Summary
Her præsenterer vi en protokol, der beskriver cellekerneforberedelse. Efter mikrodissektion og enzymatisk dissociation af hjertevæv i enkeltceller blev stamcellerne frosset efterfulgt af isolering af rene levedygtige celler, som blev anvendt til enkeltkerne-RNA-sekventering og enkeltkerneassay til transposase-tilgængeligt kromatin med high-throughput sekventeringsanalyser.
Abstract
Det udviklende hjerte er en kompleks struktur, der indeholder forskellige stamceller styret af komplekse reguleringsmekanismer. Undersøgelsen af genekspression og kromatintilstand af individuelle celler muliggør identifikation af celletype og tilstand. Enkeltcellesekventeringsmetoder har afsløret en række vigtige egenskaber ved hjertestamcelleheterogenitet. Disse metoder er dog generelt begrænset til frisk væv, hvilket begrænser undersøgelser med forskellige eksperimentelle betingelser, da det friske væv skal behandles straks i samme serie for at reducere den tekniske variabilitet. Derfor er der behov for nemme og fleksible procedurer til fremstilling af data fra metoder såsom enkeltkerne-RNA-sekventering (snRNA-seq) og enkeltkerneassay for transposase-tilgængeligt kromatin med high-throughput sekventering (snATAC-seq) på dette område. Her præsenterer vi en protokol til hurtigt at isolere kerner til efterfølgende enkeltkerner dual-omics (kombineret snRNA-seq og snATAC-seq). Denne metode tillader isolering af kerner fra frosne prøver af hjertestamceller og kan kombineres med platforme, der bruger mikrofluidiske kamre.
Introduction
Blandt fødselsdefekter er medfødte hjertefejl (CHD'er) de mest almindelige, der forekommer hos ca. 1% af levendefødte hvert år 1,2. Genetiske mutationer identificeres kun i et mindretal af tilfælde, hvilket indebærer, at andre årsager, såsom abnormiteter i genregulering, er involveret i ætiologien af CHD 2,3. Hjerteudvikling er en kompleks proces med forskellige og interagerende celletyper, hvilket gør identifikationen af kausale ikke-kodende mutationer og deres virkninger på genregulering udfordrende. Organogenese af hjertet begynder med cellulære forfædre, der giver anledning til forskellige undertyper af hjerteceller, herunder myokardiale, fibroblast, epikardiale og endokardieceller 4,5. Enkeltcellegenomik dukker op som en nøglemetode til at studere hjerteudvikling og vurdere virkningen af cellulær heterogenitet i sundhed og sygdom6. Udviklingen af multi-omics-metoder til samtidig måling af forskellige parametre og udvidelsen af beregningsrørledninger har lettet opdagelsen af celletyper og undertyper i det normale og syge hjerte6. Denne artikel beskriver en pålidelig isolationsprotokol med en enkelt kerne for frosne hjertestamceller opnået fra museembryoner, der er kompatibel med nedstrøms snRNA-seq og snATAC-seq (samt snRNA-seq og snATAC-seq kombineret)7,8,9.
ATAC-seq er en robust metode, der muliggør identifikation af regulatoriske åbne kromatinregioner og positionering af nukleosomer10,11. Disse oplysninger bruges til at drage konklusioner om placering, identitet og aktivitet af transskriptionsfaktorer. Aktiviteten af kromatinfaktorer, herunder remodelere, såvel som transkriptionsaktiviteten af RNA-polymerase kan således analyseres, da metoden er meget følsom til måling af kvantitative ændringer i kromatinstruktur 1,2. ATAC-seq giver således en robust og upartisk tilgang til at afdække de mekanismer, der styrer transkriptionsregulering i en bestemt celletype. ATAC-seq-protokoller er også blevet valideret til måling af kromatintilgængelighed i enkeltceller, hvilket afslører variabilitet i kromatinarkitekturen inden for cellepopulationer10,12,13.
Selv om der er sket betydelige fremskridt inden for enkeltceller i de senere år, er den største vanskelighed behandlingen af de friske prøver, der er nødvendige for at udføre disse forsøg14. For at omgå denne vanskelighed er der udført forskellige tests med det formål at udføre analyser såsom snRNA-seq og snATAC-seq med frosset hjertevæv eller celler15,16.
Flere platforme er blevet brugt til at analysere enkeltcellegenomiske data17. De udbredte platforme til enkeltcelle genekspression og ATAC-profilering er platforme til multipel mikrofluidisk dråbeindkapsling17. Da disse platforme bruger mikrofluidiske kamre, kan affald eller aggregater tilstoppe systemet, hvilket resulterer i ikke-brugbare data. Succesen af enkeltcelleundersøgelser afhænger således af den nøjagtige isolering af individuelle celler / kerner.
Protokollen, der præsenteres her, bruger en lignende tilgang til nylige undersøgelser ved hjælp af snRNA-seq og snATAC-seq til at forstå medfødte hjertefejl 18,19,20,21,22,23. Denne procedure anvender den enzymatiske dissociation af frisk mikrodissekeret hjertevæv efterfulgt af kryopræservering af musehjertestamceller. Efter optøning renses de levedygtige celler og behandles til nuklear isolering. I dette arbejde blev denne protokol med succes anvendt til at opnå snRNA-seq- og snATAC-seq-data fra det samme nukleare præparat af musehjertestamceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Den dyreprocedure, der blev vedtaget i denne undersøgelse, blev godkendt af de dyreetiske komitéer ved Aix-Marseille Universitet (C2EA-14) og blev udført i henhold til protokoller godkendt af den udpegede nationale etiske komité for dyreforsøg (Ministère de l'Education Nationale, de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche; Tilladelse Apafis nr. 33927-2021111715507212).
1. Opsætning af den tidsbestemte parring inden dissektion
- For at generere museembryoner skal du udføre en tidsbestemt parring mellem voksne mus 9,5 dage før hjerteregionens isolation. I denne procedure blev vildtype C57BL/6J mus i alderen 2-6 måneder brugt, og tidsindstillet parring blev udført natten over.
- Næste morgen skal du kontrollere, om hunmusene har en vaginal plug. Overvej den dag, stikket identificeres som embryonal dag (E) 0,5.
2. Vævsforberedelse og celleisolering
- Aflive 2-6 måneder gammel gravid kvinde C57BL/6J på dag 9,5 efter undfangelsen via CO2 med en stigende koncentration efterfulgt af cervikal dislokation. Rengør den nederste del af maven med 70% ethanol.
BEMÆRK: Brug af anæstetika før cervikal dislokation anbefales ikke, da dette ville udsætte embryonerne for miljømæssige ændringer, der kunne påvirke efterfølgende transkriptomiske og epigenomiske undersøgelser. - Åbn maven og bughinden med en saks. Visualiser livmoderhornene, og brug tang til at skære begge horn.
- Læg hornene i en petriskål, der indeholder koldt komplet medium med 1% FBS. Selvom der ikke kræves noget specifikt volumen, skal det sikres, at embryonerne er helt nedsænket i mediet. Et omtrentligt volumen på 10 ml pr. 10 cm petriskål er passende.
- Under stereomikroskopet indstillet til 5x forstørrelse og ved hjælp af tang fjernes endometrievævet, placenta og æggeblommesæk fra hvert embryo.
- Anbring embryonerne i en petriskål med koldt komplet medium med 1% FBS. Dissekerer det embryonale hjerteområde, som beskrevet på det skematiske embryo illustreret i figur 1, i koldt komplet medium.
- Saml hjerteregionerne dissekeret fra fem museembryoner i et 1,5 ml mikrocentrifugerør. Prechill svingende spand centrifugeres til 4 °C.
- Der centrifugeres ved 300x g i 1 min ved RT i en svingende spandcentrifuge. Supernatanten fjernes, og vævene vaskes ved tilsætning af 1 ml PBS af vævskulturkvalitet.
- Der centrifugeres ved 300 x g i 1 min ved RT. Supernatanten fjernes, og vasketrinnene gentages i i alt to vaske. Gentag vasken to gange, og erstat PBS med 0,05% trypsin/EDTA (1x).
- Til vævsfordøjelse tilsættes 50 μL 0,25% trypsin / EDTA i 10 minutter ved 37 °C. Påfør blid mekanisk dissociation efter 5 minutter med bevægelser op og ned ved hjælp af en filterspids med bred åbning.
- Inaktiver trypsin fordøjelsesaktivitet ved at tilføje 350 μL komplet medium til de dissocierede celler. Før de resuspenderede celler gennem en 40 μm cellesi.
3. Celletælling og levedygtighedsvurdering
BEMÆRK: Celletælling og levedygtighed er kritiske parametre for succes med enkeltcelleeksperimenter. SnATAC-seq-tilgangen er følsom over for mindre variationer i celleantallet. For få celler fører til overfordøjelse af kromatinet, hvilket resulterer i et højere antal aflæsninger og kortlægning af utilgængelige kromatinregioner (støj). På samme måde genererer for mange celler fragmenter med høj molekylvægt, der er svære at sekvensere. For den nøjagtige bestemmelse af celle- og kernekoncentrationerne blev celletællingen og levedygtigheden vurderet ved to forskellige metoder.
- Udfør et trypanblåt assay til celletælling som beskrevet nedenfor.
- Vortex 0,4% trypanblå farvningsopløsning, drej i 10 s ved stuetemperatur ved 2.000 x g og overfør 10 μL til et mikrorør.
- Bland cellesuspensionen med en pipette, og tilsæt 10 μL suspension til den allerede alikvotede 10 μL trypanblå opløsning. Bland forsigtigt 10 gange med en pipette.
- Overfør 10 μL af de farvede celler til et tælleobjektglas. Placer diaset i tælleren for automatisk at beregne cellekoncentrationen og levedygtigheden.
- Udfør en fluorescensbaseret vurdering af dødelighed som beskrevet nedenfor.
BEMÆRK: Dette assay er baseret på brugen af fluorescerende farvestoffer (ethidium homodimer-1, EthD-1 og calcein AM) til evaluering af cellelevedygtigheden. Et kommercielt tilgængeligt kit blev brugt, og udbyderens instruktioner blev fulgt for korrekt forberedelse og brug.- Der fremstilles en 10 μM EthD-1-opløsning ved at tilsætte 5 μL af den medfølgende 2 mM EthD-1-stamopløsning til 1 ml steril vævskulturklasse D-PBS og hvirvel i 5 s for at sikre fuldstændig blanding.
- Overfør 2,5 μL af den medfølgende 4 mM calcein AM stamopløsning til den allerede fremstillede EthD-1 opløsning. Vortex i 5 s for at sikre fuldstændig blanding.
- Der tilsættes 10 μL af den resulterende 10 μM EthD-1 og 10 μM calcein AM arbejdsløsning til 10 μL cellesuspension.
BEMÆRK: Calcein er meget modtagelig for hydrolyse i vandige opløsninger, så brug denne arbejdsløsning inden for 1 dag. - Overfør 10 μL af de farvede celler til et tælleobjektglas. Indsæt diaset i den automatiske fluorescerende celletæller. Tæl de levende celler ved hjælp af et GFP-filter og de døde celler med et RFP-filter.
BEMÆRK: De to tællemetoder gav lignende celletal og levedygtighed, og det samlede antal nyligt dissocierede celler blev anslået til gennemsnitligt ca. 20.000 celler pr. embryonalt hjerteområde (0,06 mm3).
4. Cellefrysning
- Centrifuger cellesuspensionen ved 500 x g i 5 minutter ved 4 °C. Supernatanten fjernes forsigtigt uden at røre bunden af glasset, og pelletsen resuspenderes i 1 ml afkølet frysemedium.
- Cellesuspensionen overføres til en forkølet kryovial, og kryovialen anbringes i en forkølet frysebeholder.
- Placer beholderen ved -80 ◦C i 4 timer til 8 timer. Overfør kryovial til flydende nitrogen til nedstrøms enkeltkerne-RNA- og ATAC-sekventeringseksperimenter.
BEMÆRK: Kryovialen skal transporteres på tøris før brug. Det er vores erfaring, at cellerne kan opbevares i flydende nitrogen i mindst 6 måneder uden tab af cellelevedygtighed. Opbevaringstemperaturen skal holdes under -150 °C hele tiden for at forhindre dannelse af iskrystaller.
5. Celleoptøning og fjernelse af døde celler
- Anbring kryoialerne i et 37 °C vandbad i 1-2 min. Fjern det, når en lille krystal forbliver i kryovial.
- Tilsæt 1 ml forvarmet (37 °C) komplet substrat. Bland med en pipette tre gange. Suspensionen overføres til et 15 ml konisk rør indeholdende 10 ml varmt, komplet medium.
- Hele cellesuspensionen ledes over en 30 μm si. Skyl silen med 1-2 ml varmt komplet medium, og saml gennemstrømningen i det samme koniske rør.
- Der centrifugeres ved 300 x g i 5 min, og supernatanten fjernes. Vask én gang med PBS, og overfør cellesuspensionen til et 1,5 ml mikrorør.
- Der centrifugeres ved 300 x g i 5 min, og supernatanten fjernes uden at forstyrre cellepellet.
- Der tilsættes 100 μL af de medfølgende magnetiske mikroperler til de pelleterede celler, og homogeniser fem gange ved hjælp af en pipettespids med bred boring. Inkuber i 15 minutter ved RT.
- I mellemtiden skylles den magnetiske separationskolonne (kapacitet: 1 x 107 til 2 x 108 celler) med 500 μL 1x bindingsbuffer.
- Når inkubationen er afsluttet, fortyndes cellesuspensionen indeholdende mikroperlerne med 500 μL 1x bindingsbuffer.
- Cellesuspensionen (0,6 μL) påføres den fremstillede magnetiske separationskolonne. Gennemstrømningen er den negativt valgte levende cellefraktion, og den magnetisk tilbageholdte fraktion er de positivt udvalgte døde celler.
- Det levende cellespildevand opsamles i et 15 ml centrifugeglas. Skyl det 1,5 ml mikrorør, der indeholdt cellesuspensionen, og kolonnen med 2 ml 1x bindingsbuffer, og opsaml spildevandet i det samme 15 ml rør.
- Centrifuger ved 300 x g i 5 min. Supernatanten fjernes uden at forstyrre cellepellet.
- Der tilsættes 1 ml PBS-BSA-opløsning, og blandes forsigtigt ved pipettering fem gange med en pipettespids med bred åbning. Overfør cellesuspensionen til et 1,5 ml mikrorør.
- Centrifuger ved 300 x g i 5 min. Supernatanten fjernes uden at forstyrre cellepellet.
- Tilsæt 1 ml PBS-BSA for at resuspendere pelleten, og gentag vasketrinnet i alt to vaske.
- Resuspender cellerne i 100 μL PBS-BSA-opløsning. Bland forsigtigt ved pipettering 10 gange.
- Bestem koncentrationen og levedygtigheden af cellerne ved hjælp af de tidligere beskrevne metoder (trin 3.1 og trin 3.2). For at gå videre til næste trin skal du sikre et celleantal på ≥100.000 celler. Se figur 2 for repræsentative resultater.
BEMÆRK: Kryopræservering resulterer i et tab på ca. 40% af det oprindelige udgangsmateriale i levende celler. Afhængigt af startantallet af celler resulterer perleseparation på en magnetisk søjle i høj cellelevedygtighed, men deler det samlede antal celler med to gange til fem gange. Anvendelse af et søjlebaseret magnetisk kit til fjernelse af de døde celler anbefales kun, når der er tilstrækkeligt udgangsmateriale til rådighed.
6. Isolering af kerner
BEMÆRK: snATAC og snRNA-seq kombineret udføres med en suspension af rene og intakte kerner. Det anbefales at optimere lysisbetingelserne (lysistid og NP40-koncentration) for den anvendte celletype. Det optimale lyseringstidspunkt og vaskemiddelkoncentration er dem, der resulterer i, at det maksimale antal celler lyseres uden at forstyrre den nukleare morfologi. Tabet af celler/kerner kan reduceres ved at bruge en svingende spandcentrifuge i stedet for en fastvinklet centrifuge. For at minimere kerneretention på plast anbefales det at bruge pipettespidser med lav retention og centrifugerør. Dette kan øge kernegendannelsen. Belægningen af pipettespidserne og centrifugeglassene med 5 % BSA er et billigere, men mere tidskrævende alternativ.
- Rengør arbejdspladsen og materialerne med 70 % ethanol og RNase-fjernelsesopløsning.
- Prechill svingende spand centrifugeres til 4 °C. Frisklavet lysisbuffer, lysisfortyndingsbuffer, 0,1x lysisbuffer og vaskebuffer (se tabel 1). Bevar bufferne på isen.
- Centrifuger cellesuspensionen ved 500 x g i 5min ved 4 °C i en svingende spandcentrifuge. Fjern forsigtigt hele supernatanten uden at røre bunden af røret for at undgå, at cellepillen løsner sig.
- Tilsæt 100 μL kølet 0,1x lysisbuffer. Bland forsigtigt ved pipettering 10 gange. Inkuber i 5 min på is.
- Tilsæt 1 ml kølet vaskebuffer, og bland forsigtigt ved pipettering fem gange. Der centrifugeres ved 500 x g i 5 minutter ved 4 °C. Supernatanten fjernes uden at forstyrre kernepillen.
- Gentag vaskene med kølet vaskebuffer i i alt tre vaske. Forbered den fortyndede kernebuffer. Efter resuspension opbevares kernestamopløsningen på is.
7. Kvalitets- og kvantitetsvurderinger af de isolerede kerner
BEMÆRK: Baseret på det indledende celletal og estimering af ca. 50% kernetab under cellelyse, resuspenderes det passende antal celler i kold fortyndet kernebuffer. Beregningen af resuspensionsvolumen med buffer til afkølede fortyndede kerner er baseret på den målrettede genvinding af kerner og de tilsvarende kernekoncentrationer, der anbefales i producentens brugervejledning. Se et eksempel på denne beregning i tillægsprotokol 1.
- Baseret på det indledende celletal og estimering af ca. 50 % kernetab under cellelyse resuspenderes det passende antal celler i bufferen for koldt fortyndede kerner.
- Bestem den faktiske kernekoncentration. 2 μL stamopløsning med 8 μL fortyndet kernebuffer blandes, og blandingen tilsættes til den foraliquoterede 10 μL trypanblåt eller EthD-1/calceinAM-arbejdsopløsning. Tæl kernerne ved hjælp af en automatiseret celletæller. Mindre end 5% af cellerne skal være levedygtige. Se figur 3 for repræsentative resultater.
- Volumen af kernelager og volumen af fortyndede kerner buffer beregnes for at opnå et samlet volumen på 5 μL ved den anbefalede koncentration for transponeringsreaktionen (se producentens brugervejledning). Fortsæt straks til gennemførelsesreaktionen i henhold til brugervejledningen17.
BEMÆRK: Alle trin fra transponeringsreaktionen til konstruktionen af ATAC- og GEX-bibliotekerne blev udført i henhold til brugervejledningen til det kit, der blev brugt til snRNA-seq og snATAC-seq kombineret17.
8. Kvalitetsanalyse af bibliotekerne snRNA-seq og snATAC-seq
- Før du går videre til næste generations sekventering, skal du validere kvaliteten og størrelsesfordelingen af de endelige snATAC-seq og genekspression GEX-biblioteker. Vurder kvaliteten og kvantiteten af sekvenser, der er identificeret i bibliotekerne ved hjælp af fragmentanalysesystemer. Se figur 4 for repræsentative resultater af kvalitetsvurderingen.
BEMÆRK: Det endelige spor af snATAC-seq-bibliotekerne skal vise periodiciteten af nukleosomvikling, og størrelserne skal variere fra 200 bp til flere Kbp, mens størrelserne i genekspressionsbiblioteket skal variere fra 300 bp til 600 bp.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sammenlignet med fremstillingen af enkeltcellesuspensioner til enkeltcelletilgange er fremstillingen af enkeltkernesuspensioner meget mere udfordrende og kræver en højere grad af opløsning og behandling. Nøglefaktoren for vellykket kombineret snRNA-seq og snATAC-seq er en ren og intakt kernesuspension. Protokollen for effektiv kerneisolering skal tilpasses hver vævstype og -tilstand (frisk eller frossen). Her beskrives en optimeret protokol til isolering af kerner fra frosne embryonale hjerteceller hos mus. Alle trin fra embryonal hjerteregion dissektion og hjertecelledissociation til kerneisolering er opsummeret i figur 1. Til udgangsmaterialet anbefales et celletal på 1 x 105-1 x 106 celler og en cellelevedygtighed >70% for effektiv kerneisolering. Som vist i figur 2 gjorde det yderligere trin, der udføres i denne protokol for at sortere og fjerne de døde celler efter optøning, det muligt at opnå en renere cellesuspension med en signifikant højere cellelevedygtighed og forbedre kvaliteten af startprøven. Ud over kerneisolering giver denne protokol detaljerede oplysninger om, hvordan kvaliteten og mængden af de isolerede kerner vurderes (figur 3). Kvaliteten af de isolerede kerner påvirker i høj grad kvaliteten af de kombinerede data snRNA-seq og snATAC-seq; Her blev kvaliteten af de isolerede kerner vurderet ved evalueringen af kernemembranmorfologien. De isolerede kerner fremstod glatte og ensartet runde, som vist i figur 3C, under brightfieldmikroskopi, hvilket indikerer en effektiv isolationsproces. For mere nøjagtighed blev der anvendt to forskellige tællemetoder, herunder trypanblå og et kit til fluorescensbaseret vurdering af levedygtighed, til at kvantificere cellerne og kernerne. Fluorescensanalysen blev anvendt til at bestemme cellelevedygtigheden baseret på cellulær integritet og intracellulær esteraseaktivitet. Denne farvestofopløsning gør det muligt at skelne levende celler fra døde celler ved samtidig at visualisere grøn fluorescerende calcein AM, hvilket indikerer den intracellulære esteraseaktivitet, og rød fluorescerende ethidiumhomodimer 1, som afspejler tabet af cellulær integritet. Brug af et fluorescerende farvestof til tælling hjælper med at skelne kerner fra celleklumper og snavs. Ved hjælp af denne protokol gik cellelevedygtigheden fra 80% -90% før kerneisolering til <5% efter kerneisolering, som vist i figur 3A,B.
Vores procedure blev sammenlignet med den eksisterende metode, som indebærer frysning af frisk væv direkte i flydende nitrogen og udførelse af lyseringstrinnet uden forudgående enzymatisk dissociation (supplerende protokol 2 og supplerende figur 1). Begge tilgange blev testet for at bestemme, hvilken metode der giver en kernesuspension af bedre kvalitet. Snapfrysning af hele embryonalt hjertevæv gav anledning til en høj procentdel af ikke-lyserede celler, der blev påvist som levende, hvilket indikerer uhensigtsmæssig cellelyse (supplerende figur 1A). Aggregater og ikke-individuelle celler blev observeret på trods af filtrering gennem filtre (supplerende figur 1A,B).
De isolerede kerner blev brugt til at generere biblioteker til fælles snATAC-seq og snRNA-seq. Figur 4 illustrerer kvalitetskontrolresultaterne af cDNA'et, der anvendes til konstruktion af genekspressionsbiblioteket (GEX) og ATAC-biblioteket. Kvalitetskontrol blev udført ved hjælp af automatiseret elektroforese (figur 5A). De mRNA-afledte cDNA'er blev kvantificeret, og udbyttet var tilstrækkeligt til efterfølgende anvendelse i GEX bibliotekskonstruktion. Der blev opnået et GEX-bibliotek af høj kvalitet fra ~ 300 bp til 600 bp og et ATAC-bibliotek af høj kvalitet med periodisk nukleosomvikling fra 200 bp til 7 kbp. Disse biblioteker blev sekventeret ved high-throughput sekventering og med succes genereret single-nucleus genekspression og kromatin tilgængelighed (figur 5A). Disse rådata var klar til at blive demultiplexet og bioinformatisk analyseret for at generere transkriptionel og epigenetisk profilering af mus E9.5 hjertestamceller. SnRNA-seq og snATAC-seq blev grupperet, identificeret og mærket baseret på kendte markørgener ved hjælp af uovervåget klyngedannelse med Seurat toolkit til single genomics24 . Denne indledende analyse bekræftede tilstedeværelsen af alle de forventede hjertecelletyper ved E9.5 (figur 5B).
Alle ovenstående resultater understøtter denne protokols succes med at isolere kerner, der er egnede til nedstrøms enkeltkerner fra frosne embryonale hjerteceller.
Figur 1: Repræsentation af de vigtigste trin i prøveforberedelsen til kombineret snRNA-seq- og snATAC-seq-profilering. Dette rutediagram rekapitulerer alle trin, herunder dissektion af hjertevæv og dissociation af hjerteceller, cellefrysning og optøning, rensning af levende celler ved fjernelse af døde celler og kerneisolering, der udføres til samtidig påvisning af mRNA- og kromatintilgængelighed fra den samme celle. Forkortelser: PBS = fosfatbufret saltvand; BSA = bovin serumalbumin RT = stuetemperatur. Oprettet med BioRender.com Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Levedygtigheden af de optimerede optøede celler efter død cellesortering. Billeder, der viser celletal og levedygtighed ved hjælp af en automatiseret celletæller før (øverst) og efter (nederst) fjernelse af døde celler ved hjælp af trypanblå udelukkelsesfarvestof. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Kvalitetskontrol af kernepræparatet. (A,B) Billeder, der viser celletal og levedygtighed ved hjælp af en automatiseret celletæller før (øverst) og efter (nederst) kerneisolering. Der blev anvendt to tællemetoder: (A) fluorescerende mortalitetsassay og (B)trypanblåt assay. C) Billeder, der viser kvaliteten af kerneisoleringen. Billeder blev taget ved 20x (skalabjælke = 50 μm) ved hjælp af brightfield og fluorescensmikroskopi. Brightfield-billedet (til venstre) viser nuklear morfologi; RFP (midten) viser celler, der mistede deres membranintegritet, med andre ord isolerede kerner; og GFP (højre), der normalt angiver esteraseaktiviteten af levende celler her, bekræfter fraværet af levende celler i kernesuspensionen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Kvalitetskontrol af enkeltcellede genekspressioner og ATAC-biblioteker. DNA-analyse med automatiseret elektroforese, der viser kvaliteten og størrelsesfordelingen af cDNA (øverst), GEX-bibliotek (midten) og ATAC-bibliotek (nederst). Til cDNA-kvantificeringen blev zonen fra 200 bp til 8.900 bp valgt, og bioanalysatoren estimerede cDNA-koncentrationen (i pg / μL; rød cirkel). Et tilstrækkeligt cDNA-udbytte blev opnået til at fortsætte med GEX bibliotekskonstruktion. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Prøveydelse vurderet med Cell Ranger-softwaren25. A) Krydsfølsomhedsplot, der viser transponeringshændelserne i toppe pr. stregkode på x-aksen og RNA's unikke molekylære identifikatorer (UMI'er) pr. stregkode på y-aksen. Som forventet er cellerne hovedsageligt placeret i øverste højre hjørne med høje RNA- og ATAC-data. En klar adskillelse mellem cellerne og ikke-celler (tomme GEM'er, baggrundssignal) blev observeret. (B) Repræsentativt ensartet manifoldtilnærmelse og projektionsplot (UMAP) af alle de fangede celler i scRNA-seq (venstre) og scATAC-seq (højre) farvet efter klyngeidentitet og grupperet baseret på celletyper. En god adskillelse af klynger blev observeret. Fælles GEX og ATAC rådata blev opnået ved sekventering af 7.000 kerner fra den dissekerede E9.5 mus embryonale hjerteregion. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende figur 1: Kvalitetskontrol af kerneisolering fra den eksisterende metode, der involverer frysning af frisk væv direkte i flydende nitrogen. (A) Billeder, der viser det isolerede kimtal ved hjælp af en automatiseret celletæller og trypanblåt som udelukkelsesfarvestof før (øverst) og efter (nederst) filtrering gennem en 40 μm si. En høj procentdel af ikke-lyserede celler blev påvist som levende. Påvisning af 20% levende celler indikerer uhensigtsmæssig cellelyse. De sorte pile angiver aggregater. B) Billeder, der viser kvaliteten af de isolerede kerner. Billederne blev taget ved 20x (top og midt med en skalabjælke på 50 μm) og 40x (nederst med en skalabjælke på 25 μm) ved hjælp af brightfield og fluorescensmikroskopi. Brightfield-billedet (til venstre) viser den nukleare morfologi; RFP (højre) viser celler, der mistede deres membranintegritet, med andre ord isolerede kerner. De sorte pile angiver flere kerner fastgjort af snavs. Klik her for at downloade denne fil.
Tabel 1: Tabel over buffere og opløsninger, der anvendes i proceduren. Klik her for at downloade denne tabel.
Tillægsprotokol nr. 1: Vurdering af mængden af isolerede kerner. Klik her for at downloade denne fil.
Tillægsprotokol nr. 2: Isolering af kerner fra flashfrosset væv. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Analysen af den cellulære sammensætning af det udviklende hjerte ved kombinerede snRNA-seq- og snATAC-seq-undersøgelser giver en dybere forståelse af oprindelsen af medfødt hjertesygdom26. Flere forskningslaboratorier har undersøgt effekten af kryopræservering af hjertevæv på snRNA-seq27. Udførelse af snRNA-seq og snATAC-seq ved hjælp af frisk mikrodissekeret væv fra musemodeller af menneskelig sygdom kan være logistisk udfordrende, når man sammenligner forskellige eksperimentelle forhold. For et givet udviklingstrin er en vanskelighed, at kontrol- og forsøgsgrupperne skal behandles i samme serie for at reducere den tekniske variabilitet, der indføres ved prøvebehandling. Når behandling af frisk væv ikke er mulig, anbefales det, baseret på vores resultater, at dissociere og derefter kryopræservere i stedet for at snapfryse hele det embryonale hjertevæv. Valget af den ene metode frem for den anden er baseret på det faktum, at hvis hjertevævet er frosset helt, er isolering af levedygtige enkeltceller efter optøning meget mere udfordrende. Men hvis vævsdissociationsprotokollen ikke er optimeret, kan det være bedre at snapfryse vævet helt. Dissociation efterfulgt af kryopræservering foretrækkes, da denne vævsdissociationsprotokol giver >90% friske levedygtige celler uden celletypebias.
Denne tilgang har flere fordele, såsom brugen af frosne celler, hvilket eliminerer kravet om frisk væv og brugen af et enkeltcelledissociationstrin, som muliggør isolering af intakte enkeltkerner; Faktisk er dette kritisk for nedstrøms enkeltcelleanalyse. Imidlertid kan den enzymatiske dissociation inducere transkriptionel bias i cellepopulationer. Enzymatisk celledissociation interfererer med det cellulære mikromiljø og inducerer således transkriptionelle ændringer i de fleste celletyper28. Den primære determinant for disse ændringer er dissociationstiden, ikke celletypen29. For at moderere dissociationsinducerede artefakter er det vigtigt at følge den anbefalede fordøjelsestid. Den offentliggjorte litteratur i forskellige væv indikerer, at en fordøjelsestid på 30 min eller mindre inducerer mindre transkriptionelle ændringer28,30. Derudover kunne bioinformatikinterventioner bruges til at minimere dataforvrængninger31,32.
Opnåelse af rene og intakte enkeltkerner er den vigtigste faktor i genomik med en kerne. Tilstopning af de mikrofluidiske kamre på enkeltcelleplatforme på grund af tilstedeværelsen af celleklynger eller organisk affald fører til dårlig datakvalitet eller mere problematisk til eksperimentel fiasko. I denne procedure blev eksisterende protokoller modificeret ved at kombinere enzymatisk dissociation, kryopræservering og oprensning af levedygtige hjertestamceller. Vores procedure tillader isolering af rene kerner uden behov for FACS-sortering. Ved hjælp af denne procedure opnåede vi en nuklear suspension af høj kvalitet uden klumpning, næsten ingen snavs og intakte enkeltkerner. Celleisoleringstrinnet er afgørende for at undgå potentiel kerneklumpning; Faktisk kan dette undgås ved skånsom pipettering ved hjælp af store pipettespidser eller ved at filtrere kernerne. Brug af filtre i forskellige trin og efterfølgende observation under et lysmikroskop kan forhindre sådanne problemer.
Protokollen beskrevet her blev med succes anvendt til snRNA-seq og snATAC-seq-profilering fra det samme kernepræparat opnået fra E9.5 hjertestamceller. Denne metode kan anvendes til drægtige vildtypemus versus musemodeller for medfødte hjertefejl. Medfødte hjertefejl opstår sandsynligvis på grund af forstyrrelse af veje, der styrer differentiering, multiplikation, migration og overlevelse af hjertestamceller33,34. For bedre at forstå oprindelsen af disse defekter fokuserede denne undersøgelse specifikt på embryonale trin 9.5, hvor forfædrene til de store områder, der er berørt af medfødte hjertefejl, er til stede, især hjerteforfædrene i det andet hjertefelt11 og det neurale kam35. Anvendelsen af denne procedure på celler i det voksne musehjerte og det menneskelige hjerte kræver optimering af protokollen, især med hensyn til celledissociation og lysetrin.
De vigtigste overvejelser mellem manuel og automatiseret celletælling er omkostningerne, arbejdskraften og nøjagtigheden. Automatiserede tællere er hurtigere end de fleste dygtige forskere, der udfører en manuel optælling. Især når man beskæftiger sig med et stort antal prøver, er det en stor fordel blot at kunne trykke på tæl og se resultatet. Dette er et vigtigt punkt, fordi når kernerne er isoleret, skal de behandles hurtigt for at undgå tab af deres integritet. Den primære nøjagtighedsfordel ved automatiserede systemer er, at disse systemer eliminerer variabilitet mellem brugere eller laboratorier. En anden fordel er, at automatiserede systemer typisk har et større synsfelt end hæmocytometre. Når antallet af celler/kerner eller koncentrationen af celler/kerner er lavere, er dette større synsfelt bestemt en fordel i forhold til den traditionelle manuelle metode.
En høj procentdel af mitokondriel DNA-forurening kan observeres, når koncentrationen af det ikke-ioniske vaskemiddel er for høj. Ved at reducere koncentrationen i lysisbufferen kan denne forurening reduceres uden at reducere udbyttet af kernerne. De mest tilfredsstillende resultater blev opnået i vores forsøg med en lysisbuffer indeholdende 0,1% vaskemiddel. Spinding af kernerne i en svingspand kan også reducere antallet af mitokondrier i pelleten.
At have et passende forhold mellem Tn5-transposase og kerner er afgørende for vellykket snATAC-seq13,14. For eksempel kan for meget Tn5 føre til en høj baggrund på grund af lukket kromatin og lav kompleksitet af sekventeringsbibliotekerne, mens sublyse muligvis ikke resulterer i et komplet PCR-forstærket bibliotek13. For at bestemme antallet af kerner nøjagtigt brugte vi to komplementære metoder.
Multimodale omics-datasæt giver mulighed for at undersøge flere niveauer af genomisk organisation samtidigt 9,36. Den fælles RNA og ATAC multimodale tilgang muliggør undersøgelse af opstrøms regulatorer og nedstrøms metaboliske gener og giver en omfattende tilgang til undersøgelse af transkriptionelle netværk og kromatinarkitektur i forbindelse med hjerteudvikling ved enkeltcelleopløsningen. Denne protokol til isolering af enkeltkerner er kompatibel med både individuel og fælles evaluering af ekspressions- og kromatindatasæt. Kromatintilgængelighed er et vigtigt epigenetisk reguleringsniveau, fordi det muliggør transkriptionelle regulatorers aktivitet på specifikke genomiske steder 8,9,10,11,12,13. En lang række oplysninger om identiteten og målstederne for snesevis af mulige transkriptionsfaktorer tilvejebringes således af DNA-sekvensen i kromatinprofilen. Sammenligningen af informationen opnået ved snATAC-seq med snRNA-ekspressionsprofilering kan hjælpe med at identificere de mest relevante transkriptionsfaktorer, som derefter kan analyseres yderligere af Cut&Run37. Vi håber, at denne procedure vil hjælpe interesserede forskere og tilskynde dem til at bruge denne kraftfulde metode til deres forskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Denne forskning blev støttet af ERA-CVD-2019 og ANR-JCJC-2020 til SS. Vi takker Genomics and Bioinformatics facility (GBiM) fra U 1251/Marseille Medical Genetics lab og de anonyme korrekturlæsere for at give værdifulde kommentarer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2100 Bioanalyzer Instrument | Agilent | No catalog number | |
| 5M Sodium chloride (NaCl) | Sigma | 59222C-500ML | |
| BSA 10% | Sigma | A1595-50ML | |
| Chromium Next GEM Chip J Single Cell Kit, 16 rxns | 10X Genomics | 1000230 | |
| Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression Reagent Bundle, 4 rxns (including Nuclei Buffer 20X) | 10X Genomics | 1000285 | |
| Countess cell counting chamber slides | Invitrogen | C10283 | |
| Countess III FL | Thermofisher | No catalog number | |
| Digitonin (5%) | Thermofisher | BN2006 | |
| DMSO | Sigma | D2650-5x5ML | |
| DNA LoBind Tubes | Eppendorf | 22431021 | |
| D-PBS | Thermofisher | 14190094 | Sterile and RNase-free |
| Dual Index Kit TT Set A 96 rxns | 10X Genomics | 1000215 | |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 352096 | |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 10788561 | |
| HI-FBS | Thermofisher | A3840001 | Heat inactivated |
| High sensitivity DNA kit | Agilent | 5067-4626 | |
| Igepal CA-630 | Sigma | I8896-50ML | |
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit | Thermofisher | L3224 | |
| MACS Dead Cell Removal kit: Dead Cell Romoval MicroBeads, Binding Buffer 20X | Miltenyi Biotec | 130-090-101 | |
| MACS SmartStrainers (30 µm) | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma | M1028-100ML | |
| Milieu McCoy 5A | Thermofisher | 16600082 | |
| MS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| NovaSeq 6000 S2 | Illumina | No catalog number | |
| Penicillin Streptomycin (Pen/Strep) | Thermofisher | 15070063 | |
| PluriStrainer Mini 40µm | PluriSelect | V-PM15-2021-12 | |
| Rock inhibitor | Enzo Life Sciences | ALX-270-333-M005 | |
| Single Index Kit N Set A, 96 rxn | 10X Genomics | 1000212 | |
| Standard 90mm Petri dish Sterilin | Thermofisher | 101R20 | |
| Sterile double-distilled water | Thermofisher | R0582 | |
| Trizma Hydrochloride solution (HCl) | Sigma | T2194-100ML | |
| Trypan Blue stain (0.4%) | Invitrogen | T10282 | |
| Trypsin 0.05% - EDTA 1X | Thermofisher | 25300054 | |
| Tween20 | Sigma | P9416-50ML | |
| Wide orifice filtered pipette tips 200 μl | Labcon | 1152-965-008-9 | |
| ZEISS SteREO Discovery.V8 | ZEISS | No catalog number |
References
- vander Bom, T., et al. The changing epidemiology of congenital heart disease. Nature Reviews. Cardiology. 8 (1), 50-60 (2011).
- Bouma, B. J., Mulder, B. J. Changing landscape of congenital heart disease. Circulation Research. 120 (6), 908-922 (2017).
- Postma, A. V., Bezzina, C. R., Christoffels, V. M. Genetics of congenital heart disease: The contribution of the noncoding regulatory genome. Journal of Human Genetics. 61 (1), 13-19 (2016).
- Buijtendijk, M. F. J., Barnett, P., vanden Hoff, M. J. B.
- Sylva, M., vanden Hoff, M. J., Moorman, A. F.
- Gromova, T., Gehred, N. D., Vondriska, T. M. Single-cell transcriptomes in the heart: When every epigenome counts. Cardiovascular Research. 119 (1), 64-78 (2022).
- Tanay, A., Regev, A. Scaling single-cell genomics from phenomenology to mechanism. Nature. 541 (7637), 331-338 (2017).
- Schwartzman, O., Tanay, A. Single-cell epigenomics: Techniques and emerging applications. Nature Reviews. Genetics. 16 (12), 716-726 (2015).
- Macaulay, I. C., Ponting, C. P., Voet, T. Single-cell multiomics: Multiple measurements from single cells. Trends in Genetics. 33 (2), 155-168 (2017).
- Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. ATAC-seq: A method for assaying chromatin accessibility genome-wide. Current Protocols in Molecular Biology. 109, 1-9 (2015).
- Stefanovic, S., et al. Hox-dependent coordination of mouse cardiac progenitor cell patterning and differentiation. Elife. 9, e55124 (2020).
- Xu, W., et al. A plate-based single-cell ATAC-seq workflow for fast and robust profiling of chromatin accessibility. Nature Protocols. 16 (8), 4084-4107 (2021).
- Buenrostro, J. D., et al. Single-cell chromatin accessibility reveals principles of regulatory variation. Nature. 523 (7561), 486-490 (2015).
- Denisenko, E., et al. Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus RNA-seq workflows. Genome Biology. 21 (1), 130 (2020).
- Safabakhsh, S., et al. Isolating nuclei from frozen human heart tissue for single-nucleus RNA sequencing. Current Protocols. 2 (7), e480 (2022).
- Pimpalwar, N., et al. Methods for isolation and transcriptional profiling of individual cells from the human heart. Heliyon. 6 (12), 05810 (2020).
- 10x Genomics. Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression Reagent Kits User Guide. 10x Genomics. , CG000338_ChromiumNextGEM_Multiome_ATAC_GEX_User_Guide_RevF.pdf (2022).
- Jia, G., et al. Single cell RNA-seq and ATAC-seq analysis of cardiac progenitor cell transition states and lineage settlement. Nature Communications. 9 (1), 4877 (2018).
- Wang, L., et al. Single-cell dual-omics reveals the transcriptomic and epigenomic diversity of cardiac non-myocytes. Cardiovascular Research. 118 (6), 1548-1563 (2022).
- Wang, Z., et al. Cell-type-specific gene regulatory networks underlying murine neonatal heart regeneration at single-cell resolution. Cell Reports. 35 (8), 109211 (2021).
- Ameen, M., et al. Integrative single-cell analysis of cardiogenesis identifies developmental trajectories and non-coding mutations in congenital heart disease. Cell. 185 (26), 4937-4953 (2022).
- Gao, R., et al. Pioneering function of Isl1 in the epigenetic control of cardiomyocyte cell fate. Cell Research. 29 (6), 486-501 (2019).
- Manivannan, S., et al. Single-cell transcriptomic profiling unveils dysregulation of cardiac progenitor cells and cardiomyocytes in a mouse model of maternal hyperglycemia. Communications Biology. 5 (1), 820 (2022).
- Cao, Y., et al. Integrated analysis of multimodal single-cell data with structural similarity. Nucleic Acids Research. 50 (21), e121 (2022).
- What is CellRanger. 10x Genomics. , Available from: https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/what-is-cell-ranger (2023).
- Hill, M. C. Integrated multi-omic characterization of congenital heart disease. Nature. 608 (7921), 181-191 (2022).
- Chen, Z., Wei, L., Duru, F., Chen, L. Single-cell RNA sequencing: In-depth decoding of heart biology and cardiovascular diseases. Current Genomics. 21 (8), 585-601 (2020).
- Machado, L., Relaix, F., Mourikis, P. Stress relief: Emerging methods to mitigate dissociation-induced artefacts. Trends in Cell Biology. 31 (11), 888-897 (2021).
- Tabula Muris, C., et al. Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris. Nature. 562 (7727), 367-372 (2018).
- Machado, L., et al. Tissue damage induces a conserved stress response that initiates quiescent muscle stem cell activation. Cell Stem Cell. 28 (6), 1125-1135 (2021).
- Haghverdi, L., Lun, A. T. L., Morgan, M. D., Marioni, J. C. Batch effects in single-cell RNA-sequencing data are corrected by matching mutual nearest neighbors. Nature Biotechnology. 36 (5), 421-427 (2018).
- Yang, Y., et al. SMNN: Batch effect correction for single-cell RNA-seq data via supervised mutual nearest neighbor detection. Briefings in Bioinformatics. 22 (3), 097 (2021).
- Stefanovic, S., Christoffels, V. M. GATA-dependent transcriptional and epigenetic control of cardiac lineage specification and differentiation. Cellular and Molecular Life Sciences. 72 (20), 3871-3881 (2015).
- Gunthel, M., Barnett, P., Christoffels, V. M. Development, proliferation, and growth of the mammalian heart. Molecular Therapy. 26 (7), 1599-1609 (2018).
- Stefanovic, S., Etchevers, H. C., Zaffran, S. Outflow tract formation-embryonic origins of conotruncal congenital heart disease. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 8 (4), 42 (2021).
- Hao, Y., et al. Integrated analysis of multimodal single-cell data. Cell. 184 (13), 3573-3587 (2021).
- Bai, H., Lin, M., Meng, Y., Bai, H., Cai, S. An improved CUT&RUN method for regulation network reconstruction of low abundance transcription factor. Cellular Signalling. 96, 110361 (2022).
