Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Optogenetisk hämning av rho1-medierad aktomyosinkontraktilitet i kombination med mätning av epitelspänning i Drosophila-embryon

Published: April 14, 2023 doi: 10.3791/65314
Automatic Translation
1,2, 3, 1
1Department of Biological Sciences, Dartmouth College, 2School of Life Sciences, Westlake University, 3Department of Molecular Biology, Princeton University

Summary

Actomyosinkontraktilitet spelar en viktig roll i cell- och vävnadsmorfogenesen. Det är dock utmanande att manipulera aktomyosinkontraktiliteten in vivo akut. Detta protokoll beskriver ett optogenetiskt system som snabbt hämmar Rho1-medierad aktomyosinkontraktilitet i Drosophila-embryon , vilket avslöjar den omedelbara förlusten av epitelspänning efter inaktivering av aktomyosin in vivo.

Abstract

Kontraktila krafter som genereras av aktin och icke-muskelmyosin II ("aktomyosinkontraktilitet") är avgörande för morfologiska förändringar av celler och vävnader på flera längdskalor, såsom celldelning, cellmigration, epitelveckning och förgrenad morfogenes. En djupgående förståelse av aktomyosinkontraktilitetens roll i morfogenesen kräver metoder som möjliggör snabb inaktivering av aktomyosin, vilket är svårt att uppnå med konventionella genetiska eller farmakologiska metoder. Det presenterade protokollet demonstrerar användningen av ett CRY2-CIBN-baserat optogenetiskt dimeriseringssystem, Opto-Rho1DN, för att hämma aktomyosinkontraktilitet i Drosophila-embryon med exakta tidsmässiga och rumsliga kontroller. I detta system är CRY2 sammansmält med den dominerande negativa formen av Rho1 (Rho1DN), medan CIBN är förankrat i plasmamembranet. Blåljusmedierad dimerisering av CRY2 och CIBN resulterar i snabb translokation av Rho1DN från cytoplasman till plasmamembranet, där det inaktiverar aktomyosin genom att hämma endogent Rho1. Dessutom presenterar denna artikel ett detaljerat protokoll för koppling av Opto-Rho1DN-medierad inaktivering av aktomyosin med laserablation för att undersöka aktomyosinets roll i att generera epitelspänning under bildning av Drosophila ventrala fåror. Detta protokoll kan tillämpas på många andra morfologiska processer som involverar aktomyosinkontraktilitet i Drosophila-embryon med minimala modifieringar. Sammantaget är detta optogenetiska verktyg ett kraftfullt tillvägagångssätt för att dissekera funktionen av aktomyosinkontraktilitet för att kontrollera vävnadsmekanik under dynamisk vävnadsremodellering.

Introduction

Actomyosinkontraktilitet, den sammandragande kraft som utövas av icke-muskelmyosin II (hädanefter myosin) på F-aktinnätverket, är en av de viktigaste krafterna för att ändra cellform och driva morfogenes på vävnadsnivå 1,2. Till exempel resulterar aktiveringen av aktomyosinkontraktilitet vid epitelcellernas apikala domän i apikal sammandragning, vilket underlättar en mängd olika morfogenetiska processer, inklusive epitelveckning, cellextrudering, delaminering och sårläkning 3,4,5,6,7 . Aktiveringen av myosin kräver fosforylering av dess regulatoriska ljuskedja. Denna modifiering lindrar den hämmande konformationen av myosinmolekylerna, vilket gör att de kan bilda bipolära myosinfilamentbuntar med flera huvuddomäner i båda ändar. De bipolära myosinfilamenten driver den antiparallella rörelsen av aktinfilament och resulterar i generering av kontraktil kraft 1,8,9.

Den evolutionärt bevarade Rho-familjens små GTPas RhoA (Rho1 hos Drosophila) spelar en central roll i aktiveringen av aktomyosinkontraktilitet i olika cellulära sammanhang10,11. Rho1 fungerar som en bimolekylär omkopplare genom att binda antingen GTP (aktiv form) eller GDP (inaktiv form)12. Cyklingen mellan GTP- eller GDP-bundet Rho1 regleras av dess GTPasaktiverande proteiner (GAPs) och guaninnukleotidutbytesfaktorer (GEFs)13. GEFs funktion är att underlätta utbytet av BNP mot GTP och på så sätt aktivera Rho1-aktiviteten. GAPs, å andra sidan, förbättrar GTPas-aktiviteten hos Rho1 och inaktiverar därmed Rho1. Aktiverad Rho1 främjar aktomyosinkontraktilitet genom att interagera med och aktivera dess nedströms effektorer, Rho-associerat kinas (Rok) och Diaphanous14. Rok inducerar myosinaktivering och aktomyosinkontraktilitet genom fosforylering av den regulatoriska lätta kedjan av myosin15. Dessutom hämmar Rok också myosinregulatoriskt lättkedjigt fosfatas och främjar därmed ytterligare myosinfilamentmontering16. Rok kan också fosforylera LIM-kinaser, som, när de aktiveras, förhindrar aktindemontering genom att fosforylera och hämma aktin-depolymerisationsfaktorn cofilin17,18. Diaphanous är en forminfamilj aktinkärnbildare som främjar aktinpolymerisation, vilket ger en bas för myosin att interagera med 19,20,21.

Även om de cellulära mekanismerna som aktiverar aktomyosinkontraktilitet har klarlagts väl, är vår förståelse av dess funktion för att reglera dynamisk vävnadsremodellering fortfarande ofullständig. För att fylla denna kunskapslucka krävs metoder som snabbt kan inaktivera aktomyosin i specifika vävnadsregioner in vivo och registrera den omedelbara effekten på vävnadens beteende och egenskaper. Detta protokoll beskriver användningen av ett optogenetiskt tillvägagångssätt för att akut hämma aktomyosinkontraktilitet under Drosophila mesoderm-invagination, följt av mätning av epitelspänning med hjälp av laserablation. Under Drosophila-gastrulation genomgår de ventralt lokaliserade mesodermprekursorcellerna apikal sammandragning och invaginaterar från embryots yta genom att bilda en främre-posteriort orienterad fåra22,23. Bildandet av ventrala fåror har länge använts som modell för att studera mekanismen för epitelveckning. Bildandet av ventrala fåror administreras av det dorsal-ventrala mönstringssystemet hos Drosophila24,25,26,27. Uttrycket av två transkriptionsfaktorer, Twist och Snigel, som ligger på den ventrala sidan av embryot, styr bildandet av ventrala fåror och specificerar mesodermala cellers öde28. Twist and Snail aktiverar rekryteringen av Rho1 GEF RhoGEF2 till toppen av mesodermprekursorcellerna via en G-proteinkopplad receptorväg och ett RhoGEF2-adapterprotein, T48 29,30,31,32,33. Därefter aktiverar RhoGEF2 myosin i hela den apikala ytan av den potentiella mesodermen genom Rho-Rho-kinasvägen 34,35,36,37,38,39. Aktiverad myosin bildar ett supracellulärt aktomyosinnätverk genom hela den apikala ytan av mesoderm primordium, vars sammandragningar driver apikal sammandragning och resulterar i en snabb ökning av apikal vävnadsspänning 14,37,40.

Det optogenetiska verktyget som beskrivs i detta protokoll, Opto-Rho1DN, hämmar aktomyosinkontraktilitet genom blåljusberoende plasmamembranrekrytering av en dominant negativ form av Rho1 (Rho1DN)41. En T19N-mutation i Rho1DN eliminerar det muterade proteinets förmåga att utbyta GDP mot GTP och gör därmed proteinet ständigtinaktivt. En efterföljande mutation i Rho1DN, C189Y, eliminerar dess naiva membranmålsignal42,43. När Rho1DN infunderas till plasmamembranet binder det till och uppdämmer Rho1 GEFs, vilket blockerar aktiveringen av Rho1 samt Rho1-medierad aktivering av myosin och aktin34,44. Plasmamembranrekryteringen av Rho1DN uppnås genom en ljusberoende dimeriseringsmodul härledd från Cryptochrome 2 och dess bindningspartner CIB1. Kryptokrom 2 är en blåljusaktiverad kryptokromfotoreceptor i Arabidopsis thaliana45. Kryptokrom 2 binder till CIB1, ett basiskt helix-loop-helix-protein, endast i sitt fotoexciterade tillstånd45. Det visade sig senare att den bevarade N-terminalen, fotolyashimologiregionen (PHR), från kryptokrom 2 (CRY2PHR, hädanefter kallad CRY2) och den N-terminala domänen (aa 1-170) av CIB1 (hädanefter CIBN) är viktiga för ljusinducerad dimerisering46. Opto-Rho1DN innehåller två komponenter. Den första komponenten är CIBN-proteinet sammansmält med ett CAAX-ankare, som lokaliserar proteinet till plasmamembranet47. Den andra komponenten är mCherry-märkt CRY2 smält med Rho1DN41. I frånvaro av blått ljus stannar CRY2-Rho1DN kvar i cytoplasman. Vid stimulering av blått ljus riktas CRY2-Rho1DN mot plasmamembranet genom interaktionen mellan membranförankrad CIBN och exciterad CRY2. Opto-Rho1DN kan aktiveras av ultraviolett A (UVA) ljus och blått ljus (400-500 nm, toppaktivering vid 450-488 nm), eller av en 830-980 nm pulsad laser vid utförande av tvåfotonstimulering41,46,47,48. Därför stimuleras Opto-Rho1DN av våglängder som normalt används för exciterande GFP (488 nm för enfotonavbildning och 920 nm för tvåfotonavbildning). Våglängder som vanligtvis används för exciterande mCherry (561 nm för enkelfotonavbildning och 1 040 nm för tvåfotonavbildning) stimulerar däremot inte den optogenetiska modulen och kan därför användas för prestimuleringsavbildning. Protokollet beskriver de tillvägagångssätt som används för att minimera risken för oönskad stimulering under provmanipulation.

Laserablation har använts i stor utsträckning för att upptäcka och mäta spänningar i celler och vävnader49. Tidigare studier har visat att, när laserintensiteten kontrolleras på lämpligt sätt, kan tvåfotonlaserablation med användning av en femtosekunds nära-infraröd laser fysiskt försämra vissa subcellulära strukturer (t.ex. kortikala aktomyosinnätverk) utan att orsaka plasmamembranrapture50,51. Om vävnaden är under spänning resulterar laserablation av ett intresseområde i vävnaden i en omedelbar utåtriktad rekyl av cellerna intill det ablerade området. Rekylhastigheten är en funktion av storleken på spänningen och viskositeten hos mediet (cytoplasman) som omger strukturerna som genomgår rekyl49. På grund av det överlägsna penetrationsdjupet hos de nära-infraröda lasrarna och förmågan att uppnå väl begränsad fokal ablation, är tvåfotonlaserablation särskilt användbar för att detektera vävnadsspänning in vivo. Som demonstrerats i detta protokoll kan denna metod enkelt kombineras med Opto-Rho1DN-medierad inaktivering av aktomyosinkontraktilitet för att undersöka den direkta effekten av Rho1-beroende cellulär kontraktilitet på vävnadsmekanik under dynamisk vävnadsremodellering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Ställa in det genetiska korset och förbereda ägguppsamlingskoppen

  1. Välj honflugor (jungfruliga) från den optogenetiska linjen UASp-CIBNpm (I); UASp-CRY2-Rho1DN-mCherry (III) på en CO2 pad under ett stereomikroskop och sätt upp en korsning med hanflugor från moderns GAL4 driver line 67 Sqh-mCherry; 15 E-cadherin-GFP.
    OBS: 67 och 15 står för maternal-Tubulin-GAL4 insatt i den andra (II) respektive tredje (III) kromosomen,52. GAL4-linjen som används i detta protokoll uttrycker också den mCherry-märkta myosinregulatoriska lätta kedjan Sqh (Spaghetti squash)37 och GFP-taggad E-cadherin53. Flugor från den optogenetiska linjen kan fortfarande innehålla FM7- och TM6-balanseringskromosomer. Flugor från moderns GAL4-förarlinje kan fortfarande innehålla CyO- och TM3-balanseringskromosomerna.
  2. Efter ~10 dagar, välj F1 honflugor med följande genotyp: UASp-CIBNpm/+; 67 kvmKörsbär/+; 15 E-cadherin-GFP/UASp-CRY2-Rho1DN-mCherry. Sätt upp en ägguppsamlingskopp med hanflugorna.
    1. Se till att honflugorna med rätt genotyp inte innehåller några balanserande kromosomer (dvs. de bör inte innehålla lockiga vingar [Cy], korta borst [Sb], stav- eller njurformade ögon [B] eller extra humerusborst [Hu]), som är markörer för de CyO-, TM3-, FM7- och TM6-balanserare som används för att generera bestånden. Täck koppen med en äppeljuicetallrik med en nyans av färsk jästpasta på ytan.
      OBS: Hos F1-kvinnor uttrycks de optogenetiska komponenterna maternellt. Därför behöver de F1-honor som används för att sätta upp koppen inte vara oskulder. Det rekommenderas att använda hanflugor från samma F1-population för koppen för enkelhetens skull.
  3. Förvara koppen i en kartong täckt med aluminiumfolie för att undvika eventuellt ljusläckage från omgivningen. Byt äppeljuicetallrik varje dag för koppar som förvaras i rumstemperatur (~21-23 °C), eller varannan dag för koppar som förvaras vid 18 °C.
    1. Omedelbart före tallriksbyte, slå koppen på en plan yta (t.ex. bänkskiva) för att hålla flugorna i botten av koppen och förhindra att de flyr. Byt ut äppeljuicetallriken i ett mörkt rum och använd en pannlampa med rött ljus för belysning (se Materialförteckning).
      OBS: För att öka uttrycket av de konstrukt som är under kontroll av maternell-Tubulin-GAL4 och UASp, rekommenderas att hålla koppen vid 18 °C i minst 3 dagar före embryoinsamling. Denna inkubationstid gör det också möjligt för flugorna att anpassa sig till koppen och matas väl på jästpastan för att uppnå optimal äggproduktion.

2. Insamling av embryon i önskat skede och förberedelse av dem för optogenetisk stimulering

OBS: Alla sample insamling och beredningssteg måste utföras i ett mörkt rum, med ett "säkert ljus" (t.ex. rött ljus) för belysning. De optogenetiska komponenterna är oerhört känsliga för omgivande ljus. Även den minsta exponering för omgivande ljus leder till för tidig stimulering av provet. Vanligtvis orsakar lampor i det grön-röda området (>532 nm) inte oönskad stimulering.

  1. För att samla in embryon vid tidig embryogenes, placera en ny äppeljuicetallrik på koppen 8 till 16 timmar före embryoinsamlingen (vid 18 °C).
  2. Vid tidpunkten för embryoinsamlingen, byt äppeljuicetallriken. Märk plattan som tagits bort från koppen och täck plattans yta med ett tunt lager halokarbonolja 27 (se materialförteckning). Vänta i 30-60 sekunder tills äggskalet blir genomskinligt.
  3. Placera en orangeröd plastsköld (se Materialförteckning) på stage av ett upprätt stereoskop. Placeringen av den orangeröda skärmen förhindrar oönskad stimulering under provbelysning genom att blockera de blågröna våglängderna från det överförda ljuset.
    OBS: I detta protokoll används ett upprätt stereoskop för embryoinsamling (se materialförteckning).
  4. Placera äppeljuicetallriken ovanpå den orangeröda skölden. Slå på stereomikroskopets överförda ljus för att belysa sample. Samla 5-15 embryon i lämpligt skede från äppeljuicetallriken med hjälp av en pincett. Kläm inte ihop embryona med pincetten.
    OBS: I detta protokoll bör det lämpliga embryot vara i det tidiga cellulariseringsstadiet. Embryot bör i detta skede ha en mörk ogenomskinlig äggula omgiven av ett klart, enhetligt periplasmaskikt som innehåller de blastodermceller som bildas. Klyvningsfårornas framkant ("cellulariseringsfronten"), som uppträder som en kontinuerlig linje parallell med embryots yta, bör inte passera hälften av periplasmans djup.
  5. Torka försiktigt av embryona på en bit pappershandduk (~1,5 cm × 1,5 cm) för att ta bort överflödig olja från embryona med hjälp av pincetten.
  6. Tillsätt flera droppar nypreparerat 40 % blekmedel (~3 % natriumhypoklorit; se Materialtabell) till en ny liten fyrkantig bit pappershandduk (~1,5 cm × 1,5 cm) med hjälp av en plastöverföringspipett så att pappershandduken täcks med ett tunt lager blekmedel. Överför embryot från den torra pappershandduken till den blekindränkta pappershandduken med hjälp av pincetten och se till att embryona är indränkta i blekmedel. Vänta 2-4 minuter tills embryot blir dekorionerat.
  7. Efter ekorionation, använd pincetten för att torka av den fyrkantiga pappershandduken på en stor bit silkespapper för att ta bort överflödigt blekmedel. Se till att sidan med embryona är vänd uppåt.
  8. För att skölja embryona, använd pincetten för att försiktigt blötlägga den fyrkantiga pappershandduken i en droppe avjoniserat vatten och torka den snabbt på en stor bit silkespapper. Upprepa denna process åtta gånger för att säkerställa att eventuella rester av blekmedel avlägsnas.
  9. Använd ett ögonfransverktyg för att överföra embryot från pappershandduken till en 35 mm glasbottenskål (se Materialförteckning). Tillsätt avjoniserat vatten i skålen för att täcka embryona helt. Finjustera embryonas position och orientering med hjälp av ögonfransverktyget.
    OBS: Efter ekorionation tenderar embryot att fastna på glasets yta och är orörligt utan störningar, så det är inte nödvändigt att applicera ytterligare behandling (t.ex. lim) för att immobilisera embryot på glasbottenskålen.
  10. Placera den 35 mm tjocka glasbottnen med embryona i en ljustät svart låda (se materialtabell) för att skydda provet från ljusexponering under överföringsprocessen. Ta med lådan till rummet med multifotonmikroskopet.

3. Optogenetisk stimulering, laserablation och avbildning av embryot

OBS: Multifotonsystemet som används i detta experiment (se Materialtabell) kan samtidigt avbilda med dubbla våglängder. Den innehåller också en fotostimuleringsenhet med en 458 nm laser och en separat galvanometerskanner, vilket möjliggör fotoaktivering/stimulering inom ett definierat intresseområde (ROI). Värt att notera är att 920 nm-lasern, som används för att excitera grön-gula fluorescerande proteiner, kommer att stimulera Opto-Rho1DN, om än långsammare jämfört med blå lasermedierad stimulering.

  1. Täck multifotonmikroskopet med en ljustät svart trasa (se materialförteckning) för att undvika oönskad stimulering av embryona under provinställning och avbildning.
    OBS: Samma tillvägagångssätt används under vanlig multifotonavbildning för att skydda de ljuskänsliga detektorerna som är utrustade på mikroskopet.
  2. Släck rumsbelysningen och datorskärmarna. Stäng av pekskärmskontrollen genom att klicka på AV under "Bakgrundsbelysning på pekskärmskontrollen" i programvaran. Se till att det inte finns något annat omgivande ljus i rummet.
    1. Öppna framsidan av det svarta tyglocket på mikroskopet. Ta den 35 mm tjocka glasbottnen från den svarta lådan och placera den på mikroskopscenen.
  3. Lys upp embryon med ett grönt ljus som normalt används som excitationsljus för epifluorescens. För att göra detta, slå på fluorescensbelysningsenheten, välj Ocular under panelen 'Ocular' i programvaran och ändra 'Cube revolver' till 4:TRITC. Använd okularet för att identifiera embryot av intresse och få det i fokus.
    OBS: Visualiseringen av grönt ljus uppnås genom att låta ett vitt ljus som genereras av fluorescensbelysningsenheten passera genom en inbyggd standard TRITC-filterkub, som innehåller ett 528-553 nm excitationsfilter, en 565 nm stråldelare och ett 590-650 nm emissionsfilter. Andra icke-blå lampor bör också fungera bra för provbelysning. Det är inte nödvändigt att bära ögonskydd i detta steg, eftersom excitationsljuset har låg intensitet och inte kommer att riktas mot okularet. Embryot kommer att se enhetligt rött ut på grund av autofluorescens.
  4. Stäng det svarta tyglocket så att provet är helt skyddat från ljus. Slå på datorskärmen för att komma åt programvaran som styr mikroskopet. Ändra "Ocular" till LSM i programvaran för bildtagning.
  5. Utför laserablation i kontrollerade, ostimulerade embryon med hjälp av ett 25x vattennedsänkningsobjektiv.
    1. Klicka på Bright Z, Sequence Manager och LSM Stimulation från "Verktygsfönstret" i programvaran. Ställ in skannertypen som Galvano och skanningsstorleken som 512 × 512. Slå på CH1 och CH3 under panelen "PMT-inställning" för att tillåta användning av 1 040 nm-lasern och klicka på Live × 4 för att visualisera embryot.
    2. Rotera embryot med hjälp av rotationsfunktionen i programmet så att embryots främre och bakre axel är vertikalt orienterad. Ställ in zoomen på 3. Rita ett intresseområde (ROI) med hjälp av formverktyget under "Skanningsinställningar" och ställ in storleken på ROI i panelen "Referens". Ställ in ROI som 512 pixlar i bredd och 100 pixlar i höjd (171 × 33 μm2).
    3. Ställ in exponeringsparametrar för Z-stacken före ablation.
      1. Registrera embryots yta som 0 under "Z-sektionen". Ställ in början på 0 och slutet på 100 μm. Ställ in stegstorleken till 2 μm. Aktivera Z-exponeringsläget genom att markera Z under fliken "Serier".
      2. Ställ in laserintensiteten på 1 040 nm för att öka linjärt från 3 % till 7 % med hjälp av Bright Z-funktionen .
      3. Spara den aktuella avbildningsinställningen som den första uppgiften i pipelinen genom att klicka på LSM i Sequence Manager.
        OBS: Z-stacken före ablation erhålls för att bekräfta embryots stadium. I detta experiment kommer CRY2-Rho1DN-mCherry och Sqh-mCherry att exciteras av 1 040 nm-lasern. Under apikal sammandragning förstärks Sqh-mCherry-signalen vid den medioapikala regionen av de ventrala mesodermala cellerna, medan CRY2-Rho1DN-mCherry är cytosolisk före stimulering. Laserintensiteten som används för avbildning före och efter stimulering bestäms empiriskt baserat på balansen mellan det optimala signal-brusförhållandet och undvikandet av fotoblekning.
    4. Ställ in exponeringsparametrar för förablationsfilmen.
      1. Ta bort all befintlig ROI för att tillåta avbildning av hela 512 × 512 pixelområdet (171 × 171 μm 2, 3x zoom) nära embryots ventrala yta, enligt beskrivningen i steg 3.5.2. Ställ in laserintensiteten på 1 040 nm till 3 %.
      2. Kontrollera Tid och avmarkera Z under panelen "Serie". Behåll "Intervall" som FreeRun under "Time Lapse"-panelen. Ställ in cykeln som 10.
      3. Spara de aktuella inställningarna som nästa uppgift i pipelinen genom att klicka på LSM i "Sequence Manager".
        OBS: Syftet med denna uppgift är att få en 10-bilds enkel Z-plan förablationsfilm med en 1 040 nm laser för bildtagning. Bildupptagningshastigheten är cirka 1 s per bildruta.
    5. Ställ in parametrarna för laserablation.
      1. Definiera ett 3D-område från omedelbart under vitellinmembranet till ~20 μm djup för laserablation (figur 1A). Ställ in början av Z-stacken som det plan som är omedelbart under vitellinmembranet och änden som 20 μm djupare än startplanet. Ställ in stegstorleken till 1.5 μm.
        ROI för det ablerade området är ~30 pixlar i bredd och ~10 pixlar i höjd (~10 μm längs den mediala-laterala axeln och ~3,3 μm längs AP-axeln). Syftet med att ablera provet i flera Z-plan är att säkerställa att den apikala ytan på de ventrala cellerna ableras. Detta är särskilt viktigt för de stimulerade embryona, eftersom de ventrala cellerna upplever snabb apikal avslappning efter Rho1-hämning.
      2. Slå på CH2 och CH4 under panelen 'PMT-inställning' för att tillåta användning av 920 nm-lasern. Ställ in intensiteten på 920 nm-lasern till 30 %. Ställ in bildtagning med 920 nm-lasern för en enda Z-stack inom 3D-området som definieras i steg 3.5.5.1 för laserablation.
        OBS: Laserintensiteten som valts i detta steg är tillräcklig för att avlägsna vävnaden (vilket indikeras av vävnadsrekyl omedelbart efter laserbehandlingen) men skadar under tiden inte uppenbart plasmamembranet (vilket indikeras av avsaknaden av brännmärken på cellmembranet) (Figur 1B,C).
      3. Spara den aktuella inställningen som nästa uppgift i pipelinen genom att klicka på LSM i "Sekvenshanteraren".
    6. Ställ in insamlingsparametrar för filmen efter ablation.
      1. Ställ in bildtagning för en 100-bildsfilm med ett Z-plan efter ablation med både 1 040 nm och 920 nm. Ställ in intensiteten för 1 040 nm-lasern och 920 nm-lasern till 3 % respektive 0.3 %. Området som anges i steg 3.5.4 kommer att avbildas med identisk bildtagningshastighet.
      2. Spara den aktuella inställningen som nästa uppgift i pipelinen genom att klicka på LSM i "Sekvenshanteraren".
        OBS: Syftet med att lagra de parametrar som beskrivs i steg 3.5.3-3.5.6 som sekventiella uppgifter i "Sequence Manager" före någon faktisk insamling är att säkerställa att den omedelbara vävnadsresponsen fångas upp efter laserablation.
    7. Välj Sekvens under "Förvärva". Ändra sökvägen och filnamnet för att spara data efter behov. Klicka på Klar och vänta tills programvaran initierar pipelinen. Klicka sedan på Start för att köra pipelinen.
  6. Utför laserablation på stimulerade embryon.
    1. Ställ in insamlingsparametrar för Z-stacken före ablation, enligt beskrivningen i steg 3.5.1-3.5.3. Spara den aktuella inställningen som den första uppgiften i pipelinen genom att klicka på LSM i Sequence Manager.
    2. Ställ in parametrar för optogenetisk stimulering inom en definierad ROI.
      1. Ändra zoomen till 1 och välj en ROI som täcker embryots ventrala yta (~512 × 300 μm2). Stäng av CH1-CH4-detektorerna .
      2. Klicka på LSM-stimulering. Avmarkera Kontinuerlig inom Varaktighet och skriv 12 s. Kontrollera 458 nm med 0,3 % laserintensitet.
      3. Spara den aktuella inställningen som nästa uppgift i pipelinen genom att klicka på Stimulering i "Sekvenshanteraren".
        OBS: En snabbare stimulering kan uppnås genom att öka laserintensiteten på 458 nm. Men när man använder högre laserintensiteter kan det spridda laserljuset stimulera området intill ROI, vilket inte är idealiskt om en rumsligt begränsad stimulering krävs.
    3. Ställ in en väntetid på 3 minuter efter stimulering för att säkerställa total inaktivering av myosin och demontering av apikalt F-aktin, och för att uppnå en statisk vävnadsmorfologi före laserablation. Detta uppnås genom att klicka på Vänta /Paus under 'Sekvenshanterare' och ställa in önskad tid för 'Vänta'.
      OBS: Rekrytering av CRY2-Rho1DN-mCherry till membranet orsakad av en enda stimuleringsomgång (0,3 % 458 nm laser i 12 s) är tydligt detekterbar 10-15 minuter efter stimuleringen. Detta är i linje med den publicerade dissociationshalvtid på ~9 min47.
    4. Ställ in exponeringsparametrar för den enda Z-plansförablationsfilmen, enligt beskrivningen i steg 3.5.4, förutom att både 1 040 nm och 920 nm lasrar används för bildtagning. Slå på CH1-CH4-detektorerna . Ställ in intensiteten för 1 040 nm-lasern och 920 nm-lasern till 3 % respektive 0.3 %. Spara den aktuella inställningen som nästa uppgift i pipelinen genom att klicka på LSM i "Sekvenshanteraren".
    5. Ställ in parametrar för laserablation, enligt beskrivningen i steg 3.5.5. Spara den aktuella inställningen som nästa uppgift i pipelinen genom att klicka på LSM i "Sekvenshanteraren".
    6. Ställ in insamlingsparametrar för den enskilda Z-plansfilmen efter ablation, enligt beskrivningen i steg 3.5.6. Spara den aktuella inställningen som nästa uppgift i pipelinen genom att klicka på LSM i "Sekvenshanteraren".
    7. Välj Sekvens under "Förvärva". Ändra sökvägen och filnamnet för att spara data efter behov. Klicka på Klar och vänta tills programvaran initierar pipelinen. Klicka sedan på Start för att köra pipelinen.

4. Kvantifiering av graden av vävnadsrekyl efter laserablation

  1. Öppna filmen efter ablation i ImageJ.
  2. Rita en liten ROI längs den ventrala mittlinjen som täcker det ablerade området med hjälp av rektangelmarkeringsverktyget . Bredden på ROI är nio pixlar. Höjden på ROI är inställd så att ROI är tillräckligt stor för att täcka hela spektrumet av vävnadsrekyl efter laserablation.
    1. Klicka på Duplicera under fliken "Bild". I popup-fönstret markerar du Duplicera stack och klickar sedan på OK för att duplicera stacken inom den valda ROI.
  3. Generera ett montage från den duplicerade stapeln via Image > Stacks > Make Montage. I popup-fönstret anger du radnumret till 1 och kolumnnumret till det totala antalet bildrutor i stapeln (100 i det här fallet).
  4. Mät A-P-bredden på det ablerade området över tid från det genererade montaget.
    1. Använd flerpunktsverktyget i ImageJ för att markera A-P-gränserna för det ablerade området för varje tidpunkt på montaget.
    2. Spara koordinaterna för de markerade punkterna med hjälp av File > Spara som > XY-koordinater.
    3. Importera de uppmätta XY-koordinaterna till MATLAB. Beräkna A-P-bredden för det ablerade området för varje tidpunkt genom att subtrahera Y-koordinaten för den övre gränsen från Y-koordinaten för den nedre gränsen.
  5. Bestäm hastigheten för vävnadsrekyl genom att passa in de första 20 sekunderna av kurvan "bredd över tid" i en linje med hjälp av "polyfit"-funktionen i MATLAB. Rapportera lutningen på den monterade linjen som vävnadsrekylhastigheten.
  6. Utför statistiska tester för att jämföra graden av vävnadsrekyl mellan de stimulerade och icke-stimulerade proverna.
    OBS: Det rekommenderas att inhämta data från minst fem embryon per tillstånd. Både det tvåsidiga Wilcoxon-rangsummatestet och det tvåsidiga student-t-testet kan användas för statistisk jämförelse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Hos de ostimulerade embryon som genomgick apikal sammandragning anrikades Sqh-mCherry vid den medioapikala regionen av de ventrala mesodermala cellerna, medan CRY2-Rho1DN-mCherry var cytosolisk (Figur 1A). Laserablation inom sammandragningsdomänen ledde till en snabb vävnadsrekyl längs AP-axeln (Figur 1B,C). I de stimulerade embryona blev CRY2-Rho1DN-mCherry-signalen plasmamembranlokaliserad, medan den medioapikala signalen från Sqh-mCherry helt försvann (Figur 1A). Laserablation i de stimulerade embryona resulterade inte i uppenbar vävnadsrekyl, vilket exemplifieras i figur 1B,C och kvantifieras i figur 1D. Dessa resultat indikerar att generering av vävnadsspänning kräver aktiv apikal aktomyosinkontraktilitet; När aktomyosin blir inaktivt vid Rho1-hämning minskar också den apikala vävnadsspänningen41. Dessa observationer överensstämmer med de tidigare fynden att aktivering av apikal myosinkontraktilitet i ventrala mesodermala celler resulterar i en ökning av vävnadsspänningen vid embryots ventrala yta40.

Figure 1
Figur 1: Opto-Rho1DN-stimulering under apikal sammandragning resulterar i en omedelbar förlust av kortikal spänning vid embryots ventrala yta . (A) Tecknad film som visar den experimentella uppställningen för laserablation för att detektera kortikal spänning. Gulskuggade områden anger de ablerade områdena. För stimulerade embryon utfördes ljusaktivering av Opto-Rho1DN 3 minuter före laserablationen. På grund av apikal avslappning efter stimulering ablerades flera z-plan (gulskuggat område) för att säkerställa ablationen av den mycket apikala ytan av de ventrala cellerna. (B,C) Jämförelse mellan ostimulerade och stimulerade embryon. Ingen uppenbar vävnadsrekyl observerades hos de stimulerade embryona (N = 6 för ostimulerade embryon och N = 5 för stimulerade embryon). B) En face view av de laserablerade embryona. Gulskuggade rutor markerar det ablerade området. C) Kymografer som representerar breddförändringen i det ablerade området. Gula prickade linjer anger ablationsstället. (D) Breddförändringar av det ablerade området längs A-P-axeln under de första 20 sekunderna efter laserablation. En tydlig vävnadsrekyl observerades efter laserskärning i de ostimulerade kontrollembryona. Däremot observerades liten eller ingen vävnadsrekyl i de stimulerade embryona, vilket tyder på en brist på apikal spänning efter Rho1-hämning. Felstapeln är standardavvikelsen. P-värdet beräknades med hjälp av ett dubbelsidigt Wilcoxon-rangsummatest. Denna siffra är återanvänd från Guo et al.41. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Detta protokoll beskrev den kombinerade användningen av optogenetik och laserablation för att undersöka förändringar i vävnadsspänning omedelbart efter inaktivering av aktomyosinkontraktilitet. Det optogenetiska verktyget som beskrivs här drar fördel av den dominanta negativa formen av Rho1 (Rho1DN) för att akut hämma endogent Rho1 och Rho1-beroende aktomyosinkontraktilitet. Tidigare karakterisering av Opto-Rho1DN i samband med bildning av Drosophila ventrala fåror visade att verktyget är mycket effektivt för att mediera den snabba inaktiveringen av apikal aktomyosinkontraktilitet genom samtidig myosininaktivering och aktindemontering41. I synnerhet resulterade stimuleringen av embryon vid tidpunkten för apikal sammandragning i en minskning av den apikala myosinsignalen inom 60 sekunder i celler som genomgick apikal sammandragning41. Detta snabba avlägsnande av kortikalt myosin vid Rho1-hämning beror sannolikt på den snabba cyklingen av Rho1 och myosin genom aktiva och inaktiva tillstånd, orsakade av aktiviteten hos GTPasaktiverande proteiner (GAPs) för Rho1 respektive myosinets lätta kedjefosfataser,19,54. I överensstämmelse med effekten på aktomyosin visade koppling av optogenetik med laserablation att opto-Rho1DN-stimulering under apikal sammandragning resulterade i en omedelbar förlust av epitelspänning i den ventrala regionen av embryot41 (Figur 1). Detta kombinerade tillvägagångssätt gjorde det möjligt för oss att undersöka funktionen av Rho1-medierad cellulär kontraktilitet för att reglera vävnadsmekanik med oöverträffad rumslig och tidsmässig precision, vilket gör det möjligt att dissekera omedelbara effekter från långsiktiga effekter som är svåra att uppnå med konventionella genetiska metoder.

En viktig teknisk faktor vid användning av Opto-Rho1DN är att verktyget är mycket känsligt för omgivande ljus. Ett vanligt problem i experimentet är rekryteringen av CRY2-mCherry-Rho1DN till plasmamembranet före stimuleringssteget, vilket vanligtvis orsakas av för tidig stimulering av provet under ett av följande steg: provberedning, provöverföring till mikroskoprummet, provpositionering på mikroskopsteget och bildtagning före stimulering. I vårt protokoll används flera procedurer för att förhindra oönskad stimulering, inklusive hantering av flugkoppar och embryon i ett mörkt rum under rött ljus, filtrering av blå våglängder från belysningsljuset vid val och montering av embryon under stereomikroskopet och undvikande av exponering av embryon för en 400-500 nm laser (single photon excitation) eller en 830-980 nm pulsad laser (multiphoton excitation) före stimulering. Det är viktigt att öva extra uppmärksamhet vid flera steg i experimentet för att förhindra oönskad stimulering av provet. Dessutom, när man använder Opto-Rho1DN för att hämma Rho1 inom ett specifikt intresseområde (ROI) i embryot41, rekommenderas att använda den lägsta laserintensiteten som kan uppnå en robust translokation av CRY2-Rho1DN till plasmamembranet. Eftersom Opto-Rho1DN är extremt känslig för blå våglängder kan en högintensiv blå laser resultera i oönskad stimulering i celler utanför ROI eller till och med närliggande embryon på grund av spritt ljus.

I sin nuvarande version har Opto-Rho1DN-verktyget flera begränsningar. För det första, för experimenten som beskrivs i detta protokoll, användes ett plasmamembranlokaliserat CIBN-ankare för att rekrytera aktiverat CRY2-Rho1DN från cytosolen till plasmamembranet41,47. Genom denna design är det svårt att utföra begränsad Rho1-hämning inom en specifik plasmamembrandomän på grund av diffusionen av aktiverade CRY2-Rho1DN-proteiner i cytosolen. Ytterligare förbättring av den rumsliga precisionen på subcellulär skala väntar på utvecklingen av nya CIBN-ankare som har mer specifika subcellulära lokaliseringsmönster. För det andra är Opto-Rho1DN utformad för att hämma Rho1 under tidig embryogenes. Uttrycket av CIBNpm och CRY2-Rho1DN-mCherry styrs av UASp, som är standardiserat för uttryck i kvinnliga könsceller 55. Uttrycket av dessa moduler i somatiska vävnader efter tidig embryogenes kan kräva att UASP ersätts med en promotor som är mer effektiv för att driva somatiskt uttryck (t.ex. UASt56). Slutligen är effektiviteten av Opto-Rho1DN beroende av överflödet av CIBN-ankaret och CRY2-Rho1DN-proteinerna. I den nuvarande versionen av verktyget bestäms det av GAL4-drivrutinslinjen som används för att driva uttrycket av de optogenetiska modulerna. Vid användning av moderns GAL4-drivrutin som beskrivs i detta protokoll är det viktigt att använda den linje som ger två kopior av GAL4-genen (t.ex. både 67 och 15) för att uppnå en snabb och potent hämning av aktomyosinkontraktilitet. En minskning av antalet kopior av maternell GAL4 hos F1-honorna från två till en minskade den hämmande effekten signifikant.

Jämfört med konventionella genetiska metoder är det optogenetiska tillvägagångssättet som beskrivs i detta protokoll fördelaktigt för att dissekera Rho1:s stadie- och vävnadsspecifika funktion i tidiga Drosophila-embryon. Rho1:s funktion i tidig embryogenes av Drosophila uppfylls till stor del av den maternellt laddade genprodukten11. Utarmning av Rho1 blockerar maternellt oogenesis57, vilket förhindrar studier av dess funktion under tidig embryogenes. Under de senaste åren har flera optogenetiska verktyg utvecklats för att reglera den egna Rho1-aktiviteten i Drosophila-embryon. Både Izquierdo et al. och Rich et al. utvecklade optogenetiska verktyg för att aktivera Rho1-aktivitet genom att reglera lokaliseringen av den katalytiska domänen av Rho GEFs i Drosophila-embryon 48,58. Dessutom har Herrera-Perez et al. utvecklat två optogenetiska verktyg som använder antingen fullängds RhoGEF2 (optoGEF) eller fullängds C-GAP (optoGAP) för att aktivera respektive hämma endogen Rho1-aktivitet59. Eftersom optoGAP fungerar genom att rekrytera en Rho1 GAP till plasmamembranet, kan dess tillämpning vara känslig för närvaron av endogena Rho1 GEF, vilket kan kompensera eller till och med åsidosätta effekten av ektopisk rekrytering av GAP. Däremot, genom att direkt binda Rho1 GEF, kan Opto-Rho1DN ge ett mer robust sätt att hämma endogent Rho1 och Rho1-beroende aktomyosinkontraktilitet.

Med tanke på det breda utbudet av funktioner hos Rho1 i embryogenes och postembryonal utveckling, kan det presenterade protokollet enkelt anpassas för att studera funktionen av Rho1 och Rho1-beroende cellulära omorganisationer i ett brett spektrum av morfogenetiska processer. Dessutom kan en liknande strategi i princip användas för att kraftigt begränsa andra små GTPaser, såsom Rho-familjen GTPaser Cdc42 och Rac, eftersom deras dominerande negativa former i stor utsträckning har använts för att hämma den endogena funktionen hos dessa proteiner11. Slutligen, som exemplifieras i detta protokoll, kan en kombination av optogenetik och laserablationsmetoder ge ett effektivt sätt att undersöka den omedelbara effekten av inaktiveringen av ett specifikt protein på vävnadsdynamik och vävnadsmekanik, vilket kommer att ge oss nya insikter om vävnadsmorfogenes som är svåra att avslöja med konventionella genetiska metoder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar att forskningen genomfördes i avsaknad av kommersiella eller finansiella relationer som skulle kunna tolkas som en potentiell intressekonflikt.

Acknowledgments

Författarna tackar Ann Lavanway för stöd för bildbehandling. Författarna tackar Wieschaus-laboratoriet och De Renzis-laboratoriet för att de delar reagenser och Bloomington Drosophila Stock Center för flugbestånd. Denna studie stöds av NIGMS ESI-MIRA R35GM128745 och American Cancer Society Institutional Research Grant #IRG-82-003-33 till BH.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
35 mm glass-bottom dish MatTek P35G-1.5-10-C Used for sample preparation
60 mm × 15 mm Petri dish with lid Falcon 351007 Used for sample preparation
Black cloth for covering the microscope Online NA Used to avoid unwanted light stimulation
Clorox Ultra Germicadal Bleach (8.25% sodium hypochlorite) VWR 10028-048 Used for embryo dechorination
CO2 pad Genesee Scientific 59-114 Used for cross set-up
ddH2O NA NA Used for sample preparation
Dumont Style 5 tweezers VWR 102091-654 Used for sample preparation
Eyelash tool (made from pure red sable round brush #2) VWR 22940-834 Used for sample preparation
FluoView (Software) Olympus NA Used for image acquisition and optogenetic stimulation
Halocarbon oil 27 Sigma Aldrich H8773-100ML Used for embryo stage visualization
ImageJ/FIJI NIH NA Used for image analysis
MATLAB MathWorks NA Used for image analysis
Nikon SMZ-745 stereoscope Nikon NA Used for sample preparation
Olympus FVMPE-RS multiphoton microscope with InSight DS Dual-line Ultrafast Lasers for simultaneous dual-wavelength multiphoton imaging, , a 25x/NA1.05 water immersion objective (XLPLN25XWMP2), and an IR/VIS stimulation unit for photo-activation/stimulation. This system is also equipped with a TRITC filter (39005-BX3; AT-TRICT-REDSHFT 540/25x, 565BS, 620/60M), and a fluorescence illumination unit that emits white light. Olympus NA Used for image acquisition and optogenetic stimulation
SP Bel-Art 100-place polypropylene freezer storage box (Black, light-proof box for sample transfer) VWR 30621-392 Used to avoid unwanted light stimulation
UV Filter Shield for FM1403 Fluores (Orange-red plastic shield) Bolioptics FM14036151 Used to avoid unwanted light stimulation
VITCHELO V800 Headlamp with White and Red LED Lights Amazon NA Used to avoid unwanted light stimulation

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vicente-Manzanares, M., Ma, X., Adelstein, R. S., Horwitz, A. R. Non-muscle myosin II takes centre stage in cell adhesion and migration. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 10 (11), 778-790 (2009).
  2. Munjal, A., Lecuit, T. Actomyosin networks and tissue morphogenesis. Development. 141 (9), 1789-1793 (2014).
  3. Sawyer, J. M., et al. Apical constriction: a cell shape change that can drive morphogenesis. Developmental Biology. 341 (1), 5-19 (2010).
  4. Nishimura, T., Honda, H., Takeichi, M. Planar cell polarity links axes of spatial dynamics in neural-tube closure. Cell. 149 (5), 1084-1097 (2012).
  5. Marinari, E., et al. Live-cell delamination counterbalances epithelial growth to limit tissue overcrowding. Nature. 484 (7395), 542-545 (2012).
  6. Slattum, G. M., Rosenblatt, J. Tumour cell invasion: an emerging role for basal epithelial cell extrusion. Nature Reviews. Cancer. 14 (7), 495-501 (2014).
  7. Antunes, M., Pereira, T., Cordeiro, J. V., Almeida, L., Jacinto, A. Coordinated waves of actomyosin flow and apical cell constriction immediately after wounding. The Journal of Cell Biology. 202 (2), 365-379 (2013).
  8. Yang, S., et al. The central role of the tail in switching off 10S myosin II activity. The Journal of General Physiology. 151 (9), 1081-1093 (2019).
  9. Yang, S., et al. Cryo-EM structure of the inhibited (10S) form of myosin II. Nature. 588 (7838), 521-525 (2020).
  10. Narumiya, S., Thumkeo, D. Rho signaling research: history, current status and future directions. FEBS Letters. 592 (11), 1763-1776 (2018).
  11. Johndrow, J. E., Magie, C. R., Parkhurst, S. M. Rho GTPase function in flies: insights from a developmental and organismal perspective. Biochemistry and Cell Biology. 82 (6), 643-657 (2004).
  12. Etienne-Manneville, S., Hall, A. Rho GTPases in cell biology. Nature. 420 (6916), 629-635 (2002).
  13. Hodge, R. G., Ridley, A. J. Regulating Rho GTPases and their regulators. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 17 (8), 496-510 (2016).
  14. Martin, A. C., Goldstein, B. Apical constriction: themes and variations on a cellular mechanism driving morphogenesis. Development. 141 (10), 1987-1998 (2014).
  15. Amano, M., Nakayama, M., Kaibuchi, K. Rho-kinase/ROCK: A key regulator of the cytoskeleton and cell polarity. Cytoskeleton. 67 (9), 545-554 (2010).
  16. Kimura, K., et al. Regulation of myosin phosphatase by Rho and Rho-associated kinase (Rho-kinase). Science. 273 (5272), 245-248 (1996).
  17. Maekawa, M., et al. Signaling from Rho to the actin cytoskeleton through protein kinases ROCK and LIM-kinase. Science. 285 (5429), 895-898 (1999).
  18. Ohashi, K., et al. Rho-associated kinase ROCK activates LIM-kinase 1 by phosphorylation at threonine 508 within the activation loop. The Journal of Biological Chemistry. 275 (5), 3577-3582 (2000).
  19. Coravos, J. S., Martin, A. C. Apical sarcomere-like actomyosin contracts nonmuscle drosophila epithelial cells. Developmental Cell. 39 (3), 346-358 (2016).
  20. Homem, C. C. F., Peifer, M. Diaphanous regulates myosin and adherens junctions to control cell contractility and protrusive behavior during morphogenesis. Development. 135 (6), 1005-1018 (2008).
  21. Goode, B. L., Eck, M. J. Mechanism and function of formins in the control of actin assembly. Annual Review of Biochemistry. 76, 593-627 (2007).
  22. Sweeton, D., Parks, S., Costa, M., Wieschaus, E. Gastrulation in Drosophila: the formation of the ventral furrow and posterior midgut invaginations. Development. 112 (3), 775-789 (1991).
  23. Leptin, M., Grunewald, B. Cell shape changes during gastrulation in Drosophila. Development. 110 (1), 73-84 (1990).
  24. Leptin, M. Gastrulation in Drosophila: the logic and the cellular mechanisms. The EMBO Journal. 18 (12), 3187-3192 (1999).
  25. Martin, A. C. The physical mechanisms of Drosophila gastrulation: mesoderm and endoderm invagination. Genetics. 214 (3), 543-560 (2020).
  26. Gilmour, D., Rembold, M., Leptin, M. From morphogen to morphogenesis and back. Nature. 541 (7637), 311-320 (2017).
  27. Gheisari, E., Aakhte, M., Müller, H. -A. J. Gastrulation in Drosophila melanogaster: Genetic control, cellular basis and biomechanics. Mechanisms of Development. 163, 103629 (2020).
  28. Leptin, M. Twist and snail as positive and negative regulators during Drosophila mesoderm development. Genes & Development. 5 (9), 1568-1576 (1991).
  29. Costa, M., Wilson, E. T., Wieschaus, E. A putative cell signal encoded by the folded gastrulation gene coordinates cell shape changes during Drosophila gastrulation. Cell. 76 (6), 1075-1089 (1994).
  30. Kerridge, S., et al. Modular activation of Rho1 by GPCR signalling imparts polarized myosin II activation during morphogenesis. Nature Cell Biology. 18 (3), 261-270 (2016).
  31. Kölsch, V., Seher, T., Fernandez-Ballester, G. J., Serrano, L., Leptin, M. Control of Drosophila gastrulation by apical localization of adherens junctions and RhoGEF2. Science. 315 (5810), 384-386 (2007).
  32. Manning, A. J., Peters, K. A., Peifer, M., Rogers, S. L. Regulation of epithelial morphogenesis by the G protein-coupled receptor mist and its ligand fog. Science Signaling. 6 (301), (2013).
  33. Parks, S., Wieschaus, E. The Drosophila gastrulation gene concertina encodes a G alpha-like protein. Cell. 64 (2), 447-458 (1991).
  34. Barrett, K., Leptin, M., Settleman, J. The Rho GTPase and a putative RhoGEF mediate a signaling pathway for the cell shape changes in Drosophila gastrulation. Cell. 91 (7), 905-915 (1997).
  35. Dawes-Hoang, R. E., et al. Folded gastrulation, cell shape change and the control of myosin localization. Development. 132 (18), 4165-4178 (2005).
  36. Häcker, U., Perrimon, N. DRhoGEF2 encodes a member of the Dbl family of oncogenes and controls cell shape changes during gastrulation in Drosophila. Genes & Development. 12 (2), 274-284 (1998).
  37. Martin, A. C., Kaschube, M., Wieschaus, E. F. Pulsed contractions of an actin-myosin network drive apical constriction. Nature. 457 (7228), 495-499 (2009).
  38. Mason, F. M., Tworoger, M., Martin, A. C. Apical domain polarization localizes actin-myosin activity to drive ratchet-like apical constriction. Nature Cell Biology. 15 (8), 926-936 (2013).
  39. Nikolaidou, K. K., Barrett, K. A Rho GTPase signaling pathway is used reiteratively in epithelial folding and potentially selects the outcome of Rho activation. Current Biology. 14 (20), 1822-1826 (2004).
  40. Martin, A. C., Gelbart, M., Fernandez-Gonzalez, R., Kaschube, M., Wieschaus, E. F. Integration of contractile forces during tissue invagination. The Journal of Cell Biology. 188 (5), 735-749 (2010).
  41. Guo, H., Swan, M., He, B. Optogenetic inhibition of actomyosin reveals mechanical bistability of the mesoderm epithelium during Drosophila mesoderm invagination. eLife. 11, e69082 (2022).
  42. Sebti, S. M., Der, C. J. Searching for the elusive targets of farnesyltransferase inhibitors. Nature Reviews. Cancer. 3 (12), 945-951 (2003).
  43. Roberts, P. J., et al. Rho family GTPase modification and dependence on CAAX motif-signaled posttranslational modification. The Journal of Biological Chemistry. 283 (37), 25150-25163 (2008).
  44. Feig, L. A., Cooper, G. M. Inhibition of NIH 3T3 cell proliferation by a mutant ras protein with preferential affinity for GDP. Molecular and Cellular Biology. 8 (8), 3235-3243 (1988).
  45. Liu, H., et al. Photoexcited CRY2 interacts with CIB1 to regulate transcription and floral initiation in Arabidopsis. Science. 322 (5907), 1535-1539 (2008).
  46. Kennedy, M. J., et al. Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in living cells. Nature Methods. 7 (12), 973-975 (2010).
  47. Guglielmi, G., Barry, J. D., Huber, W., De Renzis, S. An optogenetic method to modulate cell contractility during tissue morphogenesis. Developmental Cell. 35 (5), 646-660 (2015).
  48. Izquierdo, E., Quinkler, T., De Renzis, S. Guided morphogenesis through optogenetic activation of Rho signalling during early Drosophila embryogenesis. Nature Communications. 9 (1), 2366 (2018).
  49. Hutson, M. S., et al. Forces for morphogenesis investigated with laser microsurgery and quantitative modeling. Science. 300 (5616), 145-149 (2003).
  50. Rauzi, M., Lenne, P. -F. Probing cell mechanics with subcellular laser dissection of actomyosin networks in the early developing Drosophila embryo. Methods in Molecular Biology. 1189, 209-218 (2015).
  51. Rauzi, M., Verant, P., Lecuit, T., Lenne, P. -F. Nature and anisotropy of cortical forces orienting Drosophila tissue morphogenesis. Nature Cell Biology. 10 (12), 1401-1410 (2008).
  52. Hunter, C., Wieschaus, E. Regulated expression of nullo is required for the formation of distinct apical and basal adherens junctions in the Drosophila blastoderm. The Journal of Cell Biology. 150 (2), 391-401 (2000).
  53. Oda, H., Tsukita, S. Real-time imaging of cell-cell adherens junctions reveals that Drosophila mesoderm invagination begins with two phases of apical constriction of cells. Journal of Cell Science. 114, 493-501 (2001).
  54. Munjal, A., Philippe, J. -M., Munro, E., Lecuit, T. A self-organized biomechanical network drives shape changes during tissue morphogenesis. Nature. 524 (7565), 351-355 (2015).
  55. Rørth, P. Gal4 in the Drosophila female germline. Mechanisms of Development. 78 (1-2), 113-118 (1998).
  56. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  57. Magie, C. R., Meyer, M. R., Gorsuch, M. S., Parkhurst, S. M. Mutations in the Rho1 small GTPase disrupt morphogenesis and segmentation during early Drosophila development. Development. 126 (23), 5353-5364 (1999).
  58. Rich, A., Fehon, R. G., Glotzer, M. Rho1 activation recapitulates early gastrulation events in the ventral, but not dorsal, epithelium of Drosophila embryos. eLife. 9, e56893 (2020).
  59. Herrera-Perez, R. M., Cupo, C., Allan, C., Lin, A., Kasza, K. E. Using optogenetics to link myosin patterns to contractile cell behaviors during convergent extension. Biophysical Journal. 120 (19), 4214-4229 (2021).

Tags

Developmental Biology optogenetik vävnadsmekanik Rho1 aktomyosin laserablation apikal sammandragning gastrulation
Optogenetisk hämning av rho1-medierad aktomyosinkontraktilitet i kombination med mätning av epitelspänning i <em>Drosophila-embryon</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Guo, H., Swan, M., He, B.… More

Guo, H., Swan, M., He, B. Optogenetic Inhibition of Rho1-Mediated Actomyosin Contractility Coupled with Measurement of Epithelial Tension in Drosophila Embryos. J. Vis. Exp. (194), e65314, doi:10.3791/65314 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter