Summary
Her presenterer vi en protokoll som beskriver cellekjernepreparering. Etter mikrodisseksjon og enzymatisk dissosiasjon av hjertevev til enkeltceller ble stamcellene frosset, etterfulgt av isolering av rene levedyktige celler, som ble brukt til enkeltkjerne-RNA-sekvensering og enkeltkjerneanalysen for transposasetilgjengelig kromatin med høykapasitetssekvenseringsanalyser.
Abstract
Det utviklende hjertet er en kompleks struktur som inneholder forskjellige stamceller styrt av komplekse reguleringsmekanismer. Undersøkelsen av genuttrykket og kromatintilstanden til individuelle celler tillater identifisering av celletype og tilstand. Enkeltcellesekvenseringstilnærminger har avslørt en rekke viktige egenskaper ved hjerteprogenitorcelleheterogenitet. Imidlertid er disse metodene generelt begrenset til ferskt vev, noe som begrenser studier med ulike eksperimentelle forhold, da det ferske vevet må behandles samtidig i samme kjøring for å redusere den tekniske variabiliteten. Derfor er det nødvendig med enkle og fleksible prosedyrer for å produsere data fra metoder som enkeltkjerne RNA-sekvensering (snRNA-seq) og enkeltkjerneanalysen for transposase-tilgjengelig kromatin med høy gjennomstrømningssekvensering (snATAC-seq) i dette området. Her presenterer vi en protokoll for raskt å isolere kjerner for påfølgende enkeltkjerner dual-omics (kombinert snRNA-seq og snATAC-seq). Denne metoden tillater isolering av kjerner fra frosne prøver av hjerteprogenitorceller og kan kombineres med plattformer som bruker mikrofluidiske kamre.
Introduction
Blant fødselsskader, medfødte hjertefeil (CHDs) er den vanligste, forekommer i ca 1% av levende fødsler hvert år 1,2. Genetiske mutasjoner er identifisert i bare et mindretall av tilfellene, noe som innebærer at andre årsaker, som abnormiteter i genregulering, er involvert i etiologien til CHD 2,3. Hjerteutvikling er en kompleks prosess med forskjellige og samvirkende celletyper, noe som gjør identifisering av kausale ikke-kodende mutasjoner og deres effekter på genregulering utfordrende. Organogenese av hjertet begynner med cellulære progenitorer som gir opphav til forskjellige undertyper av hjerteceller, inkludert myokardiale, fibroblast-, epikardiale og endokardiale celler 4,5. Encellegenomikk fremstår som en nøkkelmetode for å studere hjerteutvikling og vurdere virkningen av cellulær heterogenitet i helse og sykdom6. Utviklingen av multi-omics-metoder for samtidig måling av forskjellige parametere og utvidelse av beregningsrørledninger har gjort det lettere å oppdage celletyper og subtyper i det normale ogsyke hjertet. Denne artikkelen beskriver en pålitelig enkeltkjerneisolasjonsprotokoll for frosne hjerteprogenitorceller oppnådd fra museembryoer som er kompatibel med nedstrøms snRNA-seq og snATAC-seq (samt snRNA-seq og snATAC-seq kombinert)7,8,9.
ATAC-seq er en robust metode som gjør det mulig å identifisere regulatoriske åpne kromatinregioner og posisjonering av nukleosomer10,11. Denne informasjonen brukes til å trekke konklusjoner om plasseringen, identiteten og aktiviteten til transkripsjonsfaktorer. Aktiviteten til kromatinfaktorer, inkludert remodelers, samt transkripsjonsaktiviteten til RNA-polymerase, kan dermed analyseres siden metoden er svært følsom for måling av kvantitative endringer i kromatinstruktur 1,2. Dermed gir ATAC-seq en robust og upartisk tilnærming til å avdekke mekanismene som styrer transkripsjonsregulering i en bestemt celletype. ATAC-seq-protokoller har også blitt validert for å måle kromatintilgjengelighet i enkeltceller, noe som avslører variabilitet i kromatinarkitekturen i cellepopulasjoner10,12,13.
Selv om det har vært bemerkelsesverdige fremskritt innen enkeltceller de siste årene, er hovedproblemet behandlingen av de ferske prøvene som trengs for å utføre disse forsøkene14. For å omgå denne vanskeligheten er det utført ulike tester med sikte på å gjennomføre analyser som snRNA-seq og snATAC-seq med frosset hjertevev eller celler15,16.
Flere plattformer har blitt brukt til å analysere encellede genomikkdata17. De mye brukte plattformene for enkeltcellegenuttrykk og ATAC-profilering er plattformer for multippel mikrofluidisk dråpeinnkapsling17. Siden disse plattformene bruker mikrofluidiske kamre, kan rusk eller aggregater tette systemet, noe som resulterer i ikke-brukbare data. Dermed avhenger suksessen til enkeltcellestudier av nøyaktig isolering av individuelle celler / kjerner.
Protokollen som presenteres her bruker en lignende tilnærming til nyere studier ved bruk av snRNA-seq og snATAC-seq for å forstå medfødte hjertefeil 18,19,20,21,22,23. Denne prosedyren benytter enzymatisk dissosiasjon av ferskt mikrodissekert hjertevev etterfulgt av kryopreservering av musens hjerteprogenitorceller. Etter tining blir de levedyktige cellene renset og behandlet for kjernefysisk isolasjon. I dette arbeidet ble denne protokollen vellykket brukt til å oppnå snRNA-seq og snATAC-seq data fra samme nukleære forberedelse av mus hjerte stamceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dyreprosedyren som ble vedtatt i denne studien ble godkjent av dyreetiske komiteer ved Aix-Marseille University (C2EA-14) og ble utført i henhold til protokoller godkjent av den utnevnte nasjonale etiske komiteen for dyreforsøk (Ministère de l'Education Nationale, de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche; Autorisasjon Apafis N°33927-2021111715507212).
1. Sette opp den tidsbestemte parringen før disseksjon
- For å generere museembryoer, utfør en tidsbestemt parring mellom voksne mus 9,5 dager før isolering av hjerteregionen. I denne prosedyren ble villtype C57BL/6J-mus i alderen 2-6 måneder brukt, og tidsbestemt parring ble utført over natten.
- Neste morgen, sjekk om hunnmusene har en vaginalplugg. Tenk på dagen pluggen er identifisert som embryonal dag (E) 0,5.
2. Vevsforberedelse og celleisolasjon
- Avlive 2-6 måneder gammel gravid kvinne C57BL/6J ved dag 9,5 etter unnfangelse via CO2 med økende konsentrasjon etterfulgt av cervikal luksasjon. Rengjør den nedre delen av magen med 70% etanol.
MERK: Bruk av anestetika før cervikal dislokasjon anbefales ikke, da dette vil utsette embryoene for miljøendringer som kan påvirke påfølgende transkriptomiske og epigenomiske studier. - Åpne magen og bukhinnen med saks. Visualiser livmorhornene, og bruk tang for å skjære ut begge hornene.
- Legg hornene i en petriskål som inneholder kaldt komplett medium med 1% FBS. Selv om det ikke kreves noe spesifikt volum, må det tas hensyn til at embryoene er helt nedsenket i mediet. Et omtrentlig volum på 10 ml per 10 cm petriskål er passende.
- Under stereomikroskopet satt til 5x forstørrelse og bruk tang, fjern endometrievev, morkake og eggeplommesekk fra hvert embryo.
- Legg embryoene i en petriskål med kaldt komplett medium med 1% FBS. Dissekere den embryonale hjerteregionen, som beskrevet på det skjematiske embryoet illustrert i figur 1, i kaldt komplett medium.
- Samle sammen hjerteområdene dissekert fra fem museembryoer i et 1,5 ml mikrosentrifugerør. Forkjølende svingende bøttesterifuger til 4 °C.
- Sentrifuge ved 300x g i 1 min ved RT i en svingende bøtte sentrifuge. Fjern supernatanten, og vask vevet ved å tilsette 1 ml vevskultur-grade PBS.
- Sentrifuge ved 300 x g i 1 min ved RT. Fjern supernatanten, og gjenta vasketrinnene i totalt to vasker. Gjenta vasken to ganger, erstatt PBS med 0,05% trypsin / EDTA (1x).
- For fordøyelse av vev, tilsett 50 μL 0,25 % trypsin/EDTA i 10 minutter ved 37 °C. Bruk forsiktig mekanisk dissosiasjon etter 5 minutter ved opp- og nedbevegelser ved hjelp av en filterspiss med bred åpning.
- Inaktiver trypsinfordøyelsesaktivitet ved å tilsette 350 μL komplett medium til de dissosierte cellene. Pass de resuspenderte cellene gjennom en 40 μm cellesil.
3. Celletelling og levedyktighetsvurdering
MERK: Celletallet og levedyktigheten er kritiske parametere for suksessen til enkeltcelleeksperimenter. SnATAC-seq-tilnærmingen er følsom for mindre variasjoner i cellenummer. For få celler fører til overfordøyelse av kromatinet, noe som resulterer i et høyere antall avlesninger og kartlegging av utilgjengelige kromatinregioner (støy). På samme måte genererer det å ha for mange celler fragmenter med høy molekylvekt som er vanskelige å sekvensere. For nøyaktig bestemmelse av celle- og kjernekonsentrasjonene ble celletallet og levedyktigheten vurdert ved to forskjellige metoder.
- Utfør en trypanblå analyse for celletelling, som beskrevet nedenfor.
- Vortex 0,4% trypan blå fargeløsning, spinn i 10 s ved romtemperatur ved 2,000 x g, og overfør 10 μL til et mikrorør.
- Bruk en pipette, bland cellesuspensjonen, og tilsett 10 μL suspensjon til den allerede alisiterte 10 μL trypanblå oppløsningen. Bland forsiktig 10 ganger med en pipette.
- Overfør 10 μL av de fargede cellene til et tellelysbilde. Plasser lysbildet i telleren for automatisk å beregne cellekonsentrasjonen og levedyktigheten.
- Utfør en fluorescensbasert vurdering av dødelighet som beskrevet nedenfor.
MERK: Denne analysen er basert på bruk av fluorescerende fargestoffer (ethidium homodimer-1, EthD-1 og calcein AM) for å evaluere cellens levedyktighet. Et kommersielt tilgjengelig sett ble brukt, og leverandørens instruksjoner ble fulgt for riktig forberedelse og bruk.- Forbered en 10 μM EthD-1-løsning ved å tilsette 5 μL av den medfølgende 2 mM EthD-1 stamløsningen til 1 ml steril vevskulturklasse D-PBS og virvel i 5 s for å sikre fullstendig blanding.
- Overfør 2,5 μL av den medfølgende 4 mM calcein AM-stamløsningen til den allerede tilberedte EthD-1-løsningen. Vortex i 5 s for å sikre fullstendig blanding.
- Tilsett 10 μL av den resulterende 10 μM EthD-1 og 10 μM calcein AM-arbeidsløsningen til 10 μL cellesuspensjon.
MERK: Calcein er svært utsatt for hydrolyse i vandige løsninger, så bruk denne arbeidsløsningen innen 1 dag. - Overfør 10 μL av de fargede cellene til et tellelysbilde. Sett lysbildet inn i den automatiserte fluorescerende celletelleren. Telle levende celler ved hjelp av et GFP-filter og de døde cellene med et RFP-filter.
MERK: De to tellemetodene ga lignende celletall og levedyktighet, og det totale antallet ferskt dissosierte celler ble estimert til gjennomsnittlig rundt 20 000 celler per embryonale hjerteregion (0, 06 mm3).
4. Cell frysing
- Sentrifuger cellesuspensjonen ved 500 x g i 5 minutter ved 4 °C. Fjern forsiktig supernatanten uten å berøre bunnen av røret, og resuspender pelleten i 1 ml kjølt frysemedium.
- Overfør cellesuspensjonen til en forkjølt kryovial, og plasser kryovialen i en forkjølt frysebeholder.
- Sett beholderen på -80 ◦C i 4 timer til 8 timer. Overfør kryovialet til flytende nitrogen for nedstrøms enkeltkjerne-RNA- og ATAC-sekvenseringseksperimenter.
MERK: Kryovialet skal transporteres på tørris før bruk. Vår erfaring er at cellene kan lagres i flytende nitrogen i minst 6 måneder uten tap av cellelevedyktighet. Lagringstemperaturen bør holdes under -150 °C hele tiden for å forhindre dannelse av iskrystaller.
5. Celletining og fjerning av døde celler
- Plasser kryovialene i et vannbad på 37 °C i 1–2 minutter. Fjern den når en liten krystall forblir i cryovial.
- Tilsett 1 ml forvarmet (37 °C) komplett medium. Bland med en pipette tre ganger. Overfør suspensjonen til et 15 ml konisk rør inneholdende 10 ml varmt komplett medium.
- Før hele cellesuspensjonen over en 30 μm sil. Skyll silen med 1-2 ml varmt komplett medium, og samle gjennomstrømningen i samme koniske rør.
- Sentrifuger ved 300 x g i 5 minutter, og fjern supernatant. Vask én gang med PBS, og overfør cellesuspensjonen til et 1,5 ml mikrorør.
- Sentrifuger ved 300 x g i 5 minutter, og fjern supernatanten uten å forstyrre cellepelleten.
- Tilsett 100 μL av de medfølgende magnetiske mikrokulene til de pelleterte cellene, og homogeniser fem ganger ved hjelp av en pipettespiss med bred boring. Inkubere i 15 min på RT.
- I mellomtiden skyller du den magnetiske separasjonskolonnen (kapasitet: 1 x 107 til 2 x 108 celler) med 500 μL 1x bindingsbuffer.
- Når inkubasjonen er fullført, fortynn cellesuspensjonen som inneholder mikrokulene med 500 μL 1x bindingsbuffer.
- Påfør cellesuspensjonen (0, 6 μL) på den forberedte magnetiske separasjonskolonnen. Gjennomstrømningen er den negativt valgte levende cellefraksjonen, og den magnetisk beholdte fraksjonen er de positivt valgte døde cellene.
- Samle avløpsvannet fra levende celler i et 15 ml sentrifugerør. Skyll mikrorøret på 1,5 ml som inneholdt cellesuspensjonen og kolonnen med 2 ml 1x bindingsbuffer, og samle opp avløpsvannet i det samme 15 ml røret.
- Sentrifuge ved 300 x g i 5 min. Fjern supernatanten uten å forstyrre cellepelleten.
- Tilsett 1 ml PBS-BSA-oppløsningen, og bland forsiktig ved å pipettere fem ganger med en pipettespiss med bred åpning. Overfør cellesuspensjonen til et 1,5 ml mikrorør.
- Sentrifuge ved 300 x g i 5 min. Fjern supernatanten uten å forstyrre cellepelleten.
- Tilsett 1 ml PBS-BSA for å resuspendere pelleten, og gjenta vasketrinnet i totalt to vasker.
- Resuspender cellene i 100 μL PBS-BSA-løsning. Bland forsiktig ved å pipettere 10 ganger.
- Bestem konsentrasjonen og levedyktigheten til cellene ved hjelp av de tidligere beskrevne metodene (trinn 3.1 og trinn 3.2). For å gå videre til neste trinn, sørg for et celletall på ≥ 100 000 celler. Se figur 2 for representative resultater.
MERK: Kryopreservering resulterer i et tap på ca. 40% av det opprinnelige utgangsmaterialet til levende celler. Avhengig av startantall celler, resulterer perleseparasjon på en magnetisk kolonne i høy celle levedyktighet, men deler det totale antall celler med to ganger til fem ganger. Bruk av et kolonnebasert magnetisk sett for å fjerne de døde cellene anbefales kun når tilstrekkelig utgangsmateriale er tilgjengelig.
6. Kjerner isolasjon
MERK: snATAC og snRNA-seq kombinert utføres med en suspensjon av rene og intakte kjerner. Optimalisering av lysforholdene (lysistid og NP40-konsentrasjon) for den brukte celletypen anbefales. Det optimale lyseringstidspunktet og vaskemiddelkonsentrasjonen er de som resulterer i at det maksimale antall celler blir lysert uten å forstyrre kjernemorfologien. Tapet av celler/kjerner kan reduseres ved å bruke en svingende bøttesentrifuge i stedet for en sentrifuge med fast vinkel. For å minimere kjerneretensjon på plast, anbefales det å bruke pipettespisser og sentrifugerør med lav retensjon. Dette kan øke kjerneutvinningen. Belegget på pipettespissene og sentrifugerørene med 5% BSA er et rimeligere, men mer tidkrevende alternativ.
- Rengjør arbeidsplassen og materialene med 70% etanol og RNase fjerningsløsning.
- Forkjølende svingende bøttesterifuger til 4 °C. Nypreparert lysisbuffer, lysisfortynningsbuffer, 0,1x lysisbuffer og vaskebuffer (se tabell 1). Oppretthold bufferne på is.
- Sentrifuger celleopphenget ved 500 x g i 5 minutter ved 4 °C i en svingende bøttesentrifuge. Fjern forsiktig all supernatanten uten å berøre bunnen av røret for å unngå å løsne cellepelleten.
- Tilsett 100 μL kjølt 0,1x lysebuffer. Bland forsiktig ved å pipettere 10 ganger. Inkuber i 5 min på is.
- Tilsett 1 ml avkjølt vaskebuffer, og bland forsiktig ved å pipettere fem ganger. Sentrifuge ved 500 x g i 5 minutter ved 4 °C. Fjern supernatanten uten å forstyrre kjernepelleten.
- Gjenta vasken med avkjølt vaskebuffer i totalt tre vask. Forbered den fortynnede kjernebufferen. Etter resuspensjon, hold kjerneoppløsningen på is.
7. Kvalitets- og kvantitetsvurderinger av de isolerte kjernene
MERK: Basert på den opprinnelige celletellingen og estimering av omtrent 50 % kjernetap under cellelyse, resuspender riktig antall celler i kaldfortynnet kjernebuffer. Beregningen av resuspensjonsvolumet med kjølt fortynnet kjernebuffer er basert på den målrettede kjerneutvinningen og de tilsvarende konsentrasjonene av kjernelager som anbefales av produsentens brukerhåndbok. Se et eksempel på denne beregningen i tilleggsprotokoll 1.
- Basert på det opprinnelige celletallet og estimering av ca. 50 % kjernetap under cellelyse, resuspenderes riktig antall celler i kaldfortynnet kjernebuffer.
- Bestem den faktiske kjernekonsentrasjonen. Bland 2 μL kjerneoppløsning med 8 μL fortynnet kjernebuffer og tilsett blandingen til den pre-alisiterte 10 μL trypanblå eller EthD-1/calceinAM arbeidsløsning. Tell kjernene ved hjelp av en automatisert celleteller. Mindre enn 5% av cellene skal være levedyktige. Se figur 3 for representative resultater.
- Beregn volumet av kjerner og volumet av fortynnede kjernebuffer for å oppnå et totalvolum på 5 μL ved anbefalt konsentrasjon for transposisjonsreaksjonen (se produsentens brukerhåndbok). Fortsett umiddelbart til transponeringsreaksjonen i henhold til brukerhåndboken17.
MERK: Alle trinnene fra transponeringsreaksjonen til konstruksjonen av ATAC- og GEX-bibliotekene ble utført i henhold til brukerhåndboken til settet som ble brukt til snRNA-seq og snATAC-seq kombinert17.
8. Kvalitetsanalyse av bibliotekene snRNA-seq og snATAC-seq
- Før du går videre til neste generasjons sekvensering, valider kvaliteten og størrelsesfordelingen av de endelige snATAC-seq og genuttrykks-GEX-bibliotekene. Vurdere kvaliteten og kvantiteten av sekvenser identifisert i bibliotekene ved hjelp av fragmentanalysesystemer. Se figur 4 for representative kvalitetsvurderingsresultater .
MERK: Det endelige sporet av snATAC-seq-bibliotekene skal vise periodiciteten av nukleosomvikling, og størrelsene skal variere fra 200 bp til flere Kbp, mens størrelsene i genuttrykksbiblioteket skal variere fra 300 bp til 600 bp.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sammenlignet med fremstillingen av enkeltcellesuspensjoner for enkeltcelletilnærminger, er fremstillingen av enkeltkjernesuspensjoner mye mer utfordrende og krever en høyere grad av oppløsning og behandling. Nøkkelfaktoren for vellykket kombinert snRNA-seq og snATAC-seq er en ren og intakt kjernesuspensjon. Protokollen for effektiv kjerneisolering må tilpasses hver vevstype og tilstand (fersk eller frossen). Her er en optimalisert protokoll beskrevet for isolering av kjerner fra frosne musembryonale hjerteceller. Alle trinnene fra embryonal hjerteregiondisseksjon og hjertecelledissosiasjon til kjerneisolering er oppsummert i figur 1. For utgangsmaterialet anbefales et celletall på 1 x 105-1 x 106 celler og en celle levedyktighet >70% for effektiv kjerneisolasjon. Som vist i figur 2, tillot det ekstra trinnet som ble utført i denne protokollen for å sortere og fjerne de døde cellene etter tining, å oppnå en renere cellesuspensjon med signifikant høyere cellelevedyktighet og for å forbedre kvaliteten på startprøven. I tillegg til kjerneisolering gir denne protokollen detaljert informasjon om hvordan man vurderer kvaliteten og mengden av de isolerte kjernene (figur 3). Kvaliteten på de isolerte kjernene påvirker i stor grad kvaliteten på snRNA-seq og snATAC-seq kombinerte data; Her ble kvaliteten på de isolerte kjernene vurdert ved evaluering av kjernemembranmorfologien. De isolerte kjernene virket glatte og jevnt runde, som vist i figur 3C, under lysfeltmikroskopi, noe som indikerer en effektiv isolasjonsprosess. For mer nøyaktighet ble to forskjellige tellemetoder brukt, inkludert trypanblå og et sett for fluorescensbasert vurdering av levedyktighet, for å kvantifisere cellene og kjernene. Fluorescensanalysen ble brukt til å bestemme cellens levedyktighet basert på cellulær integritet og intracellulær esteraseaktivitet. Denne fargestoffløsningen gjør det mulig å skille levende celler fra døde celler ved samtidig å visualisere grønn fluorescerende kalcein AM, som indikerer intracellulær esteraseaktivitet, og rød fluorescerende ethidiumhomodimer 1, som reflekterer tapet av cellulær integritet. Ved hjelp av et fluorescerende fargestoff for telling bidrar til å skille kjerner fra celleklumper og rusk. Ved hjelp av denne protokollen gikk cellens levedyktighet fra 80% -90% før kjerneisolering til <5% etter kjerneisolasjon, som vist i figur 3A, B.
Vår prosedyre ble sammenlignet med den eksisterende metoden, som innebærer å fryse ferskt vev direkte i flytende nitrogen og utføre lyseringstrinnet uten forutgående enzymatisk dissosiasjon (tilleggsprotokoll 2 og tilleggsfigur 1). Begge tilnærmingene ble testet for å bestemme hvilken metode som gir en kjernesuspensjon av bedre kvalitet. Snap-frysing av hele embryonale hjertevev ga opphav til en høy andel ikke-lyserte celler påvist som levende, noe som indikerer uhensiktsmessig cellelyse (tilleggsfigur 1A). Aggregater og ikke-individuelle celler ble observert til tross for filtrering gjennom filtre (tilleggsfigur 1A,B).
De isolerte kjernene ble brukt til å generere biblioteker for felles snATAC-seq og snRNA-seq. Figur 4 illustrerer kvalitetskontrollresultatene av cDNA brukt til konstruksjon av genuttrykksbiblioteket (GEX) og ATAC-biblioteket. Kvalitetskontrollen ble utført med automatisert elektroforese (figur 5A). De mRNA-avledede cDNAene ble kvantifisert, og utbyttet var tilstrekkelig for senere bruk i GEX-bibliotekkonstruksjon. Et høykvalitets GEX-bibliotek som spenner fra ~ 300 bp til 600 bp og et ATAC-bibliotek av høy kvalitet med periodisk nukleosomvikling fra 200 bp til 7 kbp ble oppnådd. Disse bibliotekene ble sekvensert ved høykapasitetssekvensering og genererte vellykket enkeltkjernegenuttrykk og kromatintilgjengelighet (figur 5A). Disse rådataene var klare til å bli demultiplekset og bioinformatisk analysert for å generere transkripsjonell og epigenetisk profilering av mus E9.5 hjerteprogenitorceller. SnRNA-seq og snATAC-seq ble gruppert, identifisert og merket basert på kjente markørgener ved bruk av uovervåket clustering med Seurat toolkit for single genomics24 . Denne innledende analysen bekreftet tilstedeværelsen av alle forventede hjertecelletyper ved E9.5 (figur 5B).
Alle resultatene ovenfor støtter suksessen til denne protokollen ved å isolere kjerner som er egnet for nedstrøms enkeltkjerner tilnærminger fra frosne embryonale hjerteceller.
Figur 1: Representasjon av hovedtrinnene i prøvepreparering for kombinert snRNA-seq og snATAC-seq profilering. Dette flytskjemaet rekapitulerer alle trinnene, inkludert hjertevevsdisseksjon og hjertecelledissosiasjon, cellefrysing og tining, levende cellerensing ved å fjerne døde celler og kjerneisolering, som utføres for samtidig påvisning av mRNA og kromatintilgjengelighet fra samme celle. Forkortelser: PBS = fosfatbufret saltvann; BSA = bovint serumalbumin; RT = romtemperatur. Laget med BioRender.com Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Levedyktigheten til de optimaliserte tinte cellene etter sortering av døde celler. Bilder som viser celleantall og levedyktighet ved hjelp av en automatisert celleteller før (øverst) og etter (nederst) fjerning av døde celler ved hjelp av trypanblå ekskluderingsfargestoff. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Kvalitetskontroll av kjernepreparatet. (A,B) Bilder som viser celleantall og levedyktighet ved hjelp av en automatisert celleteller før (øverst) og etter (nederst) kjerneisolasjon. To tellemetoder ble benyttet: (A) analysen for fluorescerende mortalitet og (B)trypanblåanalysen. (C) Bilder som viser kvaliteten på kjerneisolasjonen. Bildene ble tatt ved 20x (skala bar = 50 μm) ved hjelp av brightfield og fluorescens mikroskopi. Brightfield-bildet (til venstre) viser kjernemorfologi; RFP (midten) viser celler som mistet membranintegriteten, med andre ord isolerte kjerner; og GFP (høyre) som normalt indikerer esteraseaktiviteten til levende celler her, bekrefter fraværet av levende celler i kjernesuspensjonen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Kvalitetskontroll av encellet genuttrykk og ATAC-biblioteker. DNA-analyse med automatisert elektroforese som viser kvaliteten og størrelsesfordelingen av cDNA (øverst), GEX-biblioteket (midten) og ATAC-biblioteket (nederst). For cDNA-kvantifiseringen ble sonen fra 200 bp til 8,900 bp valgt, og bioanalysatoren estimerte cDNA-konsentrasjonen (i pg / μL; rød sirkel). Et tilstrekkelig cDNA-utbytte ble oppnådd for å fortsette med GEX-bibliotekkonstruksjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Eksempelytelse vurdert med Cell Ranger-programvaren25. (A) Kryssfølsomhetsplott som viser transponeringshendelsene i topper per strekkode på x-aksen og RNA unike molekylære identifikatorer (UMI) per strekkode på y-aksen. Som forventet er cellene hovedsakelig plassert i øvre høyre hjørne, med høye RNA- og ATAC-data. En klar separasjon mellom celler og ikke-celler (tomme GEMer, bakgrunnssignal) ble observert. (B) Representativ uniform manifold approksimasjon og projeksjon (UMAP) plott av alle fangede celler i scRNA-seq (venstre) og scATAC-seq (høyre) farget av klyngeidentitet og gruppert basert på celletyper. En god separasjon av klynger ble observert. Felles GEX- og ATAC-rådata ble oppnådd ved sekvensering av 7000 kjerner fra den dissekerte E9.5-museembryonale hjerteregionen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tilleggsfigur 1: Kvalitetskontroll av kjerneisolering fra eksisterende metode med frysing av ferskt vev direkte i flytende nitrogen. (A) Bilder som viser det isolerte kjerneantallet ved hjelp av en automatisert celleteller og trypanblå som eksklusjonsfarge før (øverst) og etter (bunn) filtrering gjennom en 40 μm sil. En høy andel ikke-lyserte celler ble påvist som levende. Deteksjon av 20% levende celler indikerer upassende cellelyse. De svarte pilene indikerer aggregater. (B) Bilder som viser kvaliteten på de isolerte kjernene. Bildene ble tatt ved 20x (topp og midt med en skala bar på 50 μm) og 40x (bunn med en skala bar på 25 μm) ved hjelp av brightfield og fluorescens mikroskopi. Brightfield-bildet (til venstre) viser kjernemorfologien; RFP (høyre) viser celler som mistet membranintegriteten, med andre ord isolerte kjerner. De svarte pilene indikerer multipletter av kjerner festet av rusk. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tabell 1: Tabell over buffere og løsninger brukt i prosedyren. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Tilleggsprotokoll 1: Vurdering av mengden av de isolerte kjernene. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsprotokoll 2: Isolering av kjerner fra flashfrosset vev. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Analysen av den cellulære sammensetningen av det utviklende hjertet ved kombinerte snRNA-seq- og snATAC-seq-studier gir en dypere forståelse av opprinnelsen til medfødt hjertesykdom26. Flere forskningslaboratorier har studert effekten av hjertevevskryopreservering på snRNA-seq27. Gjennomføring av snRNA-seq og snATAC-seq ved hjelp av ferskt mikrodissekert vev fra musemodeller av menneskelig sykdom kan være logistisk utfordrende når man sammenligner forskjellige eksperimentelle forhold. For et gitt utviklingsstadium er en vanskelighet at kontroll- og eksperimentgruppene må behandles i samme løp for å redusere den tekniske variabiliteten som prøvebehandlingen introduserer. Når behandling av ferskt vev ikke er mulig, anbefales det, basert på våre resultater, å dissosiere og deretter kryokonservere i stedet for å snap-fryse hele det embryonale hjertevevet. Valget av den ene metoden fremfor den andre er basert på det faktum at hvis hjertevevet fryses hele, er det mye mer utfordrende å isolere levedyktige enkeltceller etter tining. Men hvis vevsdissosiasjonsprotokollen ikke er optimalisert, kan det være bedre å snap-fryse vevet hele. Dissosiasjon etterfulgt av kryopreservering foretrekkes gitt at denne vevsdissosiasjonsprotokollen gir >90% friske levedyktige celler uten celletypeskjevhet.
Denne tilnærmingen har flere fordeler, for eksempel bruk av frosne celler, som eliminerer kravet til ferskt vev, og bruken av et enkeltcelle dissosiasjonstrinn, som muliggjør isolering av intakte enkeltkjerner; Faktisk er dette kritisk for nedstrøms enkeltcelleanalyse. Imidlertid kan den enzymatiske dissosiasjonen indusere transkripsjonsskjevhet i cellepopulasjoner. Enzymatisk celledissosiasjon forstyrrer det cellulære mikromiljøet og induserer dermed transkripsjonsendringer i de fleste celletyper28. Den primære determinanten for disse endringene er dissosiasjonstiden, ikke celletypen29. For å moderere dissosiasjonsinduserte artefakter er det viktig å følge anbefalt fordøyelsestid. Den publiserte litteraturen i forskjellige vev indikerer at en fordøyelsestid på 30 minutter eller mindre induserer mindre transkripsjonsendringer28,30. I tillegg kan bioinformatikkintervensjoner brukes til å minimere dataforvrengninger31,32.
Innhenting av rene og intakte enkeltkjerner er den viktigste faktoren i enkeltkjernegenomikk. Tilstopping av mikrofluidiske kamre av enkeltcelleplattformer på grunn av tilstedeværelsen av celleklynger eller organisk rusk fører til dårlig datakvalitet eller, mer problematisk, til eksperimentell feil. I denne prosedyren ble eksisterende protokoller modifisert ved å kombinere enzymatisk dissosiasjon, kryopreservering og rensing av levedyktige hjerteprogenitorceller. Vår prosedyre tillater isolering av rene kjerner uten behov for FACS-sortering. Ved hjelp av denne prosedyren oppnådde vi en kjernefysisk suspensjon av høy kvalitet uten klumping, nesten ingen rusk og intakte enkeltkjerner. Celleisolasjonstrinnet er avgjørende for å unngå potensiell kjerneklumping; Dette kan faktisk unngås ved forsiktig pipettering ved hjelp av store pipettespisser eller ved å filtrere kjernene. Bruk av filtre på forskjellige trinn og påfølgende observasjon under et lysmikroskop kan forhindre slike problemer.
Protokollen beskrevet her ble vellykket brukt til snRNA-seq og snATAC-seq-profilering fra samme kjernepreparat oppnådd fra E9.5 hjerteprogenitorceller. Denne metoden kan brukes i gravide vill-type mus versus mus modeller for medfødte hjertefeil. Medfødte hjertefeil oppstår sannsynligvis på grunn av forstyrrelse av veier som styrer differensiering, multiplikasjon, migrasjon og overlevelse av hjerteprogenitorceller33,34. For bedre å forstå opprinnelsen til disse feilene, fokuserte denne studien spesielt på embryonale stadium 9,5, hvor forfedrene til de viktigste områdene som er berørt i medfødte hjertefeil, er tilstede, spesielt hjerteforfedrene til det andre hjertefeltet11 og nevralkammen35. Anvendelsen av denne prosedyren på celler i det voksne musehjertet og menneskets hjerte krever optimalisering av protokollen, spesielt når det gjelder celledissosiasjon og lysistrinn.
De viktigste hensynene mellom manuell og automatisert celletelling er kostnadene, arbeidskraften og nøyaktigheten. Automatiserte tellere er raskere enn de fleste dyktige forskere som utfører en manuell telling. Spesielt når du arbeider med et stort antall prøver, er det en stor fordel å bare kunne trykke på telle og se resultatet. Dette er et viktig poeng fordi når kjernene er isolert, må de behandles raskt for å unngå tap av integritet. Den primære nøyaktighetsfordelen med automatiserte systemer er at disse systemene eliminerer variasjon mellom brukere eller laboratorier. En annen fordel er at automatiserte systemer vanligvis har et større synsfelt enn hemocytometre. Når antall celler/kjerner eller konsentrasjonen av cellene/kjernene er lavere, er dette større synsfeltet absolutt en fordel i forhold til den tradisjonelle manuelle metoden.
En høy prosentandel av mitokondriell DNA-forurensning kan observeres når konsentrasjonen av det ikke-ioniske vaskemiddelet er for høyt. Ved å redusere konsentrasjonen i lysisbufferen, kan denne forurensningen reduseres uten å redusere utbyttet av kjernene. De mest tilfredsstillende resultatene ble oppnådd i våre eksperimenter med en lysisbuffer inneholdende 0,1% vaskemiddel. Spinning av kjernene i en svingbøtte kan også redusere antall mitokondrier i pelleten.
Å ha et passende forhold mellom Tn5-transposase og kjerner er avgjørende for vellykket snATAC-seq13,14. For eksempel kan for mye Tn5 føre til høy bakgrunn på grunn av lukket kromatin og lav kompleksitet i sekvenseringsbibliotekene, mens sublysis kanskje ikke resulterer i et komplett PCR-forsterket bibliotek13. For å bestemme antall kjerner nøyaktig, brukte vi to komplementære metoder.
Multimodale omics datasett gir mulighet til å undersøke flere nivåer av genomisk organisasjon samtidig 9,36. Den felles RNA og ATAC multimodale tilnærmingen muliggjør studier av oppstrøms regulatorer og nedstrøms metabolske gener og gir en omfattende tilnærming til studiet av transkripsjonsnettverk og kromatinarkitektur i sammenheng med hjerteutvikling ved enkeltcelleoppløsning. Denne protokollen for enkeltkjerneisolering er kompatibel med både individuell og felles evaluering av ekspresjons- og kromatindatasett. Kromatintilgjengelighet er et viktig epigenetisk reguleringsnivå fordi det muliggjør aktiviteten til transkripsjonsregulatorer på spesifikke genomiske steder 8,9,10,11,12,13. Et mangfold av informasjon om identitets- og målstedene til dusinvis av mulige transkripsjonsfaktorer er dermed gitt av DNA-sekvensen i kromatinprofilen. Sammenligningen av informasjonen innhentet av snATAC-seq med snRNA-ekspresjonsprofilering kan bidra til å identifisere de mest relevante transkripsjonsfaktorene, som deretter kan analyseres videre av Cut&Run37. Vi håper at denne prosedyren vil hjelpe interesserte forskere og oppmuntre dem til å bruke denne kraftige metoden for sin forskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Denne forskningen ble støttet av ERA-CVD-2019 og ANR-JCJC-2020 til SS. Vi takker Genomics and Bioinformatics facility (GBiM) fra U 1251/Marseille Medical Genetics lab og de anonyme korrekturleserne for å gi verdifulle kommentarer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2100 Bioanalyzer Instrument | Agilent | No catalog number | |
| 5M Sodium chloride (NaCl) | Sigma | 59222C-500ML | |
| BSA 10% | Sigma | A1595-50ML | |
| Chromium Next GEM Chip J Single Cell Kit, 16 rxns | 10X Genomics | 1000230 | |
| Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression Reagent Bundle, 4 rxns (including Nuclei Buffer 20X) | 10X Genomics | 1000285 | |
| Countess cell counting chamber slides | Invitrogen | C10283 | |
| Countess III FL | Thermofisher | No catalog number | |
| Digitonin (5%) | Thermofisher | BN2006 | |
| DMSO | Sigma | D2650-5x5ML | |
| DNA LoBind Tubes | Eppendorf | 22431021 | |
| D-PBS | Thermofisher | 14190094 | Sterile and RNase-free |
| Dual Index Kit TT Set A 96 rxns | 10X Genomics | 1000215 | |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 352096 | |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 10788561 | |
| HI-FBS | Thermofisher | A3840001 | Heat inactivated |
| High sensitivity DNA kit | Agilent | 5067-4626 | |
| Igepal CA-630 | Sigma | I8896-50ML | |
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit | Thermofisher | L3224 | |
| MACS Dead Cell Removal kit: Dead Cell Romoval MicroBeads, Binding Buffer 20X | Miltenyi Biotec | 130-090-101 | |
| MACS SmartStrainers (30 µm) | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma | M1028-100ML | |
| Milieu McCoy 5A | Thermofisher | 16600082 | |
| MS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| NovaSeq 6000 S2 | Illumina | No catalog number | |
| Penicillin Streptomycin (Pen/Strep) | Thermofisher | 15070063 | |
| PluriStrainer Mini 40µm | PluriSelect | V-PM15-2021-12 | |
| Rock inhibitor | Enzo Life Sciences | ALX-270-333-M005 | |
| Single Index Kit N Set A, 96 rxn | 10X Genomics | 1000212 | |
| Standard 90mm Petri dish Sterilin | Thermofisher | 101R20 | |
| Sterile double-distilled water | Thermofisher | R0582 | |
| Trizma Hydrochloride solution (HCl) | Sigma | T2194-100ML | |
| Trypan Blue stain (0.4%) | Invitrogen | T10282 | |
| Trypsin 0.05% - EDTA 1X | Thermofisher | 25300054 | |
| Tween20 | Sigma | P9416-50ML | |
| Wide orifice filtered pipette tips 200 μl | Labcon | 1152-965-008-9 | |
| ZEISS SteREO Discovery.V8 | ZEISS | No catalog number |
References
- vander Bom, T., et al. The changing epidemiology of congenital heart disease. Nature Reviews. Cardiology. 8 (1), 50-60 (2011).
- Bouma, B. J., Mulder, B. J. Changing landscape of congenital heart disease. Circulation Research. 120 (6), 908-922 (2017).
- Postma, A. V., Bezzina, C. R., Christoffels, V. M. Genetics of congenital heart disease: The contribution of the noncoding regulatory genome. Journal of Human Genetics. 61 (1), 13-19 (2016).
- Buijtendijk, M. F. J., Barnett, P., vanden Hoff, M. J. B.
- Sylva, M., vanden Hoff, M. J., Moorman, A. F.
- Gromova, T., Gehred, N. D., Vondriska, T. M. Single-cell transcriptomes in the heart: When every epigenome counts. Cardiovascular Research. 119 (1), 64-78 (2022).
- Tanay, A., Regev, A. Scaling single-cell genomics from phenomenology to mechanism. Nature. 541 (7637), 331-338 (2017).
- Schwartzman, O., Tanay, A. Single-cell epigenomics: Techniques and emerging applications. Nature Reviews. Genetics. 16 (12), 716-726 (2015).
- Macaulay, I. C., Ponting, C. P., Voet, T. Single-cell multiomics: Multiple measurements from single cells. Trends in Genetics. 33 (2), 155-168 (2017).
- Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. ATAC-seq: A method for assaying chromatin accessibility genome-wide. Current Protocols in Molecular Biology. 109, 1-9 (2015).
- Stefanovic, S., et al. Hox-dependent coordination of mouse cardiac progenitor cell patterning and differentiation. Elife. 9, e55124 (2020).
- Xu, W., et al. A plate-based single-cell ATAC-seq workflow for fast and robust profiling of chromatin accessibility. Nature Protocols. 16 (8), 4084-4107 (2021).
- Buenrostro, J. D., et al. Single-cell chromatin accessibility reveals principles of regulatory variation. Nature. 523 (7561), 486-490 (2015).
- Denisenko, E., et al. Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus RNA-seq workflows. Genome Biology. 21 (1), 130 (2020).
- Safabakhsh, S., et al. Isolating nuclei from frozen human heart tissue for single-nucleus RNA sequencing. Current Protocols. 2 (7), e480 (2022).
- Pimpalwar, N., et al. Methods for isolation and transcriptional profiling of individual cells from the human heart. Heliyon. 6 (12), 05810 (2020).
- 10x Genomics. Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression Reagent Kits User Guide. 10x Genomics. , CG000338_ChromiumNextGEM_Multiome_ATAC_GEX_User_Guide_RevF.pdf (2022).
- Jia, G., et al. Single cell RNA-seq and ATAC-seq analysis of cardiac progenitor cell transition states and lineage settlement. Nature Communications. 9 (1), 4877 (2018).
- Wang, L., et al. Single-cell dual-omics reveals the transcriptomic and epigenomic diversity of cardiac non-myocytes. Cardiovascular Research. 118 (6), 1548-1563 (2022).
- Wang, Z., et al. Cell-type-specific gene regulatory networks underlying murine neonatal heart regeneration at single-cell resolution. Cell Reports. 35 (8), 109211 (2021).
- Ameen, M., et al. Integrative single-cell analysis of cardiogenesis identifies developmental trajectories and non-coding mutations in congenital heart disease. Cell. 185 (26), 4937-4953 (2022).
- Gao, R., et al. Pioneering function of Isl1 in the epigenetic control of cardiomyocyte cell fate. Cell Research. 29 (6), 486-501 (2019).
- Manivannan, S., et al. Single-cell transcriptomic profiling unveils dysregulation of cardiac progenitor cells and cardiomyocytes in a mouse model of maternal hyperglycemia. Communications Biology. 5 (1), 820 (2022).
- Cao, Y., et al. Integrated analysis of multimodal single-cell data with structural similarity. Nucleic Acids Research. 50 (21), e121 (2022).
- What is CellRanger. 10x Genomics. , Available from: https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/what-is-cell-ranger (2023).
- Hill, M. C. Integrated multi-omic characterization of congenital heart disease. Nature. 608 (7921), 181-191 (2022).
- Chen, Z., Wei, L., Duru, F., Chen, L. Single-cell RNA sequencing: In-depth decoding of heart biology and cardiovascular diseases. Current Genomics. 21 (8), 585-601 (2020).
- Machado, L., Relaix, F., Mourikis, P. Stress relief: Emerging methods to mitigate dissociation-induced artefacts. Trends in Cell Biology. 31 (11), 888-897 (2021).
- Tabula Muris, C., et al. Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris. Nature. 562 (7727), 367-372 (2018).
- Machado, L., et al. Tissue damage induces a conserved stress response that initiates quiescent muscle stem cell activation. Cell Stem Cell. 28 (6), 1125-1135 (2021).
- Haghverdi, L., Lun, A. T. L., Morgan, M. D., Marioni, J. C. Batch effects in single-cell RNA-sequencing data are corrected by matching mutual nearest neighbors. Nature Biotechnology. 36 (5), 421-427 (2018).
- Yang, Y., et al. SMNN: Batch effect correction for single-cell RNA-seq data via supervised mutual nearest neighbor detection. Briefings in Bioinformatics. 22 (3), 097 (2021).
- Stefanovic, S., Christoffels, V. M. GATA-dependent transcriptional and epigenetic control of cardiac lineage specification and differentiation. Cellular and Molecular Life Sciences. 72 (20), 3871-3881 (2015).
- Gunthel, M., Barnett, P., Christoffels, V. M. Development, proliferation, and growth of the mammalian heart. Molecular Therapy. 26 (7), 1599-1609 (2018).
- Stefanovic, S., Etchevers, H. C., Zaffran, S. Outflow tract formation-embryonic origins of conotruncal congenital heart disease. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 8 (4), 42 (2021).
- Hao, Y., et al. Integrated analysis of multimodal single-cell data. Cell. 184 (13), 3573-3587 (2021).
- Bai, H., Lin, M., Meng, Y., Bai, H., Cai, S. An improved CUT&RUN method for regulation network reconstruction of low abundance transcription factor. Cellular Signalling. 96, 110361 (2022).
