Summary
액토미오신 수축성은 세포 및 조직 형태 형성에 중요한 역할을 합니다. 그러나, 생체 내에서 악토미오신 수축성을 급격히 조작하는 것은 어렵다. 이 프로토콜은 초파리 배아에서 Rho1 매개 악토미오신 수축성을 빠르게 억제하는 광유전학적 시스템을 설명하여 생체 내에서 악토미오신이 비활성화된 후 상피 긴장의 즉각적인 손실을 나타냅니다.
Abstract
액틴 및 비근육 미오신 II에 의해 생성된 수축력("악토미오신 수축성")은 세포 분열, 세포 이동, 상피 접힘 및 분지 형태 형성과 같은 여러 길이 척도에서 세포 및 조직의 형태학적 변화에 중요합니다. 형태 형성에서 악토미오신 수축성의 역할에 대한 심층적인 이해는 기존의 유전적 또는 약리학적 접근 방식으로는 달성하기 어려운 악토미오신 수축의 신속한 비활성화를 허용하는 접근 방식을 필요로 합니다. 제시된 프로토콜은 정확한 시간 및 공간 제어로 초파리 배아에서 악토미오신 수축성을 억제하기 위해 CRY2-CIBN 기반 광유전학적 이합체화 시스템인 Opto-Rho1DN의 사용을 보여줍니다. 이 시스템에서 CRY2는 Rho1(Rho1DN)의 우세한 음성 형태에 융합되는 반면 CIBN은 원형질막에 고정됩니다. CRY2 및 CIBN의 청색광 매개 이량체화는 세포질에서 원형질막으로 Rho1DN의 빠른 전좌를 초래하며, 여기서 내인성 Rho1을 억제하여 악토미오신 비활성화를 초래합니다. 또한, 이 기사는 초파리 복부 고랑 형성 동안 상피 긴장을 생성하는 악토미오신의 역할을 조사하기 위해 악토미오신의 Opto-Rho1DN 매개 비활성화와 레이저 절제를 결합하기 위한 자세한 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 최소한의 수정으로 초파리 배아에서 악토미오신 수축성을 포함하는 다른 많은 형태학적 과정에 적용할 수 있습니다. 전반적으로, 이 광유전학적 도구는 동적 조직 리모델링 동안 조직 역학을 제어하는 악토미오신 수축성의 기능을 해부하는 강력한 접근 방식입니다.
Introduction
액토미오신 수축성(actomyosin contractility)은 F-액틴 네트워크에서 비근육 미오신 II(이하 '미오신')에 의해 가해지는 수축력으로, 세포 형태를 변화시키고 조직 수준의 형태 형성을 유도하는 가장 중요한 힘 중 하나이다 1,2. 예를 들어, 상피 세포의 정점 도메인에서 악토미오신 수축성의 활성화는 정단 수축을 초래하며, 이는 상피 접힘, 세포 압출, 박리 및 상처 치유를 포함한 다양한 형태 형성 과정을 촉진합니다 3,4,5,6,7 . 미오신의 활성화는 그의 조절 경쇄의 인산화를 필요로 한다. 이 변형은 미오신 분자의 억제 형태를 완화하여 양쪽 끝에 여러 헤드 도메인이 있는 양극성 미오신 필라멘트 다발을 형성할 수 있도록 합니다. 양극성 미오신 필라멘트는 액틴 필라멘트의 역평행 운동을 유도하고 수축력 1,8,9를 생성합니다.
진화적으로 보존된 Rho 계열의 작은 GTPase RhoA(초파리의 Rho1)는 다양한 세포 맥락에서 악토미오신 수축성의 활성화에 중심적인 역할을 한다10,11. Rho1은 GTP(활성형) 또는 GDP(비활성형)12에 결합하여 이분자 스위치로 기능합니다. GTP 또는 GDP 결합 Rho1 사이의 순환은 GTPase 활성화 단백질(GAP)과 구아닌 뉴클레오티드 교환 인자(GEF)에 의해 조절됩니다13. GEF는 GTP에 대한 GDP의 교환을 촉진하여 Rho1 활성을 활성화하는 기능을 합니다. 반면에 GAP는 Rho1의 GTPase 활성을 향상시켜 Rho1을 비활성화합니다. 활성화된 Rho1은 다운스트림 이펙터인 Rho 관련 키나아제(Rok) 및 Diaphanous14와 상호 작용하고 활성화하여 악토미오신 수축성을 촉진합니다. Rok은 미오신15의 조절 경쇄를 인산화하여 미오신 활성화 및 악토미오신 수축성을 유도한다. 또한, Rok은 또한 미오신 조절 경쇄 포스파타제를 억제하고, 따라서 미오신 필라멘트 조립을 더욱 촉진한다16. Rok은 또한 LIM 키나아제를 인산화할 수 있으며, 이는 활성화될 때 액틴-해중합 인자인 코필린(17,18)을 인산화 및 억제함으로써 액틴 분해를 방지합니다. Diaphanous는 액틴 중합을 촉진하는 포르민 계열 액틴 핵제로, 미오신이 19,20,21과 상호 작용할 수 있는 염기를 제공합니다.
악토미오신 수축성을 활성화하는 세포 메커니즘은 잘 밝혀졌지만 동적 조직 리모델링을 조절하는 기능에 대한 우리의 이해는 불완전합니다. 이러한 지식 격차를 메우기 위해서는 생체 내 특정 조직 영역에서 악토미오신 (actomyosin)을 빠르게 비활성화하고 조직 거동 및 특성에 대한 즉각적인 영향을 기록할 수 있는 접근법이 필요합니다. 이 프로토콜은 초파리 중배엽 침윤 동안 악토미오신 수축성을 급격히 억제하기 위한 광유전학적 접근법의 사용을 설명하고 레이저 절제를 사용하여 상피 장력을 측정하는 것을 설명합니다. 초파리 위스트레이션(Drosophila gastrulation) 동안, 복부에 국한된 중배엽 전구체 세포는 정점 수축을 겪고 전후방 배향 고랑을 형성하여 배아 표면에서 침윤합니다22,23. 복부 고랑의 형성은 오랫동안 상피 접힘의 메커니즘을 연구하기위한 모델로 사용되어 왔습니다. 복부 고랑 형성은 Drosophila24,25,26,27의 등-복부 패턴 시스템에 의해 관리됩니다. 배아의 복부 쪽에 위치한 두 가지 전사 인자인 트위스트(Twist)와 달팽이(Snail)의 발현은 복부 고랑 형성을 조절하고 중배엽 세포의 운명을 지정한다28. Twist and Snail은 G-단백질 결합 수용체 경로와 RhoGEF2 어댑터 단백질인 T48 29,30,31,32,33을 통해 중배엽 전구체 세포의 정점으로 Rho1 GEF RhoGEF2의 모집을 활성화합니다. 다음으로, RhoGEF2는 Rho-Rho 키나아제 경로 34,35,36,37,38,39를 통해 잠재적 중배엽의 정점 표면 전체에 걸쳐 미오신을 활성화합니다. 활성화된 미오신은 중배엽 원시의 정점 표면 전체에 걸쳐 세포상 악토미오신 네트워크를 형성하며, 그 수축은 정점 수축을 유도하고 정점 조직 장력의 급격한 증가를 초래한다 14,37,40.
이 프로토콜에 설명된 광유전학적 도구인 Opto-Rho1DN은 Rho1(Rho1DN)41의 지배적인 음성 형태의 청색광 의존성 원형질막 모집을 통해 악토미오신 수축성을 억제합니다. Rho1DN의 T19N 돌연변이는 GDP를 GTP로 교환하는 돌연변이 단백질의 능력을 제거하여 단백질을 영구적으로 비활성화합니다34. Rho1DN, C189Y의 후속 돌연변이는 신호42,43을 표적으로 하는 순진한 막을 제거합니다. Rho1DN이 원형질막에 주입되면 Rho1 GEF에 결합하여 가두어 Rho1의 활성화와 미오신 및 액틴의 Rho1 매개 활성화를 차단합니다34,44. Rho1DN의 원형질막 모집은 Cryptochrome 2 및 결합 파트너 CIB1에서 파생된 광 의존성 이량체화 모듈을 통해 달성됩니다. 크립토크롬 2는 애기장대45에 있는 청색광 활성화 크립토크롬 광수용체입니다. 크립토크롬 2는 광여기 상태에서만 기본 나선-루프-나선 단백질인 CIB1에 결합합니다45. 크립토크롬 2(Cryptochrome 2, CRY2 PHR, 이하 CRY2로 지칭)와 CIB1(이하 CIBN)의 N-말단 도메인(aa 1-170)으로부터 보존된 N-말단, 광분해효소 상동성 영역(PHR)이 광-유도 이량체화에 중요하다는 것이 나중에 밝혀졌다46. Opto-Rho1DN에는 두 가지 구성 요소가 포함되어 있습니다. 제1 성분은 CAAX 앵커와 융합된 CIBN 단백질이며, 이는 단백질을 원형질막(47)에 국한시킨다. 두 번째 구성 요소는 Rho1DN41과 융합된 mCherry 태그가 부착된 CRY2입니다. 청색광이 없으면 CRY2-Rho1DN이 세포질에 남아 있습니다. 청색광 자극 시 CRY2-Rho1DN은 막 고정 CIBN과 여기 CRY2 사이의 상호 작용을 통해 원형질막을 표적으로 합니다. Opto-Rho1DN은 자외선 A (UVA) 광 및 청색광 (400-500 nm, 450-488 nm에서 피크 활성화) 또는 2 광자 자극41,46,47,48을 수행 할 때 830-980 nm 펄스 레이저에 의해 활성화 될 수 있습니다. 따라서 Opto-Rho1DN은 여기 GFP에 일반적으로 사용되는 파장(단일 광자 이미징의 경우 488nm, 이광자 이미징의 경우 920nm)에 의해 자극됩니다. 대조적으로, 여기 mCherry에 일반적으로 사용되는 파장(단일 광자 이미징의 경우 561nm, 이광자 이미징의 경우 1,040nm)은 광유전학적 모듈을 자극하지 않으므로 사전 자극 이미징에 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 샘플 조작 중 원치 않는 자극의 위험을 최소화하는 데 사용되는 접근 방식을 설명합니다.
레이저 절제는 세포와 조직의 장력을 감지하고 측정하기 위해 광범위하게 사용되어 왔다49. 이전 연구에서는 레이저 강도가 적절하게 제어될 때 펨토초 근적외선 레이저를 사용하는 이광자 레이저 절제가 원형질막 파거를 일으키지 않고 일부 세포 내 구조(예: 피질 악토미오신 네트워크)를 물리적으로 손상시킬 수 있음을 보여주었습니다(50,51). 조직이 장력을 받고 있는 경우 조직 내 관심 영역의 레이저 절제는 절제된 영역에 인접한 세포의 즉각적인 바깥쪽 반동을 초래합니다. 반동 속도는 장력의 크기 및 반동을 겪는 구조물을 둘러싼 매체(세포질)의 점도의 함수이다(49). 근적외선 레이저의 우수한 침투 깊이와 잘 제한된 초점 절제를 달성할 수 있는 능력으로 인해 이광자 레이저 절제는 생체 내에서 조직 장력을 감지하는 데 특히 유용합니다. 이 프로토콜에서 입증된 바와 같이, 이 방법은 동적 조직 리모델링 동안 조직 역학에 대한 Rho1 의존성 세포 수축성의 직접적인 영향을 조사하기 위해 악토미오신 수축성의 Opto-Rho1DN 매개 비활성화와 쉽게 결합될 수 있습니다.
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Protocol
1. 유전자 십자가 설정 및 난자 채취 컵 준비
- 광유전학적 계통 UASp-CIBNpm(I)에서 암컷 파리(처녀)를 선택합니다. UASp-CRY2-Rho1DN-mCherry(III)를 입체현미경 하의CO2 패드 상에서 모체 GAL4 드라이버 라인 67 Sqh-mCherry로부터 수컷 파리와 교배시키고; 15 E-카데린-GFP.
참고: 67과 15는 각각 두 번째(II) 및 세 번째(III) 염색체에 삽입된 모체-Tubulin-GAL4를 나타냅니다(52). 이 프로토콜에 사용된 GAL4 라인은 또한 mCherry 태그된 미오신 조절 경쇄 Sqh(스파게티 스쿼시)37 및 GFP 태그가 붙은 E-cadherin53을 발현합니다. 광유전학적 계통의 파리는 여전히 FM7 및 TM6 밸런서 염색체를 포함할 수 있습니다. 모체 GAL4 드라이버 라인의 파리는 여전히 CyO 및 TM3 밸런서 염색체를 포함할 수 있습니다. - ~10일 후, 다음 유전자형을 갖는 F1 암컷 파리를 선택합니다: UASp-CIBNpm/+; 67제곱미터체리/+; 15 E-카데린-GFP/UASp-CRY2-Rho1DN-mCherry. 수컷 파리와 함께 달걀 수집 컵을 설치하십시오.
- 올바른 유전자형을 가진 암컷 파리가 균형 염색체를 포함하지 않는지 확인하십시오(즉, 곱슬 날개[Cy], 짧은 강모[Sb], 막대 또는 신장 모양의 눈[B] 또는 여분의 상완골 강모[Hu]), 이는 각각 주식을 생성하는 데 사용되는 CyO, TM3, FM7 및 TM6 밸런서의 마커입니다. 표면에 신선한 효모 페이스트가 가미된 사과 주스 접시로 컵을 덮습니다.
참고: F1 암컷에서 광유전학적 구성 요소는 모계에서 발현됩니다. 따라서 컵을 세팅하는 데 사용되는 F1 암컷은 처녀일 필요가 없습니다. 편의를 위해 컵에 동일한 F1 개체군의 수컷 파리를 사용하는 것이 좋습니다.
- 올바른 유전자형을 가진 암컷 파리가 균형 염색체를 포함하지 않는지 확인하십시오(즉, 곱슬 날개[Cy], 짧은 강모[Sb], 막대 또는 신장 모양의 눈[B] 또는 여분의 상완골 강모[Hu]), 이는 각각 주식을 생성하는 데 사용되는 CyO, TM3, FM7 및 TM6 밸런서의 마커입니다. 표면에 신선한 효모 페이스트가 가미된 사과 주스 접시로 컵을 덮습니다.
- 환경에서 빛이 새어 나오지 않도록 알루미늄 호일로 덮인 판지 상자에 컵을 보관하십시오. 실온(~21-23 °C)에 보관된 컵의 경우 매일 사과 주스 접시를 교체하거나 18 °C에 보관된 컵의 경우 이틀에 한 번씩 교체하십시오.
- 플레이트를 교체하기 직전에 컵을 평평한 표면(예: 벤치 상단)에 두드려 파리가 컵 바닥에 머물게 하고 파리가 빠져나가는 것을 방지합니다. 어두운 방에서 사과 주스 접시를 교체하고 조명을 위해 적색광이 있는 헤드램프를 사용하십시오( 재료 표 참조).
참고: 모체-Tubulin-GAL4 및 UASp의 제어 하에 있는 구성물의 발현을 증가시키려면 배아 수집 전 최소 18일 동안 컵을 3°C에서 유지하는 것이 좋습니다. 이 잠복기는 또한 파리가 컵에 적응하고 효모 페이스트를 잘 먹여 최적의 계란 생산을 달성 할 수있게합니다.
- 플레이트를 교체하기 직전에 컵을 평평한 표면(예: 벤치 상단)에 두드려 파리가 컵 바닥에 머물게 하고 파리가 빠져나가는 것을 방지합니다. 어두운 방에서 사과 주스 접시를 교체하고 조명을 위해 적색광이 있는 헤드램프를 사용하십시오( 재료 표 참조).
2. 원하는 단계에서 배아를 수집하고 광유전학적 자극을 위해 준비합니다.
알림: 모든 샘플 수집 및 준비 단계는 조명을 위해 "안전한 조명"(예: 적색광)을 사용하여 어두운 방에서 수행해야 합니다. 광유전학적 구성 요소는 주변광에 매우 민감합니다. 주변광에 조금이라도 노출되어도 시편이 조기에 자극을 받습니다. 일반적으로 녹색-적색 범위(>532nm)의 빛은 원치 않는 자극을 일으키지 않습니다.
- 초기 배아 발생 시 배아를 수집하려면 배아 수집 8-16시간 전(18°C에서) 컵에 새 사과 주스 접시를 놓습니다.
- 배아 수집시 사과 주스 접시를 교체하십시오. 컵에서 떼어낸 접시에 라벨을 붙이고 접시 표면을 할로카본 오일 27의 얇은 층으로 덮습니다( 재료 표 참조). 달걀 껍질이 투명해질 때까지 30-60초 동안 기다립니다.
- 주황색-빨간색 플라스틱 방패( 재료 표 참조)를 직립형 입체경의 무대에 놓습니다. 주황색-적색 차폐막의 배치는 투과광으로부터 청록색 파장을 차단하여 샘플 조명 중에 바람직하지 않은 자극을 방지합니다.
참고: 이 프로토콜에서는 배아 수집을 위해 직립 입체경이 사용됩니다( 재료 표 참조). - 주황색-빨간색 방패 위에 사과 주스 접시를 놓습니다. 실체현미경의 투과광을 켜서 샘플을 비춥니다. 핀셋을 사용하여 사과 주스 접시에서 적절한 단계에서 5-15 개의 배아를 수집하십시오. 핀셋으로 배아를 짜지 마십시오.
참고: 이 프로토콜에서 적절한 배아는 초기 중반 세포화 단계에 있어야 합니다. 이 단계의 배아는 형성 배반엽 세포를 포함하는 투명하고 균일 한 주변 세포질 층으로 둘러싸인 어두운 불투명 한 노른자를 가져야합니다. 배아의 표면과 평행 한 연속선으로 나타나는 분열 고랑의 앞쪽 가장자리 ( "세포화 앞면")는 주변 세포질 깊이의 절반을 통과해서는 안됩니다. - 종이 타월(~1.5cm × 1.5cm)에 배아를 부드럽게 닦아내고 핀셋을 사용하여 배아에서 과도한 기름을 제거합니다.
- 플라스틱 전사 피펫을 사용하여 새로 준비한 40% 표백제(~3% 차아염소산나트륨, 재료 표 참조)를 새 작은 정사각형 종이 타월(~1.5cm × 1.5cm)에 몇 방울 떨어뜨려 종이 타월이 얇은 표백제로 덮이도록 합니다. 핀셋을 사용하여 마른 종이 타월에서 표백제에 적신 종이 타월로 배아를 옮기고 배아가 표백제에 담겨 있는지 확인합니다. 배아가 박모식이 될 때까지 2-4분 정도 기다리십시오.
- 탈모막 후 핀셋을 사용하여 큰 티슈 페이퍼에 정사각형 종이 타월을 닦아 과도한 표백제를 제거합니다. 배아가 있는 면이 위를 향하도록 합니다.
- 배아를 헹구려면 핀셋을 사용하여 정사각형 종이 타월을 탈 이온수 한 방울에 부드럽게 담그고 큰 티슈 페이퍼에 빠르게 닦아냅니다. 이 과정을 8번 반복하여 잔여물 표백제를 제거합니다.
- 속눈썹 도구를 사용하여 종이 타월에서 35mm 유리 바닥 접시로 배아를 옮깁니다( 재료 표 참조). 배아를 완전히 덮기 위해 접시에 탈 이온수를 첨가하십시오. 속눈썹 도구를 사용하여 배아의 위치와 방향을 미세 조정합니다.
참고: 탈모막 후 배아는 유리 표면에 달라붙는 경향이 있고 섭동 없이 움직이지 않으므로 유리 바닥 접시에 배아를 고정시키기 위해 추가 처리(예: 접착제)를 적용할 필요가 없습니다. - 배아가 들어 있는 35mm 유리 바닥 접시를 내광성 블랙박스( 재료 표 참조) 안에 넣어 샘플을 보호 합니다.amp이식 과정에서 빛에 노출되지 않도록 합니다. 다광자 현미경이 있는 상자를 방으로 가져옵니다.
3. 배아의 광유전학적 자극, 레이저 절제 및 이미징
참고: 이 실험에 사용된 다광자 시스템( 재료 표 참조)은 동시 이중 파장 이미징이 가능합니다. 또한 458nm 레이저가 있는 광자극 장치와 별도의 검류계 스캐너가 포함되어 있어 정의된 관심 영역(ROI) 내에서 광활성화/자극이 가능합니다. 참고로, 녹색-노란색 형광 단백질을 여기시키는 데 사용되는 920nm 레이저는 청색 레이저 매개 자극에 비해 느리지만 Opto-Rho1DN을 자극합니다.
- 다광자 현미경을 내광성 검은색 천으로 덮고( 재료 표 참조) 샘플 설정 및 이미징 중에 배아의 원치 않는 자극을 방지합니다.
참고: 현미경에 장착된 감광성 검출기를 보호하기 위해 일반 다광자 이미징 중에 동일한 접근 방식이 사용됩니다. - 실내 조명과 컴퓨터 화면을 끕니다. 소프트웨어의 'Backlight of touch panel controller(터치 패널 컨트롤러의 백라이트)'에서 OFF (끄기)를 클릭하여 터치 패널 컨트롤러를 끕니다. 방에 다른 주변 조명이 없는지 확인하십시오.
- 현미경의 검은색 천 덮개의 앞면을 엽니다. 블랙박스에서 35mm 유리 바닥 접시를 꺼내 현미경 스테이지에 놓습니다.
- 일반적으로 epifluorescence를 위한 여기광으로 사용되는 녹색 빛으로 배아를 비춥니다. 이렇게 하려면 형광 조명 장치를 켜고 소프트웨어의 'Ocular' 패널에서 Ocular를 선택한 다음 'Cube turret'을 4:TRITC로 변경합니다. 접안렌즈를 사용하여 관심 있는 배아를 식별하고 초점을 맞춥니다.
참고: 녹색 조명 시각화는 형광 조명 장치에서 생성된 백색광이 528-553nm 여기 필터, 565nm 빔 스플리터 및 590-650nm 방출 필터를 포함하는 내장 표준 TRITC 필터 큐브를 통과하도록 하여 달성됩니다. 파란색이 아닌 다른 조명도 샘플 조명에 잘 작동해야 합니다. 여기광의 강도가 낮고 접안렌즈로 향하지 않기 때문에 이 단계에서 보안경을 착용할 필요가 없습니다. 배아는 자가형광으로 인해 균일하게 빨간색으로 나타납니다. - s가 빛으로부터 완전히 보호되도록 검은색 천 덮개를 닫습니다. 컴퓨터 화면을 켜서 현미경을 제어하는 소프트웨어에 액세스합니다. 이미지 획득을 위해 소프트웨어에서 'Ocular'를 LSM 으로 변경합니다.
- 25x Water Immersion Objective를 사용하여 제어, 자극되지 않은 배아에서 레이저 절제를 수행합니다.
- 소프트웨어의 'Tool Window'에서 Bright Z, Sequence Manager 및 LSM Stimulation 을 클릭합니다. 스캐너 유형을 Galvano 로 설정하고 스캔 크기를 512 × 512로 설정합니다. 'PMT 설정' 패널에서 CH1 및 CH3 을 켜서 1,040nm 레이저를 사용할 수 있도록 하고 Live × 4 를 클릭하여 배아를 시각화합니다.
- 소프트웨어의 회전 기능을 사용하여 배아를 회전 시켜 배아의 전후방 축이 수직 방향이 되도록 합니다. 확대/축소를 3으로 설정합니다. '스캔 설정'의 모양 도구를 사용하여 관심 영역(ROI)을 그리고 '참조' 패널에서 ROI의 크기를 설정합니다. ROI를 너비 512픽셀, 높이 100픽셀(171 × 33μm2)으로 설정합니다.
- 사전 절제 Z-스택에 대한 획득 파라미터를 설정합니다.
- 배아의 표면을 'Z 섹션' 아래에 0 으로 등록합니다. 시작을 0 으로, 끝을 100μm로 설정합니다. 스텝 크기를 2μm로 설정합니다. '시리즈' 탭에서 Z를 선택하여 Z 획득 모드를 활성화합니다.
- Bright Z 기능을 사용하여 1,040nm 레이저 강도를 3%에서 7%로 선형으로 증가시키도록 설정합니다.
- 'Sequence Manager'에서 LSM 을 클릭하여 현재 이미징 설정을 파이프라인의 첫 번째 작업으로 저장합니다.
참고: 배아의 단계를 확인하기 위해 절제 전 Z-스택을 얻습니다. 이 실험에서 CRY2-Rho1DN-mCherry 및 Sqh-mCherry는 1,040nm 레이저에 의해 여기됩니다. 정점 수축 동안 Sqh-mCherry 신호는 복부 중배엽 세포의 정근단 영역에서 강화되는 반면 CRY2-Rho1DN-mCherry는 자극 전에 세포질입니다. 자극 전 및 자극 후 이미징에 사용되는 레이저 강도는 최적의 신호 대 잡음비와 광표백 방지 사이의 균형을 기반으로 경험적으로 결정됩니다.
- 절제 전 동영상에 대한 획득 파라미터를 설정합니다.
- 3.5.2 단계에 설명된 대로 배아의 복부 표면 근처의 전체 512 × 512 픽셀 영역(171 × 171 μm2, 3배 줌)의 이미징을 허용하기 위해 기존 ROI를 삭제합니다. 1,040nm 레이저 강도를 3%로 설정합니다.
- Time(시간)을 선택하고 'Series(시리즈)' 패널에서 Z(Z)를 선택 취소합니다. '타임랩스' 패널에서 '간격'을 FreeRun으로 유지합니다. 주기를 10으로 설정합니다.
- 'Sequence Manager'에서 LSM 을 클릭하여 파이프라인의 다음 작업으로 현재 설정을 저장합니다.
참고: 이 작업의 목적은 이미지 획득을 위해 1,040nm 레이저를 사용하여 10프레임 단일 Z-평면 사전 절제 동영상을 얻는 것입니다. 이미지 획득 속도는 프레임당 약 1초입니다.
- 레이저 절제에 대한 매개변수를 설정합니다.
- 레이저 절제를 위해 바이텔린 멤브레인 바로 아래에서 ~20μm 깊이까지 3D 영역을 정의합니다(그림 1A). Z-스택의 시작을 바이텔린 멤브레인 바로 아래에 있는 평면으로 설정하고 끝을 시작 평면보다 20μm 더 깊은 평면으로 설정합니다. 스텝 크기를 1.5μm로 설정합니다.
참고: 절제된 영역의 ROI는 너비가 ~30픽셀, 높이가 ~10픽셀(내측-측면 축을 따라 ~10μm, AP 축을 따라 ~3.3μm)입니다. 여러 Z-평면에서 샘플을 절제하는 목적은 복부 세포의 정점 표면이 절제되도록 하는 것입니다. 이것은 복부 세포가 Rho1 억제 후 빠른 정점 이완을 경험하기 때문에 자극된 배아에 특히 중요합니다. - 'PMT 설정' 패널에서 CH2 및 CH4를 켜면 920nm 레이저를 사용할 수 있습니다. 920nm 레이저의 강도를 30%로 설정합니다. 레이저 절제를 위해 3.5.5.1단계에서 정의한 3D 영역 내의 단일 Z-스택에 대해 920nm 레이저로 이미지 획득을 설정합니다.
참고: 이 단계에서 선택한 레이저 강도는 조직을 절제하기에 충분하지만(레이저 치료 직후 조직 반동으로 표시됨) 원형질막을 분명히 손상시키지는 않습니다(세포막에 화상 자국이 없는 것으로 표시됨)(그림 1B, C). - 'Sequence Manager'에서 LSM 을 클릭하여 파이프라인의 다음 작업으로 현재 설정을 저장합니다.
- 레이저 절제를 위해 바이텔린 멤브레인 바로 아래에서 ~20μm 깊이까지 3D 영역을 정의합니다(그림 1A). Z-스택의 시작을 바이텔린 멤브레인 바로 아래에 있는 평면으로 설정하고 끝을 시작 평면보다 20μm 더 깊은 평면으로 설정합니다. 스텝 크기를 1.5μm로 설정합니다.
- 절제 후 동영상에 대한 획득 파라미터를 설정합니다.
- 1,040nm 및 920nm 레이저를 모두 사용하여 절제 후 100프레임 단일 Z면 영상에 대한 이미지 획득을 설정합니다. 1,040nm 레이저와 920nm 레이저의 강도를 각각 3%와 0.3%로 설정합니다. 3.5.4단계에서 지정한 영역은 동일한 이미지 획득 속도로 이미지화됩니다.
- 'Sequence Manager'에서 LSM을 클릭하여 파이프라인의 다음 작업으로 현재 설정을 저장합니다.
참고: 실제 획득 전에 3.5.3-3.5.6단계에 설명된 매개변수를 '시퀀스 관리자'에 순차적 작업으로 저장하는 목적은 레이저 절제 후 즉각적인 조직 반응을 캡처하는 것입니다.
- 'Acquire'에서 Sequence 를 선택합니다. 필요에 따라 데이터 저장 경로와 파일 이름을 변경합니다. Ready(준비 )를 클릭하고 소프트웨어가 파이프라인을 초기화할 때까지 기다립니다. 그런 다음 시작을 클릭하여 파이프라인을 실행합니다.
- 자극된 배아에서 레이저 절제를 시행합니다.
- 3.5.1-3.5.3 단계에 설명된 대로 사전 절제 Z-스택에 대한 획득 파라미터를 설정합니다. 'Sequence Manager'에서 LSM을 클릭하여 현재 설정을 파이프라인의 첫 번째 작업으로 저장합니다.
- 정의된 ROI 내에서 광유전학적 자극을 위한 파라미터를 설정합니다.
- 확대/축소를 1 로 변경하고 배아의 복부 표면을 덮는 ROI를 선택합니다(~512 × 300μm2). CH1-CH4 감지기를 끕니다.
- LSM 자극을 클릭합니다. 지속 시간 내에 연속을 선택 취소하고 12초를 입력합니다. 0.3% 레이저 강도로 458nm를 확인합니다.
- 'Sequence Manager'에서 Stimulation 을 클릭하여 현재 설정을 파이프라인의 다음 작업으로 저장합니다.
참고: 458nm 레이저 강도를 증가시켜 보다 빠른 자극을 얻을 수 있습니다. 그러나, 더 높은 레이저 강도를 사용할 때, 산란된 레이저 광은 ROI에 인접한 영역을 자극할 수 있으며, 이는 공간적으로 제한된 자극이 필요한 경우 이상적이지 않다.
- 자극 후 3분의 대기 시간을 설정하여 미오신의 완전한 비활성화 및 정점 F-액틴의 분해를 보장하고 레이저 절제 전에 정적 조직 형태를 달성합니다. 'Sequence Manager(시퀀스 관리자)'에서 Wait/ Pause(대기/일시 중지 )를 클릭하고 원하는 'Wait(대기)' 시간을 설정하면 됩니다.
참고: 단일 라운드의 자극(12초 동안 0.3% 458nm 레이저)으로 인한 막으로의 CRY2-Rho1DN-mCherry 모집은 자극 후 10-15분 후에 명확하게 감지할 수 있습니다. 이것은 ~9분47초의 공개된 해리 하프 타임과 일치합니다. - 1,040nm 및 920nm 레이저가 모두 이미지 획득에 사용된다는 점을 제외하고 3.5.4단계에서 설명한 대로 단일 Z-평면 사전 절제 동영상에 대한 획득 매개변수를 설정합니다. CH1-CH4 감지기를 켭니다. 1,040nm 레이저와 920nm 레이저의 강도를 각각 3%와 0.3%로 설정합니다. 'Sequence Manager'에서 LSM 을 클릭하여 파이프라인의 다음 작업으로 현재 설정을 저장합니다.
- 3.5.5 단계에서 설명한 대로 레이저 절제에 대한 매개변수를 설정합니다. 'Sequence Manager'에서 LSM 을 클릭하여 파이프라인의 다음 작업으로 현재 설정을 저장합니다.
- 3.5.6단계에서 설명한 대로 단일 Z-평면 절제 후 동영상에 대한 획득 파라미터를 설정합니다. 'Sequence Manager'에서 LSM 을 클릭하여 파이프라인의 다음 작업으로 현재 설정을 저장합니다.
- 'Acquire'에서 Sequence 를 선택합니다. 필요에 따라 데이터 저장 경로와 파일 이름을 변경합니다. Ready(준비 )를 클릭하고 소프트웨어가 파이프라인을 초기화할 때까지 기다립니다. 그런 다음 시작을 클릭하여 파이프라인을 실행합니다.
4. 레이저 절제 후 조직 반동 속도 정량화
- ImageJ에서 절제 후 동영상을 엽니다.
- 직사각형 선택 도구를 사용하여 절제된 영역을 덮는 복부 정중선을 따라 작은 ROI를 그립니다. ROI의 너비는 9픽셀입니다. ROI의 높이는 ROI가 레이저 절제 후 조직 반동의 전체 범위를 커버할 수 있을 만큼 충분히 크도록 설정됩니다.
- '이미지' 탭에서 복제 를 클릭합니다. 팝업 창에서 Duplicate stack (스택 복제)을 선택한 다음 OK(확인 )를 클릭하여 선택한 ROI 내에서 스택을 복제합니다.
- Image > Stacks > Make Montage를 통해 복제된 스택에서 몽타주를 생성합니다. 팝업 창에서 행 번호를 1로 설정하고 열 번호를 스택의 총 프레임 수(이 경우 100)로 설정합니다.
- 생성된 몽타주에서 시간 경과에 따른 절제된 영역의 A-P 너비를 측정합니다.
- ImageJ의 멀티포인트 툴을 사용하여 몽타주의 각 시점에 대해 절제된 영역의 A-P 경계를 표시합니다.
- 파일(File) > 다른 이름으로 저장(Save as > XY Coordinates)을 사용하여 표시된 점의 좌표를 저장합니다.
- 측정된 XY 좌표를 MATLAB으로 가져옵니다. 하한의 Y 좌표에서 상한선의 Y 좌표를 빼서 각 시점에 대한 절제 영역의 A-P 폭을 계산합니다.
- MATLAB의 'polyfit' 함수를 사용하여 "시간 경과에 따른 폭" 곡선의 처음 20초를 선에 피팅하여 조직 반동 속도를 결정합니다. 적합선의 기울기를 조직 반동 비율로 보고합니다.
- 자극된 샘플과 자극되지 않은 샘플 사이의 조직 반동 속도를 비교하기 위해 통계적 테스트를 수행합니다.
참고: 조건당 최소 5개의 배아에서 데이터를 얻는 것이 좋습니다. 통계적 비교를 위해 양측 Wilcoxon 순위합 검정과 양측 학생 t-검정을 모두 사용할 수 있습니다.
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Representative Results
정점 수축을 겪고 있는 자극되지 않은 배아에서 Sqh-mCherry는 복부 중배엽 세포의 정근단 영역에서 농축된 반면 CRY2-Rho1DN-mCherry는 세포질이었습니다(그림 1A). 수축 영역 내의 레이저 절제는 AP 축을 따라 빠른 조직 반동을 일으켰습니다(그림 1B, C). 자극된 배아에서 CRY2-Rho1DN-mCherry 신호는 원형질막에 국한된 반면, Sqh-mCherry의 정점 신호는 완전히 사라졌습니다(그림 1A). 자극된 배아에서 레이저 절제는 그림 1B, C 에 예시되고 그림 1D에서 정량화된 바와 같이 명백한 조직 반동을 초래하지 않았습니다. 이러한 결과는 조직 긴장의 생성이 활성 치단 악토미오신 수축성을 필요로 한다는 것을 나타낸다; 악토미오신이 Rho1 억제 시 비활성화되면 정점 조직 장력도 감소합니다41. 이러한 관찰은 복부 중배엽 세포에서 정점 미오신 수축성의 활성화가 배아의 복부 표면에서 조직 장력의 증가를 초래한다는 이전의 발견과 일치한다40.
그림 1: 정점 수축 동안 Opto-Rho1DN 자극은 배아의 복부 표면에서 피질 장력의 즉각적인 손실을 초래 합니다. (A) 피질 장력을 감지하기 위한 레이저 절제에 대한 실험 설정을 묘사한 만화. 노란색 음영 영역은 절제된 영역을 나타냅니다. 자극된 배아의 경우 레이저 절제 3분 전에 Opto-Rho1DN의 광 활성화를 수행했습니다. 자극 후 정점 이완으로 인해, 복부 세포의 매우 정점 표면의 절제를 보장하기 위해 여러 z-평면을 절제(노란색-음영 영역)하였다. (나,씨) 자극되지 않은 배아와 자극된 배아의 비교. 자극된 배아에서 명백한 조직 반동이 관찰되지 않았습니다(자극되지 않은 배아의 경우 N = 6, 자극된 배아의 경우 N = 5). (B) En 레이저 절제된 배아의 얼굴 모습. 노란색 음영 상자는 절제 영역을 표시합니다. (C) 절제된 영역의 폭 변화를 나타내는 키모그래프. 노란색 점선은 절제 부위를 나타냅니다. (D) 레이저 절제 후 처음 20초 동안 AP 축을 따라 절제된 영역의 폭 변화. 자극되지 않은 대조군 배아에서 레이저 절단 후 명확한 조직 반동이 관찰되었습니다. 대조적으로, 자극된 배아에서 조직 반동이 거의 또는 전혀 관찰되지 않았으며, 이는 Rho1 억제 후 정점 장력의 부족을 나타냅니다. 오차 막대는 표준 편차입니다. p-값은 양측 Wilcoxon 순위합 검정을 사용하여 계산되었습니다. 이 수치는 Guo et al.41에서 재사용되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 프로토콜은 악토미오신 수축성이 비활성화된 직후 조직 장력의 변화를 조사하기 위해 광유전학과 레이저 절제의 병용을 설명했습니다. 여기에 설명된 광유전학적 도구는 Rho1(Rho1DN)의 지배적인 음성 형태를 이용하여 내인성 Rho1 및 Rho1 의존성 악토미오신 수축성을 급격히 억제합니다. 초파리 복부 고랑 형성의 맥락에서 Opto-Rho1DN의 이전 특성화는 이 도구가 동시 미오신 불활성화 및 액틴 분해를 통해 정점 악토미오신 수축성의 빠른 불활성화를 매개하는 데 매우 효과적임을 입증했습니다41. 특히, 정점 수축 시에 배아의 자극은 정점 수축을 겪는 세포에서 60초 이내에 정점 미오신 신호의 감소를 초래하였다41. Rho1 억제에 따른 피질 미오신의 이러한 빠른 제거는 각각 Rho1 및 미오신 경쇄 포스파타제에 대한 GTPase 활성화 단백질(GAP)의 활성에 의해 유발되는 활성 및 비활성 상태를 통한 Rho1 및 미오신의 빠른 순환 때문일 수 있습니다19,54. 악토미오신에 대한 영향과 일관되게, 광유전학과 레이저 절제술을 결합한 결과, 정점 수축 동안 Opto-Rho1DN 자극이 배아의 복부 영역에서 상피 긴장의 즉각적인 손실을 초래한다는 것을 입증했습니다41(그림 1). 이 결합된 접근 방식을 통해 우리는 전례 없는 공간적 및 시간적 정밀도로 조직 역학을 조절하는 Rho1 매개 세포 수축성의 기능을 조사할 수 있었고, 기존의 유전적 접근 방식으로는 달성하기 어려운 장기적인 영향으로부터 즉각적인 영향을 해부할 수 있었습니다.
Opto-Rho1DN을 사용할 때 중요한 기술적 고려 사항은 공구가 주변광에 매우 민감하다는 것입니다. 실험에서 일반적으로 발생하는 문제는 자극 단계 전에 원형질막에 CRY2-mCherry-Rho1DN을 모집하는 것인데, 이는 일반적으로 샘플 준비, 현미경실로 샘플 이동, 현미경 스테이지에서의 샘플 위치 지정 및 사전 자극 이미지 획득 단계 중 하나에서 샘플의 조기 자극으로 인해 발생합니다. 우리의 프로토콜에서는 적색광 아래 어두운 방에서 플라이 컵과 배아를 다루고, 실체 현미경으로 배아를 선택하고 장착할 때 조명광에서 청색 파장을 걸러내고, 자극 전에 400-500nm 레이저(단일 광자 여기) 또는 830-980nm 펄스 레이저(다광자 여기)에 배아가 노출되는 것을 방지하는 등 원치 않는 자극을 방지하기 위해 여러 절차가 사용됩니다. 샘플의 원치 않는 자극을 방지하기 위해 실험의 여러 단계에서 각별한 주의를 기울이는 것이 중요합니다. 또한, Opto-Rho1DN을 사용하여 배아 41의 특정 관심 영역(ROI) 내에서Rho1을 억제하는 경우, 원형질막에 대한 CRY2-Rho1DN의 강력한 전좌를 달성할 수 있는 가장 낮은 레이저 강도를 사용하는 것이 좋습니다. Opto-Rho1DN은 청색 파장에 매우 민감하기 때문에 고강도 청색 레이저는 산란광으로 인해 ROI 외부의 세포 또는 인접한 배아에 원치 않는 자극을 줄 수 있습니다.
현재 버전에서 Opto-Rho1DN 도구에는 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 먼저, 이 프로토콜에 기술된 실험을 위해, 세포질로부터 원형질막41,47로 활성화된 CRY2-Rho1DN을 모집하기 위해 원형질막 국소 CIBN 앵커를 사용하였다. 이러한 설계에 의해, 세포질에서 활성화된 CRY2-Rho1DN 단백질의 확산으로 인해 특정 원형질막 도메인 내에서 제한된 Rho1 억제를 수행하는 것은 어렵다. 세포 내 규모에서 공간 정밀도를 더욱 향상시키려면 보다 구체적인 세포 내 국소화 패턴을 가진 새로운 CIBN 앵커의 개발이 기다리고 있습니다. 둘째, Opto-Rho1DN은 초기 배발생 동안 Rho1을 억제하도록 설계되었습니다. CIBNpm과 CRY2-Rho1DN-mCherry의 발현은 UASp에 의해 조절되며, UASp는 암컷 생식계열에서 발현하도록 표준화되어 있다 5 5. 초기 배아 발생 이후 체세포 조직에서 이러한 모듈을 발현하려면 UASp를 체세포 발현을 유도하는 데 더 효과적인 프로모터로 대체해야 할 수 있습니다(예: UASt56). 마지막으로, Opto-Rho1DN의 효과는 CIBN 앵커 및 CRY2-Rho1DN 단백질의 풍부도에 달려 있습니다. 현재 버전의 도구에서는 광유전학 모듈의 발현을 구동하는 데 사용되는 GAL4 드라이버 라인에 의해 결정됩니다. 이 프로토콜에 기술된 모체 GAL4 드라이버를 사용할 때, 악토미오신 수축성의 신속하고 강력한 억제를 달성하기 위해 GAL4 유전자의 두 사본(예를 들어, 67 및 15 모두)을 제공하는 라인을 사용하는 것이 중요합니다. F1 암컷에서 모체 GAL4의 복제 수를 2개에서 1개로 줄이면 억제 효과가 유의하게 감소했습니다.
기존의 유전적 접근과 비교하여 이 프로토콜에 설명된 광유전학적 접근은 초기 초파리 배아에서 Rho1의 단계 및 조직 특이적 기능을 해부하는 데 유리합니다. 초기 초파리 배발생에서 Rho1의 기능은 주로 모체에 로딩된 유전자 산물11에 의해 충족된다. Rho1을 고갈시키는 것은 모체적으로 난자 형성57을 차단하여 초기 배아 발생 동안 그 기능에 대한 연구를 방해합니다. 지난 몇 년 동안 초파리 배아에서 내인성 Rho1 활동을 조절하기 위해 여러 광유전학적 도구가 개발되었습니다. Izquierdo et al. 및 Rich et al. 초파리 배아에서 Rho GEF의 촉매 영역의 국소화를 조절하여 Rho1 활성을 활성화하는 광유전학적 도구를 개발했습니다48,58. 또한, Herrera-Perez et al. 내인성 Rho1 활성을 활성화하거나 억제하기 위해 전장 RhoGEF2(optoGEF) 또는 전장 C-GAP(optoGAP)을 사용하여 각각 두 가지 광유전학적 도구를 개발했습니다59. optoGAP는 원형질막에 Rho1 GAP를 모집하여 기능하기 때문에 그 적용은 내인성 Rho1 GEF의 존재에 민감할 수 있으며, 이는 GAP의 이소성 모집 효과를 상쇄하거나 심지어 무시할 수 있습니다. 대조적으로, Rho1 GEF를 직접 격리함으로써 Opto-Rho1DN은 내인성 Rho1 및 Rho1 의존성 악토미오신 수축성을 억제하는 보다 강력한 방법을 제공할 수 있습니다.
배아 발생 및 배아 후 발달에서 Rho1의 광범위한 기능을 감안할 때, 제시된 프로토콜은 광범위한 형태 발생 과정에서 Rho1 및 Rho1 의존성 세포 재구성의 기능을 연구하는 데 쉽게 적용될 수 있습니다. 또한, 유사한 전략은 원칙적으로 Rho 계열 GTPases Cdc42 및 Rac와 같은 다른 작은 GTPase를 심각하게 제한하는 데 사용될 수 있는데, 이는 이들의 지배적인 음성 형태가 이들 단백질의 내인성 기능을 억제하는 데 널리 사용되었기 때문이다11. 마지막으로, 이 프로토콜에서 예시된 바와 같이, 광유전학과 레이저 절제 접근법을 결합하면 특정 단백질의 불활성화가 조직 역학 및 조직 역학에 미치는 즉각적인 영향을 조사하는 효과적인 방법을 제공할 수 있으며, 이는 기존의 유전적 접근 방식으로는 밝히기 어려운 조직 형태 형성에 대한 새로운 통찰력을 제공할 것입니다.
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Disclosures
저자는 잠재적인 이해 상충으로 해석될 수 있는 상업적 또는 재정적 관계가 없는 상태에서 연구가 수행되었다고 선언합니다.
Acknowledgments
저자는 이미징 지원에 대해 Ann Lavanway에게 감사를 표합니다. 저자들은 시약을 공유해 준 Wieschaus 연구실과 De Renzis 연구실에, 플라이 스톡에 대해 Bloomington Drosophila Stock Center에 감사를 표합니다. 이 연구는 NIGMS ESI-MIRA R35GM128745 및 미국 암 학회 기관 연구 보조금 #IRG-82-003-33에 의해 BH에 지원됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm glass-bottom dish | MatTek | P35G-1.5-10-C | Used for sample preparation |
| 60 mm × 15 mm Petri dish with lid | Falcon | 351007 | Used for sample preparation |
| Black cloth for covering the microscope | Online | NA | Used to avoid unwanted light stimulation |
| Clorox Ultra Germicadal Bleach (8.25% sodium hypochlorite) | VWR | 10028-048 | Used for embryo dechorination |
| CO2 pad | Genesee Scientific | 59-114 | Used for cross set-up |
| ddH2O | NA | NA | Used for sample preparation |
| Dumont Style 5 tweezers | VWR | 102091-654 | Used for sample preparation |
| Eyelash tool (made from pure red sable round brush #2) | VWR | 22940-834 | Used for sample preparation |
| FluoView (Software) | Olympus | NA | Used for image acquisition and optogenetic stimulation |
| Halocarbon oil 27 | Sigma Aldrich | H8773-100ML | Used for embryo stage visualization |
| ImageJ/FIJI | NIH | NA | Used for image analysis |
| MATLAB | MathWorks | NA | Used for image analysis |
| Nikon SMZ-745 stereoscope | Nikon | NA | Used for sample preparation |
| Olympus FVMPE-RS multiphoton microscope with InSight DS Dual-line Ultrafast Lasers for simultaneous dual-wavelength multiphoton imaging, , a 25x/NA1.05 water immersion objective (XLPLN25XWMP2), and an IR/VIS stimulation unit for photo-activation/stimulation. This system is also equipped with a TRITC filter (39005-BX3; AT-TRICT-REDSHFT 540/25x, 565BS, 620/60M), and a fluorescence illumination unit that emits white light. | Olympus | NA | Used for image acquisition and optogenetic stimulation |
| SP Bel-Art 100-place polypropylene freezer storage box (Black, light-proof box for sample transfer) | VWR | 30621-392 | Used to avoid unwanted light stimulation |
| UV Filter Shield for FM1403 Fluores (Orange-red plastic shield) | Bolioptics | FM14036151 | Used to avoid unwanted light stimulation |
| VITCHELO V800 Headlamp with White and Red LED Lights | Amazon | NA | Used to avoid unwanted light stimulation |
References
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