Summary

Kjerneisolering fra musens hjerteprogenitorceller for epigenom og genuttrykksprofilering ved enkeltcelleoppløsning

Published: May 12, 2023
doi:

Summary

Her presenterer vi en protokoll som beskriver cellekjernepreparering. Etter mikrodisseksjon og enzymatisk dissosiasjon av hjertevev til enkeltceller ble stamcellene frosset, etterfulgt av isolering av rene levedyktige celler, som ble brukt til enkeltkjerne-RNA-sekvensering og enkeltkjerneanalysen for transposasetilgjengelig kromatin med høykapasitetssekvenseringsanalyser.

Abstract

Det utviklende hjertet er en kompleks struktur som inneholder forskjellige stamceller styrt av komplekse reguleringsmekanismer. Undersøkelsen av genuttrykket og kromatintilstanden til individuelle celler tillater identifisering av celletype og tilstand. Enkeltcellesekvenseringstilnærminger har avslørt en rekke viktige egenskaper ved hjerteprogenitorcelleheterogenitet. Imidlertid er disse metodene generelt begrenset til ferskt vev, noe som begrenser studier med ulike eksperimentelle forhold, da det ferske vevet må behandles samtidig i samme kjøring for å redusere den tekniske variabiliteten. Derfor er det nødvendig med enkle og fleksible prosedyrer for å produsere data fra metoder som enkeltkjerne RNA-sekvensering (snRNA-seq) og enkeltkjerneanalysen for transposase-tilgjengelig kromatin med høy gjennomstrømningssekvensering (snATAC-seq) i dette området. Her presenterer vi en protokoll for raskt å isolere kjerner for påfølgende enkeltkjerner dual-omics (kombinert snRNA-seq og snATAC-seq). Denne metoden tillater isolering av kjerner fra frosne prøver av hjerteprogenitorceller og kan kombineres med plattformer som bruker mikrofluidiske kamre.

Introduction

Blant fødselsskader, medfødte hjertefeil (CHDs) er den vanligste, forekommer i ca 1% av levende fødsler hvert år 1,2. Genetiske mutasjoner er identifisert i bare et mindretall av tilfellene, noe som innebærer at andre årsaker, som abnormiteter i genregulering, er involvert i etiologien til CHD 2,3. Hjerteutvikling er en kompleks prosess med forskjellige og samvirkende celletyper, noe som gjør identifisering av kausale ikke-kodende mutasjoner og deres effekter på genregulering utfordrende. Organogenese av hjertet begynner med cellulære progenitorer som gir opphav til forskjellige undertyper av hjerteceller, inkludert myokardiale, fibroblast-, epikardiale og endokardiale celler 4,5. Encellegenomikk fremstår som en nøkkelmetode for å studere hjerteutvikling og vurdere virkningen av cellulær heterogenitet i helse og sykdom6. Utviklingen av multi-omics-metoder for samtidig måling av forskjellige parametere og utvidelse av beregningsrørledninger har gjort det lettere å oppdage celletyper og subtyper i det normale ogsyke hjertet. Denne artikkelen beskriver en pålitelig enkeltkjerneisolasjonsprotokoll for frosne hjerteprogenitorceller oppnådd fra museembryoer som er kompatibel med nedstrøms snRNA-seq og snATAC-seq (samt snRNA-seq og snATAC-seq kombinert)7,8,9.

ATAC-seq er en robust metode som gjør det mulig å identifisere regulatoriske åpne kromatinregioner og posisjonering av nukleosomer10,11. Denne informasjonen brukes til å trekke konklusjoner om plasseringen, identiteten og aktiviteten til transkripsjonsfaktorer. Aktiviteten til kromatinfaktorer, inkludert remodelers, samt transkripsjonsaktiviteten til RNA-polymerase, kan dermed analyseres siden metoden er svært følsom for måling av kvantitative endringer i kromatinstruktur 1,2. Dermed gir ATAC-seq en robust og upartisk tilnærming til å avdekke mekanismene som styrer transkripsjonsregulering i en bestemt celletype. ATAC-seq-protokoller har også blitt validert for å måle kromatintilgjengelighet i enkeltceller, noe som avslører variabilitet i kromatinarkitekturen i cellepopulasjoner10,12,13.

Selv om det har vært bemerkelsesverdige fremskritt innen enkeltceller de siste årene, er hovedproblemet behandlingen av de ferske prøvene som trengs for å utføre disse forsøkene14. For å omgå denne vanskeligheten er det utført ulike tester med sikte på å gjennomføre analyser som snRNA-seq og snATAC-seq med frosset hjertevev eller celler15,16.

Flere plattformer har blitt brukt til å analysere encellede genomikkdata17. De mye brukte plattformene for enkeltcellegenuttrykk og ATAC-profilering er plattformer for multippel mikrofluidisk dråpeinnkapsling17. Siden disse plattformene bruker mikrofluidiske kamre, kan rusk eller aggregater tette systemet, noe som resulterer i ikke-brukbare data. Dermed avhenger suksessen til enkeltcellestudier av nøyaktig isolering av individuelle celler / kjerner.

Protokollen som presenteres her bruker en lignende tilnærming til nyere studier ved bruk av snRNA-seq og snATAC-seq for å forstå medfødte hjertefeil 18,19,20,21,22,23. Denne prosedyren benytter enzymatisk dissosiasjon av ferskt mikrodissekert hjertevev etterfulgt av kryopreservering av musens hjerteprogenitorceller. Etter tining blir de levedyktige cellene renset og behandlet for kjernefysisk isolasjon. I dette arbeidet ble denne protokollen vellykket brukt til å oppnå snRNA-seq og snATAC-seq data fra samme nukleære forberedelse av mus hjerte stamceller.

Protocol

Dyreprosedyren som ble vedtatt i denne studien ble godkjent av dyreetiske komiteer ved Aix-Marseille University (C2EA-14) og ble utført i henhold til protokoller godkjent av den utnevnte nasjonale etiske komiteen for dyreforsøk (Ministère de l’Education Nationale, de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche; Autorisasjon Apafis N°33927-2021111715507212). 1. Sette opp den tidsbestemte parringen før disseksjon For å generere museembryoer, utfør en tidsbestem…

Representative Results

Sammenlignet med fremstillingen av enkeltcellesuspensjoner for enkeltcelletilnærminger, er fremstillingen av enkeltkjernesuspensjoner mye mer utfordrende og krever en høyere grad av oppløsning og behandling. Nøkkelfaktoren for vellykket kombinert snRNA-seq og snATAC-seq er en ren og intakt kjernesuspensjon. Protokollen for effektiv kjerneisolering må tilpasses hver vevstype og tilstand (fersk eller frossen). Her er en optimalisert protokoll beskrevet for isolering av kjerner fra frosne musembryonale hjerteceller. Al…

Discussion

Analysen av den cellulære sammensetningen av det utviklende hjertet ved kombinerte snRNA-seq- og snATAC-seq-studier gir en dypere forståelse av opprinnelsen til medfødt hjertesykdom26. Flere forskningslaboratorier har studert effekten av hjertevevskryopreservering på snRNA-seq27. Gjennomføring av snRNA-seq og snATAC-seq ved hjelp av ferskt mikrodissekert vev fra musemodeller av menneskelig sykdom kan være logistisk utfordrende når man sammenligner forskjellige eksper…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Denne forskningen ble støttet av ERA-CVD-2019 og ANR-JCJC-2020 til SS. Vi takker Genomics and Bioinformatics facility (GBiM) fra U 1251/Marseille Medical Genetics lab og de anonyme korrekturleserne for å gi verdifulle kommentarer.

Materials

2100 Bioanalyzer Instrument Agilent No catalog number
5M Sodium chloride (NaCl) Sigma 59222C-500ML 
BSA 10%  Sigma A1595-50ML
Chromium Next GEM Chip J Single Cell Kit, 16 rxns 10X Genomics 1000230
Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression Reagent Bundle, 4 rxns (including Nuclei Buffer 20X) 10X Genomics 1000285
Countess cell counting chamber slides Invitrogen C10283
Countess III FL Thermofisher No catalog number
Digitonin (5%) Thermofisher BN2006
DMSO Sigma D2650-5x5ML
DNA LoBind Tubes  Eppendorf 22431021
D-PBS Thermofisher 14190094 Sterile and RNase-free
Dual Index Kit TT Set A 96 rxns 10X Genomics 1000215
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes  Fisher Scientific  352096
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes  Fisher Scientific  10788561
HI-FBS Thermofisher A3840001 Heat inactivated
High sensitivity DNA kit Agilent 5067-4626
Igepal CA-630 Sigma I8896-50ML
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit Thermofisher L3224
MACS Dead Cell Removal kit: Dead Cell Romoval MicroBeads, Binding Buffer 20X Miltenyi Biotec 130-090-101
MACS SmartStrainers (30 µm) Miltenyi Biotec 130-098-458
Magnesium chloride (MgCl2) Sigma M1028-100ML
Milieu McCoy 5A  Thermofisher 16600082
MS Columns Miltenyi Biotec 130-042-201
NovaSeq 6000 S2 Illumina No catalog number
Penicillin Streptomycin (Pen/Strep) Thermofisher 15070063
PluriStrainer Mini 40µm PluriSelect V-PM15-2021-12
Rock inhibitor Enzo Life Sciences ALX-270-333-M005
Single Index Kit N Set A, 96 rxn 10X Genomics 1000212
Standard 90mm Petri dish Sterilin Thermofisher 101R20
Sterile double-distilled water Thermofisher R0582
Trizma Hydrochloride solution (HCl) Sigma T2194-100ML 
Trypan Blue stain (0.4%) Invitrogen T10282
Trypsin 0.05% – EDTA 1X Thermofisher 25300054
Tween20 Sigma P9416-50ML 
Wide orifice filtered pipette tips 200 μl Labcon 1152-965-008-9
ZEISS SteREO Discovery.V8 ZEISS No catalog number

References

  1. vander Bom, T., et al. The changing epidemiology of congenital heart disease. Nature Reviews. Cardiology. 8 (1), 50-60 (2011).
  2. Bouma, B. J., Mulder, B. J. Changing landscape of congenital heart disease. Circulation Research. 120 (6), 908-922 (2017).
  3. Postma, A. V., Bezzina, C. R., Christoffels, V. M. Genetics of congenital heart disease: The contribution of the noncoding regulatory genome. Journal of Human Genetics. 61 (1), 13-19 (2016).
  4. Buijtendijk, M. F. J., Barnett, P., vanden Hoff, M. J. B. Development of the human heart. American Journal of Medical Genetics. Part C, Seminars in Medical Genetics. 184 (1), 7-22 (2020).
  5. Sylva, M., vanden Hoff, M. J., Moorman, A. F. Development of the human heart. American Journal of Medical Genetics. Part A. 164 (6), 1347-1371 (2014).
  6. Gromova, T., Gehred, N. D., Vondriska, T. M. Single-cell transcriptomes in the heart: When every epigenome counts. Cardiovascular Research. 119 (1), 64-78 (2022).
  7. Tanay, A., Regev, A. Scaling single-cell genomics from phenomenology to mechanism. Nature. 541 (7637), 331-338 (2017).
  8. Schwartzman, O., Tanay, A. Single-cell epigenomics: Techniques and emerging applications. Nature Reviews. Genetics. 16 (12), 716-726 (2015).
  9. Macaulay, I. C., Ponting, C. P., Voet, T. Single-cell multiomics: Multiple measurements from single cells. Trends in Genetics. 33 (2), 155-168 (2017).
  10. Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. ATAC-seq: A method for assaying chromatin accessibility genome-wide. Current Protocols in Molecular Biology. 109, 1-9 (2015).
  11. Stefanovic, S., et al. Hox-dependent coordination of mouse cardiac progenitor cell patterning and differentiation. Elife. 9, e55124 (2020).
  12. Xu, W., et al. A plate-based single-cell ATAC-seq workflow for fast and robust profiling of chromatin accessibility. Nature Protocols. 16 (8), 4084-4107 (2021).
  13. Buenrostro, J. D., et al. Single-cell chromatin accessibility reveals principles of regulatory variation. Nature. 523 (7561), 486-490 (2015).
  14. Denisenko, E., et al. Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus RNA-seq workflows. Genome Biology. 21 (1), 130 (2020).
  15. Safabakhsh, S., et al. Isolating nuclei from frozen human heart tissue for single-nucleus RNA sequencing. Current Protocols. 2 (7), e480 (2022).
  16. Pimpalwar, N., et al. Methods for isolation and transcriptional profiling of individual cells from the human heart. Heliyon. 6 (12), 05810 (2020).
  17. 10x Genomics. Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression Reagent Kits User Guide. 10x Genomics. , (2022).
  18. Jia, G., et al. Single cell RNA-seq and ATAC-seq analysis of cardiac progenitor cell transition states and lineage settlement. Nature Communications. 9 (1), 4877 (2018).
  19. Wang, L., et al. Single-cell dual-omics reveals the transcriptomic and epigenomic diversity of cardiac non-myocytes. Cardiovascular Research. 118 (6), 1548-1563 (2022).
  20. Wang, Z., et al. Cell-type-specific gene regulatory networks underlying murine neonatal heart regeneration at single-cell resolution. Cell Reports. 35 (8), 109211 (2021).
  21. Ameen, M., et al. Integrative single-cell analysis of cardiogenesis identifies developmental trajectories and non-coding mutations in congenital heart disease. Cell. 185 (26), 4937-4953 (2022).
  22. Gao, R., et al. Pioneering function of Isl1 in the epigenetic control of cardiomyocyte cell fate. Cell Research. 29 (6), 486-501 (2019).
  23. Manivannan, S., et al. Single-cell transcriptomic profiling unveils dysregulation of cardiac progenitor cells and cardiomyocytes in a mouse model of maternal hyperglycemia. Communications Biology. 5 (1), 820 (2022).
  24. Cao, Y., et al. Integrated analysis of multimodal single-cell data with structural similarity. Nucleic Acids Research. 50 (21), e121 (2022).
  25. What is CellRanger. 10x Genomics Available from: https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/what-is-cell-ranger (2023)
  26. Hill, M. C. Integrated multi-omic characterization of congenital heart disease. Nature. 608 (7921), 181-191 (2022).
  27. Chen, Z., Wei, L., Duru, F., Chen, L. Single-cell RNA sequencing: In-depth decoding of heart biology and cardiovascular diseases. Current Genomics. 21 (8), 585-601 (2020).
  28. Machado, L., Relaix, F., Mourikis, P. Stress relief: Emerging methods to mitigate dissociation-induced artefacts. Trends in Cell Biology. 31 (11), 888-897 (2021).
  29. Tabula Muris, C., et al. Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris. Nature. 562 (7727), 367-372 (2018).
  30. Machado, L., et al. Tissue damage induces a conserved stress response that initiates quiescent muscle stem cell activation. Cell Stem Cell. 28 (6), 1125-1135 (2021).
  31. Haghverdi, L., Lun, A. T. L., Morgan, M. D., Marioni, J. C. Batch effects in single-cell RNA-sequencing data are corrected by matching mutual nearest neighbors. Nature Biotechnology. 36 (5), 421-427 (2018).
  32. Yang, Y., et al. SMNN: Batch effect correction for single-cell RNA-seq data via supervised mutual nearest neighbor detection. Briefings in Bioinformatics. 22 (3), 097 (2021).
  33. Stefanovic, S., Christoffels, V. M. GATA-dependent transcriptional and epigenetic control of cardiac lineage specification and differentiation. Cellular and Molecular Life Sciences. 72 (20), 3871-3881 (2015).
  34. Gunthel, M., Barnett, P., Christoffels, V. M. Development, proliferation, and growth of the mammalian heart. Molecular Therapy. 26 (7), 1599-1609 (2018).
  35. Stefanovic, S., Etchevers, H. C., Zaffran, S. Outflow tract formation-embryonic origins of conotruncal congenital heart disease. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 8 (4), 42 (2021).
  36. Hao, Y., et al. Integrated analysis of multimodal single-cell data. Cell. 184 (13), 3573-3587 (2021).
  37. Bai, H., Lin, M., Meng, Y., Bai, H., Cai, S. An improved CUT&RUN method for regulation network reconstruction of low abundance transcription factor. Cellular Signalling. 96, 110361 (2022).

Play Video

Cite This Article
Ibrahim, S., Robert, C., Humbert, C., Ferreira, C., Collod, G., Stefanovic, S. Nuclei Isolation from Mouse Cardiac Progenitor Cells for Epigenome and Gene Expression Profiling at Single-Cell Resolution. J. Vis. Exp. (195), e65328, doi:10.3791/65328 (2023).

View Video