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Developmental Biology

ड्रोसोफिला भ्रूण में उपकला तनाव के माप के साथ युग्मित Rho1-मध्यस्थ एक्टोमायोसिन सिकुड़न का ऑप्टोजेनेटिक निषेध

Published: April 14, 2023 doi: 10.3791/65314
Automatic Translation
1,2, 3, 1
1Department of Biological Sciences, Dartmouth College, 2School of Life Sciences, Westlake University, 3Department of Molecular Biology, Princeton University

Summary

एक्टोमायोसिन सिकुड़न कोशिका और ऊतक मोर्फोजेनेसिस में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। हालांकि, विवो में एक्टोमायोसिन सिकुड़न को तीव्र रूप से हेरफेर करना चुनौतीपूर्ण है। यह प्रोटोकॉल एक ऑप्टोजेनेटिक प्रणाली का वर्णन करता है जो ड्रोसोफिला भ्रूण में Rho1-मध्यस्थता एक्टोमायोसिन संकुचन को तेजी से रोकता है, जिससे विवो में एक्टोमायोसिन की निष्क्रियता के बाद उपकला तनाव के तत्काल नुकसान का पता चलता है।

Abstract

एक्टिन और गैर-मांसपेशी मायोसिन II ("एक्टोमायोसिन कॉन्ट्रैक्टिलिटी") द्वारा उत्पन्न सिकुड़ा हुआ बल कई लंबाई के पैमाने पर कोशिकाओं और ऊतकों के रूपात्मक परिवर्तनों के लिए महत्वपूर्ण हैं, जैसे कि कोशिका विभाजन, कोशिका प्रवास, उपकला तह और ब्रांचिंग मोर्फोजेनेसिस। मॉर्फोजेनेसिस में एक्टोमायोसिन सिकुड़न की भूमिका की गहन समझ के लिए उन दृष्टिकोणों की आवश्यकता होती है जो एक्टोमायोसिन की तेजी से निष्क्रियता की अनुमति देते हैं, जो पारंपरिक आनुवंशिक या औषधीय दृष्टिकोण का उपयोग करके प्राप्त करना मुश्किल है। प्रस्तुत प्रोटोकॉल सटीक अस्थायी और स्थानिक नियंत्रण के साथ ड्रोसोफिला भ्रूण में एक्टोमायोसिन सिकुड़न को रोकने के लिए एक CRY2-CIBN आधारित ऑप्टोजेनेटिक डिमराइजेशन सिस्टम, Opto-Rho1DN के उपयोग को प्रदर्शित करता है। इस प्रणाली में, CRY2 को Rho1 (Rho1DN) के प्रमुख नकारात्मक रूप से जोड़ा जाता है, जबकि CIBN को प्लाज्मा झिल्ली पर लंगर डाला जाता है। CRY2 और CIBN के ब्लू लाइट-मध्यस्थता डिमराइजेशन के परिणामस्वरूप साइटोप्लाज्म से प्लाज्मा झिल्ली तक Rho1DN का तेजी से स्थानांतरण होता है, जहां यह अंतर्जात Rho1 को रोककर एक्टोमायोसिन को निष्क्रिय कर देता है। इसके अलावा, यह लेख ड्रोसोफिला वेंट्रल कुंड गठन के दौरान उपकला तनाव उत्पन्न करने में एक्टोमायोसिन की भूमिका की जांच करने के लिए लेजर एब्लेशन के साथ एक्टोमायोसिन की ऑप्टो-Rho1DN-मध्यस्थता निष्क्रियता को युग्मित करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है। इस प्रोटोकॉल को कई अन्य रूपात्मक प्रक्रियाओं पर लागू किया जा सकता है जिसमें न्यूनतम संशोधनों के साथ ड्रोसोफिला भ्रूण में एक्टोमायोसिन सिकुड़न शामिल है। कुल मिलाकर, यह ऑप्टोजेनेटिक उपकरण गतिशील ऊतक रीमॉडेलिंग के दौरान ऊतक यांत्रिकी को नियंत्रित करने में एक्टोमायोसिन सिकुड़न के कार्य को विच्छेदित करने के लिए एक शक्तिशाली दृष्टिकोण है।

Introduction

एक्टोमायोसिन सिकुड़न, एफ-एक्टिन नेटवर्क पर गैर-मांसपेशी मायोसिन II (इसके बाद 'मायोसिन') द्वारा लगाया गया सिकुड़ा हुआ बल, सेल आकार को बदलने और ऊतक-स्तर मॉर्फोजेनेसिस 1,2 को चलाने में सबसे महत्वपूर्ण बलों में से एक है। उदाहरण के लिए, उपकला कोशिकाओं के एपिकल डोमेन में एक्टोमायोसिन सिकुड़न के सक्रियण के परिणामस्वरूप एपिकल कसना होता है, जो उपकला तह, सेल एक्सट्रूज़न, डिलेमिनेशन और घाव भरने सहित विभिन्न मोर्फोजेनेटिक प्रक्रियाओं की सुविधा प्रदान करता है।. मायोसिन के सक्रियण के लिए इसकी नियामक प्रकाश श्रृंखला के फॉस्फोराइलेशन की आवश्यकता होती है। यह संशोधन मायोसिन अणुओं के निरोधात्मक रचना को कम करता है, जिससे उन्हें दोनों सिरों पर कई सिर डोमेन के साथ द्विध्रुवी मायोसिन फिलामेंट बंडल बनाने की अनुमति मिलती है। द्विध्रुवी मायोसिन फिलामेंट्स एक्टिन फिलामेंट्स के विरोधी समानांतर आंदोलन को चलाते हैं और परिणामस्वरूप सिकुड़ा हुआ बल 1,8,9 उत्पन्न होता है।

क्रमिक रूप से संरक्षित Rho परिवार छोटा GTPase RhoA (ड्रोसोफिला में Rho1) विभिन्न सेलुलर संदर्भों में एक्टोमायोसिन सिकुड़न के सक्रियण में एक केंद्रीय भूमिका निभाता है। Rho1 जीटीपी (सक्रिय रूप) या जीडीपी (निष्क्रिय रूप) 12 को बांधकर एक द्वि-आणविक स्विच के रूप में कार्य करता है। जीटीपी- या जीडीपी-बाउंड Rho1 के बीच साइक्लिंग को इसके GTPase-सक्रिय प्रोटीन (GAPs) और गुआनिन न्यूक्लियोटाइड-एक्सचेंज फैक्टर्स (GEFs) 13 द्वारा नियंत्रित किया जाता है। जीईएफ जीटीपी के लिए जीडीपी के आदान-प्रदान को सुविधाजनक बनाने के लिए कार्य करते हैं और इस प्रकार Rho1 गतिविधि को सक्रिय करते हैं। दूसरी ओर, जीएपी, Rho1 की GTPase गतिविधि को बढ़ाते हैं और इस प्रकार Rho1 को निष्क्रिय करते हैं। सक्रिय Rho1 अपने डाउनस्ट्रीम प्रभावकों, Rho-संबद्ध काइनेज (Rok) और डायफेनस14 के साथ बातचीत और सक्रिय करके एक्टोमायोसिन सिकुड़न को बढ़ावा देता है। रोक मायोसिन15 की नियामक प्रकाश श्रृंखला को फॉस्फोराइलेट करके मायोसिन सक्रियण और एक्टोमायोसिन सिकुड़न को प्रेरित करता है। इसके अलावा, रोक मायोसिन नियामक प्रकाश श्रृंखला फॉस्फेट को भी रोकता है, और इसलिए मायोसिन फिलामेंट असेंबली16 को बढ़ावा देता है। रोक एलआईएम किनेसेस को फॉस्फोराइलेट भी कर सकता है, जो सक्रिय होने पर, एक्टिन-डिपोलीमराइजेशन कारक कोफिलिन17,18 को फॉस्फोराइलेट और बाधित करके एक्टिन विघटन को रोकता है। डायफेनस एक फॉर्मिन परिवार एक्टिन न्यूक्लिएटर है जो एक्टिन पोलीमराइजेशन को बढ़ावा देता है, जो मायोसिन को 19,20,21 के साथ बातचीत करने के लिए एक आधार प्रदान करता है।

जबकि एक्टोमायोसिन सिकुड़न को सक्रिय करने वाले सेलुलर तंत्र को अच्छी तरह से स्पष्ट किया गया है, गतिशील ऊतक रीमॉडेलिंग को विनियमित करने में इसके कार्य की हमारी समझ अधूरी है। इस ज्ञान अंतर को भरने के लिए ऐसे दृष्टिकोणों की आवश्यकता होती है जो विवो में विशिष्ट ऊतक क्षेत्रों में एक्टोमायोसिन को तेजी से निष्क्रिय कर सकते हैं और ऊतक व्यवहार और गुणों पर तत्काल प्रभाव रिकॉर्ड कर सकते हैं। यह प्रोटोकॉल ड्रोसोफिला मेसोडर्म इनवेजाइनेशन के दौरान एक्टोमायोसिन सिकुड़न को तीव्र रूप से रोकने के लिए एक ऑप्टोजेनेटिक दृष्टिकोण के उपयोग का वर्णन करता है, इसके बाद लेजर एब्लेशन का उपयोग करके उपकला तनाव का माप होता है। ड्रोसोफिला गैस्ट्रुलेशन के दौरान, उदर स्थानीयकृत मेसोडर्म अग्रदूत कोशिकाएं भ्रूण की सतह से एपिकल कसना और इनवेजाइनेट से गुजरती हैं, जिससे एक पूर्वकाल-पीछे उन्मुख कुंड22,23 बनता है। वेंट्रल कुंड का गठन लंबे समय से उपकला तह के तंत्र का अध्ययन करने के लिए एक मॉडल के रूप में उपयोग किया जाता है। ड्रोसोफिला24,25,26,27 में पृष्ठीय-उदर पैटर्निंग प्रणाली द्वारा वेंट्रल कुंड गठन को प्रशासित किया जाता है। भ्रूण के उदर पक्ष में स्थित दो प्रतिलेखन कारकों, ट्विस्ट और स्नेल की अभिव्यक्ति, उदर कुंड गठन को नियंत्रित करती है और मेसोडर्मल सेल भाग्य28 को निर्दिष्ट करती है। ट्विस्ट और स्नेल एक जी-प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर मार्ग और एक RhoGEF2 एडाप्टर प्रोटीन, T48 29,30,31,32,33 के माध्यम से मेसोडर्म अग्रदूत कोशिकाओं के शीर्ष पर Rho1 GEF RhoGEF2 की भर्ती को सक्रिय करते हैं। इसके बाद, RhoGEF2 Rho-Rho kinese मार्ग 34,35,36,37,38,39 के माध्यम से संभावित मेसोडर्म की एपिकल सतह में मायोसिन को सक्रिय करता है। सक्रिय मायोसिन मेसोडर्म प्रिमोडियम की एपिकल सतह पर एक सुपरसेलुलर एक्टोमायोसिन नेटवर्क बनाता है, जिसके संकुचन एपिकल कसना को चलाते हैं और परिणामस्वरूप एपिकल ऊतक तनाव 14,37,40 में तेजी से वृद्धि होती है।

इस प्रोटोकॉल में वर्णित ऑप्टोजेनेटिक उपकरण, ऑप्टो-Rho1DN, Rho1 (Rho1DN)41 के एक प्रमुख नकारात्मक रूप के ब्लू-लाइट निर्भर प्लाज्मा झिल्ली भर्ती के माध्यम से एक्टोमायोसिन सिकुड़न को रोकता है। Rho1DN में एक T19N उत्परिवर्तन जीटीपी के लिए GDP का आदान-प्रदान करने के लिए उत्परिवर्ती प्रोटीन की क्षमता को समाप्त कर देता है और इस प्रकार प्रोटीन कोलगातार निष्क्रिय कर देता है। Rho1DN, C189Y में एक बाद का उत्परिवर्तन, इसके भोले झिल्ली लक्ष्यीकरण संकेत42,43 को समाप्त कर देता है। जब Rho1DN को प्लाज्मा झिल्ली से जोड़ा जाता है, तो यह Rho1 GEFs को बांधता है और रोकता है, जिससे Rho1 के सक्रियण के साथ-साथ मायोसिन और एक्टिन34,44 के Rho1-मध्यस्थता सक्रियण को अवरुद्ध किया जाता है। Rho1DN की प्लाज्मा झिल्ली भर्ती क्रिप्टोक्रोम 2 और इसके बाध्यकारी भागीदार CIB1 से प्राप्त एक प्रकाश-निर्भर डिमराइजेशन मॉड्यूल के माध्यम से प्राप्त की जाती है। क्रिप्टोक्रोम 2 एराबिडोप्सिस थैलियाना45 में एक ब्लू-लाइट सक्रिय क्रिप्टोक्रोम फोटोरिसेप्टर है। क्रिप्टोक्रोम 2 सीआईबी 1, एक बुनियादी हेलिक्स-लूप-हेलिक्स प्रोटीन को बांधता है, केवल इसकी फोटोउत्तेजित अवस्था45 में। बाद में यह पाया गया कि क्रिप्टोक्रोम 2 (CRY2 PHR, जिसे बाद में CRY2 के रूप में संदर्भित किया जाता है) से संरक्षित एन-टर्मिनल, फोटोलाइस होमोलॉजी क्षेत्र (PHR), और CIB1 (इसके बाद CIBN) के N-टर्मिनल डोमेन (aa 1-170) प्रकाश-प्रेरित डिमराइजेशन46 के लिए महत्वपूर्ण हैं। Opto-Rho1DN में दो घटक होते हैं। पहला घटक सीएएएक्स एंकर के साथ जुड़ा हुआ सीआईबीएन प्रोटीन है, जो प्रोटीन को प्लाज्मा झिल्ली47 में स्थानीयकृत करता है। दूसरा घटक mCherry-टैग किया गया CRY2 है जो Rho1DN41 के साथ जुड़ा हुआ है। नीली रोशनी की अनुपस्थिति में, CRY2-Rho1DN साइटोप्लाज्म में रहता है। नीली रोशनी उत्तेजना पर, CRY2-Rho1DN को झिल्ली-लंगर वाले CIBN और उत्तेजित CRY2 के बीच बातचीत के माध्यम से प्लाज्मा झिल्ली पर लक्षित किया जाता है। ऑप्टो-Rho1DN को पराबैंगनी ए (यूवीए) प्रकाश और नीली रोशनी (400-500 एनएम, 450-488 एनएम पर पीक सक्रियण) या दो-फोटॉन उत्तेजना41,46,47,48 करते समय 830-980 एनएम स्पंदित लेजर द्वारा सक्रिय किया जा सकता है। इसलिए, ऑप्टो-Rho1DN को आमतौर पर रोमांचक जीएफपी (एकल फोटॉन इमेजिंग के लिए 488 एनएम और दो-फोटॉन इमेजिंग के लिए 920 एनएम) के लिए उपयोग किए जाने वाले तरंग दैर्ध्य द्वारा उत्तेजित किया जाता है। इसके विपरीत, आमतौर पर रोमांचक एमचेरी के लिए उपयोग की जाने वाली तरंग दैर्ध्य (एकल फोटॉन इमेजिंग के लिए 561 एनएम और दो-फोटॉन इमेजिंग के लिए 1,040 एनएम) ऑप्टोजेनेटिक मॉड्यूल को उत्तेजित नहीं करती है और इसलिए इसका उपयोग पूर्व-उत्तेजना इमेजिंग के लिए किया जा सकता है। प्रोटोकॉल नमूना हेरफेर के दौरान अवांछित उत्तेजना के जोखिम को कम करने के लिए उपयोग किए जाने वाले दृष्टिकोणों का वर्णन करता है।

कोशिकाओं और ऊतकों में तनाव का पता लगाने औरमापने के लिए लेजर एब्लेशन को बड़े पैमाने पर नियोजित किया गया है। पिछले अध्ययनों से पता चला है कि, जब लेजर तीव्रता को उचित रूप से नियंत्रित किया जाता है, तो फेम्टोसेकंड नियर-इन्फ्रारेड लेजर को नियोजित करने वाला दो-फोटॉन लेजर एब्लेशन कुछ उपकोशिकीय संरचनाओं (जैसे, कॉर्टिकल एक्टोमायोसिन नेटवर्क) को शारीरिक रूप से खराब कर सकता है, जिससे प्लाज्मा झिल्ली50,51 हो सकती है। यदि ऊतक तनाव में है, तो ऊतक के भीतर रुचि के क्षेत्र के लेजर पृथक्करण के परिणामस्वरूप एब्लेटेड क्षेत्र से सटे कोशिकाओं का तत्काल बाहरी पुनरावृत्ति होता है। पुनरावृत्ति वेग तनाव के परिमाण और पुनरावृत्ति49 से गुजरने वाली संरचनाओं के आसपास मीडिया (साइटोप्लाज्म) की चिपचिपाहट का एक कार्य है। निकट-अवरक्त लेजर की बेहतर प्रवेश गहराई और अच्छी तरह से सीमित फोकल एब्लेशन प्राप्त करने की क्षमता के कारण, दो-फोटॉन लेजर एब्लेशन विवो में ऊतक तनाव का पता लगाने के लिए विशेष रूप से उपयोगी है। जैसा कि इस प्रोटोकॉल में दिखाया गया है, इस विधि को गतिशील ऊतक रीमॉडेलिंग के दौरान ऊतक यांत्रिकी पर Rho1-निर्भर सेलुलर सिकुड़न के प्रत्यक्ष प्रभाव की जांच करने के लिए एक्टोमायोसिन अनुबंध की ऑप्टो-Rho1DN-मध्यस्थता निष्क्रियता के साथ आसानी से जोड़ा जा सकता है।

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Protocol

1. आनुवंशिक क्रॉस स्थापित करना और अंडे संग्रह कप तैयार करना

  1. ऑप्टोजेनेटिक लाइन यूएएसपी-सीआईबीएनपीएम (आई) से मादा मक्खियों (कुंवारी) का चयन करें; एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत सीओ 2 पैड पर यूएएसपी-सीआरवाई 2-आरएचओ1डीएन-एमचेरी (III) और मातृ जीएएल 4 ड्राइवर लाइन 67 वर्ग एच-एमचेरी से नर मक्खियों के साथ एक क्रॉस स्थापित करें; 15 ई-कैडरिन-जीएफपी।
    नोट: 67 और 15 मातृ-ट्यूबुलिन-जीएएल 4 के लिए खड़े हैं, जिन्हें क्रमशःदूसरे (II) और तीसरे (III) गुणसूत्रों में डाला गया है। इस प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली जीएएल 4 लाइन एमचेरी-टैग किए गए मायोसिन नियामक प्रकाश श्रृंखला वर्ग (स्पेगेटी स्क्वैश) 37 और जीएफपी-टैग किए गए ई-कैडरिन53 को भी व्यक्त करती है। ऑप्टोजेनेटिक लाइन से मक्खियों में अभी भी एफएम 7 और टीएम 6 बैलेंसर क्रोमोसोम हो सकते हैं। मातृ जीएएल 4 ड्राइवर लाइन से मक्खियों में अभी भी CyO और TM3 बैलेंसर क्रोमोसोम हो सकते हैं।
  2. ~ 10 दिनों के बाद, निम्नलिखित जीनोटाइप वाले एफ 1 मादा मक्खियों का चयन करें: यूएएसपी-सीआईबीएनपीएम / +; 67 वर्ग मीटर / +; 15 ई-कैडरिन-जीएफपी / यूएएसपी-क्राई 2-Rho1DN-mचेरी। नर मक्खियों के साथ एक अंडा संग्रह कप स्थापित करें।
    1. सुनिश्चित करें कि सही जीनोटाइप वाली मादा मक्खियों में कोई बैलेंसर क्रोमोसोम नहीं होते हैं (यानी, उनमें घुंघराले पंख [साइ], छोटे ब्रिसल्स [एसबी], बार- या किडनी के आकार की आंखें [बी], या अतिरिक्त ह्यूमरल ब्रिसल्स [हू]), जो क्रमशः स्टॉक उत्पन्न करने में उपयोग किए जाने वाले साइओ, टीएम 3, एफएम 7 और टीएम 6 बैलेंसर के मार्कर हैं। कप को सेब के रस की प्लेट के साथ सतह पर ताजा खमीर पेस्ट के साथ कवर करें।
      नोट: एफ 1 महिलाओं में, ऑप्टोजेनेटिक घटक मातृ रूप से व्यक्त किए जाते हैं। इसलिए, कप स्थापित करने के लिए उपयोग की जाने वाली एफ 1 महिलाओं को कुंवारी होने की आवश्यकता नहीं है। सुविधा के लिए कप के लिए एक ही एफ 1 आबादी से नर मक्खियों का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है।
  3. पर्यावरण से किसी भी संभावित प्रकाश रिसाव से बचने के लिए कप को एल्यूमीनियम पन्नी से ढके एक कार्डबोर्ड बॉक्स में रखें। कमरे के तापमान (~ 21-23 डिग्री सेल्सियस) पर रखे कप के लिए हर दिन सेब के रस की प्लेट बदलें, या 18 डिग्री सेल्सियस पर रखे कप के लिए हर दो दिन में।
    1. प्लेट बदलने से तुरंत पहले, कप को एक सपाट सतह (जैसे, बेंच टॉप) पर खटखटाएं ताकि मक्खियों को कप के तल पर रखा जा सके और उन्हें भागने से रोका जा सके। एक अंधेरे कमरे में सेब के रस की प्लेट बदलें और रोशनी के लिए लाल रोशनी के साथ हेडलैम्प का उपयोग करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
      नोट: मातृ-ट्यूबुलिन-जीएएल 4 और यूएएसपी के नियंत्रण में संरचनाओं की अभिव्यक्ति को बढ़ाने के लिए, भ्रूण संग्रह से पहले कम से कम 3 दिनों के लिए कप को 18 डिग्री सेल्सियस पर रखने की सिफारिश की जाती है। यह इनक्यूबेशन अवधि मक्खियों को कप के अनुकूल होने और इष्टतम अंडे के उत्पादन को प्राप्त करने के लिए खमीर पेस्ट पर अच्छी तरह से खिलाने की अनुमति देती है।

2. वांछित चरण में भ्रूण का संग्रह और उन्हें ऑप्टोजेनेटिक उत्तेजना के लिए तैयार करना

नोट: सभी नमूना संग्रह और तैयारी चरणों को रोशनी के लिए "सुरक्षित प्रकाश" (जैसे, लाल बत्ती) का उपयोग करके एक अंधेरे कमरे में किया जाना चाहिए। ऑप्टोजेनेटिक घटक परिवेश प्रकाश के प्रति बेहद संवेदनशील होते हैं। यहां तक कि परिवेश प्रकाश के लिए थोड़ा सा भी संपर्क नमूने की समय से पहले उत्तेजना की ओर जाता है। आमतौर पर, हरे-लाल रेंज (>532 एनएम) में रोशनी अवांछित उत्तेजना का कारण नहीं बनती है।

  1. प्रारंभिक भ्रूणजनन में भ्रूण एकत्र करने के लिए, भ्रूण संग्रह (18 डिग्री सेल्सियस पर) से 8 से 16 घंटे पहले कप पर एक नई सेब रस प्लेट रखें।
  2. भ्रूण संग्रह के समय, सेब के रस की प्लेट बदलें। कप से निकाली गई प्लेट को लेबल करें और प्लेट की सतह को हेलोकार्बन तेल 27 की एक पतली परत के साथ कवर करें ( सामग्री की तालिका देखें)। अंडे के छिलके को पारदर्शी होने के लिए 30-60 सेकंड तक प्रतीक्षा करें।
  3. एक ईमानदार स्टीरियोस्कोप के मंच पर एक नारंगी-लाल प्लास्टिक ढाल ( सामग्री की तालिका देखें) रखें। नारंगी-लाल ढाल का प्लेसमेंट संचारित प्रकाश से नीले-हरे तरंग दैर्ध्य को अवरुद्ध करके नमूना रोशनी के दौरान अवांछनीय उत्तेजना को रोकता है।
    नोट: इस प्रोटोकॉल में, भ्रूण संग्रह के लिए एक ईमानदार स्टीरियोस्कोप का उपयोग किया जाता है ( सामग्री की तालिका देखें)।
  4. संतरे-लाल ढाल के ऊपर सेब के रस की प्लेट रखें। नमूने को रोशन करने के लिए स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के प्रेषित प्रकाश को चालू करें। चिमटी की एक जोड़ी का उपयोग करके सेब के रस की प्लेट से उचित चरण में 5-15 भ्रूण एकत्र करें। चिमटी के साथ भ्रूण को निचोड़ें नहीं।
    नोट: इस प्रोटोकॉल में, उपयुक्त भ्रूण प्रारंभिक-मध्य सेलुलराइजेशन चरण में होना चाहिए। इस स्तर पर भ्रूण में एक गहरी अपारदर्शी जर्दी होनी चाहिए जो एक स्पष्ट, समान पेरिप्लाज्म परत से घिरी होती है जिसमें ब्लास्टोडर्म कोशिकाएं होती हैं। दरार के कुंड ("सेलुलराइजेशन फ्रंट") का अग्रणी किनारा, जो भ्रूण की सतह के समानांतर एक निरंतर रेखा के रूप में दिखाई देता है, को पेरिप्लाज्म की गहराई के आधे हिस्से से नहीं गुजरना चाहिए।
  5. चिमटी का उपयोग करके भ्रूण से अतिरिक्त तेल निकालने के लिए पेपर तौलिया (~ 1.5 सेमी × 1.5 सेमी) के एक टुकड़े पर भ्रूण को धीरे से धब्बा लगाएं।
  6. प्लास्टिक ट्रांसफर पिपेट का उपयोग करके पेपर तौलिया के एक नए छोटे चौकोर टुकड़े (~ 1.5 सेमी × 1.5 सेमी) में ताजा तैयार 40% ब्लीच (~ 3% सोडियम हाइपोक्लोराइट; सामग्री की तालिका देखें) की कई बूंदें जोड़ें ताकि पेपर तौलिया ब्लीच की एक पतली परत के साथ कवर हो जाए। चिमटी का उपयोग करके भ्रूण को सूखे पेपर तौलिया से ब्लीच-भिगोए हुए पेपर तौलिया में स्थानांतरित करें और सुनिश्चित करें कि भ्रूण ब्लीच में भिगोए गए हैं। भ्रूण के विघटित होने के लिए 2-4 मिनट प्रतीक्षा करें।
  7. डिकोरियोनेशन के बाद, अतिरिक्त ब्लीच को हटाने के लिए टिशू पेपर के एक बड़े टुकड़े पर स्क्वायर पेपर तौलिया को ब्लॉट करने के लिए चिमटी का उपयोग करें। सुनिश्चित करें कि भ्रूण के साथ पक्ष ऊपर की ओर है।
  8. भ्रूण को कुल्ला करने के लिए, विआयनीकृत पानी की एक बूंद में चौकोर पेपर तौलिया को धीरे से भिगोने के लिए चिमटी का उपयोग करें और जल्दी से इसे टिशू पेपर के एक बड़े टुकड़े पर धब्बा दें। किसी भी अवशेष ब्लीच को हटाने के लिए इस प्रक्रिया को आठ बार दोहराएं।
  9. भ्रूण को पेपर टॉवल से 35 मिमी ग्लास-बॉटम डिश में स्थानांतरित करने के लिए एक आईलैश टूल का उपयोग करें ( सामग्री की तालिका देखें)। भ्रूण को पूरी तरह से कवर करने के लिए डिश में विआयनीकृत पानी जोड़ें। आईलैश टूल का उपयोग करके भ्रूण की स्थिति और अभिविन्यास को ठीक करें।
    नोट: डिकोरियोनेशन के बाद, भ्रूण कांच की सतह पर चिपक जाता है और गड़बड़ी के बिना स्थिर होता है, इसलिए ग्लास-बॉटम डिश पर भ्रूण को गतिहीन करने के लिए अतिरिक्त उपचार (जैसे गोंद) लागू करना आवश्यक नहीं है।
  10. स्थानांतरण प्रक्रिया के दौरान नमूने को प्रकाश जोखिम से बचाने के लिए भ्रूण के साथ 35 मिमी ग्लास-बॉटम डिश को एक लाइटप्रूफ ब्लैक बॉक्स ( सामग्री की तालिका देखें) के अंदर रखें। मल्टीफोटॉन माइक्रोस्कोप के साथ बॉक्स को कमरे में लाएं।

3. ऑप्टोजेनेटिक उत्तेजना, लेजर एब्लेशन, और भ्रूण की इमेजिंग

नोट: इस प्रयोग में प्रयुक्त मल्टीफोटॉन प्रणाली ( सामग्री की तालिका देखें) एक साथ दोहरी तरंग दैर्ध्य इमेजिंग में सक्षम है। इसमें 458 एनएम लेजर और एक अलग गैल्वेनोमीटर स्कैनर के साथ एक फोटोस्टिम्यूलेशन यूनिट भी शामिल है, जो रुचि के परिभाषित क्षेत्र (आरओआई) के भीतर फोटो-सक्रियण / उत्तेजना की अनुमति देता है। ध्यान दें, 920 एनएम लेजर, जिसका उपयोग हरे-पीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन को उत्तेजित करने के लिए किया जाता है, ऑप्टो-Rho1DN को उत्तेजित करेगा, हालांकि नीले लेजर-मध्यस्थता उत्तेजना की तुलना में अधिक धीरे-धीरे।

  1. नमूना सेटअप और इमेजिंग के दौरान भ्रूण की अवांछित उत्तेजना से बचने के लिए मल्टीफोटॉन माइक्रोस्कोप को एक लाइटप्रूफ काले कपड़े ( सामग्री की तालिका देखें) के साथ कवर करें।
    नोट: माइक्रोस्कोप पर सुसज्जित प्रकाश-संवेदनशील डिटेक्टरों की रक्षा के लिए नियमित मल्टीफोटॉन इमेजिंग के दौरान एक ही दृष्टिकोण का उपयोग किया जाता है।
  2. कमरे की रोशनी और कंप्यूटर स्क्रीन बंद कर दें। सॉफ्टवेयर में 'बैकलाइट ऑफ टच पैनल कंट्रोलर' के तहत बंद पर क्लिक करके टच पैनल कंट्रोलर को बंद करें। सुनिश्चित करें कि कमरे में कोई अन्य परिवेश प्रकाश नहीं है।
    1. माइक्रोस्कोप पर काले कपड़े के कवर के सामने की तरफ खोलें। ब्लैक बॉक्स से 35 मिमी ग्लास-बॉटम डिश लें और इसे माइक्रोस्कोप स्टेज पर रखें।
  3. हरे रंग की रोशनी के साथ भ्रूण को रोशन करें जो आमतौर पर एपिफ्लोरेसेंस के लिए उत्तेजना प्रकाश के रूप में उपयोग किया जाता है। ऐसा करने के लिए, प्रतिदीप्ति रोशनी इकाई चालू करें, सॉफ्टवेयर में 'ओकुलर' पैनल के तहत ओकुलर का चयन करें, और 'क्यूब बुर्ज' को 4: TRITC में बदलें। रुचि के भ्रूण की पहचान करने और इसे फोकस में लाने के लिए आईपीस का उपयोग करें।
    नोट: ग्रीन लाइट विज़ुअलाइज़ेशन फ्लोरेसेंस रोशनी इकाई द्वारा उत्पन्न एक सफेद प्रकाश को एक अंतर्निहित मानक TRITC फ़िल्टर क्यूब से गुजरने की अनुमति देकर प्राप्त किया जाता है, जिसमें 528-553 एनएम उत्तेजना फ़िल्टर, 565 एनएम बीम स्प्लिटर और 590-650 एनएम उत्सर्जन फ़िल्टर होता है। नमूना रोशनी के लिए अन्य गैर-नीली रोशनी भी ठीक काम करनी चाहिए। इस चरण में आंखों की सुरक्षा पहनना आवश्यक नहीं है, क्योंकि उत्तेजना प्रकाश में कम तीव्रता होती है और इसे आईपीस पर निर्देशित नहीं किया जाएगा। ऑटोफ्लोरेसेंस के कारण भ्रूण समान रूप से लाल दिखाई देगा।
  4. काले कपड़े के कवर को बंद करें ताकि नमूना प्रकाश से पूरी तरह से सुरक्षित हो। माइक्रोस्कोप को नियंत्रित करने वाले सॉफ़्टवेयर तक पहुँचने के लिए कंप्यूटर स्क्रीन चालू करें। छवि अधिग्रहण के लिए सॉफ्टवेयर में 'ओकुलर' को एलएसएम में बदलें।
  5. 25x जल विसर्जन उद्देश्य का उपयोग करके नियंत्रण, अनियंत्रित भ्रूण में लेजर एब्लेशन करें।
    1. सॉफ़्टवेयर में 'टूल विंडो' से ब्राइट जेड, अनुक्रम प्रबंधक और एलएसएम उत्तेजना क्लिक करें। स्कैनर प्रकार को गैलवानो के रूप में सेट करें और स्कैन आकार 512 × 512 के रूप में सेट करें। 1,040 एनएम लेजर के उपयोग की अनुमति देने के लिए 'पीएमटी सेटिंग' पैनल के तहत सीएच 1 और सीएच 3 चालू करें, और भ्रूण की कल्पना करने के लिए लाइव × 4 पर क्लिक करें।
    2. सॉफ्टवेयर में रोटेशन फ़ंक्शन का उपयोग करके भ्रूण को घुमाएं ताकि भ्रूण का पूर्वकाल-पीछे का अक्ष लंबवत उन्मुख हो। ज़ूम को 3 पर सेट करें। 'स्कैन सेटिंग्स' के तहत आकार उपकरण का उपयोग करके रुचि का एक क्षेत्र (आरओआई) बनाएं और 'संदर्भ' पैनल में आरओआई का आकार सेट करें। ROI को चौड़ाई में 512 पिक्सेल और ऊंचाई में 100 पिक्सेल (171 × 33μm 2) के रूप में सेट करें।
    3. प्री-एब्लेशन जेड-स्टैक के लिए अधिग्रहण पैरामीटर सेट करें।
      1. 'जेड सेक्शन' के तहत भ्रूण की सतह को 0 के रूप में पंजीकृत करें। प्रारंभ को 0 और अंत को 100 μm के रूप में सेट करें। चरण आकार 2 μm के रूप में सेट करें। 'श्रृंखला' टैब के तहत Z की जाँच करके Z अधिग्रहण मोड को सक्रिय करें।
      2. ब्राइट जेड फ़ंक्शन का उपयोग करके रैखिक रूप से 3% से 7% तक बढ़ाने के लिए 1,040 एनएम लेजर तीव्रता सेट करें।
      3. 'अनुक्रम प्रबंधक' में LSM क्लिक करके वर्तमान इमेजिंग सेटिंग को पाइपलाइन के पहले कार्य के रूप में सहेजें।
        नोट: भ्रूण के चरण की पुष्टि करने के लिए प्री-एब्लेशन जेड-स्टैक प्राप्त किया जाता है। इस प्रयोग में, CRY2-Rho1DN-mचेरी और Sqh-mCherry 1,040 एनएम लेजर द्वारा उत्साहित होंगे। एपिकल कसना के दौरान, स्क्वर-एमचेरी सिग्नल को वेंट्रल मेसोडर्मल कोशिकाओं के मेडियोपिकल क्षेत्र में बढ़ाया जाता है, जबकि क्राई 2-Rho1DN-mचेरी उत्तेजना से पहले साइटोसोलिक होता है। पूर्व और बाद की उत्तेजना इमेजिंग के लिए नियोजित लेजर तीव्रता को इष्टतम सिग्नल-टू-शोर अनुपात और फोटोब्लीचिंग से बचने के बीच संतुलन के आधार पर अनुभवजन्य रूप से तय किया जाता है।
    4. प्री-एब्लेशन मूवी के लिए अधिग्रहण पैरामीटर सेट करें।
      1. भ्रूण की उदर सतह के पास पूरे 512 × 512 पिक्सेल क्षेत्र (171 × 171 μm 2, 3x ज़ूम) की इमेजिंग की अनुमति देने के लिए किसी भी मौजूदा ROI को हटा दें, जैसा कि चरण 3.5.2 में वर्णित है। 1,040 एनएम लेजर तीव्रता को 3% पर सेट करें।
      2. समय की जांच करें और 'श्रृंखला' पैनल के तहत जेड को अनचेक करें। 'टाइम लैप्स' पैनल के तहत 'इंटरवल' को फ्रीरन के रूप में रखें। चक्र को 10 के रूप में सेट करें।
      3. 'अनुक्रम प्रबंधक' में LSM क्लिक करके वर्तमान सेटिंग्स को पाइपलाइन के अगले कार्य के रूप में सहेजें.
        नोट: इस कार्य का उद्देश्य छवि अधिग्रहण के लिए 1,040 एनएम लेजर के साथ 10-फ्रेम एकल जेड-प्लेन प्री-एब्लेशन फिल्म प्राप्त करना है। छवि अधिग्रहण की गति लगभग 1 एस प्रति फ्रेम है।
    5. लेजर एब्लेशन के लिए पैरामीटर सेट करें।
      1. लेजर एब्लेशन के लिए विटेलिन झिल्ली के ठीक नीचे से ~ 20 μm गहरे तक एक 3 D क्षेत्र को परिभाषित करें (चित्रा 1 ए)। जेड-स्टैक की शुरुआत को विमान के रूप में सेट करें जो विटेलिन झिल्ली के ठीक नीचे है और अंत स्टार्ट प्लेन की तुलना में 20 μm गहरा है। चरण आकार 1.5 μm के रूप में सेट करें।
        नोट: एब्लेटेड क्षेत्र का आरओआई चौड़ाई में ~ 30 पिक्सेल और ऊंचाई में ~ 10 पिक्सेल है (औसत-पार्श्व अक्ष के साथ ~ 10 μm और A-P अक्ष के साथ ~ 3.3 μm)। कई जेड-विमानों पर नमूने को अलग करने का उद्देश्य यह सुनिश्चित करना है कि उदर कोशिकाओं की एपिकल सतह एब्लेट है। यह उत्तेजित भ्रूण के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है, क्योंकि उदर कोशिकाएं Rho1 निषेध के बाद तेजी से एपिकल विश्राम का अनुभव करती हैं।
      2. 920 एनएम लेजर के उपयोग की अनुमति देने के लिए 'पीएमटी सेटिंग' पैनल के तहत सीएच 2 और सीएच 4 चालू करें। 920 एनएम लेजर की तीव्रता को 30% तक सेट करें। लेजर एब्लेशन के लिए चरण 3.5.5.1 में परिभाषित 3 डी क्षेत्र के भीतर एकल जेड-स्टैक के लिए 920 एनएम लेजर के साथ छवि अधिग्रहण सेट करें।
        नोट: इस चरण में चुनी गई लेजर तीव्रता ऊतक को नष्ट करने के लिए पर्याप्त है (जैसा कि लेजर उपचार के तुरंत बाद ऊतक पुनरावृत्ति द्वारा इंगित किया गया है) लेकिन इस बीच स्पष्ट रूप से प्लाज्मा झिल्ली को नुकसान नहीं पहुंचाता है (जैसा कि कोशिका झिल्ली पर जलने के निशान की कमी से संकेत मिलता है) (चित्रा 1 बी, सी)।
      3. 'अनुक्रम प्रबंधक' में LSM क्लिक करके वर्तमान सेटिंग को पाइपलाइन के अगले कार्य के रूप में सहेजें.
    6. पोस्ट-एब्लेशन मूवी के लिए अधिग्रहण पैरामीटर सेट करें।
      1. 1,040 एनएम और 920 एनएम लेजर दोनों का उपयोग करके 100-फ्रेम एकल जेड-प्लेन पोस्ट-एब्लेशन फिल्म के लिए छवि अधिग्रहण सेट करें। 1,040 एनएम लेजर और 920 एनएम लेजर की तीव्रता क्रमशः 3% और 0.3% पर सेट करें। चरण 3.5.4 में निर्दिष्ट क्षेत्र को समान छवि अधिग्रहण गति के साथ चित्रित किया जाएगा।
      2. 'अनुक्रम प्रबंधक' में LSM क्लिक करके वर्तमान सेटिंग को पाइपलाइन के अगले कार्य के रूप में सहेजें.
        नोट: किसी भी वास्तविक अधिग्रहण से पहले 'अनुक्रम प्रबंधक' में अनुक्रमिक कार्यों के रूप में चरण 3.5.3-3.5.6 में वर्णित मापदंडों को संग्रहीत करने का उद्देश्य लेजर एब्लेशन के बाद तत्काल ऊतक प्रतिक्रिया का कब्जा सुनिश्चित करना है।
    7. 'अधिग्रहण' के अंतर्गत अनुक्रम का चयन करें. आवश्यकतानुसार डेटा-सहेजने पथ और फ़ाइल नाम परिवर्तित करें. तैयार क्लिक करें और सॉफ़्टवेयर द्वारा पाइपलाइन प्रारंभ करने की प्रतीक्षा करें. फिर पाइपलाइन निष्पादित करने के लिए प्रारंभ पर क्लिक करें।
  6. उत्तेजित भ्रूण में लेजर एब्लेशन करें।
    1. चरण 3.5.1-3.5.3 में वर्णित के रूप में प्री-एब्लेशन जेड-स्टैक के लिए अधिग्रहण पैरामीटर सेट करें। 'अनुक्रम प्रबंधक' में LSM क्लिक करके वर्तमान सेटिंग को पाइपलाइन के पहले कार्य के रूप में सहेजें.
    2. एक परिभाषित आरओआई के भीतर ऑप्टोजेनेटिक उत्तेजना के लिए पैरामीटर सेट करें।
      1. ज़ूम को 1 में बदलें और एक आरओआई का चयन करें जो भ्रूण की उदर सतह को कवर करता है (~ 512 × 300μm 2)। CH1-CH4 डिटेक्टरों को बंद करें।
      2. LSM उत्तेजना क्लिक करें. अवधि और टाइप 12 सेकंड के भीतर निरंतर अनचेक करें। 0.3% लेजर तीव्रता के साथ 458 एनएम की जांच करें।
      3. 'अनुक्रम प्रबंधक' में उत्तेजना क्लिक करके वर्तमान सेटिंग को पाइपलाइन के अगले कार्य के रूप में सहेजें।
        नोट: 458 एनएम लेजर तीव्रता को बढ़ाकर अधिक तेजी से उत्तेजना प्राप्त की जा सकती है। हालांकि, उच्च लेजर तीव्रता का उपयोग करते समय, बिखरा हुआ लेजर प्रकाश आरओआई से सटे क्षेत्र को उत्तेजित कर सकता है, जो आदर्श नहीं है यदि स्थानिक रूप से सीमित उत्तेजना की आवश्यकता होती है।
    3. मायोसिन की कुल निष्क्रियता और एपिकल एफ-एक्टिन के विघटन को सुनिश्चित करने के लिए उत्तेजना के बाद 3 मिनट का प्रतीक्षा समय निर्धारित करें, और लेजर एब्लेशन से पहले एक स्थिर ऊतक आकृति विज्ञान प्राप्त करें। यह 'अनुक्रम प्रबंधक' के तहत प्रतीक्षा / विराम पर क्लिक करके और 'प्रतीक्षा' के लिए वांछित समय निर्धारित करके प्राप्त किया जाता है।
      नोट: उत्तेजना के एक दौर (12 सेकंड के लिए 0.3% 458 एनएम लेजर) के कारण झिल्ली में CRY2-Rho1DN-mचेरी की भर्ती उत्तेजना के 10-15 मिनट बाद स्पष्ट रूप से पता लगाने योग्य है। यह ~ 9 मिनट47 के प्रकाशित पृथक्करण आधे समय के साथ संरेखण में है।
    4. एकल जेड-प्लेन प्री-एब्लेशन मूवी के लिए अधिग्रहण पैरामीटर सेट करें, जैसा कि चरण 3.5.4 में वर्णित है, सिवाय इसके कि छवि अधिग्रहण के लिए 1,040 एनएम और 920 एनएम लेजर दोनों का उपयोग किया जाता है। CH1-CH4 डिटेक्टरों को चालू करें। 1,040 एनएम लेजर और 920 एनएम लेजर की तीव्रता क्रमशः 3% और 0.3% पर सेट करें। 'अनुक्रम प्रबंधक' में LSM क्लिक करके वर्तमान सेटिंग को पाइपलाइन के अगले कार्य के रूप में सहेजें.
    5. चरण 3.5.5 में वर्णित के रूप में लेजर एब्लेशन के लिए पैरामीटर सेट करें। 'अनुक्रम प्रबंधक' में LSM क्लिक करके वर्तमान सेटिंग को पाइपलाइन के अगले कार्य के रूप में सहेजें.
    6. एकल जेड-प्लेन पोस्ट-एब्लेशन फिल्म के लिए अधिग्रहण पैरामीटर सेट करें, जैसा कि चरण 3.5.6 में वर्णित है। 'अनुक्रम प्रबंधक' में LSM क्लिक करके वर्तमान सेटिंग को पाइपलाइन के अगले कार्य के रूप में सहेजें.
    7. 'अधिग्रहण' के अंतर्गत अनुक्रम का चयन करें. आवश्यकतानुसार डेटा-सहेजने पथ और फ़ाइल नाम परिवर्तित करें. तैयार क्लिक करें और सॉफ़्टवेयर द्वारा पाइपलाइन प्रारंभ करने की प्रतीक्षा करें. उसके बाद, पाइपलाइन निष्पादित करने के लिए प्रारंभ क्लिक करें।

4. लेजर एब्लेशन के बाद ऊतक पुनरावृत्ति की दर की मात्रा निर्धारित करना

  1. ImageJ में पोस्ट-एब्लेशन मूवी खोलें।
  2. उदर मध्य रेखा के साथ एक छोटा आरओआई खींचें जो आयत चयन उपकरण का उपयोग करके एब्लेटेड क्षेत्र को कवर करता है। ROI की चौड़ाई नौ पिक्सेल है। आरओआई की ऊंचाई इस तरह से सेट की गई है कि आरओआई लेजर एब्लेशन के बाद ऊतक पुनरावृत्ति की पूरी श्रृंखला को कवर करने के लिए पर्याप्त बड़ा है।
    1. 'छवि' टैब के अंतर्गत डुप्लिकेट क्लिक करें. पॉप-अप विंडो में, डुप्लिकेट स्टैक की जाँच करें और फिर चयनित ROI के भीतर स्टैक को डुप्लिकेट करने के लिए ठीक क्लिक करें।
  3. इमेज > स्टैक्स के माध्यम से डुप्लिकेट स्टैक से एक मोंटाज उत्पन्न करें > मोंटेज बनाएं। पॉप-अप विंडो में, पंक्ति संख्या को 1 पर सेट करें और कॉलम संख्या को स्टैक में फ्रेम की कुल संख्या (इस मामले में 100 ) पर सेट करें।
  4. उत्पन्न मोंटाज से समय के साथ एब्लेटेड क्षेत्र की ए-पी चौड़ाई को मापें।
    1. मोंटेज पर प्रत्येक समय बिंदु के लिए एब्लेटेड क्षेत्र की ए-पी सीमाओं को चिह्नित करने के लिए इमेजजे में मल्टी-पॉइंट टूल का उपयोग करें।
    2. फ़ाइल > XY निर्देशांक के रूप >में सहेजें का उपयोग करके चिह्नित बिंदुओं के निर्देशांक सहेजें.
    3. मापा XY निर्देशांक MATLAB में आयात करें। निचली सीमा के Y निर्देशांक से ऊपरी सीमा के Y निर्देशांक को घटाकर प्रत्येक समय बिंदु के लिए एब्लेटेड क्षेत्र की A-P चौड़ाई की गणना करें।
  5. MATLAB में 'पॉलीफिट' फ़ंक्शन का उपयोग करके "समय के साथ चौड़ाई" वक्र के पहले 20 सेकंड को एक पंक्ति में फिट करके ऊतक पुनरावृत्ति की दर निर्धारित करें। ऊतक पुनरावृत्ति की दर के रूप में फिट लाइन की ढलान की रिपोर्ट करें।
  6. उत्तेजित और गैर-उत्तेजित नमूनों के बीच ऊतक पुनरावृत्ति की दर की तुलना करने के लिए सांख्यिकीय परीक्षण करें।
    नोट: प्रति स्थिति कम से कम पांच भ्रूण से डेटा प्राप्त करने की सिफारिश की जाती है। सांख्यिकीय तुलना के लिए दो-तरफा विलकॉक्सन रैंक-योग परीक्षण और दो-तरफा छात्र टी-टेस्ट दोनों का उपयोग किया जा सकता है।

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Representative Results

एपिकल कसना से गुजरने वाले अनियंत्रित भ्रूण में, स्क्वर-एमचेरी वेंट्रल मेसोडर्मल कोशिकाओं के मेडियोपिकल क्षेत्र में समृद्ध हो गया, जबकि क्राई 2-Rho1DN-mचेरी साइटोसोलिक था (चित्रा 1 ए)। कसना डोमेन के भीतर लेजर एब्लेशन ने ए-पी अक्ष (चित्रा 1 बी, सी) के साथ एक तेजी से ऊतक पुनरावृत्ति का नेतृत्व किया। उत्तेजित भ्रूण में, CRY2-Rho1DN-mचेरी सिग्नल प्लाज्मा झिल्ली स्थानीयकृत हो गया, जबकि Sqh-mCherry का मेडियोपिकल सिग्नल पूरी तरह से गायब हो गया (चित्रा 1 ए)। उत्तेजित भ्रूण में लेजर एब्लेशन के परिणामस्वरूप स्पष्ट ऊतक पुनरावृत्ति नहीं हुई, जैसा कि चित्रा 1 बी, सी में उदाहरण दिया गया है और चित्रा 1 डी में मात्रा निर्धारित की गई है। इन परिणामों से संकेत मिलता है कि ऊतक तनाव की पीढ़ी को सक्रिय एपिकल एक्टोमायोसिन सिकुड़न की आवश्यकता होती है; जब एक्टोमायोसिन Rho1 निषेध पर निष्क्रिय हो जाता है, तो एपिकल ऊतक तनाव भीकम हो जाता है। ये अवलोकन पिछले निष्कर्षों के अनुरूप हैं कि वेंट्रल मेसोडर्मल कोशिकाओं में एपिकल मायोसिन सिकुड़न के सक्रियण के परिणामस्वरूप भ्रूण की उदर सतह पर ऊतक तनाव में वृद्धि होतीहै।

Figure 1
चित्रा 1: एपिकल कसना के दौरान ऑप्टो-Rho1DN उत्तेजना के परिणामस्वरूप भ्रूण की उदर सतह पर कॉर्टिकल तनाव का तत्काल नुकसान होता है। (ए) कॉर्टिकल तनाव का पता लगाने के लिए लेजर एब्लेशन के लिए प्रयोगात्मक सेटअप को दर्शाने वाला कार्टून। पीले-छायांकित क्षेत्र एब्लेटेड क्षेत्रों को इंगित करते हैं। उत्तेजित भ्रूण के लिए, लेजर एब्लेशन से 3 मिनट पहले ऑप्टो-Rho1DN का प्रकाश-सक्रियण किया गया था। उत्तेजना के बाद एपिकल विश्राम के कारण, उदर कोशिकाओं की बहुत एपिकल सतह के पृथक्करण को सुनिश्चित करने के लिए कई जेड-प्लेन (पीले-छायांकित क्षेत्र) को एब्लेट किया गया था। (बी, सी) उत्तेजित और उत्तेजित भ्रूण के बीच तुलना। उत्तेजित भ्रूण में कोई स्पष्ट ऊतक पुनरावृत्ति नहीं देखी गई (उत्तेजित भ्रूण के लिए एन = 6 और उत्तेजित भ्रूण के लिए एन = 5)। (बी) लेजर-एब्लेटेड भ्रूण का फेस व्यू। पीले-छायांकित बक्से एब्लेटेड क्षेत्र को चिह्नित करते हैं। (सी) काइमोग्राफ एब्लेटेड क्षेत्र की चौड़ाई परिवर्तन का प्रतिनिधित्व करते हैं। पीली बिंदीदार रेखाएं पृथक्करण स्थल को इंगित करती हैं। (डी) लेजर एब्लेशन के बाद पहले 20 सेकंड के दौरान ए-पी अक्ष के साथ एब्लेटेड क्षेत्र की चौड़ाई में परिवर्तन। अनियंत्रित नियंत्रण भ्रूण में लेजर काटने के बाद एक स्पष्ट ऊतक पुनरावृत्ति देखी गई। इसके विपरीत, उत्तेजित भ्रूण में कोई ऊतक पुनरावृत्ति नहीं देखी गई, जो Rho1 निषेध के बाद एपिकल तनाव की कमी का संकेत देती है। त्रुटि पट्टी मानक विचलन है. पी-वैल्यू की गणना दो-तरफा विलकॉक्सन रैंक-योग परीक्षण का उपयोग करके की गई थी। यह आंकड़ा गुओ एट अल .41 से पुन: उपयोग किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

इस प्रोटोकॉल ने एक्टोमायोसिन संकुचन की निष्क्रियता के तुरंत बाद ऊतक तनाव में परिवर्तन की जांच के लिए ऑप्टोजेनेटिक्स और लेजर एब्लेशन के संयुक्त उपयोग का वर्णन किया। यहां वर्णित ऑप्टोजेनेटिक उपकरण Rho1 (Rho1DN) के प्रमुख नकारात्मक रूप का लाभ उठाता है ताकि अंतर्जात Rho1 और Rho1-निर्भर एक्टोमायोसिन संकुचन को तीव्र रूप से रोका जा सके। ड्रोसोफिला वेंट्रल कुंड गठन के संदर्भ में ऑप्टो-Rho1DN के पिछले लक्षण वर्णन से पता चला है कि उपकरण एक साथ मायोसिन निष्क्रियता और एक्टिन विघटन41 के माध्यम से एपिकल एक्टोमायोसिन सिकुड़न की तेजी से निष्क्रियता की मध्यस्थता में अत्यधिक प्रभावी है। विशेष रूप से, एपिकल कसना के समय भ्रूण की उत्तेजना के परिणामस्वरूप एपिकल कसना41 से गुजरने वाली कोशिकाओं में 60 सेकंड के भीतर एपिकल मायोसिन सिग्नल में कमी आई। Rho1 निषेध पर कॉर्टिकल मायोसिन का यह तेजी से निष्कासन सक्रिय और निष्क्रिय अवस्थाओं के माध्यम से Rho1 और मायोसिन के तेजी से चक्रण के कारण होने की संभावना है, जो क्रमशःRho1 और मायोसिन लाइट चेन फॉस्फेटेस के लिए GTPase सक्रिय प्रोटीन (जीएपी) की गतिविधियों के कारण होता है। एक्टोमायोसिन पर प्रभाव के अनुरूप, लेजर एब्लेशन के साथ ऑप्टोजेनेटिक्स को युग्मित करने से पता चला कि एपिकल कसना के दौरान ऑप्टो-Rho1DN उत्तेजना के परिणामस्वरूप भ्रूण के उदर क्षेत्र में उपकला तनाव का तत्काल नुकसान हुआ41 (चित्रा 1)। इस संयुक्त दृष्टिकोण ने हमें अभूतपूर्व स्थानिक और लौकिक परिशुद्धता के साथ ऊतक यांत्रिकी को विनियमित करने में Rho1-मध्यस्थता सेलुलर अनुबंध के कार्य की जांच करने की अनुमति दी, जिससे दीर्घकालिक प्रभावों से तत्काल प्रभावों को विच्छेदित करना संभव हो जाता है जो पारंपरिक आनुवंशिक दृष्टिकोण का उपयोग करके प्राप्त करना मुश्किल है।

Opto-Rho1DN का उपयोग करते समय एक महत्वपूर्ण तकनीकी विचार यह है कि उपकरण परिवेश प्रकाश के प्रति अत्यधिक संवेदनशील है। प्रयोग में आमतौर पर सामना की जाने वाली समस्या उत्तेजना चरण से पहले प्लाज्मा झिल्ली में CRY2-mCherry-Rho1DN की भर्ती है, जो आमतौर पर निम्नलिखित चरणों में से एक के दौरान नमूने की समयपूर्व उत्तेजना के कारण होती है: नमूना तैयारी, माइक्रोस्कोप कक्ष में नमूना स्थानांतरण, माइक्रोस्कोप चरण पर नमूना स्थिति, और पूर्व-उत्तेजना छवि अधिग्रहण। हमारे प्रोटोकॉल में, अवांछित उत्तेजना को रोकने के लिए कई प्रक्रियाओं को नियोजित किया जाता है, जिसमें लाल रोशनी के तहत एक अंधेरे कमरे में फ्लाई कप और भ्रूण को संभालना, स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत भ्रूण का चयन और माउंट करते समय रोशनी से नीली तरंग दैर्ध्य को फ़िल्टर करना, और उत्तेजना से पहले 400-500 एनएम लेजर (एकल फोटॉन उत्तेजना) या 830-980 एनएम स्पंदित लेजर (मल्टीफोटॉन उत्तेजना) के लिए भ्रूण के संपर्क से बचना शामिल है। नमूने की अवांछित उत्तेजना को रोकने के लिए प्रयोग के कई चरणों में अतिरिक्त ध्यान देना महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, भ्रूण41 में रुचि के एक विशिष्ट क्षेत्र (आरओआई) के भीतर Rho1 को रोकने के लिए Opto-Rho1DN का उपयोग करते समय, सबसे कम लेजर तीव्रता का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है जो प्लाज्मा झिल्ली में CRY2-Rho1DN के एक मजबूत स्थानांतरण को प्राप्त कर सकती है। क्योंकि ऑप्टो-Rho1DN नीले तरंग दैर्ध्य के प्रति बेहद संवेदनशील है, एक उच्च तीव्रता वाली नीली लेजर के परिणामस्वरूप बिखरे हुए प्रकाश के कारण आरओआई या यहां तक कि पड़ोसी भ्रूण के बाहर कोशिकाओं में अवांछित उत्तेजना हो सकती है।

अपने वर्तमान संस्करण में, Opto-Rho1DN उपकरण की कई सीमाएँ हैं। सबसे पहले, इस प्रोटोकॉल में वर्णित प्रयोगों के लिए, साइटोसोल से प्लाज्मा झिल्ली41,47 तक सक्रिय CRY2-Rho1DN को भर्ती करने के लिए एक प्लाज्मा झिल्ली स्थानीयकृत CIBN लंगर का उपयोग किया गया था। इस डिजाइन द्वारा, साइटोसोल में सक्रिय CRY2-Rho1DN प्रोटीन के प्रसार के कारण एक विशिष्ट प्लाज्मा झिल्ली डोमेन के भीतर सीमित Rho1 निषेध करना मुश्किल है। उपकोशिकीय पैमाने पर स्थानिक परिशुद्धता में और सुधार नए सीआईबीएन एंकरों के विकास की प्रतीक्षा कर रहा है जिसमें अधिक विशिष्ट उपकोशिकीय स्थानीयकरण पैटर्न हैं। दूसरा, ऑप्टो-Rho1DN को प्रारंभिक भ्रूणजनन के दौरान Rho1 को रोकने के लिए डिज़ाइन किया गया है। CIBNPM और CRY2-Rho1DN-mचेरी की अभिव्यक्ति को UASp द्वारा नियंत्रित किया जाता है, जिसे महिला जर्मलाइन 55 में अभिव्यक्ति के लिए मानकीकृत किया गया है। प्रारंभिक भ्रूणजनन से परे दैहिक ऊतकों में इन मॉड्यूल की अभिव्यक्ति के लिए यूएएसपी के प्रतिस्थापन की आवश्यकता हो सकती है जो दैहिक अभिव्यक्ति को चलाने के लिए अधिक प्रभावी है (उदाहरण के लिए, यूएएसटी56)। अंत में, ऑप्टो-Rho1DN की प्रभावशीलता CIBN लंगर और CRY2-Rho1DN प्रोटीन की प्रचुरता पर निर्भर है। उपकरण के वर्तमान संस्करण में, यह ऑप्टोजेनेटिक मॉड्यूल की अभिव्यक्ति को चलाने के लिए उपयोग की जाने वाली जीएएल 4 ड्राइवर लाइन द्वारा निर्धारित किया जाता है। इस प्रोटोकॉल में वर्णित मातृ जीएएल 4 ड्राइवर का उपयोग करते समय, एक्टोमायोसिन संकुचन के तेजी से और शक्तिशाली अवरोध को प्राप्त करने के लिए जीएएल 4 जीन (जैसे, 67 और 15 दोनों) की दो प्रतियां प्रदान करने वाली लाइन का उपयोग करना महत्वपूर्ण है। एफ 1 महिलाओं में मातृ जीएएल 4 की प्रतिलिपि संख्या को दो से एक तक कम करने से निरोधात्मक प्रभाव में काफी कमी आई।

पारंपरिक आनुवंशिक दृष्टिकोणों की तुलना में, इस प्रोटोकॉल में वर्णित ऑप्टोजेनेटिक दृष्टिकोण प्रारंभिक ड्रोसोफिला भ्रूण में Rho1 के चरण और ऊतक-विशिष्ट कार्य को विच्छेदित करने में फायदेमंद है। प्रारंभिक ड्रोसोफिला भ्रूणजनन में Rho1 का कार्य काफी हद तक मातृ लोडेड जीन उत्पाद11 द्वारा पूरा किया जाता है। Rho1 मातृ रूप से ओजेनेसिस57 को अवरुद्ध करता है, प्रारंभिक भ्रूणजनन के दौरान इसके कार्य के अध्ययन को रोकता है। पिछले कुछ वर्षों में, ड्रोसोफिला भ्रूण में अंतर्जात Rho1 गतिविधि को विनियमित करने के लिए कई ऑप्टोजेनेटिक उपकरण विकसित किए गए हैं। इज़क्विएर्डो एट अल और रिच एट अल दोनों ने ड्रोसोफिला भ्रूण48,58 में आरएचओ जीईएफ के उत्प्रेरक डोमेन के स्थानीयकरण को विनियमित करके Rho1 गतिविधि को सक्रिय करने के लिए ऑप्टोजेनेटिक उपकरण विकसित किए। इसके अलावा, हेरेरा-पेरेज़ एट अल ने क्रमशः अंतर्जात Rho1 गतिविधि को सक्रिय या बाधित करने के लिए पूर्ण-लंबाई RhoGEF2 (optoGEF) या पूर्ण लंबाई C-GAP (ऑप्टोजीएपी) का उपयोग करके दो ऑप्टोजेनेटिक उपकरण विकसितकिए। चूंकि ऑप्टोजीएपी प्लाज्मा झिल्ली में एक Rho1 GAP की भर्ती करके कार्य करता है, इसलिए इसका आवेदन अंतर्जात Rho1 GEFs की उपस्थिति के प्रति संवेदनशील हो सकता है, जो GAP की एक्टोपिक भर्ती के प्रभाव को ऑफसेट या ओवरराइड कर सकता है। इसके विपरीत, Rho1 GEFs को सीधे अनुक्रमित करके, Opto-Rho1DN अंतर्जात Rho1 और Rho1-निर्भर एक्टोमायोसिन संकुचन को रोकने के लिए एक अधिक मजबूत तरीका प्रदान कर सकता है।

भ्रूणजनन और भ्रूण के बाद के विकास में Rho1 के कार्यों की विस्तृत श्रृंखला को देखते हुए, प्रस्तुत प्रोटोकॉल को मॉर्फोजेनेटिक प्रक्रियाओं की एक विस्तृत श्रृंखला में Rho1 और Rho1-निर्भर सेलुलर पुनर्गठन के कार्य का अध्ययन करने के लिए आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है। इसके अलावा, सिद्धांत रूप में, एक समान रणनीति का उपयोग अन्य छोटे जीटीपेस को गंभीर रूप से प्रतिबंधित करने के लिए किया जा सकता है, जैसे कि रो परिवार जीटीपेस सीडीसी 42 और आरएसी, क्योंकि उनके प्रमुख नकारात्मक रूपों का व्यापक रूप से इनप्रोटीनों के अंतर्जात कार्य को बाधित करने के लिए उपयोग किया गया है। अंत में, जैसा कि इस प्रोटोकॉल में उदाहरण दिया गया है, ऑप्टोजेनेटिक्स और लेजर एब्लेशन दृष्टिकोण का संयोजन ऊतक गतिशीलता और ऊतक यांत्रिकी पर एक विशिष्ट प्रोटीन की निष्क्रियता के तत्काल प्रभाव की जांच करने का एक प्रभावी तरीका प्रदान कर सकता है, जो हमें ऊतक मोर्फोजेनेसिस में नई अंतर्दृष्टि लाएगा जो पारंपरिक आनुवंशिक दृष्टिकोण का उपयोग करके उजागर करना मुश्किल है।

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Disclosures

लेखकों ने घोषणा की कि अनुसंधान किसी भी वाणिज्यिक या वित्तीय संबंधों की अनुपस्थिति में आयोजित किया गया था जिसे संभावित हितों के टकराव के रूप में माना जा सकता है।

Acknowledgments

लेखक इमेजिंग समर्थन के लिए एन लावनवे को धन्यवाद देते हैं। लेखक अभिकर्मकों को साझा करने के लिए विस्चौस प्रयोगशाला और डी रेनजिस प्रयोगशाला और फ्लाई स्टॉक के लिए ब्लूमिंगटन ड्रोसोफिला स्टॉक सेंटर को धन्यवाद देते हैं। यह अध्ययन एनआईजीएमएस ईएसआई-एमआईआरए R35GM128745 और अमेरिकन कैंसर सोसाइटी इंस्टीट्यूशनल रिसर्च ग्रांट #IRG-82-003-33 द्वारा बीएच को समर्थित है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
35 mm glass-bottom dish MatTek P35G-1.5-10-C Used for sample preparation
60 mm × 15 mm Petri dish with lid Falcon 351007 Used for sample preparation
Black cloth for covering the microscope Online NA Used to avoid unwanted light stimulation
Clorox Ultra Germicadal Bleach (8.25% sodium hypochlorite) VWR 10028-048 Used for embryo dechorination
CO2 pad Genesee Scientific 59-114 Used for cross set-up
ddH2O NA NA Used for sample preparation
Dumont Style 5 tweezers VWR 102091-654 Used for sample preparation
Eyelash tool (made from pure red sable round brush #2) VWR 22940-834 Used for sample preparation
FluoView (Software) Olympus NA Used for image acquisition and optogenetic stimulation
Halocarbon oil 27 Sigma Aldrich H8773-100ML Used for embryo stage visualization
ImageJ/FIJI NIH NA Used for image analysis
MATLAB MathWorks NA Used for image analysis
Nikon SMZ-745 stereoscope Nikon NA Used for sample preparation
Olympus FVMPE-RS multiphoton microscope with InSight DS Dual-line Ultrafast Lasers for simultaneous dual-wavelength multiphoton imaging, , a 25x/NA1.05 water immersion objective (XLPLN25XWMP2), and an IR/VIS stimulation unit for photo-activation/stimulation. This system is also equipped with a TRITC filter (39005-BX3; AT-TRICT-REDSHFT 540/25x, 565BS, 620/60M), and a fluorescence illumination unit that emits white light. Olympus NA Used for image acquisition and optogenetic stimulation
SP Bel-Art 100-place polypropylene freezer storage box (Black, light-proof box for sample transfer) VWR 30621-392 Used to avoid unwanted light stimulation
UV Filter Shield for FM1403 Fluores (Orange-red plastic shield) Bolioptics FM14036151 Used to avoid unwanted light stimulation
VITCHELO V800 Headlamp with White and Red LED Lights Amazon NA Used to avoid unwanted light stimulation

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References

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विकासात्मक जीवविज्ञान अंक 194 ऑप्टोजेनेटिक्स ऊतक यांत्रिकी Rho1 एक्टोमायोसिन लेजर एब्लेशन एपिकल कन्सक्शन गैस्ट्रुलेशन
<em>ड्रोसोफिला</em> भ्रूण में उपकला तनाव के माप के साथ युग्मित Rho1-मध्यस्थ एक्टोमायोसिन सिकुड़न का ऑप्टोजेनेटिक निषेध
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Guo, H., Swan, M., He, B.… More

Guo, H., Swan, M., He, B. Optogenetic Inhibition of Rho1-Mediated Actomyosin Contractility Coupled with Measurement of Epithelial Tension in Drosophila Embryos. J. Vis. Exp. (194), e65314, doi:10.3791/65314 (2023).

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