Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Drosophila Embriyolarında Epitelyal Gerginliğin Ölçümü ile Birlikte Rho1 Aracılı Aktomiyosin Kontraktilitesinin Optogenetik İnhibisyonu

Published: April 14, 2023 doi: 10.3791/65314
Automatic Translation
1,2, 3, 1
1Department of Biological Sciences, Dartmouth College, 2School of Life Sciences, Westlake University, 3Department of Molecular Biology, Princeton University

Summary

Aktomiyosin kontraktilitesi hücre ve doku morfogenezinde önemli bir rol oynar. Bununla birlikte, aktomiyosin kontraktilitesini in vivo akut olarak manipüle etmek zordur. Bu protokol, Drosophila embriyolarında Rho1 aracılı aktomiyosin kontraktilitesini hızla inhibe eden ve aktomiyozinin in vivo inaktivasyonundan sonra epitel gerginliğinin ani kaybını ortaya çıkaran bir optogenetik sistemi tanımlar.

Abstract

Aktin ve kas dışı miyozin II ("aktomiyosin kontraktilitesi") tarafından üretilen kasılma kuvvetleri, hücre bölünmesi, hücre göçü, epitelyal katlanma ve dallanma morfogenezi gibi çoklu uzunluk ölçeklerinde hücrelerin ve dokuların morfolojik değişiklikleri için kritik öneme sahiptir. Aktomiyosin kontraktilitesinin morfogenezdeki rolünün derinlemesine anlaşılması, geleneksel genetik veya farmakolojik yaklaşımlar kullanılarak elde edilmesi zor olan aktomiyosinin hızlı inaktivasyonuna izin veren yaklaşımlar gerektirir. Sunulan protokol, hassas zamansal ve uzamsal kontrollerle Drosophila embriyolarında aktomiyosin kontraktilitesini inhibe etmek için CRY2-CIBN tabanlı bir optogenetik dimerizasyon sistemi olan Opto-Rho1DN'nin kullanımını göstermektedir. Bu sistemde, CRY2, baskın negatif Rho1 formuna (Rho1DN) kaynaştırılırken, CIBN plazma zarına bağlanır. CRY2 ve CIBN'nin mavi ışık aracılı dimerizasyonu, Rho1DN'nin sitoplazmadan plazma membranına hızlı bir şekilde translokasyonuna neden olur ve burada endojen Rho1'i inhibe ederek aktomiyosini inaktive eder. Ek olarak, bu makale, Drosophila ventral karık oluşumu sırasında aktomiyosinin epitelyal gerginlik oluşturmadaki rolünü araştırmak için Opto-Rho1DN aracılı aktomiyosin inaktivasyonunu lazer ablasyonu ile birleştirmek için ayrıntılı bir protokol sunmaktadır. Bu protokol, Drosophila embriyolarında aktomiyozin kontraktilitesini içeren diğer birçok morfolojik sürece minimal modifikasyonlarla uygulanabilir. Genel olarak, bu optogenetik araç, dinamik doku yeniden şekillenmesi sırasında doku mekaniğini kontrol etmede aktomiyosin kontraktilitesinin işlevini incelemek için güçlü bir yaklaşımdır.

Introduction

Kassız miyozin II'nin (bundan böyle 'miyozin' olarak anılacaktır) F-aktin ağına uyguladığı kasılma kuvveti olan aktomiyosin kontraktilitesi, hücre şeklini değiştirmede ve doku düzeyinde morfogeneziyönlendirmede en önemli kuvvetlerden biridir 1,2. Örneğin, epitel hücrelerinin apikal alanında aktomiyosin kontraktilitesinin aktivasyonu, epitel katlanması, hücre ekstrüzyonu, delaminasyon ve yara iyileşmesi dahil olmak üzere çeşitli morfogenetik süreçleri kolaylaştıran apikal daralma ile sonuçlanır 3,4,5,6,7 . Miyozinin aktivasyonu, düzenleyici hafif zincirinin fosforilasyonunu gerektirir. Bu modifikasyon, miyozin moleküllerinin inhibitör konformasyonunu hafifleterek, her iki uçta birden fazla baş alanına sahip bipolar miyozin filament demetleri oluşturmalarına izin verir. Bipolar miyozin filamentleri, aktin filamentlerinin anti-paralel hareketini yönlendirir ve kasılma kuvveti 1,8,9 oluşumuna neden olur.

Evrimsel olarak korunmuş Rho ailesi küçük GTPase RhoA (Drosophila'da Rho1), çeşitli hücresel bağlamlarda aktomiyosin kontraktilitesinin aktivasyonunda merkezi bir rol oynar10,11. Rho1, GTP'yi (aktif form) veya GDP'yi (aktif olmayan form) bağlayarak bimoleküler bir anahtar olarak işlev görür12. GTP'ye veya GDP'ye bağlı Rho1 arasındaki döngü, GTPaz aktive edici proteinleri (GAP'ler) ve guanin nükleotid değişim faktörleri (GEF'ler) tarafından düzenlenir13. GEF'ler, GSYİH'nın GTP ile değişimini kolaylaştırma ve böylece Rho1 aktivitesini etkinleştirme işlevi görür. Öte yandan GAP'ler, Rho1'in GTPase aktivitesini arttırır ve böylece Rho1'i devre dışı bırakır. Aktive edilmiş Rho1, aşağı akış efektörleri, Rho ile ilişkili kinaz (Rok) ve Diaphanous14 ile etkileşime girerek ve aktive ederek aktomiyosin kasılmasını teşvik eder. Rok, miyozin15'in düzenleyici hafif zincirini fosforile ederek miyozin aktivasyonunu ve aktomiyosin kasılmasını indükler. Ek olarak, Rok ayrıca miyozin düzenleyici hafif zincir fosfatazı inhibe eder ve dolayısıyla miyozin filament düzeneğini daha da teşvikeder 16. Rok ayrıca, aktive edildiğinde, aktin-depolimerizasyon faktörü kofilin17,18'i fosforile ederek ve inhibe ederek aktinin parçalanmasını önleyen LIM kinazları fosforile edebilir. Diaphanous, aktin polimerizasyonunu destekleyen ve miyozinin 19,20,21 ile etkileşime girmesi için bir temel sağlayan bir formin ailesi aktin nükleatörüdür.

Aktomiyosin kontraktilitesini aktive eden hücresel mekanizmalar iyi aydınlatılmış olsa da, dinamik doku yeniden şekillenmesini düzenlemedeki işlevine ilişkin anlayışımız eksik kalmaktadır. Bu bilgi boşluğunu doldurmak, in vivo olarak belirli doku bölgelerinde aktomiyosini hızla etkisiz hale getirebilen ve doku davranışı ve özellikleri üzerindeki ani etkiyi kaydedebilen yaklaşımlar gerektirir. Bu protokol, Drosophila mezoderm invaginasyonu sırasında aktomiyosin kontraktilitesini akut olarak inhibe etmek için optogenetik bir yaklaşımın kullanımını ve ardından lazer ablasyonu kullanılarak epitel gerginliğinin ölçülmesini açıklar. Drosophila gastrulasyonu sırasında, ventral lokalize mezoderm öncü hücreleri apikal daralmaya uğrar ve ön-arka yönelimli bir karık oluşturarak embriyonun yüzeyinden invaze olur22,23. Ventral olukların oluşumu uzun zamandır epitelyal katlanma mekanizmasını incelemek için bir model olarak kullanılmaktadır. Ventral karık oluşumu, Drosophila24,25,26,27'de dorsal-ventral modelleme sistemi ile uygulanır. Embriyonun ventral tarafında bulunan iki transkripsiyon faktörünün, Twist ve Salyangoz'un ekspresyonu, ventral karık oluşumunu kontrol eder ve mezodermal hücre kaderini belirler28. Twist ve Salyangoz, bir G-proteinine bağlı reseptör yolu ve bir RhoGEF2 adaptör proteini, T48 29,30,31,32,33 yoluyla mezoderm öncü hücrelerinin tepesine Rho1 GEF RhoGEF2'nin alımını aktive eder. Daha sonra, RhoGEF2, Rho-Rho kinaz yolu 34,35,36,37,38,39 yoluyla potansiyel mezodermin apikal yüzeyi boyunca miyozini aktive eder. Aktive miyozin, mezoderm primordiumun apikal yüzeyi boyunca bir supraselüler aktomiyosin ağı oluşturur, kasılmaları apikal daralmaya neden olur ve apikal doku gerginliğinde hızlı bir artışa neden olur 14,37,40.

Bu protokolde tarif edilen optogenetik araç, Opto-Rho1DN, baskın bir negatif Rho1 (Rho1DN) 41 formunun mavi ışığa bağlı plazma membranı alımı yoluyla aktomiyozin kontraktilitesini inhibe eder. Rho1DN'deki bir T19N mutasyonu, mutant proteinin GDP'yi GTP ile değiştirme yeteneğini ortadan kaldırır ve böylece proteini sürekli olarak inaktif hale getirir34. Rho1DN'deki müteakip bir mutasyon olan C189Y, saf membran hedefleme sinyalini42,43 ortadan kaldırır. Rho1DN plazma membranına infüze edildiğinde, Rho1 GEF'lere bağlanır ve onu tutar, böylece Rho1'in aktivasyonunun yanı sıra miyozin ve aktinin Rho1 aracılı aktivasyonunu bloke eder34,44. Rho1DN'nin plazma membranı alımı, Cryptochrome 2 ve onun bağlanma ortağı CIB1'den türetilen ışığa bağlı bir dimerizasyon modülü aracılığıyla sağlanır. Cryptochrome 2, Arabidopsis thaliana45'te mavi ışıkla aktive olan bir Cryptochrome fotoreseptörüdür. Kriptokrom 2, temel bir sarmal-döngü-sarmal proteini olan CIB1'e yalnızca foto-uyarılmış durumundabağlanır 45. Daha sonra, Kriptokrom 2'den (CRY2 PHR, bundan sonra CRY2 olarak anılacaktır) ve CIB1'in (bundan sonra CIBN olarak anılacaktır) N-terminal alanından (aa 1-170) korunmuş N-terminali, fotoliyaz homoloji bölgesinin (PHR) ışık kaynaklı dimerizasyon için önemli olduğu bulunmuştur46. Opto-Rho1DN iki bileşen içerir. İlk bileşen, proteini plazma zarına47 lokalize eden bir CAAX çapası ile kaynaşmış CIBN proteinidir. İkinci bileşen, Rho1DN41 ile kaynaşmış mCherry etiketli CRY2'dir. Mavi ışığın yokluğunda, CRY2-Rho1DN sitoplazmada kalır. Mavi ışık stimülasyonu üzerine, CRY2-Rho1DN, membrana bağlı CIBN ve uyarılmış CRY2 arasındaki etkileşim yoluyla plazma membranına hedeflenir. Opto-Rho1DN, ultraviyole A (UVA) ışığı ve mavi ışık (400-500 nm, 450-488 nm'de tepe aktivasyonu) veya iki foton stimülasyonu41,46,47,48 gerçekleştirirken 830-980 nm darbeli lazer ile aktive edilebilir. Bu nedenle, Opto-Rho1DN, normalde heyecan verici GFP için kullanılan dalga boyları tarafından uyarılır (tek foton görüntüleme için 488 nm ve iki foton görüntüleme için 920 nm). Buna karşılık, heyecan verici mCherry için yaygın olarak kullanılan dalga boyları (tek foton görüntüleme için 561 nm ve iki foton görüntüleme için 1.040 nm) optogenetik modülü uyarmaz ve bu nedenle ön stimülasyon görüntüleme için kullanılabilir. Protokol, numune manipülasyonu sırasında istenmeyen stimülasyon riskini en aza indirmek için kullanılan yaklaşımları açıklar.

Lazer ablasyon, hücrelerdeki ve dokulardaki gerilimi tespit etmek ve ölçmek için yaygın olarak kullanılmaktadır49. Önceki çalışmalar, lazer yoğunluğu uygun şekilde kontrol edildiğinde, femtosaniye yakın kızılötesi lazer kullanan iki fotonlu lazer ablasyonunun, plazma membranı yırtılmasına neden olmadan bazı hücre altı yapıları (örneğin, kortikal aktomiyosin ağları) fiziksel olarak bozabileceğini göstermiştir50,51. Doku gergin ise, doku içindeki ilgilenilen bir bölgenin lazerle ablasyonu, ablasyon bölgesine bitişik hücrelerin hemen dışa doğru geri tepmesine neden olur. Geri tepme hızı, gerilimin büyüklüğünün ve geri tepmeye maruz kalan yapıları çevreleyen ortamın (sitoplazma) viskozitesinin bir fonksiyonudur49. Yakın kızılötesi lazerlerin üstün penetrasyon derinliği ve iyi sınırlandırılmış fokal ablasyon elde etme yeteneği nedeniyle, iki fotonlu lazer ablasyonu, in vivo doku gerginliğini tespit etmek için özellikle yararlıdır. Bu protokolde gösterildiği gibi, bu yöntem, dinamik doku yeniden şekillenmesi sırasında Rho1'e bağımlı hücresel kontraktilitenin doku mekaniği üzerindeki doğrudan etkisini araştırmak için aktomiyosin kontraktilitesinin Opto-Rho1DN aracılı inaktivasyonu ile kolayca birleştirilebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Genetik çaprazlamanın ayarlanması ve yumurta toplama kabının hazırlanması

  1. Optogenetik hat UASp-CIBNpm (I) 'den dişi sinekleri (bakire) seçin; UASp-CRY2-Rho1DN-mCherry (III) bir stereomikroskop altında bir CO2 pedi üzerinde ve maternal GAL4 sürücü hattı 67 Sqh-mCherry'den erkek sineklerle bir çaprazlama kurdu; 15 E-kaderin-GFP.
    NOT: 67 ve 15, sırasıyla ikinci (II) ve üçüncü (III) kromozomlara yerleştirilen maternal-Tubulin-GAL4'ü temsil eder52. Bu protokolde kullanılan GAL4 hattı ayrıca mCherry etiketli miyozin düzenleyici hafif zincir Sqh (Spagetti kabağı)37 ve GFP etiketli E-cadherin53'ü ifade eder. Optogenetik çizgiden gelen sinekler hala FM7 ve TM6 dengeleyici kromozomları içerebilir. Maternal GAL4 sürücü hattından gelen sinekler hala CyO ve TM3 dengeleyici kromozomlarını içerebilir.
  2. ~10 gün sonra, aşağıdaki genotipe sahip F1 dişi sineklerini seçin: UASp-CIBNpm/+; 67 Metrekare-mKiraz/+; 15 E-cadherin-GFP/UASp-CRY2-Rho1DN-mKiraz. Erkek sineklerle bir yumurta toplama kabı kurun.
    1. Doğru genotipe sahip dişi sineklerin herhangi bir dengeleyici kromozom içermediğinden emin olun (yani, kıvırcık kanatlar [Cy], kısa kıllar [Sb], çubuk veya böbrek şeklindeki gözler [B] veya ekstra humerus kılları [Hu]), sırasıyla stokların oluşturulmasında kullanılan CyO, TM3, FM7 ve TM6 dengeleyicileri için belirteçlerdir. Bardağı, yüzeyinde bir miktar taze maya ezmesi bulunan bir elma suyu tabağı ile örtün.
      NOT: F1 dişilerinde, optogenetik bileşenler maternal olarak eksprese edilir. Bu nedenle, bardağı kurmak için kullanılan F1 dişilerinin bakire olmasına gerek yoktur. Kolaylık sağlamak için fincan için aynı F1 popülasyonundan erkek sineklerin kullanılması tavsiye edilir.
  3. Ortamdan olası bir ışık sızıntısını önlemek için bardağı alüminyum folyo ile kaplı bir karton kutuda saklayın. Oda sıcaklığında (~21-23 °C) tutulan bardaklar için elma suyu tabağını her gün veya 18 °C'de tutulan bardaklar için iki günde bir değiştirin.
    1. Tabak değişiminden hemen önce, sinekleri bardağın dibinde tutmak ve kaçmalarını önlemek için bardağı düz bir yüzeye (örn. tezgah üstü) vurun. Elma suyu tabağını karanlık bir odada değiştirin ve aydınlatma için kırmızı ışıklı bir far kullanın (Malzeme Tablosuna bakın).
      NOT: Maternal-Tubulin-GAL4 ve UASp'nin kontrolü altındaki yapıların ekspresyonunu arttırmak için embriyo toplanmadan önce kabın en az 3 gün 18 °C'de tutulması önerilir. Bu kuluçka süresi aynı zamanda sineklerin bardağa uyum sağlamasına ve optimum yumurta üretimini elde etmek için maya ezmesi üzerinde iyi beslenmesine izin verir.

2. İstenilen aşamada embriyoların toplanması ve optogenetik stimülasyona hazırlanması

NOT: Tüm numune toplama ve hazırlama adımlarının karanlık bir odada, aydınlatma için "güvenli ışık" (örn. kırmızı ışık) kullanılarak gerçekleştirilmesi gerekir. Optogenetik bileşenler ortam ışığına karşı son derece hassastır. Ortam ışığına en ufak bir maruz kalma bile numunenin erken uyarılmasına yol açar. Tipik olarak, yeşil-kırmızı aralığındaki (>532 nm) ışıklar istenmeyen uyarılara neden olmaz.

  1. Erken embriyogenezde embriyo toplamak için, embriyo toplamadan 8 ila 16 saat önce (18 ° C'de) bardağa yeni bir elma suyu tabağı yerleştirin.
  2. Embriyo toplama sırasında elma suyu tabağını değiştirin. Bardaktan çıkarılan plakayı etiketleyin ve plakanın yüzeyini ince bir tabaka Halokarbon yağı 27 ile kaplayın (bkz. Yumurta kabuğunun şeffaflaşması için 30-60 s bekleyin.
  3. Dik bir stereoskop üzerine turuncu-kırmızı plastik bir kalkan yerleştirin (Malzeme Tablosuna bakın). Turuncu-kırmızı kalkanın yerleştirilmesi, iletilen ışıktan mavi-yeşil dalga boylarını bloke ederek numune aydınlatması sırasında istenmeyen uyarımı önler.
    NOT: Bu protokolde embriyo toplama işlemi için dik stereoskop kullanılmaktadır (bkz.
  4. Elma suyu tabağını turuncu-kırmızı kalkanın üzerine yerleştirin. Numuneyi aydınlatmak için stereomikroskobun iletilen ışığını açın. Bir cımbız kullanarak elma suyu tabağından uygun aşamada 5-15 embriyo toplayın. Embriyoları cımbızla sıkmayın.
    NOT: Bu protokolde uygun embriyo erken-orta hücreselleşme aşamasında olmalıdır. Bu aşamadaki embriyo, oluşturan blastoderm hücrelerini içeren berrak, düzgün bir periplazma tabakası ile çevrili koyu opak bir yumurta sarısına sahip olmalıdır. Embriyonun yüzeyine paralel sürekli bir çizgi olarak görünen bölünme oluklarının ön kenarı ("hücreselleşme cephesi"), periplazmanın derinliğinin yarısını geçmemelidir.
  5. Cımbız kullanarak embriyolardaki fazla yağı çıkarmak için embriyoları bir parça kağıt havlu (~ 1,5 cm × 1,5 cm) üzerinde nazikçe kurulayın.
  6. Plastik bir transfer pipeti kullanarak yeni bir küçük kare kağıt havlu parçasına (~1,5 cm × 1,5 cm) birkaç damla taze hazırlanmış %40 çamaşır suyu (~%3 sodyum hipoklorit; Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin, böylece kağıt havlu ince bir çamaşır suyu tabakası ile kaplanır. Cımbız kullanarak embriyoyu kuru kağıt havludan ağartıcıya batırılmış kağıt havluya aktarın ve embriyoların çamaşır suyuna batırıldığından emin olun. Embriyonun dekoryonlaşması için 2-4 dakika bekleyin.
  7. Dekoryonasyondan sonra, fazla ağartıcıyı çıkarmak için kare kağıt havluyu büyük bir kağıt mendil üzerine sürmek için cımbız kullanın. Embriyoların bulunduğu tarafın yukarı baktığından emin olun.
  8. Embriyoları durulamak için, kare kağıt havluyu bir damla deiyonize suya hafifçe batırmak için cımbız kullanın ve büyük bir kağıt mendil parçasına hızlıca kurulayın. Herhangi bir kalıntı ağartıcının çıkarılmasını sağlamak için bu işlemi sekiz kez tekrarlayın.
  9. Embriyoyu kağıt havludan 35 mm'lik cam tabanlı bir tabağa aktarmak için bir kirpik aleti kullanın (bkz. Embriyoları tamamen kaplayacak şekilde yemeğe deiyonize su ekleyin. Kirpik aletini kullanarak embriyoların konumuna ve yönüne ince ayar yapın.
    NOT: Dekoryonasyondan sonra, embriyo camın yüzeyine yapışma eğilimindedir ve pertürbasyon olmadan hareketsizdir, bu nedenle embriyoyu cam tabanlı tabak üzerinde hareketsiz hale getirmek için ek tedavi (yapıştırıcı gibi) uygulamak gerekli değildir.
  10. Transfer işlemi sırasında numuneyi ışığa maruz kalmaktan korumak için 35 mm'lik cam tabanlı tabağı embriyolarla birlikte ışık geçirmez bir kara kutunun içine yerleştirin (Malzeme Tablosuna bakın). Kutuyu çoklu foton mikroskobu ile odaya getirin.

3. Optogenetik stimülasyon, lazer ablasyon ve embriyonun görüntülenmesi

NOT: Bu deneyde kullanılan çoklu foton sistemi (Malzeme Tablosuna bakınız) eşzamanlı çift dalga boylu görüntüleme yeteneğine sahiptir. Ayrıca, 458 nm lazerli bir fotostimülasyon ünitesi ve ayrı bir galvanometre tarayıcı içerir ve tanımlanmış bir ilgi alanı (ROI) içinde foto-aktivasyon/stimülasyona izin verir. Yeşil-sarı floresan proteinleri uyarmak için kullanılan 920 nm lazer, mavi lazer aracılı stimülasyona kıyasla daha yavaş da olsa Opto-Rho1DN'yi uyaracaktır.

  1. Numune kurulumu ve görüntüleme sırasında embriyoların istenmeyen uyarılmasını önlemek için multifoton mikroskobunu ışığa dayanıklı siyah bir bezle örtün (Malzeme Tablosuna bakınız).
    NOT: Aynı yaklaşım, mikroskopta bulunan ışığa duyarlı dedektörleri korumak için normal çoklu foton görüntüleme sırasında kullanılır.
  2. Oda ışığını ve bilgisayar ekranlarını kapatın. Yazılımda 'Dokunmatik panel denetleyicisinin arka ışığı' altında KAPALI'ya tıklayarak dokunmatik panel denetleyicisini kapatın. Odada başka bir ortam ışığı olmadığından emin olun.
    1. Mikroskop üzerindeki siyah bez kapağın ön tarafını açın. 35 mm'lik cam tabanlı çanağı kara kutudan alın ve mikroskop tablasına yerleştirin.
  3. Embriyoları normalde epifloresan için uyarma ışığı olarak kullanılan yeşil ışıkla aydınlatın. Bunu yapmak için, floresan aydınlatma ünitesini açın, yazılımdaki 'Oküler' panelinin altında Oküler'i seçin ve 'Küp taret'i 4:TRITC olarak değiştirin. İlgilenilen embriyoyu tanımlamak ve odaklamak için göz merceğini kullanın.
    NOT: Yeşil ışık görselleştirmesi, floresan aydınlatma ünitesi tarafından üretilen beyaz ışığın, 528-553 nm uyarma filtresi, 565 nm ışın ayırıcı ve 590-650 nm emisyon filtresi içeren yerleşik bir standart TRITC filtre küpünden geçmesine izin verilerek elde edilir. Diğer mavi olmayan ışıklar da örnek aydınlatma için iyi çalışmalıdır. Uyarma ışığının yoğunluğu düşük olduğundan ve göz merceğine yönlendirilmeyeceğinden bu adımda göz koruması takmak gerekli değildir. Embriyo, otofloresan nedeniyle düzgün bir şekilde kırmızı görünecektir.
  4. Numunenin ışıktan tamamen korunması için siyah bez kapağını kapatın. Mikroskobu kontrol eden yazılıma erişmek için bilgisayar ekranını açın. Görüntü alma için yazılımda 'Oküler'i LSM olarak değiştirin.
  5. 25x suya daldırma objektifi kullanarak kontrollü, uyarılmamış embriyolarda lazer ablasyonu gerçekleştirin.
    1. Yazılımdaki 'Araç Penceresi'nden Bright Z, Sequence Manager ve LSM Stimulation'a tıklayın. Tarayıcı türünü Galvano ve tarama boyutunu 512 × 512 olarak ayarlayın. 1.040 nm lazerin kullanımına izin vermek için 'PMT ayarı' paneli altında CH1 ve CH3'ü açın ve embriyoyu görselleştirmek için Canlı × 4'e tıklayın.
    2. Embriyonun ön-arka ekseni dikey olarak yönlendirilecek şekilde yazılımdaki Döndürme işlevini kullanarak embriyoyu döndürün. Yakınlaştırmayı 3 olarak ayarlayın. 'Tarama Ayarları' altındaki şekil aracını kullanarak bir ilgi alanı (ROI) çizin ve 'Referans' panelinde ROI'nin boyutunu ayarlayın. ROI'yi 512 piksel genişliğinde ve 100 piksel yüksekliğinde (171 × 33μm2) olarak ayarlayın.
    3. Ön ablasyon Z-yığını için toplama parametrelerini ayarlayın.
      1. Embriyonun yüzeyini 'Z Bölümü' altında 0 olarak kaydedin. Başlangıcı 0 ve bitişi 100 μm olarak ayarlayın. Adım boyutunu 2 μm olarak ayarlayın. 'Seriler' sekmesi altında Z'yi işaretleyerek Z edinme modunu etkinleştirin.
      2. Bright Z işlevini kullanarak doğrusal olarak %3'ten %7'ye çıkarmak için 1.040 nm lazer yoğunluğunu ayarlayın.
      3. 'Sequence Manager' (Sıra Yöneticisi) bölümünde LSM'ye tıklayarak mevcut görüntüleme ayarını işlem hattının ilk görevi olarak kaydedin.
        NOT: Embriyonun aşamasını doğrulamak için ön ablasyon Z-yığını elde edilir. Bu deneyde, CRY2-Rho1DN-mCherry ve Sqh-mCherry, 1.040 nm lazer tarafından heyecanlandırılacak. Apikal daralma sırasında, Sqh-mCherry sinyali ventral mezodermal hücrelerin medioapikal bölgesinde arttırılırken, CRY2-Rho1DN-mCherry stimülasyondan önce sitozoliktir. Stimülasyon öncesi ve sonrası görüntüleme için kullanılan lazer yoğunluğuna, optimal sinyal-gürültü oranı ile fotoağartmadan kaçınma arasındaki dengeye dayalı olarak ampirik olarak karar verilir.
    4. Ön ablasyon filmi için alım parametrelerini ayarlayın.
      1. Adım 3.5.2'de açıklandığı gibi, embriyonun ventral yüzeyine yakın 512 × 512 piksel bölgesinin tamamının (171 × 171 μm2, 3x yakınlaştırma) görüntülenmesine izin vermek için mevcut ROI'yi silin. 1.040 nm lazer yoğunluğunu %3'e ayarlayın.
      2. Saat'i işaretleyin ve 'Seri' panelinin altındaki Z'nin işaretini kaldırın. 'Time Lapse' panelinin altında 'Interval'i FreeRun olarak tutun. Döngüyü 10 olarak ayarlayın.
      3. 'Sıra Yöneticisi'nde LSM'ye tıklayarak mevcut ayarları işlem hattının bir sonraki görevi olarak kaydedin.
        NOT: Bu görevin amacı, görüntü elde etmek için 1.040 nm lazerle 10 karelik tek bir Z-düzlemi ön ablasyon filmi elde etmektir. Görüntü alma hızı kare başına yaklaşık 1 sn'dir.
    5. Lazer ablasyon için parametreleri ayarlayın.
      1. Lazer ablasyon için vitellin membranın hemen altından ~20 μm derinliğe kadar bir 3D bölge tanımlayın (Şekil 1A). Z yığınının başlangıcını vitellin membranının hemen altındaki düzlem ve sonunu başlangıç düzleminden 20 μm daha derin olarak ayarlayın. Adım boyutunu 1,5 μm olarak ayarlayın.
        NOT: Ablasyon yapılan bölgenin ROI'si ~30 piksel genişliğinde ve ~10 piksel yüksekliğindedir (medial-lateral eksen boyunca ~10 μm ve AP ekseni boyunca ~3.3 μm). Numunenin birden fazla Z-düzleminde kesilmesinin amacı, ventral hücrelerin apikal yüzeyinin ablasyonunu sağlamaktır. Bu, uyarılmış embriyolar için özellikle önemlidir, çünkü ventral hücreler Rho1 inhibisyonundan sonra hızlı apikal gevşeme yaşar.
      2. 920 nm lazerin kullanımına izin vermek için 'PMT ayarı' panelinin altında CH2 ve CH4'ü açın. 920 nm lazerin yoğunluğunu %30'a ayarlayın. Lazer ablasyonu için adım 3.5.5.1'de tanımlanan 3B bölge içinde tek bir Z yığını için 920 nm lazerle görüntü alımını ayarlayın.
        NOT: Bu adımda seçilen lazer yoğunluğu dokuyu ablate etmek için yeterlidir (lazer tedavisinden hemen sonra doku geri tepmesi ile gösterildiği gibi), ancak bu arada plazma zarına açıkça zarar vermez (hücre zarında yanık izlerinin olmaması ile gösterildiği gibi) (Şekil 1B, C).
      3. 'Sequence Manager' (Sıra Yöneticisi) bölümünde LSM'ye tıklayarak mevcut ayarı işlem hattının bir sonraki görevi olarak kaydedin.
    6. Ablasyon sonrası film için alım parametrelerini ayarlayın.
      1. Hem 1.040 nm hem de 920 nm lazerleri kullanarak 100 karelik tek bir Z düzlemi ablasyon sonrası film için görüntü alımını ayarlayın. 1.040 nm lazer ve 920 nm lazerin yoğunluğunu sırasıyla %3 ve %0,3 olarak ayarlayın. Adım 3.5.4'te belirtilen bölge, aynı görüntü alma hızıyla görüntülenecektir.
      2. 'Sequence Manager' (Sıra Yöneticisi) bölümünde LSM'ye tıklayarak mevcut ayarı işlem hattının bir sonraki görevi olarak kaydedin.
        NOT: 3.5.3-3.5.6 adımlarında açıklanan parametrelerin herhangi bir gerçek alımdan önce 'Sıra Yöneticisi'nde sıralı görevler olarak saklanmasının amacı, lazer ablasyonundan sonra anında doku yanıtının yakalanmasını sağlamaktır.
    7. 'Al' altında Sıra'yı seçin. Veri kaydetme yolunu ve dosya adını gerektiği gibi değiştirin. Hazır'a tıklayın ve yazılımın işlem hattını başlatmasını bekleyin. Ardından işlem hattını yürütmek için Başlat'a tıklayın.
  6. Uyarılmış embriyolarda lazer ablasyon yapın.
    1. 3.5.1-3.5.3 adımlarında açıklandığı gibi ön ablasyon Z-yığını için edinme parametrelerini ayarlayın. 'Sıra Yöneticisi'nde LSM'ye tıklayarak mevcut ayarı işlem hattının ilk görevi olarak kaydedin.
    2. Tanımlanmış bir ROI içinde optogenetik stimülasyon için parametreleri ayarlayın.
      1. Yakınlaştırmayı 1 olarak değiştirin ve embriyonun ventral yüzeyini kaplayan bir ROI seçin (~512 × 300μm2). CH1-CH4 dedektörlerini kapatın.
      2. LSM Stimülasyonu'na tıklayın. Süre içinde Sürekli'nin işaretini kaldırın ve 12 s yazın. 458 nm'yi %0,3 lazer yoğunluğu ile kontrol edin.
      3. 'Sıra Yöneticisi'nde Stimülasyon'a tıklayarak mevcut ayarı boru hattının bir sonraki görevi olarak kaydedin.
        NOT: 458 nm lazer yoğunluğu artırılarak daha hızlı bir stimülasyon elde edilebilir. Bununla birlikte, daha yüksek lazer yoğunlukları kullanıldığında, saçılan lazer ışığı, ROI'ye bitişik bölgeyi uyarabilir, bu da uzamsal olarak sınırlı bir stimülasyon gerekiyorsa ideal değildir.
    3. Miyozinin tamamen inaktivasyonunu ve apikal F-aktinin sökülmesini sağlamak ve lazer ablasyonundan önce statik bir doku morfolojisi elde etmek için stimülasyondan sonra 3 dakikalık bir bekleme süresi ayarlayın. Bu, 'Sıra Yöneticisi' altında Bekle /Duraklat'a tıklanarak ve 'Bekle' için istenen zamanı ayarlayarak elde edilir.
      NOT: Tek bir stimülasyon turunun (12 saniye boyunca% 0.3 458 nm lazer) neden olduğu membrana CRY2-Rho1DN-mCherry'nin alınması, stimülasyondan 10-15 dakika sonra açıkça tespit edilebilir. Bu, ~9 dakika47'lik yayınlanan ayrışma yarı süresi ile uyumludur.
    4. Görüntü elde etmek için hem 1.040 nm hem de 920 nm lazerlerin kullanılması dışında, adım 3.5.4'te açıklandığı gibi tek Z düzlemi ön ablasyon filmi için alım parametrelerini ayarlayın. CH1-CH4 dedektörlerini açın. 1.040 nm lazer ve 920 nm lazerin yoğunluğunu sırasıyla %3 ve %0,3 olarak ayarlayın. 'Sequence Manager' (Sıra Yöneticisi) bölümünde LSM'ye tıklayarak mevcut ayarı işlem hattının bir sonraki görevi olarak kaydedin.
    5. Adım 3.5.5'te açıklandığı gibi lazer ablasyon için parametreleri ayarlayın. 'Sequence Manager' (Sıra Yöneticisi) bölümünde LSM'ye tıklayarak mevcut ayarı işlem hattının bir sonraki görevi olarak kaydedin.
    6. Adım 3.5.6'da açıklandığı gibi, tek Z düzlemi ablasyon sonrası film için alım parametrelerini ayarlayın. 'Sequence Manager' (Sıra Yöneticisi) bölümünde LSM'ye tıklayarak mevcut ayarı işlem hattının bir sonraki görevi olarak kaydedin.
    7. 'Al' altında Sıra'yı seçin. Veri kaydetme yolunu ve dosya adını gerektiği gibi değiştirin. Hazır'a tıklayın ve yazılımın işlem hattını başlatmasını bekleyin. Ardından, işlem hattını yürütmek için Başlat'a tıklayın.

4. Lazer ablasyonundan sonra doku geri tepme oranının ölçülmesi

  1. Ablasyon sonrası filmi ImageJ'de açın.
  2. Dikdörtgen Seçim aracını kullanarak ablasyonlu bölgeyi kaplayan ventral orta hat boyunca küçük bir ROI çizin. ROI'nin genişliği dokuz pikseldir. ROI'nin yüksekliği, ROI, lazer ablasyonundan sonra tüm doku geri tepme aralığını kapsayacak kadar büyük olacak şekilde ayarlanır.
    1. 'Resim' sekmesinin altındaki Çoğalt'ı tıklayın. Açılır pencerede, Yığını çoğalt'ı işaretleyin ve ardından yığını seçilen YG içinde çoğaltmak için Tamam'a tıklayın.
  3. Görüntü > Yığınları aracılığıyla çoğaltılan yığından bir montaj oluşturun > Montaj Yapın. Açılır pencerede, satır numarasını 1 ve sütun numarasını yığındaki toplam çerçeve sayısına (bu durumda 100 ) ayarlayın.
  4. Oluşturulan montajdan ablasyon yapılan bölgenin zaman içindeki AP genişliğini ölçün.
    1. Montajdaki her zaman noktası için kesilen bölgenin A-P sınırlarını işaretlemek için ImageJ'deki Çok noktalı aracı kullanın.
    2. Dosya > XY Koordinatları Olarak Kaydet'i kullanarak işaretli noktaların koordinatlarını kaydedin >.
    3. Ölçülen XY koordinatlarını MATLAB'a aktarın. Üst sınırın Y koordinatını alt sınırın Y koordinatından çıkararak her zaman noktası için ablasyon bölgesinin AP genişliğini hesaplayın.
  5. MATLAB'daki 'polyfit' fonksiyonunu kullanarak "zaman içinde genişlik" eğrisinin ilk 20 s'sini bir çizgiye sığdırarak doku geri tepme oranını belirleyin. Takılan hattın eğimini doku geri tepme oranı olarak bildirin.
  6. Uyarılmış ve uyarılmamış numuneler arasındaki doku geri tepme oranını karşılaştırmak için istatistiksel testler yapın.
    NOT: Her koşulda en az beş embriyodan veri elde edilmesi önerilir. İstatistiksel karşılaştırma için hem iki taraflı Wilcoxon sıra toplamı testi hem de iki taraflı öğrenci t-testi kullanılabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Apikal daralma geçiren uyarılmamış embriyolarda, Sqh-mCherry ventral mezodermal hücrelerin medioapikal bölgesinde zenginleşirken, CRY2-Rho1DN-mCherry sitozolik idi (Şekil 1A). Konstriksiyon alanı içindeki lazer ablasyonu, AP ekseni boyunca hızlı bir doku geri tepmesine yol açtı (Şekil 1B, C). Uyarılan embriyolarda, CRY2-Rho1DN-mCherry sinyali plazma membranı lokalize olurken, Sqh-mCherry'nin medioapikal sinyali tamamen kayboldu (Şekil 1A). Uyarılmış embriyolarda lazer ablasyonu, Şekil 1B,C'de örneklendiği ve Şekil 1D'de ölçüldüğü gibi belirgin doku geri tepmesine neden olmamıştır. Bu sonuçlar, doku gerginliğinin oluşumunun aktif apikal aktomiyosin kontraktilitesi gerektirdiğini göstermektedir; Aktomiyosin, Rho1 inhibisyonu üzerine inaktif hale geldiğinde, apikal doku gerginliği de azalır41. Bu gözlemler, ventral mezodermal hücrelerde apikal miyozin kontraktilitesinin aktivasyonunun, embriyonun ventral yüzeyinde doku gerginliğinde bir artışa neden olduğuna dair önceki bulgularla tutarlıdır40.

Figure 1
Şekil 1: Apikal daralma sırasında Opto-Rho1DN stimülasyonu, embriyonun ventral yüzeyinde ani bir kortikal gerilim kaybına neden olur . (A) Kortikal gerilimi tespit etmek için lazer ablasyonu için deney düzeneğini gösteren karikatür. Sarı gölgeli bölgeler ablasyonlu bölgeleri gösterir. Uyarılmış embriyolar için, lazer ablasyonundan 3 dakika önce Opto-Rho1DN'nin ışık aktivasyonu gerçekleştirildi. Stimülasyondan sonra apikal gevşeme nedeniyle, ventral hücrelerin çok apikal yüzeyinin ablasyonunu sağlamak için çoklu z-düzlemleri ablasyon (sarı gölgeli bölge) yapıldı. (B,C) Uyarılmamış ve uyarılmış embriyolar arasındaki karşılaştırma. Uyarılan embriyolarda belirgin bir doku geri tepmesi gözlenmedi (uyarılmamış embriyolar için N = 6 ve uyarılmış embriyolar için N = 5). (B) Lazerle ablasyonlu embriyoların yüz görünümü. Sarı gölgeli kutular ablasyonlu bölgeyi işaretler. (C) Ablasyon yapılan bölgenin genişlik değişimini temsil eden kimografiler. Sarı noktalı çizgiler ablasyon bölgesini gösterir. (D) Lazer ablasyonundan sonraki ilk 20 saniye boyunca AP ekseni boyunca ablasyonlu bölgenin genişlik değişiklikleri. Uyarılmamış kontrol embriyolarında lazer kesimden sonra berrak bir doku geri tepmesi gözlendi. Buna karşılık, uyarılan embriyolarda çok az doku geri tepmesi gözlendi veya hiç gözlenmedi, bu da Rho1 inhibisyonundan sonra apikal gerginlik eksikliğini gösteriyor. Hata çubuğu standart sapmadır. P değeri, iki taraflı Wilcoxon sıra toplamı testi kullanılarak hesaplandı. Bu rakam Guo ve ark.41'den yeniden kullanılmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu protokol, aktomiyosin kontraktilitesinin inaktivasyonundan hemen sonra doku gerginliğindeki değişiklikleri araştırmak için optogenetik ve lazer ablasyonun birlikte kullanımını tanımladı. Burada tarif edilen optogenetik araç, endojen Rho1 ve Rho1'e bağımlı aktomiyosin kontraktilitesini akut olarak inhibe etmek için baskın negatif Rho1 (Rho1DN) formundan yararlanır. Drosophila ventral karık oluşumu bağlamında Opto-Rho1DN'nin önceki karakterizasyonu, aletin eşzamanlı miyozin inaktivasyonu ve aktin demontajı yoluyla apikal aktomiyosin kontraktilitesinin hızlı inaktivasyonuna aracılık etmede oldukça etkili olduğunu göstermiştir41. Özellikle, apikal daralma sırasında embriyoların uyarılması, apikal daralma geçiren hücrelerde apikal miyozin sinyalinin 60 s içinde azalmasına neden oldu41. Rho1 inhibisyonu üzerine kortikal miyozinin bu hızlı uzaklaştırılması, muhtemelen Rho1 ve miyozin hafif zincir fosfatazları için GTPaz aktive edici proteinlerin (GAP'ler) aktivitelerinin neden olduğu aktif ve inaktif durumlar yoluyla Rho1 ve miyozinin hızlı döngüsünden kaynaklanmaktadır,19,54. Aktomiyosin üzerindeki etkiyle tutarlı olarak, optogenetiğin lazer ablasyonu ile birleştirilmesi, apikal daralma sırasında Opto-Rho1DN stimülasyonunun embriyonun ventral bölgesinde ani bir epitel gerginliği kaybına yol açtığını göstermiştir41 (Şekil 1). Bu birleşik yaklaşım, Rho1 aracılı hücresel kontraktilitenin doku mekaniğini benzeri görülmemiş uzamsal ve zamansal hassasiyetle düzenlemedeki işlevini araştırmamıza izin vererek, geleneksel genetik yaklaşımlar kullanılarak elde edilmesi zor olan uzun vadeli etkilerden kaynaklanan ani etkileri incelemeyi mümkün kıldı.

Opto-Rho1DN kullanırken göz önünde bulundurulması gereken önemli bir teknik husus, aletin ortam ışığına karşı oldukça hassas olmasıdır. Deneyde yaygın olarak karşılaşılan bir sorun, tipik olarak aşağıdaki adımlardan biri sırasında numunenin erken uyarılmasından kaynaklanan, stimülasyon adımından önce plazma membranına CRY2-mCherry-Rho1DN'nin alınmasıdır: numune hazırlama, mikroskop odasına numune transferi, mikroskop aşamasında numune konumlandırma ve stimülasyon öncesi görüntü elde etme. Protokolümüzde, istenmeyen uyarımı önlemek için, sinek kaplarının ve embriyoların karanlık bir odada kırmızı ışık altında tutulması, stereomikroskop altında embriyoların seçilmesi ve monte edilmesi sırasında aydınlatma ışığından gelen mavi dalga boylarının filtrelenmesi ve stimülasyon öncesi embriyoların 400-500 nm lazere (tek foton uyarımı) veya 830-980 nm atımlı lazere (çoklu foton uyarımı) maruz bırakılmasının önlenmesi gibi birçok prosedür uygulanmaktadır. Numunenin istenmeyen uyarılmasını önlemek için deneyin birden fazla adımında ekstra dikkat göstermek çok önemlidir. Ek olarak, embriyo 41'de belirli bir ilgi alanı (ROI) içindeRho1'i inhibe etmek için Opto-Rho1DN kullanıldığında, CRY2-Rho1DN'nin plazma membranına sağlam bir translokasyonunu sağlayabilen en düşük lazer yoğunluğunun kullanılması önerilir. Opto-Rho1DN mavi dalga boylarına karşı son derece hassas olduğundan, yüksek yoğunluklu bir mavi lazer, saçılan ışık nedeniyle ROI dışındaki hücrelerde ve hatta komşu embriyolarda istenmeyen uyarılara neden olabilir.

Mevcut sürümünde, Opto-Rho1DN aracının çeşitli sınırlamaları vardır. İlk olarak, bu protokolde açıklanan deneyler için, aktive edilmiş CRY2-Rho1DN'yi sitozolden plazma membranına41,47 almak için bir plazma membranı lokalize CIBN ankrajı kullanıldı. Bu tasarımla, sitozolde aktive edilmiş CRY2-Rho1DN proteinlerinin difüzyonu nedeniyle belirli bir plazma membranı alanı içinde sınırlı Rho1 inhibisyonunu gerçekleştirmek zordur. Hücre altı ölçekte uzamsal hassasiyetin daha da iyileştirilmesi, daha spesifik hücre altı lokalizasyon modellerine sahip yeni CIBN çapalarının geliştirilmesini beklemektedir. İkincisi, Opto-Rho1DN, erken embriyogenez sırasında Rho1'i inhibe etmek için tasarlanmıştır. CIBNpm ve CRY2-Rho1DN-mCherry'nin ekspresyonu, dişi germ hatlarında ekspresyon için standartlaştırılmışUASp tarafından kontrol edilir 5 5. Bu modüllerin erken embriyogenezin ötesinde somatik dokularda ekspresyonu, UASp'nin somatik ekspresyonu yönlendirmek için daha etkili olan bir promotör ile değiştirilmesini gerektirebilir (örneğin, UASt56). Son olarak, Opto-Rho1DN'nin etkinliği, CIBN çapasının ve CRY2-Rho1DN proteinlerinin bolluğuna bağlıdır. Aracın mevcut sürümünde, optogenetik modüllerin ekspresyonunu sürmek için kullanılan GAL4 sürücü hattı tarafından belirlenir. Bu protokolde açıklanan maternal GAL4 sürücüsünü kullanırken, aktomiyosin kontraktilitesinin hızlı ve güçlü inhibisyonunu elde etmek için GAL4 geninin iki kopyasını (örneğin, hem 67 hem de 15) sağlayan çizgiyi kullanmak çok önemlidir. F1 dişilerinde maternal GAL4'ün kopya sayısının ikiden bire düşürülmesi, inhibitör etkiyi önemli ölçüde azalttı.

Konvansiyonel genetik yaklaşımlarla karşılaştırıldığında, bu protokolde tarif edilen optogenetik yaklaşım, erken Drosophila embriyolarında Rho1'in evresini ve dokuya özgü fonksiyonunu diseksiyonda avantajlıdır. Erken Drosophila embriyogenezinde Rho1'in işlevi büyük ölçüde maternal olarak yüklenen gen ürünü11 tarafından yerine getirilir. Rho1'in maternal olarak tükenmesi, oogenez57'yi bloke ederek erken embriyogenez sırasındaki işlevinin incelenmesini engeller. Son birkaç yılda, Drosophila embriyolarında endojen Rho1 aktivitesini düzenlemek için çeşitli optogenetik araçlar geliştirilmiştir. Hem Izquierdo ve ark. hem de Rich ve ark. Drosophila embriyolarında Rho GEF'lerin katalitik alanının lokalizasyonunu düzenleyerek Rho1 aktivitesini aktive etmek için optogenetik araçlar geliştirdi48,58. Ek olarak, Herrera-Perez ve ark. endojen Rho1 aktivitesini aktive etmek veya inhibe etmek için sırasıyla tam uzunlukta RhoGEF2 (optoGEF) veya tam uzunlukta C-GAP (optoGAP) kullanarak iki optogenetik araç geliştirdi59. OptoGAP, plazma membranına bir Rho1 GAP alarak işlev gördüğünden, uygulaması, GAP'nin ektopik alımının etkisini dengeleyebilen veya hatta geçersiz kılabilen endojen Rho1 GEF'lerin varlığına duyarlı olabilir. Buna karşılık, Rho1 GEF'leri doğrudan sekestre ederek, Opto-Rho1DN, endojen Rho1 ve Rho1'e bağlı aktomiyosin kontraktilitesini inhibe etmek için daha sağlam bir yol sağlayabilir.

Rho1'in embriyogenez ve post-embriyonik gelişimdeki çok çeşitli işlevleri göz önüne alındığında, sunulan protokol, çok çeşitli morfogenetik süreçlerde Rho1 ve Rho1'e bağımlı hücresel yeniden yapılanmaların işlevini incelemek için kolayca uyarlanabilir. Ek olarak, benzer bir strateji, prensip olarak, Rho ailesi GTPazları Cdc42 ve Rac gibi diğer küçük GTPazları ciddi şekilde kısıtlamak için kullanılabilir, çünkü baskın negatif formları, bu proteinlerin endojen fonksiyonunu inhibe etmek için yaygın olarak kullanılmıştır11. Son olarak, bu protokolde örneklendiği gibi, optogenetik ve lazer ablasyon yaklaşımlarını birleştirmek, belirli bir proteinin inaktivasyonunun doku dinamikleri ve doku mekaniği üzerindeki ani etkisini araştırmak için etkili bir yol sağlayabilir ve bu da bize geleneksel genetik yaklaşımlar kullanılarak ortaya çıkarılması zor olan doku morfogenezi hakkında yeni bilgiler getirecektir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar, araştırmanın potansiyel bir çıkar çatışması olarak yorumlanabilecek herhangi bir ticari veya finansal ilişkinin yokluğunda yürütüldüğünü beyan ederler.

Acknowledgments

Yazarlar, görüntüleme desteği için Ann Lavanway'e teşekkür eder. Yazarlar, reaktifleri paylaştıkları için Wieschaus laboratuvarına ve De Renzis laboratuvarına ve sinek stokları için Bloomington Drosophila Stok Merkezi'ne teşekkür ediyor. Bu çalışma NIGMS ESI-MIRA R35GM128745 ve Amerikan Kanser Derneği Kurumsal Araştırma Hibesi #IRG-82-003-33 tarafından BH'ye desteklenmektedir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
35 mm glass-bottom dish MatTek P35G-1.5-10-C Used for sample preparation
60 mm × 15 mm Petri dish with lid Falcon 351007 Used for sample preparation
Black cloth for covering the microscope Online NA Used to avoid unwanted light stimulation
Clorox Ultra Germicadal Bleach (8.25% sodium hypochlorite) VWR 10028-048 Used for embryo dechorination
CO2 pad Genesee Scientific 59-114 Used for cross set-up
ddH2O NA NA Used for sample preparation
Dumont Style 5 tweezers VWR 102091-654 Used for sample preparation
Eyelash tool (made from pure red sable round brush #2) VWR 22940-834 Used for sample preparation
FluoView (Software) Olympus NA Used for image acquisition and optogenetic stimulation
Halocarbon oil 27 Sigma Aldrich H8773-100ML Used for embryo stage visualization
ImageJ/FIJI NIH NA Used for image analysis
MATLAB MathWorks NA Used for image analysis
Nikon SMZ-745 stereoscope Nikon NA Used for sample preparation
Olympus FVMPE-RS multiphoton microscope with InSight DS Dual-line Ultrafast Lasers for simultaneous dual-wavelength multiphoton imaging, , a 25x/NA1.05 water immersion objective (XLPLN25XWMP2), and an IR/VIS stimulation unit for photo-activation/stimulation. This system is also equipped with a TRITC filter (39005-BX3; AT-TRICT-REDSHFT 540/25x, 565BS, 620/60M), and a fluorescence illumination unit that emits white light. Olympus NA Used for image acquisition and optogenetic stimulation
SP Bel-Art 100-place polypropylene freezer storage box (Black, light-proof box for sample transfer) VWR 30621-392 Used to avoid unwanted light stimulation
UV Filter Shield for FM1403 Fluores (Orange-red plastic shield) Bolioptics FM14036151 Used to avoid unwanted light stimulation
VITCHELO V800 Headlamp with White and Red LED Lights Amazon NA Used to avoid unwanted light stimulation

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vicente-Manzanares, M., Ma, X., Adelstein, R. S., Horwitz, A. R. Non-muscle myosin II takes centre stage in cell adhesion and migration. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 10 (11), 778-790 (2009).
  2. Munjal, A., Lecuit, T. Actomyosin networks and tissue morphogenesis. Development. 141 (9), 1789-1793 (2014).
  3. Sawyer, J. M., et al. Apical constriction: a cell shape change that can drive morphogenesis. Developmental Biology. 341 (1), 5-19 (2010).
  4. Nishimura, T., Honda, H., Takeichi, M. Planar cell polarity links axes of spatial dynamics in neural-tube closure. Cell. 149 (5), 1084-1097 (2012).
  5. Marinari, E., et al. Live-cell delamination counterbalances epithelial growth to limit tissue overcrowding. Nature. 484 (7395), 542-545 (2012).
  6. Slattum, G. M., Rosenblatt, J. Tumour cell invasion: an emerging role for basal epithelial cell extrusion. Nature Reviews. Cancer. 14 (7), 495-501 (2014).
  7. Antunes, M., Pereira, T., Cordeiro, J. V., Almeida, L., Jacinto, A. Coordinated waves of actomyosin flow and apical cell constriction immediately after wounding. The Journal of Cell Biology. 202 (2), 365-379 (2013).
  8. Yang, S., et al. The central role of the tail in switching off 10S myosin II activity. The Journal of General Physiology. 151 (9), 1081-1093 (2019).
  9. Yang, S., et al. Cryo-EM structure of the inhibited (10S) form of myosin II. Nature. 588 (7838), 521-525 (2020).
  10. Narumiya, S., Thumkeo, D. Rho signaling research: history, current status and future directions. FEBS Letters. 592 (11), 1763-1776 (2018).
  11. Johndrow, J. E., Magie, C. R., Parkhurst, S. M. Rho GTPase function in flies: insights from a developmental and organismal perspective. Biochemistry and Cell Biology. 82 (6), 643-657 (2004).
  12. Etienne-Manneville, S., Hall, A. Rho GTPases in cell biology. Nature. 420 (6916), 629-635 (2002).
  13. Hodge, R. G., Ridley, A. J. Regulating Rho GTPases and their regulators. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 17 (8), 496-510 (2016).
  14. Martin, A. C., Goldstein, B. Apical constriction: themes and variations on a cellular mechanism driving morphogenesis. Development. 141 (10), 1987-1998 (2014).
  15. Amano, M., Nakayama, M., Kaibuchi, K. Rho-kinase/ROCK: A key regulator of the cytoskeleton and cell polarity. Cytoskeleton. 67 (9), 545-554 (2010).
  16. Kimura, K., et al. Regulation of myosin phosphatase by Rho and Rho-associated kinase (Rho-kinase). Science. 273 (5272), 245-248 (1996).
  17. Maekawa, M., et al. Signaling from Rho to the actin cytoskeleton through protein kinases ROCK and LIM-kinase. Science. 285 (5429), 895-898 (1999).
  18. Ohashi, K., et al. Rho-associated kinase ROCK activates LIM-kinase 1 by phosphorylation at threonine 508 within the activation loop. The Journal of Biological Chemistry. 275 (5), 3577-3582 (2000).
  19. Coravos, J. S., Martin, A. C. Apical sarcomere-like actomyosin contracts nonmuscle drosophila epithelial cells. Developmental Cell. 39 (3), 346-358 (2016).
  20. Homem, C. C. F., Peifer, M. Diaphanous regulates myosin and adherens junctions to control cell contractility and protrusive behavior during morphogenesis. Development. 135 (6), 1005-1018 (2008).
  21. Goode, B. L., Eck, M. J. Mechanism and function of formins in the control of actin assembly. Annual Review of Biochemistry. 76, 593-627 (2007).
  22. Sweeton, D., Parks, S., Costa, M., Wieschaus, E. Gastrulation in Drosophila: the formation of the ventral furrow and posterior midgut invaginations. Development. 112 (3), 775-789 (1991).
  23. Leptin, M., Grunewald, B. Cell shape changes during gastrulation in Drosophila. Development. 110 (1), 73-84 (1990).
  24. Leptin, M. Gastrulation in Drosophila: the logic and the cellular mechanisms. The EMBO Journal. 18 (12), 3187-3192 (1999).
  25. Martin, A. C. The physical mechanisms of Drosophila gastrulation: mesoderm and endoderm invagination. Genetics. 214 (3), 543-560 (2020).
  26. Gilmour, D., Rembold, M., Leptin, M. From morphogen to morphogenesis and back. Nature. 541 (7637), 311-320 (2017).
  27. Gheisari, E., Aakhte, M., Müller, H. -A. J. Gastrulation in Drosophila melanogaster: Genetic control, cellular basis and biomechanics. Mechanisms of Development. 163, 103629 (2020).
  28. Leptin, M. Twist and snail as positive and negative regulators during Drosophila mesoderm development. Genes & Development. 5 (9), 1568-1576 (1991).
  29. Costa, M., Wilson, E. T., Wieschaus, E. A putative cell signal encoded by the folded gastrulation gene coordinates cell shape changes during Drosophila gastrulation. Cell. 76 (6), 1075-1089 (1994).
  30. Kerridge, S., et al. Modular activation of Rho1 by GPCR signalling imparts polarized myosin II activation during morphogenesis. Nature Cell Biology. 18 (3), 261-270 (2016).
  31. Kölsch, V., Seher, T., Fernandez-Ballester, G. J., Serrano, L., Leptin, M. Control of Drosophila gastrulation by apical localization of adherens junctions and RhoGEF2. Science. 315 (5810), 384-386 (2007).
  32. Manning, A. J., Peters, K. A., Peifer, M., Rogers, S. L. Regulation of epithelial morphogenesis by the G protein-coupled receptor mist and its ligand fog. Science Signaling. 6 (301), (2013).
  33. Parks, S., Wieschaus, E. The Drosophila gastrulation gene concertina encodes a G alpha-like protein. Cell. 64 (2), 447-458 (1991).
  34. Barrett, K., Leptin, M., Settleman, J. The Rho GTPase and a putative RhoGEF mediate a signaling pathway for the cell shape changes in Drosophila gastrulation. Cell. 91 (7), 905-915 (1997).
  35. Dawes-Hoang, R. E., et al. Folded gastrulation, cell shape change and the control of myosin localization. Development. 132 (18), 4165-4178 (2005).
  36. Häcker, U., Perrimon, N. DRhoGEF2 encodes a member of the Dbl family of oncogenes and controls cell shape changes during gastrulation in Drosophila. Genes & Development. 12 (2), 274-284 (1998).
  37. Martin, A. C., Kaschube, M., Wieschaus, E. F. Pulsed contractions of an actin-myosin network drive apical constriction. Nature. 457 (7228), 495-499 (2009).
  38. Mason, F. M., Tworoger, M., Martin, A. C. Apical domain polarization localizes actin-myosin activity to drive ratchet-like apical constriction. Nature Cell Biology. 15 (8), 926-936 (2013).
  39. Nikolaidou, K. K., Barrett, K. A Rho GTPase signaling pathway is used reiteratively in epithelial folding and potentially selects the outcome of Rho activation. Current Biology. 14 (20), 1822-1826 (2004).
  40. Martin, A. C., Gelbart, M., Fernandez-Gonzalez, R., Kaschube, M., Wieschaus, E. F. Integration of contractile forces during tissue invagination. The Journal of Cell Biology. 188 (5), 735-749 (2010).
  41. Guo, H., Swan, M., He, B. Optogenetic inhibition of actomyosin reveals mechanical bistability of the mesoderm epithelium during Drosophila mesoderm invagination. eLife. 11, e69082 (2022).
  42. Sebti, S. M., Der, C. J. Searching for the elusive targets of farnesyltransferase inhibitors. Nature Reviews. Cancer. 3 (12), 945-951 (2003).
  43. Roberts, P. J., et al. Rho family GTPase modification and dependence on CAAX motif-signaled posttranslational modification. The Journal of Biological Chemistry. 283 (37), 25150-25163 (2008).
  44. Feig, L. A., Cooper, G. M. Inhibition of NIH 3T3 cell proliferation by a mutant ras protein with preferential affinity for GDP. Molecular and Cellular Biology. 8 (8), 3235-3243 (1988).
  45. Liu, H., et al. Photoexcited CRY2 interacts with CIB1 to regulate transcription and floral initiation in Arabidopsis. Science. 322 (5907), 1535-1539 (2008).
  46. Kennedy, M. J., et al. Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in living cells. Nature Methods. 7 (12), 973-975 (2010).
  47. Guglielmi, G., Barry, J. D., Huber, W., De Renzis, S. An optogenetic method to modulate cell contractility during tissue morphogenesis. Developmental Cell. 35 (5), 646-660 (2015).
  48. Izquierdo, E., Quinkler, T., De Renzis, S. Guided morphogenesis through optogenetic activation of Rho signalling during early Drosophila embryogenesis. Nature Communications. 9 (1), 2366 (2018).
  49. Hutson, M. S., et al. Forces for morphogenesis investigated with laser microsurgery and quantitative modeling. Science. 300 (5616), 145-149 (2003).
  50. Rauzi, M., Lenne, P. -F. Probing cell mechanics with subcellular laser dissection of actomyosin networks in the early developing Drosophila embryo. Methods in Molecular Biology. 1189, 209-218 (2015).
  51. Rauzi, M., Verant, P., Lecuit, T., Lenne, P. -F. Nature and anisotropy of cortical forces orienting Drosophila tissue morphogenesis. Nature Cell Biology. 10 (12), 1401-1410 (2008).
  52. Hunter, C., Wieschaus, E. Regulated expression of nullo is required for the formation of distinct apical and basal adherens junctions in the Drosophila blastoderm. The Journal of Cell Biology. 150 (2), 391-401 (2000).
  53. Oda, H., Tsukita, S. Real-time imaging of cell-cell adherens junctions reveals that Drosophila mesoderm invagination begins with two phases of apical constriction of cells. Journal of Cell Science. 114, 493-501 (2001).
  54. Munjal, A., Philippe, J. -M., Munro, E., Lecuit, T. A self-organized biomechanical network drives shape changes during tissue morphogenesis. Nature. 524 (7565), 351-355 (2015).
  55. Rørth, P. Gal4 in the Drosophila female germline. Mechanisms of Development. 78 (1-2), 113-118 (1998).
  56. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  57. Magie, C. R., Meyer, M. R., Gorsuch, M. S., Parkhurst, S. M. Mutations in the Rho1 small GTPase disrupt morphogenesis and segmentation during early Drosophila development. Development. 126 (23), 5353-5364 (1999).
  58. Rich, A., Fehon, R. G., Glotzer, M. Rho1 activation recapitulates early gastrulation events in the ventral, but not dorsal, epithelium of Drosophila embryos. eLife. 9, e56893 (2020).
  59. Herrera-Perez, R. M., Cupo, C., Allan, C., Lin, A., Kasza, K. E. Using optogenetics to link myosin patterns to contractile cell behaviors during convergent extension. Biophysical Journal. 120 (19), 4214-4229 (2021).

Tags

Gelişim Biyolojisi Sayı 194 optogenetik doku mekaniği Rho1 aktomiyosin lazer ablasyon apikal daralma gastrulasyon
<em>Drosophila</em> Embriyolarında Epitelyal Gerginliğin Ölçümü ile Birlikte Rho1 Aracılı Aktomiyosin Kontraktilitesinin Optogenetik İnhibisyonu
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Guo, H., Swan, M., He, B.… More

Guo, H., Swan, M., He, B. Optogenetic Inhibition of Rho1-Mediated Actomyosin Contractility Coupled with Measurement of Epithelial Tension in Drosophila Embryos. J. Vis. Exp. (194), e65314, doi:10.3791/65314 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter