Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Оптогенетическое ингибирование Rho1-опосредованной сократимости актомиозина в сочетании с измерением эпителиального натяжения у эмбрионов дрозофилы

Published: April 14, 2023 doi: 10.3791/65314
Automatic Translation
1,2, 3, 1
1Department of Biological Sciences, Dartmouth College, 2School of Life Sciences, Westlake University, 3Department of Molecular Biology, Princeton University

Summary

Сократительная способность актомиозина играет важную роль в морфогенезе клеток и тканей. Тем не менее, сложно оперативно манипулировать сократительной способностью актомиозина in vivo . Этот протокол описывает оптогенетическую систему, которая быстро ингибирует Rho1-опосредованную сократительную способность актомиозина у эмбрионов дрозофилы , выявляя немедленную потерю эпителиального напряжения после инактивации актомиозина in vivo.

Abstract

Сократительные силы, генерируемые актином и немышечным миозином II («сократительная способность актомиозина»), имеют решающее значение для морфологических изменений клеток и тканей в различных масштабах длины, таких как деление клеток, миграция клеток, сворачивание эпителия и морфогенез ветвления. Глубокое понимание роли сократительной способности актомиозина в морфогенезе требует подходов, позволяющих осуществлять быструю инактивацию актомиозина, чего трудно достичь с помощью традиционных генетических или фармакологических подходов. Представленный протокол демонстрирует использование системы оптогенетической димеризации Opto-Rho1DN на основе CRY2-CIBN для ингибирования сократительной способности актомиозина у эмбрионов дрозофилы с точным временным и пространственным контролем. В этой системе CRY2 сливается с доминирующей отрицательной формой Rho1 (Rho1DN), тогда как CIBN закрепляется на плазматической мембране. Опосредованная синим светом димеризация CRY2 и CIBN приводит к быстрой транслокации Rho1DN из цитоплазмы в плазматическую мембрану, где он инактивирует актомиозин путем ингибирования эндогенного Rho1. Кроме того, в данной статье представлен подробный протокол сопряжения Opto-Rho1DN-опосредованной инактивации актомиозина с лазерной абляцией для изучения роли актомиозина в генерации эпителиального натяжения при формировании вентральной борозды дрозофилы . Этот протокол может быть применен ко многим другим морфологическим процессам, включающим сократительную способность актомиозина у эмбрионов дрозофилы с минимальными модификациями. В целом, этот оптогенетический инструмент является мощным подходом к анализу функции сократительной способности актомиозина в контроле механики тканей во время динамического ремоделирования тканей.

Introduction

Сократительная способность актомиозина, сократительная сила, оказываемая немышечным миозином II (далее «миозин») на F-актиновую сеть, является одной из наиболее важных сил в изменении формы клеток и управлении морфогенезом на тканевом уровне 1,2. Например, активация сократительной способности актомиозина в апикальном домене эпителиальных клеток приводит к апикальному сужению, что способствует различным морфогенетическим процессам, включая сворачивание эпителия, экструзию клеток, расслоение и заживление ран 3,4,5,6,7 . Активация миозина требует фосфорилирования его регуляторной легкой цепи. Эта модификация ослабляет ингибирующую конформацию молекул миозина, позволяя им образовывать биполярные пучки миозиновых филаментов с несколькими головными доменами на обоих концах. Биполярные миозиновые филаменты управляют антипараллельным движением актиновых филаментов и приводят к генерации сократительной силы 1,8,9.

Эволюционно консервативная малая ГТФаза семейства Rho RhoA (Rho1 у дрозофилы) играет центральную роль в активации сократительной способности актомиозина в различных клеточных контекстах10,11. Rho1 функционирует как бимолекулярный переключатель, связывая либо GTP (активная форма), либо GDP (неактивная форма)12. Цикл между ГТФ- или ГДФ-связанным Rho1 регулируется его ГТФаза-активирующими белками (GAP) и гуаниновыми нуклеотидными факторами обмена (ГЭФ)13. ГЭФ функционируют для облегчения обмена ВВП на ГТП и, таким образом, активизируют деятельность Rho1. GAPs, с другой стороны, усиливают активность ГТФазы Rho1 и, таким образом, деактивируют Rho1. Активированный Rho1 способствует сократительной способности актомиозина, взаимодействуя и активируя его нижележащие эффекторы, Rho-ассоциированную киназу (Rok) и Diaphanous14. Rok индуцирует активацию миозина и сократительную способность актомиозина путем фосфорилирования регуляторной легкой цепи миозина15. Кроме того, Rok также ингибирует миозин-регуляторную фосфатазу легкой цепи и, следовательно, способствует дальнейшей сборке миозиновых филаментов16. Rok также может фосфорилировать киназы LIM, которые при активации предотвращают распад актина путем фосфорилирования и ингибирования фактора деполимеризации актинакофилина 17,18. Diaphanous - это актиновый нуклеатор семейства форминов, который способствует полимеризации актина, обеспечивая основу для взаимодействия миозина с 19,20,21.

В то время как клеточные механизмы, активирующие сократительную способность актомиозина, хорошо изучены, наше понимание его функции в регуляции динамического ремоделирования тканей остается неполным. Чтобы восполнить этот пробел в знаниях, требуются подходы, которые могут быстро инактивировать актомиозин в определенных участках тканей in vivo и регистрировать непосредственное влияние на поведение и свойства тканей. В данном протоколе описано использование оптогенетического подхода для резкого ингибирования сократительной способности актомиозина при инвагинации мезодермы дрозофилы с последующим измерением натяжения эпителия с помощью лазерной абляции. Во время гаструляции дрозофилы вентрально локализованные клетки-предшественники мезодермы подвергаются апикальному сужению и инвагинируются с поверхности эмбриона, образуя передне-заднюю ориентированную борозду22,23. Образование вентральных борозд издавна использовалось в качестве модели для изучения механизма складчатости эпителия. Формирование вентральной борозды осуществляется дорсально-вентральной системой паттерна у дрозофилы24,25,26,27. Экспрессия двух транскрипционных факторов, Twist и Snail, расположенных на вентральной стороне эмбриона, контролирует формирование вентральной борозды и определяет судьбу мезодермальных клеток28. Twist и Snail активируют рекрутирование Rho1 GEF RhoGEF2 к вершине клеток-предшественников мезодермы через рецепторный путь, связанный с G-белком, и адапторный белок RhoGEF2, T48 29,30,31,32,33. Затем RhoGEF2 активирует миозин по всей апикальной поверхности потенциальной мезодермы через путь Rho-Rho киназы 34,35,36,37,38,39. Активированный миозин образует надклеточную актомиозиновую сеть по всей апикальной поверхности зачатка мезодермы, сокращения которой приводят к сужению апикальной ткани и приводят к быстрому увеличению натяжения апикальной ткани 14,37,40.

Оптогенетический инструмент, описанный в этом протоколе, Opto-Rho1DN, ингибирует сократительную способность актомиозина через зависимую от синего света рекрутацию плазматической мембраной доминантной отрицательной формы Rho1 (Rho1DN)41. Мутация T19N в Rho1DN устраняет способность мутантного белка обменивать GDP на GTP и, таким образом, делает белоквечно неактивным. Последующая мутация в Rho1DN, C189Y, устраняет его наивный сигнал нацеливания на мембрану42,43. Когда Rho1DN вводится в плазматическую мембрану, он связывается с Rho1 GEF и захватывает их, тем самым блокируя активацию Rho1, а также Rho1-опосредованную активацию миозина и актина34,44. Рекрутирование Rho1DN плазматической мембраной достигается с помощью светозависимого модуля димеризации, полученного из Cryptochrome 2 и его связывающего партнера CIB1. Криптохром 2 представляет собой фоторецептор криптохрома, активируемый синим светом, у Arabidopsis thaliana45. Криптохром 2 связывается с CIB1, основным белком спирали-петля-спираль, только в его фотовозбужденном состоянии45. Позже было обнаружено, что консервативная N-концевая область гомологии фотолиазы (PHR) из криптохрома 2 (CRY2PHR, далее именуемая CRY2) и N-концевой домен (aa 1-170) CIB1 (далее CIBN) важны для светоиндуцированной димеризации46. Opto-Rho1DN содержит два компонента. Первым компонентом является белок CIBN, слитый с якорем CAAX, который локализует белок на плазматической мембране47. Второй компонент — CRY2 с мечением mCherry, сплавленный с Rho1DN41. При отсутствии синего света CRY2-Rho1DN остается в цитоплазме. При стимуляции синим светом CRY2-Rho1DN воздействует на плазматическую мембрану посредством взаимодействия между мембранозакрепленным CIBN и возбужденным CRY2. Opto-Rho1DN может быть активирован ультрафиолетовым светом A (UVA) и синим светом (400-500 нм, пик активации 450-488 нм) или импульсным лазером 830-980 нм при выполнении двухфотонной стимуляции41,46,47,48. Таким образом, Opto-Rho1DN стимулируется длинами волн, обычно используемыми для возбуждения GFP (488 нм для однофотонной визуализации и 920 нм для двухфотонной визуализации). В отличие от этого, длины волн, обычно используемые для возбуждения mCherry (561 нм для однофотонной визуализации и 1040 нм для двухфотонной визуализации), не стимулируют оптогенетический модуль и, следовательно, могут быть использованы для предстимуляционной визуализации. Протокол описывает подходы, используемые для минимизации риска нежелательной стимуляции во время манипуляций с образцом.

Лазерная абляция широко используется для обнаружения и измерения напряжения в клетках и тканях49. Предыдущие исследования показали, что при надлежащем контроле интенсивности лазера двухфотонная лазерная абляция с использованием фемтосекундного лазера ближнего инфракрасного диапазона может физически повредить некоторые субклеточные структуры (например, кортикальные актомиозиновые сети), не вызывая разрыва плазматической мембраны. Если ткань находится под напряжением, лазерная абляция интересующей области внутри ткани приводит к немедленной отдаче наружу клеток, прилегающих к абляционной области. Скорость отдачи является функцией величины натяжения и вязкости среды (цитоплазмы), окружающей структуры, подвергающиеся отдаче49. Из-за превосходной глубины проникновения лазеров ближнего инфракрасного диапазона и способности достигать хорошо ограниченной фокальной абляции, двухфотонная лазерная абляция особенно полезна для обнаружения натяжения тканей in vivo. Как показано в этом протоколе, этот метод может быть легко комбинирован с опто-Rho1DN-опосредованной инактивацией сократимости актомиозина для исследования прямого влияния Rho1-зависимой клеточной сократимости на механику тканей во время динамического ремоделирования тканей.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Установка генетического скрещивания и подготовка чашки для сбора яйцеклеток

  1. Селекция самок мух (девственных) из оптогенетической линии UASp-CIBNpm (I); UASp-CRY2-Rho1DN-mCherry (III) на подушечке CO2 под стереомикроскопом и установили скрещивание с самцами мух из материнской линии драйвера GAL4 67 Sqh-mCherry; 15 Е-кадгерин-GFP.
    ПРИМЕЧАНИЕ: 67 и 15 означают материнский тубулин-GAL4, вставленный во вторую (II) и третью (III) хромосомы, соответственно52. Линия GAL4, используемая в этом протоколе, также экспрессирует регуляторную легкую цепь миозина Sqh (Spaghetti squash)37 и меченую GFP E-кадгерин53. Мухи из оптогенетической линии все еще могут содержать хромосомы FM7 и TM6. Мухи из материнской линии драйверов GAL4 все еще могут содержать хромосомы балансира CyO и TM3.
  2. Через ~10 дней отобрать самок F1 со следующим генотипом: UASp-CIBNpm/+; 67 кв.мВишня/+; 15 Е-кадгерин-GFP/UASp-CRY2-Rho1DN-мВишня. Установите чашку для сбора яиц с самцами мух.
    1. Убедитесь, что самки мух с правильным генотипом не содержат хромосом-балансиров (т.е. они не должны иметь курчавых крыльев [Cy], коротких щетинок [Sb], глаз в форме перемычки или почки [B] или дополнительных щетинок плечевой кости [Hu]), которые являются маркерами балансиров CyO, TM3, FM7 и TM6, используемых при создании запасов, соответственно. Накройте чашку тарелкой с яблочным соком с оттенком свежей дрожжевой пасты на поверхности.
      ПРИМЕЧАНИЕ: У самок F1 оптогенетические компоненты выражены по материнской линии. Таким образом, самки F1, используемые для установки чашки, не обязательно должны быть девственницами. Для удобства рекомендуется использовать самцов мух из той же популяции F1.
  3. Храните чашку в картонной коробке, покрытой алюминиевой фольгой, чтобы избежать возможной утечки света из окружающей среды. Меняйте тарелку с яблочным соком каждый день для чашек, хранящихся при комнатной температуре (~21-23 °C), или каждые два дня для чашек, хранящихся при температуре 18 °C.
    1. Непосредственно перед сменой тарелки стукните чашкой по плоской поверхности (например, сверху стола), чтобы мухи оставались на дне чашки и не позволяли им вырваться наружу. Замените тарелку с яблочным соком в темной комнате и используйте для освещения налобный фонарь с красным светом (см. Таблицу материалов).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для увеличения экспрессии конструктов, находящихся под контролем материнского тубулина-GAL4 и UASp, рекомендуется держать чашку при температуре 18 °C в течение как минимум 3 дней до забора эмбрионов. Этот инкубационный период также позволяет мухам адаптироваться к чашке и хорошо питаться дрожжевой пастой для достижения оптимальной яйценоскости.

2. Забор эмбрионов на нужном этапе и подготовка их к оптогенетической стимуляции

ПРИМЕЧАНИЕ: Все этапы сбора и подготовки образцов должны выполняться в темном помещении с использованием «безопасного света» (например, красного света) для освещения. Оптогенетические компоненты чрезвычайно чувствительны к окружающему свету. Даже малейшее воздействие окружающего света приводит к преждевременной стимуляции образца. Как правило, свет в зелено-красном диапазоне (>532 нм) не вызывает нежелательной стимуляции.

  1. Для сбора эмбрионов на ранних стадиях эмбриогенеза поместите новую тарелку с яблочным соком в чашку за 8-16 ч до забора эмбрионов (при температуре 18 °C).
  2. Во время забора эмбрионов смените тарелку с яблочным соком. Наклейте этикетку на пластину, снятую с чашки, и покройте поверхность пластины тонким слоем галогеноуглеродного масла 27 (см. таблицу материалов). Подождите 30-60 с, чтобы яичная скорлупа стала прозрачной.
  3. Поместите оранжево-красный пластиковый щиток (см. Таблицу материалов) на столик вертикального стереоскопа. Расположение оранжево-красного экрана предотвращает нежелательную стимуляцию во время освещения образца, блокируя сине-зеленые длины волн от проходящего света.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе для забора эмбрионов используется вертикальный стереоскоп (см. Таблицу материалов).
  4. Поместите тарелку с яблочным соком поверх оранжево-красного щитка. Включите проходящий свет стереомикроскопа, чтобы осветить образец. Соберите 5-15 эмбрионов на соответствующем этапе из пластины с яблочным соком с помощью пинцета. Не сдавливайте эмбрионы пинцетом.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе соответствующий эмбрион должен находиться на ранней-средней стадии клеточной структуры. Эмбрион на этой стадии должен иметь темно-непрозрачный желток, окруженный прозрачным, однородным слоем периплазмы, содержащим формирующиеся клетки бластодермы. Передний край борозд расщепления («фронт целлюляризации»), выступающий в виде непрерывной линии, параллельной поверхности зародыша, не должен проходить и половины глубины периплазмы.
  5. Аккуратно промокните эмбрионы бумажным полотенцем (~1,5 см × 1,5 см), чтобы удалить излишки жира с эмбрионов с помощью пинцета.
  6. Добавьте несколько капель свежеприготовленного 40%-ного отбеливателя (~3% гипохлорита натрия; см. Таблицу материалов) в новый небольшой квадратный кусочек бумажного полотенца (~1,5 см × 1,5 см) с помощью пластиковой пипетки для переноса так, чтобы бумажное полотенце покрылось тонким слоем отбеливателя. Перенесите эмбрион с сухого бумажного полотенца на пропитанное отбеливателем бумажное полотенце с помощью пинцета и убедитесь, что эмбрионы пропитаны отбеливателем. Подождите 2-4 минуты, пока эмбрион не станет дехорионированным.
  7. После дехорионации используйте пинцет, чтобы промокнуть квадратное бумажное полотенце о большой лист папиросной бумаги, чтобы удалить излишки отбеливателя. Следите за тем, чтобы сторона с эмбрионами была обращена вверх.
  8. Чтобы промыть эмбрионы, с помощью пинцета аккуратно смочите квадратное бумажное полотенце в капле деионизированной воды и быстро промокните им большой кусок папиросной бумаги. Повторите этот процесс восемь раз, чтобы убедиться, что остатки отбеливателя удалены.
  9. С помощью инструмента для наращивания ресниц перенесите эмбрион из бумажного полотенца в чашку со стеклянным дном диаметром 35 мм (см. Таблицу материалов). Добавьте деионизированную воду в чашку, чтобы полностью покрыть эмбрионы. Точно отрегулируйте положение и ориентацию эмбрионов с помощью инструмента для наращивания ресниц.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После дехорионирования эмбрион имеет тенденцию прилипать к поверхности стекла и неподвижен без возмущений, поэтому нет необходимости применять дополнительную обработку (например, клей), чтобы обездвижить эмбрион на чашке со стеклянным дном.
  10. Поместите чашку со стеклянным дном диаметром 35 мм с эмбрионами внутрь светонепроницаемого черного ящика (см. Таблицу материалов), чтобы защитить образец от воздействия света во время процесса переноса. Принесите коробку в комнату с многофотонным микроскопом.

3. Оптогенетическая стимуляция, лазерная абляция и визуализация эмбриона

ПРИМЕЧАНИЕ: Многофотонная система, используемая в этом эксперименте (см. таблицу материалов), способна к одновременной двухволновой визуализации. Он также содержит блок фотостимуляции с лазером 458 нм и отдельный гальванометрический сканер, позволяющий осуществлять фотоактивацию/стимуляцию в определенной области интереса (ROI). Следует отметить, что лазер с длиной волны 920 нм, который используется для возбуждения зелено-желтых флуоресцентных белков, будет стимулировать Opto-Rho1DN, хотя и медленнее по сравнению с синей лазерно-опосредованной стимуляцией.

  1. Накройте многофотонный микроскоп светонепроницаемой черной тканью (см. Таблицу материалов), чтобы избежать нежелательной стимуляции эмбрионов во время подготовки образца и визуализации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Тот же подход используется при обычной многофотонной визуализации для защиты светочувствительных детекторов, установленных на микроскопе.
  2. Выключите свет в комнате и экраны компьютеров. Выключите контроллер сенсорной панели, нажав OFF в разделе «Подсветка контроллера сенсорной панели» в программном обеспечении. Убедитесь, что в комнате нет другого окружающего света.
    1. Откройте лицевую сторону черной матерчатой крышки микроскопа. Возьмите 35-миллиметровую чашку со стеклянным дном из черного ящика и поместите ее на столик микроскопа.
  3. Осветите эмбрионы зеленым светом, который обычно используется в качестве возбуждающего света для эпифлуоресценции. Для этого включите блок флуоресцентного освещения, выберите Ocular под панелью «Ocular» в программном обеспечении и измените «Cube turret» на 4:TRITC. Используйте окуляр, чтобы определить интересующий эмбрион и сфокусировать его.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Визуализация зеленого света достигается за счет пропускания белого света, генерируемого блоком флуоресцентного освещения, через встроенный стандартный куб фильтра TRITC, который содержит фильтр возбуждения 528-553 нм, светоделитель 565 нм и фильтр излучения 590-650 нм. Другие несиние индикаторы также должны отлично работать для освещения образца. На этом этапе нет необходимости надевать защитные очки, так как возбуждающий свет имеет низкую интенсивность и не будет направлен на окуляр. Эмбрион будет выглядеть равномерно красным из-за аутофлуоресценции.
  4. Закройте черную тканевую крышку так, чтобы образец был полностью защищен от света. Включите экран компьютера, чтобы получить доступ к программному обеспечению, управляющему микроскопом. Измените 'Ocular' на LSM в программном обеспечении для получения изображения.
  5. Выполняйте лазерную абляцию в контрольных нестимулированных эмбрионах с помощью объектива для погружения в воду с 25-кратным увеличением.
    1. Нажмите Bright Z, Sequence Manager и LSM Stimulation в «Окне инструментов» в программном обеспечении. Установите тип сканера Galvano, а размер сканирования — 512 × 512. Включите CH1 и CH3 на панели «Настройка ФЭУ», чтобы разрешить использование лазера с длиной волны 1040 нм, и нажмите Live × 4, чтобы визуализировать эмбрион.
    2. Поверните эмбрион с помощью функции вращения в программном обеспечении так, чтобы передняя задняя ось эмбриона была вертикально ориентирована. Установите масштаб на 3. Нарисуйте область интереса (ROI) с помощью инструмента «Фигура» в разделе «Настройки сканирования» и установите размер ROI на панели «Ссылка». Установите ROI равным 512 пикселям в ширину и 100 пикселям в высоту (171 × 33мкм 2).
    3. Задайте параметры сбора данных для Z-стека предварительной абляции.
      1. Зарегистрируйте поверхность эмбриона как 0 в разделе «Z». Установите начало на 0 и конец на 100 мкм. Установите размер шага 2 мкм. Активируйте режим съемки Z, установив флажок Z на вкладке «Серия».
      2. Установите интенсивность лазера 1 040 нм, чтобы линейно увеличиваться от 3% до 7% с помощью функции Bright Z .
      3. Сохраните текущую настройку образа в качестве первой задачи конвейера, щелкнув LSM в "Диспетчере последовательностей".
        ПРИМЕЧАНИЕ: Z-стек перед абляцией получен для подтверждения стадии эмбриона. В этом эксперименте CRY2-Rho1DN-mCherry и Sqh-mCherry будут возбуждаться лазером с длиной волны 1040 нм. Во время апикальной констрикции сигнал Sqh-mCherry усиливается в медиоапикальной области вентральных мезодермальных клеток, тогда как CRY2-Rho1DN-mCherry является цитозольным до стимуляции. Интенсивность лазера, используемая для визуализации до и после стимуляции, определяется эмпирически на основе баланса между оптимальным соотношением сигнал/шум и предотвращением фотообесцвечивания.
    4. Задайте параметры съемки для видеоролика перед абляцией.
      1. Удалите все существующие ROI, чтобы получить изображение всей области 512 × 512 пикселей (171 × 171мкм2, 3-кратный зум) вблизи вентральной поверхности эмбриона, как описано в шаге 3.5.2. Установите интенсивность лазера 1,040 нм на 3%.
      2. Установите флажок « Время » и снимите галочку с Z на панели «Серия». Оставьте «Интервал» в качестве FreeRun под панелью «Таймлапс». Установите цикл равным 10.
      3. Сохраните текущие настройки в качестве следующей задачи конвейера, щелкнув LSM в "Диспетчере последовательностей".
        ПРИМЕЧАНИЕ: Целью этой задачи является получение 10-кадрового фильма предварительной абляции в одной Z-плоскости с помощью лазера с длиной волны 1040 нм для получения изображения. Скорость получения изображения составляет примерно 1 с на кадр.
    5. Задайте параметры для лазерной абляции.
      1. Определите 3D-область непосредственно под вителлиновой мембраной на глубину ~20 мкм для лазерной абляции (рис. 1A). Установите начало Z-стека в плоскость, которая находится непосредственно под вителлиновой мембраной, а конец — на 20 мкм глубже начальной плоскости. Установите размер шага 1,5 мкм.
        ПРИМЕЧАНИЕ: ROI абляционной области составляет ~30 пикселей в ширину и ~10 пикселей в высоту (~10 мкм по медиально-латеральной оси и ~3,3 мкм по оси A-P). Целью абляции образца в нескольких Z-плоскостях является обеспечение абляции апикальной поверхности вентральных клеток. Это особенно важно для стимулированных эмбрионов, так как вентральные клетки испытывают быстрое апикальное расслабление после ингибирования Rho1.
      2. Включите CH2 и CH4 на панели «Настройка ФЭУ», чтобы разрешить использование лазера с длиной волны 920 нм. Установите интенсивность лазера с длиной волны 920 нм на 30%. Настройте получение изображения с помощью лазера с длиной волны 920 нм для одного Z-стека в пределах 3D-области, определенной в шаге 3.5.5.1 для лазерной абляции.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Интенсивность лазера, выбранная на этом этапе, достаточна для абляции ткани (на что указывает отдача тканей сразу после лазерной обработки), но в то же время не повреждает плазматическую мембрану (на что указывает отсутствие следов ожога на клеточной мембране) (Рисунок 1B, C).
      3. Сохраните текущую настройку в качестве следующей задачи конвейера, щелкнув LSM в "Диспетчере последовательностей".
    6. Задайте параметры захвата для видеоролика после абляции.
      1. Настройте получение изображения для 100-кадрового видеоролика после абляции в одной Z-плоскости с использованием лазеров с длиной волны 1 040 нм и 920 нм. Установите интенсивность лазера с длиной волны 1040 нм и лазера с длиной волны 920 нм на 3% и 0,3% соответственно. Область, указанная в шаге 3.5.4, будет получена с одинаковой скоростью получения изображения.
      2. Сохраните текущую настройку в качестве следующей задачи конвейера, щелкнув LSM в "Диспетчере последовательностей".
        ПРИМЕЧАНИЕ: Цель сохранения параметров, описанных в шагах 3.5.3-3.5.6, в виде последовательных задач в «Диспетчере последовательностей» перед любым фактическим получением, состоит в том, чтобы обеспечить захват немедленной реакции тканей после лазерной абляции.
    7. Выберите «Последовательность» в разделе «Получить». При необходимости измените путь сохранения данных и имя файла. Нажмите кнопку Готово и подождите, пока программное обеспечение инициализирует конвейер. Затем нажмите кнопку Пуск, чтобы запустить конвейер.
  6. Проводят лазерную абляцию у стимулированных эмбрионов.
    1. Задайте параметры сбора данных для Z-стека предварительной абляции, как описано в шагах 3.5.1-3.5.3. Сохраните текущую настройку в качестве первой задачи конвейера, щелкнув LSM в "Диспетчере последовательностей".
    2. Задайте параметры оптогенетической стимуляции в пределах заданной окупаемости инвестиций.
      1. Измените масштаб на 1 и выберите ROI, который охватывает вентральную поверхность эмбриона (~512 × 300мкм2). Выключите датчики CH1-CH4 .
      2. Нажмите LSM Стимуляция. Снимите флажок Непрерывный в пределах длительности и введите 12 с. Проверьте 458 нм с интенсивностью лазера 0,3%.
      3. Сохраните текущую настройку в качестве следующей задачи конвейера, нажав кнопку Стимуляция в «Диспетчере последовательностей».
        ПРИМЕЧАНИЕ: Более быстрая стимуляция может быть достигнута за счет увеличения интенсивности лазера 458 нм. Однако при использовании более высокой интенсивности лазера рассеянный лазерный свет может стимулировать область, прилегающую к ROI, что не идеально, если требуется пространственно ограниченная стимуляция.
    3. Установите 3-минутное время ожидания после стимуляции, чтобы обеспечить полную инактивацию миозина и демонтаж апикального F-актина, а также достичь статической морфологии тканей перед лазерной абляцией. Это достигается нажатием кнопки «Ожидание/пауза » в разделе «Диспетчер последовательностей» и установкой желаемого времени для «Ожидания».
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекрутирование CRY2-Rho1DN-mCherry к мембране, вызванное одним раундом стимуляции (лазер 0,3% 458 нм в течение 12 с), четко обнаруживается через 10-15 минут после стимуляции. Это согласуется с опубликованным периодом диссоциации ~9 мин47.
    4. Задайте параметры съемки для одного видеоролика предварительной абляции в Z-плоскости, как описано в шаге 3.5.4, за исключением того, что для получения изображения используются лазеры с длиной волны 1040 нм и 920 нм. Включите датчики CH1-CH4 . Установите интенсивность лазера с длиной волны 1040 нм и лазера с длиной волны 920 нм на 3% и 0,3% соответственно. Сохраните текущую настройку в качестве следующей задачи конвейера, щелкнув LSM в "Диспетчере последовательностей".
    5. Задайте параметры лазерной абляции, как описано в шаге 3.5.5. Сохраните текущую настройку в качестве следующей задачи конвейера, щелкнув LSM в "Диспетчере последовательностей".
    6. Задайте параметры съемки для одного видеоролика после абляции в Z-плоскости, как описано в шаге 3.5.6. Сохраните текущую настройку в качестве следующей задачи конвейера, щелкнув LSM в "Диспетчере последовательностей".
    7. Выберите «Последовательность» в разделе «Получить». При необходимости измените путь сохранения данных и имя файла. Нажмите кнопку Готово и подождите, пока программное обеспечение инициализирует конвейер. Затем нажмите кнопку Пуск, чтобы запустить конвейер.

4. Количественная оценка скорости отдачи тканей после лазерной абляции

  1. Откройте видеоролик после абляции в ImageJ.
  2. Нарисуйте небольшой ROI вдоль вентральной срединной линии, которая покрывает абляционную область, с помощью инструмента «Прямоугольное выделение ». Ширина ROI составляет девять пикселей. Высота ROI устанавливается таким образом, чтобы ROI была достаточно большой, чтобы покрыть весь диапазон отдачи тканей после лазерной абляции.
    1. Нажмите «Дублировать» на вкладке «Изображение». Во всплывающем окне установите флажок Дублировать стек и нажмите кнопку ОК, чтобы продублировать стек в пределах выбранной рентабельности инвестиций.
  3. Создайте монтаж из дублированного стека с помощью Image > Stacks > Make Montage. Во всплывающем окне задайте номер строки равным 1 , а номер столбца — общему количеству кадров в стеке (в данном случае 100 ).
  4. Измерьте ширину A-P удаленной области с течением времени по сгенерированному монтажу.
    1. Используйте инструмент « Несколько точек » в ImageJ, чтобы обозначить границы A-P удаленной области для каждой временной точки на монтаже.
    2. Сохраните координаты отмеченных точек с помощью команды Файл > Сохранить как > координаты XY.
    3. Импортируйте измеренные координаты XY в MATLAB. Вычислите ширину A-P абляционной области для каждого момента времени, вычитая координату Y верхней границы из координаты Y нижней границы.
  5. Определите скорость отдачи тканей, подогнав первые 20 секунд кривой «ширина во времени» в линию с помощью функции «полифит» в MATLAB. Укажите наклон подогнанной линии как скорость отдачи ткани.
  6. Выполнение статистических тестов для сравнения скорости тканевой отдачи между стимулированными и нестимулированными образцами.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется получить данные не менее чем от пяти эмбрионов для каждого заболевания. Для статистического сравнения можно использовать как двусторонний критерий ранговой суммы Вилкоксона, так и двусторонний t-критерий Стьюдента.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

У нестимулированных эмбрионов, подвергшихся апикальной констрикции, Sqh-mCherry обогащался в медиоапикальной области вентральных мезодермальных клеток, тогда как CRY2-Rho1DN-mCherry был цитозольным (рис. 1A). Лазерная абляция в пределах констрикционного домена приводила к быстрому откату тканей вдоль оси A-P (рис. 1B, C). У стимулированных эмбрионов сигнал CRY2-Rho1DN-mCherry стал локализованным на плазматической мембране, в то время как медиоапикальный сигнал Sqh-mCherry полностью исчез (рис. 1А). Лазерная абляция у стимулированных эмбрионов не приводила к явной откатке тканей, как показано на рисунке 1B, C и количественно определено на рисунке 1D. Эти результаты свидетельствуют о том, что генерация натяжения тканей требует активной апикальной сократительной способности актомиозина; когда актомиозин становится неактивным при ингибировании Rho1, натяжение апикальной ткани также уменьшается41. Эти наблюдения согласуются с предыдущими выводами о том, что активация апикальной сократимости миозина в вентральных мезодермальных клетках приводит к увеличению натяжения тканей на вентральной поверхностиэмбриона.

Figure 1
Рисунок 1: Стимуляция Opto-Rho1DN во время апикальной констрикции приводит к немедленной потере кортикального натяжения на вентральной поверхности эмбриона . (A) Карикатура, изображающая экспериментальную установку для лазерной абляции для обнаружения кортикального натяжения. Области, закрашенные желтым цветом, обозначают удаленные области. Для стимулированных эмбрионов световая активация Opto-Rho1DN проводилась за 3 мин до лазерной абляции. Из-за апикальной релаксации после стимуляции были удалены множественные z-плоскости (область желтого оттенка), чтобы обеспечить абляцию самой апикальной поверхности вентральных клеток. (В,В) Сравнение нестимулированных и стимулированных эмбрионов. У стимулированных эмбрионов не наблюдалось явной тканевой отдачи (N = 6 для нестимулированных эмбрионов и N = 5 для стимулированных эмбрионов). (B) Вид эмбрионов с лазерной абляцией в лицо. Желтыми прямоугольниками отмечена удаленная область. (C) Кимографы, показывающие изменение ширины абляционной области. Желтыми пунктирными линиями обозначено место абляции. (D) Изменение ширины абляционной области вдоль оси A-P в течение первых 20 с после лазерной абляции. Явная отдача тканей наблюдалась после лазерной резки у нестимулированных контрольных эмбрионов. Напротив, у стимулированных эмбрионов практически не наблюдалась тканевая отдача, что указывает на отсутствие апикального натяжения после ингибирования Rho1. Погрешность — это стандартное отклонение. p-значение вычисляли с помощью двустороннего критерия ранговой суммы Вилкоксона. Эта цифра взята из Guo et al.41. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Этот протокол описывал комбинированное использование оптогенетики и лазерной абляции для зондирования изменений натяжения тканей сразу после инактивации сократимости актомиозина. Оптогенетический инструмент, описанный здесь, использует преимущества доминантной негативной формы Rho1 (Rho1DN) для резкого ингибирования эндогенной сократимости Rho1 и Rho1-зависимого актомиозина. Предыдущая характеристика Opto-Rho1DN в контексте формирования вентральной борозды дрозофилы показала, что инструмент очень эффективен в опосредовании быстрой инактивации сократительной способности апикального актомиозина путем одновременной инактивации миозина и дизассемблирования актина41. В частности, стимуляция эмбрионов в момент апикальной сужения приводила к снижению апикального сигнала миозина в течение 60 с в клетках, подвергающихся апикальной сужению41. Это быстрое удаление кортикального миозина при ингибировании Rho1, вероятно, связано с быстрым циклом Rho1 и миозина через активное и неактивное состояния, вызванное активностью белков, активирующих ГТФазу (GAPs) для фосфатаз легкой цепи Rho1 и миозина, соответственно19,54. В соответствии с влиянием на актомиозин, сочетание оптогенетики с лазерной абляцией продемонстрировало, что стимуляция Opto-Rho1DN во время апикальной констрикции приводила к немедленной потере эпителиального натяжения в вентральной области эмбриона41 (рис. 1). Этот комбинированный подход позволил нам исследовать функцию Rho1-опосредованной клеточной сократимости в регуляции механики тканей с беспрецедентной пространственной и временной точностью, что позволило препарировать непосредственные эффекты от долгосрочных эффектов, которых трудно достичь с помощью традиционных генетических подходов.

Важным техническим моментом при использовании Opto-Rho1DN является высокая чувствительность инструмента к окружающему освещению. Часто встречающейся проблемой в эксперименте является рекрутирование CRY2-mCherry-Rho1DN в плазматическую мембрану перед этапом стимуляции, что обычно вызвано преждевременной стимуляцией образца на одном из следующих этапов: подготовка образца, перенос образца в помещение микроскопа, позиционирование образца на столике микроскопа и получение изображения перед стимуляцией. В нашем протоколе используется несколько процедур для предотвращения нежелательной стимуляции, в том числе работа с мухами и эмбрионами в темной комнате под красным светом, фильтрация синих волн из света освещения при отборе и размещении эмбрионов под стереомикроскопом, а также избегание воздействия на эмбрионы лазера 400-500 нм (однофотонное возбуждение) или импульсного лазера 830-980 нм (многофотонное возбуждение) перед стимуляцией. Очень важно проявлять повышенное внимание на нескольких этапах эксперимента, чтобы предотвратить нежелательную стимуляцию образца. Кроме того, при использовании Opto-Rho1DN для ингибирования Rho1 в пределах определенной области интереса (ROI) в эмбрионе41 рекомендуется использовать самую низкую интенсивность лазера, которая может обеспечить надежную транслокацию CRY2-Rho1DN на плазматическую мембрану. Поскольку Opto-Rho1DN чрезвычайно чувствителен к синим длинам волн, высокоинтенсивный синий лазер может привести к нежелательной стимуляции клеток за пределами ROI или даже соседних эмбрионов из-за рассеянного света.

В своей текущей версии инструмент Opto-Rho1DN имеет ряд ограничений. Во-первых, для экспериментов, описанных в этом протоколе, для рекрутирования активированного CRY2-Rho1DN из цитозоля в плазматическую мембрану использовали локализованный якорь CIBN для рекрутирования активированного CRY2-Rho1DN из цитозоля в плазматическую мембрану41,47. При таком подходе трудно выполнить ограниченное ингибирование Rho1 в пределах специфического домена плазматической мембраны из-за диффузии активированных белков CRY2-Rho1DN в цитозоле. Дальнейшее повышение пространственной точности на субклеточном уровне ожидает разработки новых якорей CIBN, которые имеют более специфические субклеточные паттерны локализации. Во-вторых, Opto-Rho1DN предназначен для ингибирования Rho1 во время раннего эмбриогенеза. Экспрессия CIBNpm и CRY2-Rho1DN-mCherry контролируется UASp, который стандартизирован для экспрессии в женских зародышевых линиях 55. Экспрессия этих модулей в соматических тканях после раннего эмбриогенеза может потребовать замены UASp промотором, который более эффективен для управления соматической экспрессией (например, UASt56). Наконец, эффективность Opto-Rho1DN зависит от обилия якорных белков CIBN и CRY2-Rho1DN. В текущей версии инструмента он определяется линией драйвера GAL4, используемой для управления экспрессией оптогенетических модулей. При использовании материнского драйвера GAL4, описанного в этом протоколе, крайне важно использовать линию, которая обеспечивает две копии гена GAL4 (например, 67 и 15), чтобы добиться быстрого и мощного ингибирования сократительной способности актомиозина. Уменьшение числа копий материнского GAL4 у самок F1 с двух до одного значительно снижало ингибирующий эффект.

По сравнению с традиционными генетическими подходами, оптогенетический подход, описанный в этом протоколе, имеет преимущество в анализе стадии и тканеспецифической функции Rho1 у ранних эмбрионов дрозофилы. Функция Rho1 в раннем эмбриогенезе дрозофилы в значительной степени выполняется материнским продуктом гена11. Истощение Rho1 по материнской линии блокирует оогенез57, препятствуя изучению его функции во время раннего эмбриогенеза. За последние несколько лет было разработано несколько оптогенетических инструментов для регуляции эндогенной активности Rho1 у эмбрионов дрозофилы. И Izquierdo et al., и Rich et al. разработали оптогенетические инструменты для активации активности Rho1 путем регуляции локализации каталитического домена Rho GEF в эмбрионах дрозофилы 48,58. Кроме того, Herrera-Perez et al. разработали два оптогенетических инструмента, использующих либо полноразмерный RhoGEF2 (optoGEF), либо полноразмерный C-GAP (optoGAP) для активации или ингибирования эндогенной активности Rho1, соответственно59. Поскольку optoGAP функционирует, рекрутируя Rho1 GAP к плазматической мембране, его применение может быть чувствительным к присутствию эндогенных Rho1 ГЭФ, которые могут компенсировать или даже перекрывать эффект эктопического рекрутирования GAP. Напротив, путем прямого секвестрирования Rho1 GEF, Opto-Rho1DN может обеспечить более надежный способ ингибирования эндогенной сократимости Rho1 и Rho1-зависимого актомиозина.

Учитывая широкий спектр функций Rho1 в эмбриогенезе и постэмбриональном развитии, представленный протокол может быть легко адаптирован для изучения функции Rho1 и Rho1-зависимых клеточных реорганизаций в широком спектре морфогенетических процессов. Кроме того, аналогичная стратегия, в принципе, может быть использована для жесткого ограничения других малых ГТФаз, таких как ГТФазы семейства Rho Cdc42 и Rac, поскольку их доминирующие негативные формы широко используются для ингибирования эндогенной функции этих белков11. Наконец, как показано в этом протоколе, сочетание оптогенетики и лазерной абляции может обеспечить эффективный способ исследования непосредственного влияния инактивации специфического белка на динамику тканей и механику тканей, что даст нам новое понимание морфогенеза тканей, которое трудно раскрыть с помощью традиционных генетических подходов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют, что исследование проводилось в отсутствие каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могли бы быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Acknowledgments

Авторы благодарят Энн Лавануэй (Ann Lavanway) за помощь в создании изображений. Авторы благодарят лабораторию Вишауса и лабораторию Де Ренциса за обмен реагентами, а также Блумингтонский центр разведения дрозофил за запасы мух. Это исследование поддержано NIGMS ESI-MIRA R35GM128745 и грантом Американского онкологического общества на институциональные исследования #IRG-82-003-33 для BH.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
35 mm glass-bottom dish MatTek P35G-1.5-10-C Used for sample preparation
60 mm × 15 mm Petri dish with lid Falcon 351007 Used for sample preparation
Black cloth for covering the microscope Online NA Used to avoid unwanted light stimulation
Clorox Ultra Germicadal Bleach (8.25% sodium hypochlorite) VWR 10028-048 Used for embryo dechorination
CO2 pad Genesee Scientific 59-114 Used for cross set-up
ddH2O NA NA Used for sample preparation
Dumont Style 5 tweezers VWR 102091-654 Used for sample preparation
Eyelash tool (made from pure red sable round brush #2) VWR 22940-834 Used for sample preparation
FluoView (Software) Olympus NA Used for image acquisition and optogenetic stimulation
Halocarbon oil 27 Sigma Aldrich H8773-100ML Used for embryo stage visualization
ImageJ/FIJI NIH NA Used for image analysis
MATLAB MathWorks NA Used for image analysis
Nikon SMZ-745 stereoscope Nikon NA Used for sample preparation
Olympus FVMPE-RS multiphoton microscope with InSight DS Dual-line Ultrafast Lasers for simultaneous dual-wavelength multiphoton imaging, , a 25x/NA1.05 water immersion objective (XLPLN25XWMP2), and an IR/VIS stimulation unit for photo-activation/stimulation. This system is also equipped with a TRITC filter (39005-BX3; AT-TRICT-REDSHFT 540/25x, 565BS, 620/60M), and a fluorescence illumination unit that emits white light. Olympus NA Used for image acquisition and optogenetic stimulation
SP Bel-Art 100-place polypropylene freezer storage box (Black, light-proof box for sample transfer) VWR 30621-392 Used to avoid unwanted light stimulation
UV Filter Shield for FM1403 Fluores (Orange-red plastic shield) Bolioptics FM14036151 Used to avoid unwanted light stimulation
VITCHELO V800 Headlamp with White and Red LED Lights Amazon NA Used to avoid unwanted light stimulation

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vicente-Manzanares, M., Ma, X., Adelstein, R. S., Horwitz, A. R. Non-muscle myosin II takes centre stage in cell adhesion and migration. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 10 (11), 778-790 (2009).
  2. Munjal, A., Lecuit, T. Actomyosin networks and tissue morphogenesis. Development. 141 (9), 1789-1793 (2014).
  3. Sawyer, J. M., et al. Apical constriction: a cell shape change that can drive morphogenesis. Developmental Biology. 341 (1), 5-19 (2010).
  4. Nishimura, T., Honda, H., Takeichi, M. Planar cell polarity links axes of spatial dynamics in neural-tube closure. Cell. 149 (5), 1084-1097 (2012).
  5. Marinari, E., et al. Live-cell delamination counterbalances epithelial growth to limit tissue overcrowding. Nature. 484 (7395), 542-545 (2012).
  6. Slattum, G. M., Rosenblatt, J. Tumour cell invasion: an emerging role for basal epithelial cell extrusion. Nature Reviews. Cancer. 14 (7), 495-501 (2014).
  7. Antunes, M., Pereira, T., Cordeiro, J. V., Almeida, L., Jacinto, A. Coordinated waves of actomyosin flow and apical cell constriction immediately after wounding. The Journal of Cell Biology. 202 (2), 365-379 (2013).
  8. Yang, S., et al. The central role of the tail in switching off 10S myosin II activity. The Journal of General Physiology. 151 (9), 1081-1093 (2019).
  9. Yang, S., et al. Cryo-EM structure of the inhibited (10S) form of myosin II. Nature. 588 (7838), 521-525 (2020).
  10. Narumiya, S., Thumkeo, D. Rho signaling research: history, current status and future directions. FEBS Letters. 592 (11), 1763-1776 (2018).
  11. Johndrow, J. E., Magie, C. R., Parkhurst, S. M. Rho GTPase function in flies: insights from a developmental and organismal perspective. Biochemistry and Cell Biology. 82 (6), 643-657 (2004).
  12. Etienne-Manneville, S., Hall, A. Rho GTPases in cell biology. Nature. 420 (6916), 629-635 (2002).
  13. Hodge, R. G., Ridley, A. J. Regulating Rho GTPases and their regulators. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 17 (8), 496-510 (2016).
  14. Martin, A. C., Goldstein, B. Apical constriction: themes and variations on a cellular mechanism driving morphogenesis. Development. 141 (10), 1987-1998 (2014).
  15. Amano, M., Nakayama, M., Kaibuchi, K. Rho-kinase/ROCK: A key regulator of the cytoskeleton and cell polarity. Cytoskeleton. 67 (9), 545-554 (2010).
  16. Kimura, K., et al. Regulation of myosin phosphatase by Rho and Rho-associated kinase (Rho-kinase). Science. 273 (5272), 245-248 (1996).
  17. Maekawa, M., et al. Signaling from Rho to the actin cytoskeleton through protein kinases ROCK and LIM-kinase. Science. 285 (5429), 895-898 (1999).
  18. Ohashi, K., et al. Rho-associated kinase ROCK activates LIM-kinase 1 by phosphorylation at threonine 508 within the activation loop. The Journal of Biological Chemistry. 275 (5), 3577-3582 (2000).
  19. Coravos, J. S., Martin, A. C. Apical sarcomere-like actomyosin contracts nonmuscle drosophila epithelial cells. Developmental Cell. 39 (3), 346-358 (2016).
  20. Homem, C. C. F., Peifer, M. Diaphanous regulates myosin and adherens junctions to control cell contractility and protrusive behavior during morphogenesis. Development. 135 (6), 1005-1018 (2008).
  21. Goode, B. L., Eck, M. J. Mechanism and function of formins in the control of actin assembly. Annual Review of Biochemistry. 76, 593-627 (2007).
  22. Sweeton, D., Parks, S., Costa, M., Wieschaus, E. Gastrulation in Drosophila: the formation of the ventral furrow and posterior midgut invaginations. Development. 112 (3), 775-789 (1991).
  23. Leptin, M., Grunewald, B. Cell shape changes during gastrulation in Drosophila. Development. 110 (1), 73-84 (1990).
  24. Leptin, M. Gastrulation in Drosophila: the logic and the cellular mechanisms. The EMBO Journal. 18 (12), 3187-3192 (1999).
  25. Martin, A. C. The physical mechanisms of Drosophila gastrulation: mesoderm and endoderm invagination. Genetics. 214 (3), 543-560 (2020).
  26. Gilmour, D., Rembold, M., Leptin, M. From morphogen to morphogenesis and back. Nature. 541 (7637), 311-320 (2017).
  27. Gheisari, E., Aakhte, M., Müller, H. -A. J. Gastrulation in Drosophila melanogaster: Genetic control, cellular basis and biomechanics. Mechanisms of Development. 163, 103629 (2020).
  28. Leptin, M. Twist and snail as positive and negative regulators during Drosophila mesoderm development. Genes & Development. 5 (9), 1568-1576 (1991).
  29. Costa, M., Wilson, E. T., Wieschaus, E. A putative cell signal encoded by the folded gastrulation gene coordinates cell shape changes during Drosophila gastrulation. Cell. 76 (6), 1075-1089 (1994).
  30. Kerridge, S., et al. Modular activation of Rho1 by GPCR signalling imparts polarized myosin II activation during morphogenesis. Nature Cell Biology. 18 (3), 261-270 (2016).
  31. Kölsch, V., Seher, T., Fernandez-Ballester, G. J., Serrano, L., Leptin, M. Control of Drosophila gastrulation by apical localization of adherens junctions and RhoGEF2. Science. 315 (5810), 384-386 (2007).
  32. Manning, A. J., Peters, K. A., Peifer, M., Rogers, S. L. Regulation of epithelial morphogenesis by the G protein-coupled receptor mist and its ligand fog. Science Signaling. 6 (301), (2013).
  33. Parks, S., Wieschaus, E. The Drosophila gastrulation gene concertina encodes a G alpha-like protein. Cell. 64 (2), 447-458 (1991).
  34. Barrett, K., Leptin, M., Settleman, J. The Rho GTPase and a putative RhoGEF mediate a signaling pathway for the cell shape changes in Drosophila gastrulation. Cell. 91 (7), 905-915 (1997).
  35. Dawes-Hoang, R. E., et al. Folded gastrulation, cell shape change and the control of myosin localization. Development. 132 (18), 4165-4178 (2005).
  36. Häcker, U., Perrimon, N. DRhoGEF2 encodes a member of the Dbl family of oncogenes and controls cell shape changes during gastrulation in Drosophila. Genes & Development. 12 (2), 274-284 (1998).
  37. Martin, A. C., Kaschube, M., Wieschaus, E. F. Pulsed contractions of an actin-myosin network drive apical constriction. Nature. 457 (7228), 495-499 (2009).
  38. Mason, F. M., Tworoger, M., Martin, A. C. Apical domain polarization localizes actin-myosin activity to drive ratchet-like apical constriction. Nature Cell Biology. 15 (8), 926-936 (2013).
  39. Nikolaidou, K. K., Barrett, K. A Rho GTPase signaling pathway is used reiteratively in epithelial folding and potentially selects the outcome of Rho activation. Current Biology. 14 (20), 1822-1826 (2004).
  40. Martin, A. C., Gelbart, M., Fernandez-Gonzalez, R., Kaschube, M., Wieschaus, E. F. Integration of contractile forces during tissue invagination. The Journal of Cell Biology. 188 (5), 735-749 (2010).
  41. Guo, H., Swan, M., He, B. Optogenetic inhibition of actomyosin reveals mechanical bistability of the mesoderm epithelium during Drosophila mesoderm invagination. eLife. 11, e69082 (2022).
  42. Sebti, S. M., Der, C. J. Searching for the elusive targets of farnesyltransferase inhibitors. Nature Reviews. Cancer. 3 (12), 945-951 (2003).
  43. Roberts, P. J., et al. Rho family GTPase modification and dependence on CAAX motif-signaled posttranslational modification. The Journal of Biological Chemistry. 283 (37), 25150-25163 (2008).
  44. Feig, L. A., Cooper, G. M. Inhibition of NIH 3T3 cell proliferation by a mutant ras protein with preferential affinity for GDP. Molecular and Cellular Biology. 8 (8), 3235-3243 (1988).
  45. Liu, H., et al. Photoexcited CRY2 interacts with CIB1 to regulate transcription and floral initiation in Arabidopsis. Science. 322 (5907), 1535-1539 (2008).
  46. Kennedy, M. J., et al. Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in living cells. Nature Methods. 7 (12), 973-975 (2010).
  47. Guglielmi, G., Barry, J. D., Huber, W., De Renzis, S. An optogenetic method to modulate cell contractility during tissue morphogenesis. Developmental Cell. 35 (5), 646-660 (2015).
  48. Izquierdo, E., Quinkler, T., De Renzis, S. Guided morphogenesis through optogenetic activation of Rho signalling during early Drosophila embryogenesis. Nature Communications. 9 (1), 2366 (2018).
  49. Hutson, M. S., et al. Forces for morphogenesis investigated with laser microsurgery and quantitative modeling. Science. 300 (5616), 145-149 (2003).
  50. Rauzi, M., Lenne, P. -F. Probing cell mechanics with subcellular laser dissection of actomyosin networks in the early developing Drosophila embryo. Methods in Molecular Biology. 1189, 209-218 (2015).
  51. Rauzi, M., Verant, P., Lecuit, T., Lenne, P. -F. Nature and anisotropy of cortical forces orienting Drosophila tissue morphogenesis. Nature Cell Biology. 10 (12), 1401-1410 (2008).
  52. Hunter, C., Wieschaus, E. Regulated expression of nullo is required for the formation of distinct apical and basal adherens junctions in the Drosophila blastoderm. The Journal of Cell Biology. 150 (2), 391-401 (2000).
  53. Oda, H., Tsukita, S. Real-time imaging of cell-cell adherens junctions reveals that Drosophila mesoderm invagination begins with two phases of apical constriction of cells. Journal of Cell Science. 114, 493-501 (2001).
  54. Munjal, A., Philippe, J. -M., Munro, E., Lecuit, T. A self-organized biomechanical network drives shape changes during tissue morphogenesis. Nature. 524 (7565), 351-355 (2015).
  55. Rørth, P. Gal4 in the Drosophila female germline. Mechanisms of Development. 78 (1-2), 113-118 (1998).
  56. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  57. Magie, C. R., Meyer, M. R., Gorsuch, M. S., Parkhurst, S. M. Mutations in the Rho1 small GTPase disrupt morphogenesis and segmentation during early Drosophila development. Development. 126 (23), 5353-5364 (1999).
  58. Rich, A., Fehon, R. G., Glotzer, M. Rho1 activation recapitulates early gastrulation events in the ventral, but not dorsal, epithelium of Drosophila embryos. eLife. 9, e56893 (2020).
  59. Herrera-Perez, R. M., Cupo, C., Allan, C., Lin, A., Kasza, K. E. Using optogenetics to link myosin patterns to contractile cell behaviors during convergent extension. Biophysical Journal. 120 (19), 4214-4229 (2021).

Tags

Биология развития выпуск 194 оптогенетика механика тканей Rho1 актомиозин лазерная абляция апикальное сужение гаструляция
Оптогенетическое ингибирование Rho1-опосредованной сократимости актомиозина в сочетании с измерением эпителиального натяжения у <em>эмбрионов дрозофилы</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Guo, H., Swan, M., He, B.… More

Guo, H., Swan, M., He, B. Optogenetic Inhibition of Rho1-Mediated Actomyosin Contractility Coupled with Measurement of Epithelial Tension in Drosophila Embryos. J. Vis. Exp. (194), e65314, doi:10.3791/65314 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter