Her presenterer vi en protokoll som beskriver cellekjernepreparering. Etter mikrodisseksjon og enzymatisk dissosiasjon av hjertevev til enkeltceller ble stamcellene frosset, etterfulgt av isolering av rene levedyktige celler, som ble brukt til enkeltkjerne-RNA-sekvensering og enkeltkjerneanalysen for transposasetilgjengelig kromatin med høykapasitetssekvenseringsanalyser.
Det utviklende hjertet er en kompleks struktur som inneholder forskjellige stamceller styrt av komplekse reguleringsmekanismer. Undersøkelsen av genuttrykket og kromatintilstanden til individuelle celler tillater identifisering av celletype og tilstand. Enkeltcellesekvenseringstilnærminger har avslørt en rekke viktige egenskaper ved hjerteprogenitorcelleheterogenitet. Imidlertid er disse metodene generelt begrenset til ferskt vev, noe som begrenser studier med ulike eksperimentelle forhold, da det ferske vevet må behandles samtidig i samme kjøring for å redusere den tekniske variabiliteten. Derfor er det nødvendig med enkle og fleksible prosedyrer for å produsere data fra metoder som enkeltkjerne RNA-sekvensering (snRNA-seq) og enkeltkjerneanalysen for transposase-tilgjengelig kromatin med høy gjennomstrømningssekvensering (snATAC-seq) i dette området. Her presenterer vi en protokoll for raskt å isolere kjerner for påfølgende enkeltkjerner dual-omics (kombinert snRNA-seq og snATAC-seq). Denne metoden tillater isolering av kjerner fra frosne prøver av hjerteprogenitorceller og kan kombineres med plattformer som bruker mikrofluidiske kamre.
Blant fødselsskader, medfødte hjertefeil (CHDs) er den vanligste, forekommer i ca 1% av levende fødsler hvert år 1,2. Genetiske mutasjoner er identifisert i bare et mindretall av tilfellene, noe som innebærer at andre årsaker, som abnormiteter i genregulering, er involvert i etiologien til CHD 2,3. Hjerteutvikling er en kompleks prosess med forskjellige og samvirkende celletyper, noe som gjør identifisering av kausale ikke-kodende mutasjoner og deres effekter på genregulering utfordrende. Organogenese av hjertet begynner med cellulære progenitorer som gir opphav til forskjellige undertyper av hjerteceller, inkludert myokardiale, fibroblast-, epikardiale og endokardiale celler 4,5. Encellegenomikk fremstår som en nøkkelmetode for å studere hjerteutvikling og vurdere virkningen av cellulær heterogenitet i helse og sykdom6. Utviklingen av multi-omics-metoder for samtidig måling av forskjellige parametere og utvidelse av beregningsrørledninger har gjort det lettere å oppdage celletyper og subtyper i det normale ogsyke hjertet. Denne artikkelen beskriver en pålitelig enkeltkjerneisolasjonsprotokoll for frosne hjerteprogenitorceller oppnådd fra museembryoer som er kompatibel med nedstrøms snRNA-seq og snATAC-seq (samt snRNA-seq og snATAC-seq kombinert)7,8,9.
ATAC-seq er en robust metode som gjør det mulig å identifisere regulatoriske åpne kromatinregioner og posisjonering av nukleosomer10,11. Denne informasjonen brukes til å trekke konklusjoner om plasseringen, identiteten og aktiviteten til transkripsjonsfaktorer. Aktiviteten til kromatinfaktorer, inkludert remodelers, samt transkripsjonsaktiviteten til RNA-polymerase, kan dermed analyseres siden metoden er svært følsom for måling av kvantitative endringer i kromatinstruktur 1,2. Dermed gir ATAC-seq en robust og upartisk tilnærming til å avdekke mekanismene som styrer transkripsjonsregulering i en bestemt celletype. ATAC-seq-protokoller har også blitt validert for å måle kromatintilgjengelighet i enkeltceller, noe som avslører variabilitet i kromatinarkitekturen i cellepopulasjoner10,12,13.
Selv om det har vært bemerkelsesverdige fremskritt innen enkeltceller de siste årene, er hovedproblemet behandlingen av de ferske prøvene som trengs for å utføre disse forsøkene14. For å omgå denne vanskeligheten er det utført ulike tester med sikte på å gjennomføre analyser som snRNA-seq og snATAC-seq med frosset hjertevev eller celler15,16.
Flere plattformer har blitt brukt til å analysere encellede genomikkdata17. De mye brukte plattformene for enkeltcellegenuttrykk og ATAC-profilering er plattformer for multippel mikrofluidisk dråpeinnkapsling17. Siden disse plattformene bruker mikrofluidiske kamre, kan rusk eller aggregater tette systemet, noe som resulterer i ikke-brukbare data. Dermed avhenger suksessen til enkeltcellestudier av nøyaktig isolering av individuelle celler / kjerner.
Protokollen som presenteres her bruker en lignende tilnærming til nyere studier ved bruk av snRNA-seq og snATAC-seq for å forstå medfødte hjertefeil 18,19,20,21,22,23. Denne prosedyren benytter enzymatisk dissosiasjon av ferskt mikrodissekert hjertevev etterfulgt av kryopreservering av musens hjerteprogenitorceller. Etter tining blir de levedyktige cellene renset og behandlet for kjernefysisk isolasjon. I dette arbeidet ble denne protokollen vellykket brukt til å oppnå snRNA-seq og snATAC-seq data fra samme nukleære forberedelse av mus hjerte stamceller.
Analysen av den cellulære sammensetningen av det utviklende hjertet ved kombinerte snRNA-seq- og snATAC-seq-studier gir en dypere forståelse av opprinnelsen til medfødt hjertesykdom26. Flere forskningslaboratorier har studert effekten av hjertevevskryopreservering på snRNA-seq27. Gjennomføring av snRNA-seq og snATAC-seq ved hjelp av ferskt mikrodissekert vev fra musemodeller av menneskelig sykdom kan være logistisk utfordrende når man sammenligner forskjellige eksper…
The authors have nothing to disclose.
Denne forskningen ble støttet av ERA-CVD-2019 og ANR-JCJC-2020 til SS. Vi takker Genomics and Bioinformatics facility (GBiM) fra U 1251/Marseille Medical Genetics lab og de anonyme korrekturleserne for å gi verdifulle kommentarer.
2100 Bioanalyzer Instrument | Agilent | No catalog number | |
5M Sodium chloride (NaCl) | Sigma | 59222C-500ML | |
BSA 10% | Sigma | A1595-50ML | |
Chromium Next GEM Chip J Single Cell Kit, 16 rxns | 10X Genomics | 1000230 | |
Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression Reagent Bundle, 4 rxns (including Nuclei Buffer 20X) | 10X Genomics | 1000285 | |
Countess cell counting chamber slides | Invitrogen | C10283 | |
Countess III FL | Thermofisher | No catalog number | |
Digitonin (5%) | Thermofisher | BN2006 | |
DMSO | Sigma | D2650-5x5ML | |
DNA LoBind Tubes | Eppendorf | 22431021 | |
D-PBS | Thermofisher | 14190094 | Sterile and RNase-free |
Dual Index Kit TT Set A 96 rxns | 10X Genomics | 1000215 | |
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 352096 | |
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 10788561 | |
HI-FBS | Thermofisher | A3840001 | Heat inactivated |
High sensitivity DNA kit | Agilent | 5067-4626 | |
Igepal CA-630 | Sigma | I8896-50ML | |
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit | Thermofisher | L3224 | |
MACS Dead Cell Removal kit: Dead Cell Romoval MicroBeads, Binding Buffer 20X | Miltenyi Biotec | 130-090-101 | |
MACS SmartStrainers (30 µm) | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | |
Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma | M1028-100ML | |
Milieu McCoy 5A | Thermofisher | 16600082 | |
MS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
NovaSeq 6000 S2 | Illumina | No catalog number | |
Penicillin Streptomycin (Pen/Strep) | Thermofisher | 15070063 | |
PluriStrainer Mini 40µm | PluriSelect | V-PM15-2021-12 | |
Rock inhibitor | Enzo Life Sciences | ALX-270-333-M005 | |
Single Index Kit N Set A, 96 rxn | 10X Genomics | 1000212 | |
Standard 90mm Petri dish Sterilin | Thermofisher | 101R20 | |
Sterile double-distilled water | Thermofisher | R0582 | |
Trizma Hydrochloride solution (HCl) | Sigma | T2194-100ML | |
Trypan Blue stain (0.4%) | Invitrogen | T10282 | |
Trypsin 0.05% – EDTA 1X | Thermofisher | 25300054 | |
Tween20 | Sigma | P9416-50ML | |
Wide orifice filtered pipette tips 200 μl | Labcon | 1152-965-008-9 | |
ZEISS SteREO Discovery.V8 | ZEISS | No catalog number |