm glassbunnfat med embryoene inne i en lystett svart boks (se materialfortegnelse) for å beskytte prøven mot lyseksponering under overføringsprosessen. Ta boksen til rommet med multifotonmikroskopet.

3. Optogenetisk stimulering, laserablasjon og avbildning av embryoet

MERK: Multifotonsystemet som brukes i dette eksperimentet (se materialfortegnelse) er i stand til samtidig avbildning med to bølgelengder. Den inneholder også en fotostimuleringsenhet med en 458 nm laser og en separat galvanometerskanner, som tillater fotoaktivering / stimulering innenfor et definert interesseområde (ROI). Merk at 920 nm laseren, som brukes til å opphisse grønngule fluorescerende proteiner, vil stimulere Opto-Rho1DN, om enn langsommere sammenlignet med blå lasermediert stimulering.

  1. Dekk multifotonmikroskopet med en lystett svart klut (se materialfortegnelse) for å unngå uønsket stimulering av embryoene under prøveoppsett og avbildning.
    MERK: Den samme tilnærmingen brukes under vanlig multifotonavbildning for å beskytte de lysfølsomme detektorene som er utstyrt på mikroskopet.
  2. Slå av romlyset og dataskjermene. Slå av kontrolleren på berøringspanelet ved å klikke AV under 'Bakgrunnsbelysning på kontrolleren på berøringspanelet' i programvaren. Forsikre deg om at det ikke er noe annet omgivelseslys i rommet.
    1. Åpne forsiden av det svarte tøydekselet på mikroskopet. Ta fatet med 35 mm glassbunn fra den svarte boksen og plasser det på mikroskopstadiet.
  3. Belys embryoer med et grønt lys som vanligvis brukes som eksitasjonslys for epifluorescens. For å gjøre dette, slå på fluorescensbelysningsenheten, velg Ocular under 'Ocular'-panelet i programvaren, og endre 'Kubetårnet' til 4:TRITC. Bruk okularet til å identifisere embryoet av interesse og bringe det i fokus.
    MERK: Visualiseringen av grønt lys oppnås ved å la et hvitt lys generert av fluorescensbelysningsenheten passere gjennom en innebygd standard TRITC-filterkube, som inneholder et 528-553 nm eksitasjonsfilter, en 565 nm strålesplitter og et utslippsfilter på 590-650 nm. Andre ikke-blå lys bør også fungere fint for prøvebelysning. Det er ikke nødvendig å bruke øyevern på dette trinnet, siden eksitasjonslyset har lav intensitet og ikke vil bli rettet mot okularet. Embryoet vil virke jevnt rødt på grunn av autofluorescens.
  4. Lukk det svarte tøydekselet slik at prøven er fullstendig beskyttet mot lys. Slå på dataskjermen for å få tilgang til programvaren som styrer mikroskopet. Endre 'Ocular' til LSM i programvaren for bildeopptak.
  5. Utfør laserablasjon i kontroll, ustimulerte embryoer ved hjelp av et 25x vannnedsenkingsmål.
    1. Klikk på Bright Z, Sequence Manager og LSM Stimulation fra 'Tool Window' i programvaren. Sett skannertypen som Galvano og skannestørrelsen som 512 × 512. Slå på CH1 og CH3 under PMT-innstillingspanelet for å tillate bruk av 1,040 nm laseren, og klikk Live × 4 for å visualisere embryoet.
    2. Roter embryoet ved hjelp av rotasjonsfunksjonen i programvaren slik at embryoets fremre-bakre akse er vertikalt orientert. Sett zoom til 3. Tegn et interesseområde (ROI) ved hjelp av formverktøyet under 'Scan Settings' og angi størrelsen på ROI i 'Reference'-panelet. Sett avkastningen til 512 piksler i bredden og 100 piksler i høyden (171 × 33 μm2).
    3. Angi anskaffelsesparametere for Z-stakken før ablasjon.
      1. Registrer overflaten av embryoet som 0 under 'Z-seksjonen'. Sett starten som 0 og slutten som 100 μm. Sett trinnstørrelsen til 2 μm. Aktiver Z-oppkjøpsmodus ved å merke av for Z under 'Serie'fanen.
      2. Still inn laserintensiteten på 1040 nm for å øke lineært fra 3 % til 7 % ved hjelp av Bright Z-funksjonen .
      3. Lagre gjeldende bildebehandlingsinnstilling som den første oppgaven i pipelinen ved å klikke på LSM i 'Sequence Manager'.
        MERK: Pre-ablasjon Z-stack er oppnådd for å bekrefte embryostadiet. I dette eksperimentet vil CRY2-Rho1DN-mCherry og Sqh-mCherry bli eksitert av 1,040 nm laseren. Under apikal innsnevring forsterkes Sqh-mCherry-signalet i det medioapikale området av de ventrale mesodermale cellene, mens CRY2-Rho1DN-mCherry er cytosolisk før stimulering. Laserintensiteten som brukes til avbildning før og etter stimulering, bestemmes empirisk basert på balansen mellom det optimale signal-støy-forholdet og unngåelse av fotobleking.
    4. Angi anskaffelsesparametere for filmen før ablasjon.
      1. Slett eventuell eksisterende avkastning på investeringen for å tillate avbildning av hele området på 512 × 512 piksler (171 × 171 μm 2, 3x zoom) nær embryoets ventrale overflate, som beskrevet i trinn 3.5.2. Sett laserintensiteten på 1,040 nm til 3%.
      2. Sjekk Tid og fjern merket for Z under 'Serie'panelet. Hold 'Intervall' som FreeRun under 'Time Lapse'-panelet. Sett syklus som 10.
      3. Lagre gjeldende innstillinger som neste oppgave i pipelinen ved å klikke LSM i 'Sequence Manager'.
        MERK: Hensikten med denne oppgaven er å skaffe en 10-rammers enkelt Z-plan pre-ablasjonsfilm med en 1,040 nm laser for bildeopptak. Bildeinnsamlingshastigheten er omtrent 1 s per ramme.
    5. Still inn parametrene for laserablation.
      1. Definer et 3D-område fra rett under vitellinemembranen til ~20 μm dyp for laserablasjon (figur 1A). Sett starten på Z-stakken som planet som er rett under vitellinemembranen og enden som 20 μm dypere enn startplanet. Sett trinnstørrelsen til 1,5 μm.
        MERK: Avkastningen på den ablerte regionen er ~ 30 piksler i bredden og ~ 10 pixela i høyden (~ 10 μm langs medial-lateral akse og ~ 3,3 μm langs A-P-aksen). Hensikten med å ablatere prøven ved flere Z-plan er å sikre at den apikale overflaten av ventralcellene ablateres. Dette er spesielt viktig for de stimulerte embryoene, da de ventrale cellene opplever rask apikal avslapping etter Rho1-hemming.
      2. Slå på CH2 og CH4 under 'PMT-innstillingspanelet' for å tillate bruk av laseren på 920 nm. Sett intensiteten til 920 nm laser til 30%. Angi bildeopptak med 920 nm-laseren for en enkelt Z-stakk innenfor 3D-området som er definert i trinn 3.5.5.1 for laserablasjon.
        MERK: Laserintensiteten som er valgt i dette trinnet er tilstrekkelig til å ablate vevet (som indikert av vevsrekyl umiddelbart etter laserbehandlingen), men i mellomtiden skader det ikke åpenbart plasmamembranen (som indikert ved mangel på brennmerker på cellemembranen) (figur 1B, C).
      3. Lagre gjeldende innstilling som neste oppgave i pipelinen ved å klikke LSM i 'Sequence Manager'.
    6. Angi anskaffelsesparametere for filmen etter ablasjon.
      1. Sett bildeopptak for en 100-rammers enkelt Z-plan post-ablasjonsfilm ved hjelp av både 1,040 nm og 920 nm lasere. Sett intensiteten til 1,040 nm laser og 920 nm laser til henholdsvis 3% og 0.3%. Regionen spesifisert i trinn 3.5.4 vil bli avbildet med identisk bildeinnsamlingshastighet.
      2. Lagre gjeldende innstilling som neste oppgave i pipelinen ved å klikke LSM i 'Sequence Manager'.
        MERK: Hensikten med å lagre parametrene beskrevet i trinn 3.5.3-3.5.6 som sekvensielle oppgaver i 'Sequence Manager' før noen faktisk anskaffelse, er å sikre fangst av den umiddelbare vevsresponsen etter laserablasjon.
    7. Velg Sekvens under 'Hent'. Endre datasparingsbanen og filnavnet etter behov. Klikk på Klar og vent til programvaren initialiserer rørledningen. Klikk deretter Start for å kjøre pipelinen.
  6. Utfør laserablasjon i stimulerte embryoer.
    1. Angi anskaffelsesparametere for Z-stakken før ablasjon, som beskrevet i trinn 3.5.1–3.5.3. Lagre gjeldende innstilling som den første oppgaven i pipelinen ved å klikke på LSM i 'Sequence Manager'.
    2. Angi parametere for optogenetisk stimulering innenfor en definert avkastning.
      1. Endre zoom til 1 og velg en avkastning som dekker embryoets ventrale overflate (~512 × 300 μm2). Slå av CH1-CH4-detektorene .
      2. Klikk på LSM-stimulering. Fjern merket for Kontinuerlig innen Varighet og skriv inn 12 s. Sjekk 458 nm med 0,3% laserintensitet.
      3. Lagre gjeldende innstilling som neste oppgave i pipelinen ved å klikke på Stimulering i 'Sequence Manager'.
        MERK: En raskere stimulering kan oppnås ved å øke laserintensiteten på 458 nm. Men når du bruker høyere laserintensiteter, kan det spredte laserlyset stimulere regionen ved siden av avkastningen, noe som ikke er ideelt hvis en romlig begrenset stimulering er nødvendig.
    3. Sett en 3 min ventetid etter stimulering for å sikre total inaktivering av myosin og demontering av apikal F-aktin, og for å oppnå statisk vevsmorfologi før laserablasjon. Dette oppnås ved å klikke på Vent /Pause under 'Sekvensbehandling' og stille inn ønsket tid for 'Vent'.
      MERK: Rekruttering av CRY2-Rho1DN-mCherry til membranen forårsaket av en enkelt stimuleringsrunde (0,3% 458 nm laser i 12 s) er tydelig påviselig 10-15 min etter stimuleringen. Dette er i tråd med den publiserte dissosiasjonshalvtiden på ~9 min47.
    4. Sett innsamlingsparametere for den enkle Z-plan pre-ablasjonsfilmen, som beskrevet i trinn 3.5.4, bortsett fra at både 1,040 nm og 920 nm lasere brukes til bildeopptak. Slå på CH1-CH4-detektorene . Sett intensiteten til 1,040 nm laser og 920 nm laser til henholdsvis 3% og 0.3%. Lagre gjeldende innstilling som neste oppgave i pipelinen ved å klikke LSM i 'Sequence Manager'.
    5. Angi parametere for laserablasjon, som beskrevet i trinn 3.5.5. Lagre gjeldende innstilling som neste oppgave i pipelinen ved å klikke LSM i 'Sequence Manager'.
    6. Angi innsamlingsparametere for den enkle Z-planet etter ablasjonsfilmen, som beskrevet i trinn 3.5.6. Lagre gjeldende innstilling som neste oppgave i pipelinen ved å klikke LSM i 'Sequence Manager'.
    7. Velg Sekvens under 'Hent'. Endre datasparingsbanen og filnavnet etter behov. Klikk på Klar og vent til programvaren initialiserer rørledningen. Klikk deretter Start for å kjøre pipelinen.

4. Kvantifisering av frekvensen av vevsrekyl etter laserablasjon

  1. Åpne filmen etter ablasjon i ImageJ.
  2. Tegn en liten avkastning langs den ventrale midtlinjen som dekker det ablerte området, ved hjelp av rektangelmerkingsverktøyet . Bredden på avkastningen er ni piksler. Høyden på avkastningen er satt slik at avkastningen er stor nok til å dekke hele spekteret av vevsrekyl etter laserablasjon.
    1. Klikk på Dupliser under "Bilde"-fanen. Merk av for Duplicate stack i popup-vinduet, og klikk deretter OK for å duplisere stabelen innenfor den valgte avkastningen.
  3. Generer en montasje fra den dupliserte stakken gjennom Image > Stacks > Make Montage. I popup-vinduet setter du radnummeret til 1 og kolonnenummeret til totalt antall rammer i stakken (100 i dette tilfellet).
  4. Mål A-P-bredden på det ablerte området over tid fra den genererte montasjen.
    1. Bruk flerpunktsverktøyet i ImageJ til å markere A-P-grensene for det ablerte området for hvert tidspunkt på montasjen.
    2. Lagre koordinatene til de merkede prikkene ved hjelp av Fil > Lagre som > XY-koordinater.
    3. Importer de målte XY-koordinatene til MATLAB. Beregn A-P-bredden til det ablerte området for hvert tidspunkt ved å trekke Y-koordinaten til den øvre grensen fra Y-koordinaten til den nedre grensen.
  5. Bestem hastigheten på vevsrekylen ved å montere de første 20 s av kurven "bredde over tid" i en linje ved hjelp av "polyfit" -funksjonen i MATLAB. Rapporter helningen på den monterte linjen som frekvensen av vevsrekyl.
  6. Utfør statistiske tester for å sammenligne frekvensen av vevsrekyl mellom stimulerte og ikke-stimulerte prøver.
    MERK: Det anbefales å innhente data fra minst fem embryoer per tilstand. Både den tosidige Wilcoxon rangsumtesten og den tosidige student-t-testen kan brukes til statistisk sammenligning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I de ustimulerte embryoene som gjennomgikk apikal innsnevring, ble Sqh-mCherry anriket i det mediaapiske området av de ventrale mesodermale cellene, mens CRY2-Rho1DN-mCherry var cytosolisk (figur 1A). Laserablasjon innenfor innsnevringsdomenet førte til rask vevsrekyl langs A-P-aksen (figur 1B,C). I de stimulerte embryoene ble CRY2-Rho1DN-mCherry-signalet plasmamembranlokalisert, mens det medioapikale signalet fra Sqh-mCherry helt forsvant (figur 1A). Laserablasjon i de stimulerte embryoene resulterte ikke i åpenbar vevsrekyl, som eksemplifisert i figur 1B,C og kvantifisert i figur 1D. Disse resultatene indikerer at genereringen av vevspenning krever aktiv apikal aktomyosinkontraktilitet; når actomyosin blir inaktiv ved Rho1-hemming, reduseres også den apikale vevsspenningen41. Disse observasjonene stemmer overens med tidligere funn om at aktivering av apikal myosinkontraktilitet i ventrale mesodermale celler resulterer i en økning i vevspenning ved embryoets ventrale overflate40.

Figure 1
Figur 1: Opto-Rho1DN-stimulering under apikal innsnevring gir umiddelbart tap av kortikal spenning på embryoets ventrale overflate . (A) Tegneserie som viser det eksperimentelle oppsettet for laserablasjon for å oppdage kortikal spenning. Gulskraverte områder angir de ablerte områdene. For stimulerte embryoer ble lysaktivering av Opto-Rho1DN utført 3 min før laserablasjonen. På grunn av apikal relaksasjon etter stimulering ble det ablert flere z-plan (gulskygget region) for å sikre ablasjon av den svært apikale overflaten av ventralcellene. (B,C) Sammenligning mellom ustimulerte og stimulerte embryoer. Ingen åpenbar vevsrekyl ble observert i de stimulerte embryoene (N = 6 for ustimulerte embryoer og N = 5 for stimulerte embryoer). (B) Et ansiktsbilde av de laserablerte embryoene. Gulskyggede bokser markerer det ablerte området. (C) Kymographs som representerer breddeendringen i det ablerte området. Gule stiplede linjer indikerer ablasjonsstedet. (D) Breddeendringer i ablert område langs A-P-aksen i løpet av de første 20 s etter laserablasjon. En klar vevsrekyl ble observert etter laserskjæring i de ustimulerte kontrollembryoene. I motsetning til dette ble det observert liten eller ingen vevsrekyl i de stimulerte embryoene, noe som indikerer mangel på apikal spenning etter Rho1-hemming. Feilfelt er standardavvik. P-verdien ble beregnet ved hjelp av en tosidig Wilcoxon rangsumtest. Dette tallet er gjenbrukt fra Guo et al.41. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokollen beskrev kombinert bruk av optogenetikk og laserablasjon for å undersøke endringer i vevsspenning umiddelbart etter inaktivering av aktomyosinkontraktilitet. Det optogenetiske verktøyet beskrevet her utnytter den dominerende negative formen av Rho1 (Rho1DN) til akutt å hemme endogen Rho1 og Rho1-avhengig aktomyosinkontraktilitet. Tidligere karakterisering av Opto-Rho1DN i sammenheng med Drosophila ventral furedannelse viste at verktøyet er svært effektivt for å formidle den raske inaktiveringen av apikal aktomyosinkontraktilitet gjennom samtidig myosininaktivering og aktindemontering41. Spesielt resulterte stimuleringen av embryoer på tidspunktet for apikal innsnevring i reduksjon av det apikale myosinsignalet innen 60 s i celler som gjennomgikk apikal innsnevring41. Denne raske fjerningen av kortikal myosin ved Rho1-hemming skyldes sannsynligvis rask sykling av Rho1 og myosin gjennom aktive og inaktive tilstander, forårsaket av aktivitetene til GTPase-aktiverende proteiner (GAPs) for henholdsvis Rho1 og myosin lettkjedefosfataser, henholdsvis19,54. I samsvar med påvirkningen på aktomyosin viste kobling av optogenetikk med laserablasjon at Opto-Rho1DN-stimulering under apikal innsnevring resulterte i et umiddelbart tap av epitelspenning i den ventrale regionen av embryoet41 (figur 1). Denne kombinerte tilnærmingen tillot oss å undersøke funksjonen til Rho1-mediert cellulær kontraktilitet ved regulering av vevsmekanikk med enestående romlig og tidsmessig presisjon, noe som gjør det mulig å dissekere umiddelbare virkninger fra langsiktige effekter som er vanskelige å oppnå ved bruk av konvensjonelle genetiske tilnærminger.

En viktig teknisk vurdering ved bruk av Opto-Rho1DN er at verktøyet er svært følsomt for omgivelseslys. Et vanlig problem i forsøket er rekrutteringen av CRY2-mCherry-Rho1DN til plasmamembranen før stimuleringstrinnet, som vanligvis skyldes for tidlig stimulering av prøven under ett av følgende trinn: prøvepreparering, prøveoverføring til mikroskoprommet, prøveposisjonering på mikroskopstadiet og bildeopptak før stimulering. I vår protokoll brukes flere prosedyrer for å forhindre uønsket stimulering, inkludert håndtering av fluekopper og embryoer i et mørkt rom under rødt lys, filtrering av blå bølgelengder fra belysningslyset når du velger og monterer embryoer under stereomikroskopet, og unngår eksponering av embryoer til en 400-500 nm laser (enkeltfoton eksitasjon) eller en 830-980 nm pulserende laser (multifoton eksitasjon) før stimulering. Det er viktig å øve ekstra oppmerksomhet på flere trinn i forsøket for å forhindre uønsket stimulering av prøven. I tillegg, når du bruker Opto-Rho1DN til å hemme Rho1 innenfor et spesifikt interesseområde (ROI) i embryoet41, anbefales det å bruke den laveste laserintensiteten som kan oppnå en robust translokasjon av CRY2-Rho1DN til plasmamembranen. Fordi Opto-Rho1DN er ekstremt følsom for blå bølgelengder, kan en blå laser med høy intensitet resultere i uønsket stimulering i celler utenfor avkastningen eller til og med nærliggende embryoer på grunn av spredt lys.

I sin nåværende versjon har Opto-Rho1DN-verktøyet flere begrensninger. For det første, for eksperimentene beskrevet i denne protokollen, ble et plasmamembranlokalisert CIBN-anker brukt til å rekruttere aktivert CRY2-Rho1DN fra cytosolen til plasmamembranen41,47. Ved denne utformingen er det vanskelig å utføre begrenset Rho1-inhibering innenfor et spesifikt plasmamembrandomene på grunn av diffusjon av aktiverte CRY2-Rho1DN-proteiner i cytosolen. Ytterligere forbedring av romlig presisjon på subcellulær skala venter på utvikling av nye CIBN-ankre som har mer spesifikke subcellulære lokaliseringsmønstre. For det andre er Opto-Rho1DN designet for å hemme Rho1 under tidlig embryogenese. Uttrykket av CIBNpm og CRY2-Rho1DN-mCherry styres av UASp, som er standardisert for uttrykk i kvinnelige kimlinjer 55. Ekspresjonen av disse modulene i somatisk vev utover tidlig embryogenese kan kreve erstatning av UASp med en promotor som er mer effektiv for å drive somatisk uttrykk (f.eks. UASt5, 6). Endelig er effektiviteten til Opto-Rho1DN betinget av overflod av CIBN-ankeret og CRY2-Rho1DN-proteinene. I den nåværende versjonen av verktøyet bestemmes det av GAL4-driverlinjen som brukes til å drive uttrykket til de optogenetiske modulene. Når du bruker mors GAL4-driveren beskrevet i denne protokollen, er det viktig å bruke linjen som gir to kopier av GAL4-genet (f.eks. Både 67 og 15) for å oppnå rask og potent hemming av aktomyosinkontraktilitet. Reduksjon av kopinummeret av mors GAL4 hos F1-hunnene fra to til en reduserte den hemmende effekten signifikant.

Sammenlignet med konvensjonelle genetiske tilnærminger, er den optogenetiske tilnærmingen beskrevet i denne protokollen fordelaktig ved å dissekere stadium og vevsspesifikk funksjon av Rho1 i tidlige Drosophila-embryoer. Funksjonen til Rho1 i tidlig Drosophila embryogenese er i stor grad oppfylt av det maternelt ladede genproduktet11. Nedbryting av Rho1 blokkerer mors oogenese57, og forhindrer studiet av funksjonen under tidlig embryogenese. I de siste årene har flere optogenetiske verktøy blitt utviklet for å regulere endogen Rho1-aktivitet i Drosophila-embryoer. Både Izquierdo et al. og Rich et al. utviklet optogenetiske verktøy for å aktivere Rho1-aktivitet ved å regulere lokaliseringen av det katalytiske domenet til Rho GEFs i Drosophila-embryoer 48,58. I tillegg utviklet Herrera-Perez et al. to optogenetiske verktøy ved bruk av enten full lengde RhoGEF2 (optoGEF) eller full lengde C-GAP (optoGAP) for å aktivere eller hemme endogen Rho1-aktivitet, henholdsvis59. Siden optoGAP fungerer ved å rekruttere et Rho1 GAP til plasmamembranen, kan applikasjonen være følsom for tilstedeværelsen av endogene Rho1 GEFs, som kan oppveie eller til og med overstyre effekten av ektopisk rekruttering av GAP. I kontrast, ved direkte sekvestrering av Rho1 GEFs, kan Opto-Rho1DN gi en mer robust måte å hemme endogen Rho1 og Rho1-avhengig actomyosinkontraktilitet.

Gitt det brede spekteret av funksjoner av Rho1 i embryogenese og postembryonal utvikling, kan den presenterte protokollen lett tilpasses for å studere funksjonen til Rho1 og Rho1-avhengige cellulære omorganiseringer i et bredt spekter av morfogenetiske prosesser. I tillegg kan en lignende strategi i prinsippet brukes til å begrense andre små GTPaser, som Rho-familien GTPases Cdc42 og Rac, siden deres dominerende negative former har blitt mye brukt til å hemme den endogene funksjonen til disse proteinene11. Til slutt, som eksemplifisert i denne protokollen, kan kombinasjon av optogenetikk og laserablasjonstilnærminger gi en effektiv måte å undersøke den umiddelbare effekten av inaktivering av et spesifikt protein på vevsdynamikk og vevsmekanikk, noe som vil gi oss ny innsikt i vevsmorfogenese som er vanskelig å avdekke ved hjelp av konvensjonelle genetiske tilnærminger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer at forskningen ble utført i fravær av kommersielle eller økonomiske forhold som kan tolkes som en potensiell interessekonflikt.

Acknowledgments

Forfatterne takker Ann Lavanway for bildestøtte. Forfatterne takker Wieschaus-laboratoriet og De Renzis-laboratoriet for å dele reagenser og Bloomington Drosophila Stock Center for fluebestander. Denne studien støttes av NIGMS ESI-MIRA R35GM128745 og American Cancer Society Institutional Research Grant #IRG-82-003-33 til BH.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
35 mm glass-bottom dish MatTek P35G-1.5-10-C Used for sample preparation
60 mm × 15 mm Petri dish with lid Falcon 351007 Used for sample preparation
Black cloth for covering the microscope Online NA Used to avoid unwanted light stimulation
Clorox Ultra Germicadal Bleach (8.25% sodium hypochlorite) VWR 10028-048 Used for embryo dechorination
CO2 pad Genesee Scientific 59-114 Used for cross set-up
ddH2O NA NA Used for sample preparation
Dumont Style 5 tweezers VWR 102091-654 Used for sample preparation
Eyelash tool (made from pure red sable round brush #2) VWR 22940-834 Used for sample preparation
FluoView (Software) Olympus NA Used for image acquisition and optogenetic stimulation
Halocarbon oil 27 Sigma Aldrich H8773-100ML Used for embryo stage visualization
ImageJ/FIJI NIH NA Used for image analysis
MATLAB MathWorks NA Used for image analysis
Nikon SMZ-745 stereoscope Nikon NA Used for sample preparation
Olympus FVMPE-RS multiphoton microscope with InSight DS Dual-line Ultrafast Lasers for simultaneous dual-wavelength multiphoton imaging, , a 25x/NA1.05 water immersion objective (XLPLN25XWMP2), and an IR/VIS stimulation unit for photo-activation/stimulation. This system is also equipped with a TRITC filter (39005-BX3; AT-TRICT-REDSHFT 540/25x, 565BS, 620/60M), and a fluorescence illumination unit that emits white light. Olympus NA Used for image acquisition and optogenetic stimulation
SP Bel-Art 100-place polypropylene freezer storage box (Black, light-proof box for sample transfer) VWR 30621-392 Used to avoid unwanted light stimulation
UV Filter Shield for FM1403 Fluores (Orange-red plastic shield) Bolioptics FM14036151 Used to avoid unwanted light stimulation
VITCHELO V800 Headlamp with White and Red LED Lights Amazon NA Used to avoid unwanted light stimulation

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vicente-Manzanares, M., Ma, X., Adelstein, R. S., Horwitz, A. R. Non-muscle myosin II takes centre stage in cell adhesion and migration. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 10 (11), 778-790 (2009).
  2. Munjal, A., Lecuit, T. Actomyosin networks and tissue morphogenesis. Development. 141 (9), 1789-1793 (2014).
  3. Sawyer, J. M., et al. Apical constriction: a cell shape change that can drive morphogenesis. Developmental Biology. 341 (1), 5-19 (2010).
  4. Nishimura, T., Honda, H., Takeichi, M. Planar cell polarity links axes of spatial dynamics in neural-tube closure. Cell. 149 (5), 1084-1097 (2012).
  5. Marinari, E., et al. Live-cell delamination counterbalances epithelial growth to limit tissue overcrowding. Nature. 484 (7395), 542-545 (2012).
  6. Slattum, G. M., Rosenblatt, J. Tumour cell invasion: an emerging role for basal epithelial cell extrusion. Nature Reviews. Cancer. 14 (7), 495-501 (2014).
  7. Antunes, M., Pereira, T., Cordeiro, J. V., Almeida, L., Jacinto, A. Coordinated waves of actomyosin flow and apical cell constriction immediately after wounding. The Journal of Cell Biology. 202 (2), 365-379 (2013).
  8. Yang, S., et al. The central role of the tail in switching off 10S myosin II activity. The Journal of General Physiology. 151 (9), 1081-1093 (2019).
  9. Yang, S., et al. Cryo-EM structure of the inhibited (10S) form of myosin II. Nature. 588 (7838), 521-525 (2020).
  10. Narumiya, S., Thumkeo, D. Rho signaling research: history, current status and future directions. FEBS Letters. 592 (11), 1763-1776 (2018).
  11. Johndrow, J. E., Magie, C. R., Parkhurst, S. M. Rho GTPase function in flies: insights from a developmental and organismal perspective. Biochemistry and Cell Biology. 82 (6), 643-657 (2004).
  12. Etienne-Manneville, S., Hall, A. Rho GTPases in cell biology. Nature. 420 (6916), 629-635 (2002).
  13. Hodge, R. G., Ridley, A. J. Regulating Rho GTPases and their regulators. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 17 (8), 496-510 (2016).
  14. Martin, A. C., Goldstein, B. Apical constriction: themes and variations on a cellular mechanism driving morphogenesis. Development. 141 (10), 1987-1998 (2014).
  15. Amano, M., Nakayama, M., Kaibuchi, K. Rho-kinase/ROCK: A key regulator of the cytoskeleton and cell polarity. Cytoskeleton. 67 (9), 545-554 (2010).
  16. Kimura, K., et al. Regulation of myosin phosphatase by Rho and Rho-associated kinase (Rho-kinase). Science. 273 (5272), 245-248 (1996).
  17. Maekawa, M., et al. Signaling from Rho to the actin cytoskeleton through protein kinases ROCK and LIM-kinase. Science. 285 (5429), 895-898 (1999).
  18. Ohashi, K., et al. Rho-associated kinase ROCK activates LIM-kinase 1 by phosphorylation at threonine 508 within the activation loop. The Journal of Biological Chemistry. 275 (5), 3577-3582 (2000).
  19. Coravos, J. S., Martin, A. C. Apical sarcomere-like actomyosin contracts nonmuscle drosophila epithelial cells. Developmental Cell. 39 (3), 346-358 (2016).
  20. Homem, C. C. F., Peifer, M. Diaphanous regulates myosin and adherens junctions to control cell contractility and protrusive behavior during morphogenesis. Development. 135 (6), 1005-1018 (2008).
  21. Goode, B. L., Eck, M. J. Mechanism and function of formins in the control of actin assembly. Annual Review of Biochemistry. 76, 593-627 (2007).
  22. Sweeton, D., Parks, S., Costa, M., Wieschaus, E. Gastrulation in Drosophila: the formation of the ventral furrow and posterior midgut invaginations. Development. 112 (3), 775-789 (1991).
  23. Leptin, M., Grunewald, B. Cell shape changes during gastrulation in Drosophila. Development. 110 (1), 73-84 (1990).
  24. Leptin, M. Gastrulation in Drosophila: the logic and the cellular mechanisms. The EMBO Journal. 18 (12), 3187-3192 (1999).
  25. Martin, A. C. The physical mechanisms of Drosophila gastrulation: mesoderm and endoderm invagination. Genetics. 214 (3), 543-560 (2020).
  26. Gilmour, D., Rembold, M., Leptin, M. From morphogen to morphogenesis and back. Nature. 541 (7637), 311-320 (2017).
  27. Gheisari, E., Aakhte, M., Müller, H. -A. J. Gastrulation in Drosophila melanogaster: Genetic control, cellular basis and biomechanics. Mechanisms of Development. 163, 103629 (2020).
  28. Leptin, M. Twist and snail as positive and negative regulators during Drosophila mesoderm development. Genes & Development. 5 (9), 1568-1576 (1991).
  29. Costa, M., Wilson, E. T., Wieschaus, E. A putative cell signal encoded by the folded gastrulation gene coordinates cell shape changes during Drosophila gastrulation. Cell. 76 (6), 1075-1089 (1994).
  30. Kerridge, S., et al. Modular activation of Rho1 by GPCR signalling imparts polarized myosin II activation during morphogenesis. Nature Cell Biology. 18 (3), 261-270 (2016).
  31. Kölsch, V., Seher, T., Fernandez-Ballester, G. J., Serrano, L., Leptin, M. Control of Drosophila gastrulation by apical localization of adherens junctions and RhoGEF2. Science. 315 (5810), 384-386 (2007).
  32. Manning, A. J., Peters, K. A., Peifer, M., Rogers, S. L. Regulation of epithelial morphogenesis by the G protein-coupled receptor mist and its ligand fog. Science Signaling. 6 (301), (2013).
  33. Parks, S., Wieschaus, E. The Drosophila gastrulation gene concertina encodes a G alpha-like protein. Cell. 64 (2), 447-458 (1991).
  34. Barrett, K., Leptin, M., Settleman, J. The Rho GTPase and a putative RhoGEF mediate a signaling pathway for the cell shape changes in Drosophila gastrulation. Cell. 91 (7), 905-915 (1997).
  35. Dawes-Hoang, R. E., et al. Folded gastrulation, cell shape change and the control of myosin localization. Development. 132 (18), 4165-4178 (2005).
  36. Häcker, U., Perrimon, N. DRhoGEF2 encodes a member of the Dbl family of oncogenes and controls cell shape changes during gastrulation in Drosophila. Genes & Development. 12 (2), 274-284 (1998).
  37. Martin, A. C., Kaschube, M., Wieschaus, E. F. Pulsed contractions of an actin-myosin network drive apical constriction. Nature. 457 (7228), 495-499 (2009).
  38. Mason, F. M., Tworoger, M., Martin, A. C. Apical domain polarization localizes actin-myosin activity to drive ratchet-like apical constriction. Nature Cell Biology. 15 (8), 926-936 (2013).
  39. Nikolaidou, K. K., Barrett, K. A Rho GTPase signaling pathway is used reiteratively in epithelial folding and potentially selects the outcome of Rho activation. Current Biology. 14 (20), 1822-1826 (2004).
  40. Martin, A. C., Gelbart, M., Fernandez-Gonzalez, R., Kaschube, M., Wieschaus, E. F. Integration of contractile forces during tissue invagination. The Journal of Cell Biology. 188 (5), 735-749 (2010).
  41. Guo, H., Swan, M., He, B. Optogenetic inhibition of actomyosin reveals mechanical bistability of the mesoderm epithelium during Drosophila mesoderm invagination. eLife. 11, e69082 (2022).
  42. Sebti, S. M., Der, C. J. Searching for the elusive targets of farnesyltransferase inhibitors. Nature Reviews. Cancer. 3 (12), 945-951 (2003).
  43. Roberts, P. J., et al. Rho family GTPase modification and dependence on CAAX motif-signaled posttranslational modification. The Journal of Biological Chemistry. 283 (37), 25150-25163 (2008).
  44. Feig, L. A., Cooper, G. M. Inhibition of NIH 3T3 cell proliferation by a mutant ras protein with preferential affinity for GDP. Molecular and Cellular Biology. 8 (8), 3235-3243 (1988).
  45. Liu, H., et al. Photoexcited CRY2 interacts with CIB1 to regulate transcription and floral initiation in Arabidopsis. Science. 322 (5907), 1535-1539 (2008).
  46. Kennedy, M. J., et al. Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in living cells. Nature Methods. 7 (12), 973-975 (2010).
  47. Guglielmi, G., Barry, J. D., Huber, W., De Renzis, S. An optogenetic method to modulate cell contractility during tissue morphogenesis. Developmental Cell. 35 (5), 646-660 (2015).
  48. Izquierdo, E., Quinkler, T., De Renzis, S. Guided morphogenesis through optogenetic activation of Rho signalling during early Drosophila embryogenesis. Nature Communications. 9 (1), 2366 (2018).
  49. Hutson, M. S., et al. Forces for morphogenesis investigated with laser microsurgery and quantitative modeling. Science. 300 (5616), 145-149 (2003).
  50. Rauzi, M., Lenne, P. -F. Probing cell mechanics with subcellular laser dissection of actomyosin networks in the early developing Drosophila embryo. Methods in Molecular Biology. 1189, 209-218 (2015).
  51. Rauzi, M., Verant, P., Lecuit, T., Lenne, P. -F. Nature and anisotropy of cortical forces orienting Drosophila tissue morphogenesis. Nature Cell Biology. 10 (12), 1401-1410 (2008).
  52. Hunter, C., Wieschaus, E. Regulated expression of nullo is required for the formation of distinct apical and basal adherens junctions in the Drosophila blastoderm. The Journal of Cell Biology. 150 (2), 391-401 (2000).
  53. Oda, H., Tsukita, S. Real-time imaging of cell-cell adherens junctions reveals that Drosophila mesoderm invagination begins with two phases of apical constriction of cells. Journal of Cell Science. 114, 493-501 (2001).
  54. Munjal, A., Philippe, J. -M., Munro, E., Lecuit, T. A self-organized biomechanical network drives shape changes during tissue morphogenesis. Nature. 524 (7565), 351-355 (2015).
  55. Rørth, P. Gal4 in the Drosophila female germline. Mechanisms of Development. 78 (1-2), 113-118 (1998).
  56. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  57. Magie, C. R., Meyer, M. R., Gorsuch, M. S., Parkhurst, S. M. Mutations in the Rho1 small GTPase disrupt morphogenesis and segmentation during early Drosophila development. Development. 126 (23), 5353-5364 (1999).
  58. Rich, A., Fehon, R. G., Glotzer, M. Rho1 activation recapitulates early gastrulation events in the ventral, but not dorsal, epithelium of Drosophila embryos. eLife. 9, e56893 (2020).
  59. Herrera-Perez, R. M., Cupo, C., Allan, C., Lin, A., Kasza, K. E. Using optogenetics to link myosin patterns to contractile cell behaviors during convergent extension. Biophysical Journal. 120 (19), 4214-4229 (2021).

Tags

Utviklingsbiologi utgave 194 optogenetikk vevsmekanikk Rho1 actomyosin laserablasjon apikal innsnevring gastrulering
Optogenetisk hemming av rho1-mediert aktomyosinkontraktilitet kombinert med måling av epitelspenning i <em>Drosophila-embryoer</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Guo, H., Swan, M., He, B.… More

Guo, H., Swan, M., He, B. Optogenetic Inhibition of Rho1-Mediated Actomyosin Contractility Coupled with Measurement of Epithelial Tension in Drosophila Embryos. J. Vis. Exp. (194), e65314, doi:10.3791/65314 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter