Summary
Här presenterar vi ett protokoll som beskriver cellkärnberedning. Efter mikrodissektion och enzymatisk dissociation av hjärtvävnad i enstaka celler frystes stamcellerna, följt av isolering av rena livskraftiga celler, som användes för RNA-sekvensering med en kärna och enkärnsanalysen för transposastillgängligt kromatin med sekvenseringsanalyser med hög genomströmning.
Abstract
Det utvecklande hjärtat är en komplex struktur som innehåller olika stamceller som styrs av komplexa regleringsmekanismer. Undersökningen av genuttrycket och kromatintillståndet hos enskilda celler möjliggör identifiering av celltyp och tillstånd. Encellssekvenseringsmetoder har avslöjat ett antal viktiga egenskaper hos hjärtprogenitorcellheterogenitet. Dessa metoder är dock i allmänhet begränsade till färsk vävnad, vilket begränsar studier med olika experimentella betingelser, eftersom den färska vävnaden måste bearbetas omedelbart i samma omgång för att minska den tekniska variationen. Därför behövs enkla och flexibla procedurer för att producera data från metoder som single-nucleus RNA sequencing (snRNA-seq) och single-nucleus assay för transposas-tillgängligt kromatin med high-throughput sekvensering (snATAC-seq) inom detta område. Här presenterar vi ett protokoll för att snabbt isolera kärnor för efterföljande single-nuclei dual-omics (kombinerad snRNA-seq och snATAC-seq). Denna metod möjliggör isolering av kärnor från frysta prover av hjärtstamceller och kan kombineras med plattformar som använder mikrofluidiska kamrar.
Introduction
Bland fosterskador är medfödda hjärtfel (CHD) de vanligaste, som förekommer hos cirka 1% av levande födda varje år 1,2. Genetiska mutationer identifieras endast i en minoritet av fallen, vilket innebär att andra orsaker, såsom avvikelser i genreglering, är involverade i etiologin för CHD 2,3. Hjärtutveckling är en komplex process av olika och interagerande celltyper, vilket gör identifieringen av kausala icke-kodande mutationer och deras effekter på genreglering utmanande. Organogenes av hjärtat börjar med cellulära progenitorer som ger upphov till olika subtyper av hjärtceller, inklusive myokardiala, fibroblast-, epikardiala och endokardiala celler 4,5. Encellsgenomik framträder som en nyckelmetod för att studera hjärtutveckling och bedöma effekterna av cellulär heterogenitet i hälsa och sjukdom6. Utvecklingen av multi-omics-metoder för samtidig mätning av olika parametrar och expansionen av beräkningsrörledningar har underlättat upptäckten av celltyper och subtyper i det normala och sjuka hjärtat6. Denna artikel beskriver ett tillförlitligt isoleringsprotokoll med en kärna för frysta hjärtstamceller erhållna från musembryon som är kompatibla med nedströms snRNA-seq och snATAC-seq (samt snRNA-seq och snATAC-seq kombinerat)7,8,9.
ATAC-seq är en robust metod som möjliggör identifiering av regulatoriska öppna kromatinregioner och positionering av nukleosomer10,11. Denna information används för att dra slutsatser om plats, identitet och aktivitet för transkriptionsfaktorer. Aktiviteten hos kromatinfaktorer, inklusive remodelers, liksom transkriptionsaktiviteten hos RNA-polymeras, kan således analyseras eftersom metoden är mycket känslig för mätning av kvantitativa förändringar i kromatinstruktur 1,2. Således ger ATAC-seq ett robust och opartiskt tillvägagångssätt för att avslöja mekanismerna som styr transkriptionsreglering i en specifik celltyp. ATAC-seq-protokoll har också validerats för att mäta kromatintillgänglighet i enskilda celler, vilket avslöjar variabilitet i kromatinarkitekturen inom cellpopulationer10,12,13.
Även om det har skett anmärkningsvärda framsteg inom området för enskilda celler under de senaste åren, är den största svårigheten bearbetningen av de färska prover som behövs för att utföra dessa experiment14. För att kringgå denna svårighet har olika tester utförts i syfte att genomföra analyser såsom snRNA-seq och snATAC-seq med frusen hjärtvävnad eller celler15,16.
Flera plattformar har använts för att analysera encellsgenomikdata17. De allmänt använda plattformarna för encellsgenuttryck och ATAC-profilering är plattformar för multipel mikrofluidisk droppinkapsling17. Eftersom dessa plattformar använder mikrofluidiska kammare kan skräp eller aggregat täppa till systemet, vilket resulterar i oanvändbara data. Således beror framgången för encellsstudier på noggrann isolering av enskilda celler / kärnor.
Protokollet som presenteras här använder ett liknande tillvägagångssätt som nyligen genomförda studier med snRNA-seq och snATAC-seq för att förstå medfödda hjärtfel 18,19,20,21,22,23. Denna procedur utnyttjar enzymatisk dissociation av nyligen mikrodissekerad hjärtvävnad följt av kryokonservering av mushjärtprogenitorceller. Efter upptining renas de livskraftiga cellerna och bearbetas för kärnisolering. I detta arbete användes detta protokoll framgångsrikt för att erhålla snRNA-seq- och snATAC-seq-data från samma kärnberedning av mushjärtprogenitorceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Det djurförsök som antogs i denna studie godkändes av de djuretiska kommittéerna vid universitetet i Aix-Marseille (C2EA-14) och utfördes i enlighet med protokoll som godkänts av den utsedda nationella etiska kommittén för djurförsök (Ministère de l'Education Nationale, de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche; Auktorisering Apafis nr 33927-2021111715507212).
1. Ställa in den tidsinställda parningen före dissektion
- För att generera musembryon, utför en tidsbestämd parning mellan vuxna möss 9,5 dagar före isolering av hjärtregionen. I denna procedur användes vildtyp C57BL / 6J-möss i åldern 2-6 månader och tidsbestämd parning utfördes över natten.
- Nästa morgon, kontrollera om honmössen har en vaginal plugg. Tänk på dagen då proppen identifieras som embryonal dag (E) 0,5.
2. Vävnadsberedning och cellisolering
- Avliva 2-6 månader gammal gravid kvinnlig C57BL / 6J vid dag 9.5 efter befruktning via CO2 med en ökande koncentration följt av cervikal dislokation. Rengör underdelen av buken med 70% etanol.
OBS: Användning av anestetika före cervikal dislokation rekommenderas inte eftersom detta skulle utsätta embryon för miljöförändringar som kan påverka efterföljande transkriptomiska och epigenomiska studier. - Öppna buken och bukhinnan med sax. Visualisera livmoderhornen och använd pincett för att skära ut båda hornen.
- Placera hornen i en petriskål som innehåller kallt komplett medium med 1% FBS. Även om ingen specifik volym krävs, måste man se till att embryona är helt nedsänkta i mediet. En ungefärlig volym på 10 ml per 10 cm petriskål är lämplig.
- Under stereomikroskopet inställt på 5x förstoring och med pincett, ta bort endometrievävnaden, placentan och äggula sac från varje embryo.
- Placera embryon i en petriskål med kallt komplett medium med 1% FBS. Dissekera den embryonala hjärtregionen, såsom beskrivs på det schematiska embryot som illustreras i figur 1, i kallt komplett medium.
- Slå samman hjärtregionerna dissekerade från fem musembryon i ett 1,5 ml mikrocentrifugrör. Prechill svängskopa centrifugerar till 4 °C.
- Centrifugera vid 300x g i 1 min vid rumstemperatur i en svängande skopcentrifug. Ta bort supernatanten och tvätta vävnaderna genom att tillsätta 1 ml vävnadsodlingskvalitet PBS.
- Centrifugera vid 300 x g i 1 min vid rumstemperatur. Ta bort supernatanten och upprepa tvättstegen i totalt två tvättar. Upprepa tvätten två gånger och ersätt PBS med 0,05% trypsin / EDTA (1x).
- För vävnadsuppslutning, tillsätt 50 μL 0,25% trypsin / EDTA i 10 min vid 37 ° C. Applicera mild mekanisk dissociation efter 5 minuter genom att upp och ner gester med hjälp av en bred öppning filterspets.
- Inaktivera trypsinuppslutningsaktivitet genom att tillsätta 350 μL komplett medium till de dissocierade cellerna. För de återsuspenderade cellerna genom en 40 μm cellsil.
3. Cellräkning och viabilitetsbedömning
OBS: Cellantalet och livskraften är kritiska parametrar för framgången med encellsexperiment. Metoden snATAC-seq är känslig för mindre variationer i cellantal. För få celler leder till överuppslutning av kromatinet, vilket resulterar i ett högre antal läsningar och kartläggning av otillgängliga kromatinregioner (brus). På samma sätt genererar för många celler fragment med hög molekylvikt som är svåra att sekvensera. För noggrann bestämning av cell- och kärnkoncentrationer bedömdes cellantal och viabilitet med två olika metoder.
- Utför en trypan blå analys för cellräkning, enligt beskrivningen nedan.
- Vortex 0,4% trypan blå färgningslösning, snurra i 10 s vid rumstemperatur vid 2,000 x g och överför 10 μL till ett mikrorör.
- Blanda cellsuspensionen med pipett och tillsätt 10 μl suspension till den redan alikvoterade 10 μL trypanblå lösningen. Blanda försiktigt 10 gånger med en pipett.
- Överför 10 μL av de färgade cellerna till ett räkneglas. Placera bilden i räknaren för att automatiskt beräkna cellkoncentrationen och livskraften.
- Utför en fluorescensbaserad bedömning av mortalitet enligt beskrivningen nedan.
OBS: Denna analys är baserad på användningen av fluorescerande färgämnen (etidiumhomodimer-1, EthD-1 och calcein AM) för att utvärdera cellviabiliteten. Ett kommersiellt tillgängligt kit användes, och leverantörens instruktioner följdes för lämplig förberedelse och användning.- Bered en 10 μM EthD-1-lösning genom att tillsätta 5 μL av den medföljande 2 mM EthD-1-stamlösningen till 1 ml steril vävnadsodlingskvalitet D-PBS och virvel i 5 s för att säkerställa fullständig blandning.
- Överför 2,5 μl av den medföljande 4 mM stamlösningen av kalcein AM till den redan beredda EthD-1-lösningen. Vortex i 5 s för att säkerställa fullständig blandning.
- Tillsätt 10 μL av den resulterande 10 μM EthD-1 och 10 μM calcein AM-arbetslösningen till 10 μL cellsuspension.
OBS: Calcein är mycket mottagligt för hydrolys i vattenhaltiga lösningar, så använd denna arbetslösning inom 1 dag. - Överför 10 μL av de färgade cellerna till ett räkneglas. Sätt in bilden i den automatiska fluorescerande cellräknaren. Räkna de levande cellerna med ett GFP-filter och de döda cellerna med ett RFP-filter.
OBS: De två räknemetoderna gav liknande celltal och viabilitet, och det totala antalet nyligen dissocierade celler uppskattades till i genomsnitt cirka 20 000 celler per embryonal hjärtregion (0,06 mm3).
4. Frysning av celler
- Centrifugera cellsuspensionen vid 500 x g i 5 min vid 4 °C. Ta försiktigt bort supernatanten utan att vidröra rörets botten och suspendera pelleten igen i 1 ml kylt frysmedium.
- Överför cellsuspensionen till en förkyld kryovial och placera kryovialen i en förkyld frysbehållare.
- Placera behållaren vid -80 ◦ C i 4 timmar till 8 timmar. Överför kryovialen till flytande kväve för nedströms RNA- och ATAC-sekvenseringsexperiment.
OBS: Kryovialen ska transporteras på torris före användning. Enligt vår erfarenhet kan cellerna lagras i flytande kväve i minst 6 månader utan förlust av cellviabilitet. Lagringstemperaturen bör hållas under -150 °C hela tiden för att förhindra bildandet av iskristaller.
5. Upptining av celler och avlägsnande av döda celler
- Placera kryovialerna i ett 37 ° C vattenbad i 1-2 min. Ta bort det när en liten kristall finns kvar i kryovialen.
- Tillsätt 1 ml förvärmt (37 °C) komplett medium. Blanda med en pipett tre gånger. Överför suspensionen till ett 15 ml koniskt rör innehållande 10 ml varmt komplett medium.
- För hela cellsuspensionen över en 30 μm sil. Skölj silen med 1-2 ml varmt komplett medium och samla genomströmningen i samma koniska rör.
- Centrifugera vid 300 x g i 5 minuter och avlägsna supernatanten. Tvätta en gång med PBS och överför cellsuspensionen till ett 1,5 ml mikrorör.
- Centrifugera vid 300 x g i 5 minuter och avlägsna supernatanten utan att störa cellpelleten.
- Tillsätt 100 μL av de medföljande magnetiska mikrokulorna till de pelleterade cellerna och homogenisera fem gånger med en pipettspets med bred borrning. Inkubera i 15 minuter vid rumstemperatur.
- Skölj under tiden den magnetiska separationskolonnen (kapacitet: 1 x 107 till 2 x 108 celler) med 500 μL 1x bindningsbuffert.
- När inkubationen är avslutad, späd cellsuspensionen som innehåller mikrokulorna med 500 μL 1x bindningsbuffert.
- Applicera cellsuspensionen (0,6 μL) på den förberedda magnetiska separationskolonnen. Genomströmningen är den negativt valda levande cellfraktionen, och den magnetiskt kvarhållna fraktionen är de positivt valda döda cellerna.
- Samla upp det levande cellutflödet i ett 15 ml centrifugrör. Skölj 1,5 ml mikroröret som innehöll cellsuspensionen och kolonnen med 2 ml 1x bindningsbuffert och samla utflödet i samma 15 ml rör.
- Centrifugera vid 300 x g i 5 min. Ta bort supernatanten utan att störa cellpelleten.
- Tillsätt 1 ml PBS-BSA-lösning och blanda försiktigt genom pipettering fem gånger med en pipettspets med bred öppning. Överför cellsuspensionen till ett 1,5 ml mikrorör.
- Centrifugera vid 300 x g i 5 min. Ta bort supernatanten utan att störa cellpelleten.
- Tillsätt 1 ml PBS-BSA för att återsuspendera pelleten och upprepa tvättsteget i totalt två tvättar.
- Återsuspendera cellerna i 100 μl PBS-BSA-lösning. Blanda försiktigt genom pipettering 10 gånger.
- Bestäm cellernas koncentration och livskraft med hjälp av de tidigare beskrivna metoderna (steg 3.1 och steg 3.2). För att gå vidare till nästa steg, se till att ett cellantal på ≥ 100 000 celler. Se figur 2 för representativa resultat.
OBS: Kryokonservering resulterar i en förlust på cirka 40% av det ursprungliga utgångsmaterialet i levande celler. Beroende på startantalet celler resulterar pärlseparation på en magnetisk kolonn i hög cellviabilitet men delar det totala antalet celler med två gånger till fem gånger. Användning av en kolonnbaserad magnetisk sats för att avlägsna de döda cellerna rekommenderas endast när tillräckligt utgångsmaterial finns tillgängligt.
6. Isolering av kärnor
OBS: snATAC och snRNA-seq kombinerat utförs med en suspension av rena och intakta kärnor. Optimering av lysförhållandena (lystid och NP40-koncentration) för den använda celltypen rekommenderas. Den optimala lystidpunkten och tvättmedelskoncentrationen är de som resulterar i att det maximala antalet celler lyseras utan att störa kärnmorfologin. Förlusten av celler/kärnor kan minskas genom att använda en svängande skopcentrifug istället för en centrifug med fast vinkel. För att minimera kärnretention på plast rekommenderas det att använda pipettspetsar och centrifugrör med låg retention. Detta kan öka kärnans återhämtning. Beläggningen av pipettspetsarna och centrifugrören med 5% BSA är ett billigare men mer tidskrävande alternativ.
- Rengör arbetsplatsen och materialen med 70% etanol och RNas-borttagningslösning.
- Prechill svängskopa centrifugerar till 4 °C. Nyberedd lysbuffert, lysutspädningsbuffert, 0,1x lysbuffert och tvättbuffert (se tabell 1). Håll buffertarna på is.
- Centrifugera cellsuspensionen vid 500 x g i 5 minuter vid 4 °C i en svängande skopcentrifug. Ta försiktigt bort all supernatant utan att vidröra rörets botten för att undvika att cellpelleten lossnar.
- Tillsätt 100 μL kyld 0,1x lyseringsbuffert. Blanda försiktigt genom pipettering 10 gånger. Inkubera i 5 min på is.
- Tillsätt 1 ml kyld tvättbuffert och blanda försiktigt genom pipettering fem gånger. Centrifugera vid 500 x g i 5 min vid 4 °C. Ta bort supernatanten utan att störa kärnpelleten.
- Upprepa tvättarna med kyld tvättbuffert i totalt tre tvättar. Förbered den utspädda kärnbufferten. Efter resuspension, håll kärnstamlösningen på is.
7. Kvalitets- och kvantitetsbedömningar av de isolerade kärnorna
OBS: Baserat på det initiala cellantalet och uppskattning av cirka 50% kärnförlust under celllys, suspendera lämpligt antal celler i kall utspädd nukleibuffert. Beräkningen av resuspensionsvolymen med kyld utspädd kärnbuffert baseras på den målinriktade återvinningen av kärnor och motsvarande koncentrationer av kärnkärnor som rekommenderas i tillverkarens användarhandbok. Se ett exempel på denna beräkning i tilläggsprotokoll 1.
- Baserat på det initiala cellantalet och uppskattning av cirka 50 % nukleiförlust under celllys, suspendera lämpligt antal celler i kallutspädd nukleibuffert.
- Bestäm den faktiska kärnkoncentrationen. Blanda 2 μl stamlösning med 8 μl utspädd nukleibuffert och tillsätt blandningen till den föralikvoterade 10 μl trypanblå eller EthD-1/calceinAM-arbetslösningen. Räkna kärnorna med en automatiserad cellräknare. Mindre än 5% av cellerna ska vara livskraftiga. Se figur 3 för representativa resultat.
- Beräkna volymen av kärnmaterial och volymen av utspädd kärnbuffert för att erhålla en total volym på 5 μl vid den rekommenderade koncentrationen för transponeringsreaktionen (se tillverkarens bruksanvisning). Fortsätt omedelbart till transponeringsreaktionen enligt användarhandboken17.
OBS: Alla steg från transponeringsreaktionen till konstruktionen av ATAC- och GEX-biblioteken utfördes enligt användarhandboken för satsen som används för snRNA-seq och snATAC-seq kombinerat17.
8. Kvalitetsanalys av biblioteken snRNA-seq och snATAC-seq
- Innan du går vidare till nästa generations sekvensering, validera kvaliteten och storleksfördelningen för de slutliga snATAC-seq- och genuttrycks-GEX-biblioteken. Bedöm kvaliteten och kvantiteten av sekvenser som identifierats i biblioteken med hjälp av fragmentanalyssystem. Se figur 4 för representativa resultat av kvalitetsbedömningar.
OBS: Det slutliga spåret av snATAC-seq-biblioteken bör visa periodiciteten för nukleosomlindning, och storlekarna bör sträcka sig från 200 bp till flera Kbp, medan storlekarna i genuttrycksbiblioteket bör sträcka sig från 300 bp till 600 bp.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Jämfört med beredningen av encellssuspensioner för encellsmetoder är beredningen av encellssuspensioner mycket mer utmanande och kräver en högre grad av upplösning och bearbetning. Nyckelfaktorn för framgångsrik kombinerad snRNA-seq och snATAC-seq är en ren och intakt kärnsuspension. Protokollet för effektiv isolering av kärnor måste anpassas till varje vävnadstyp och tillstånd (färskt eller fryst). Här beskrivs ett optimerat protokoll för isolering av kärnor från frysta musembryonala hjärtceller. Alla steg från embryonal hjärtregiondissektion och hjärtcellsdissociation till kärnisolering sammanfattas i figur 1. För utgångsmaterialet rekommenderas ett celltal på 1 x 105-1 x 106 celler och en cellviabilitet >70% för effektiv kärnisolering. Som visas i figur 2 möjliggjorde det ytterligare steget som utfördes i detta protokoll för att sortera och avlägsna de döda cellerna efter upptining att erhålla en renare cellsuspension med en signifikant högre cellviabilitet och för att förbättra kvaliteten på utgångsprovet. Förutom isolering av kärnor ger detta protokoll detaljerad information om hur man bedömer kvaliteten och kvantiteten hos de isolerade kärnorna (figur 3). Kvaliteten på de isolerade kärnorna påverkar i hög grad kvaliteten på kombinerade data för snRNA-seq och snATAC-seq; Här bedömdes kvaliteten på de isolerade kärnorna genom utvärderingen av kärnmembranmorfologin. De isolerade kärnorna verkade släta och enhetligt runda, som visas i figur 3C, under ljusfältmikroskopi, vilket indikerar en effektiv isoleringsprocess. För mer noggrannhet användes två olika räkningsmetoder, inklusive trypanblått och ett kit för fluorescensbaserad bedömning av livskraft, för att kvantifiera cellerna och kärnorna. Fluorescensanalysen användes för att bestämma cellviabiliteten baserat på cellulär integritet och intracellulär esterasaktivitet. Denna färglösning gör det möjligt att skilja levande celler från döda celler genom att samtidigt visualisera grön fluorescerande kalcein AM, vilket indikerar den intracellulära esterasaktiviteten, och röd fluorescerande etidiumhomodimer 1, vilket återspeglar förlusten av cellulär integritet. Att använda ett fluorescerande färgämne för räkning hjälper till att skilja kärnor från cellklumpar och skräp. Med hjälp av detta protokoll passerade cellviabiliteten från 80% -90% före kärnisolering till <5% efter kärnisolering, som visas i figur 3A, B.
Vår procedur jämfördes med den befintliga metoden, som innebär att frysa färsk vävnad direkt i flytande kväve och utföra lyseringssteget utan föregående enzymatisk dissociation (tilläggsprotokoll 2 och kompletterande figur 1). Båda metoderna testades för att bestämma vilken metod som ger en kärnsuspension av bättre kvalitet. Snapfrysning av hel embryonal hjärtvävnad gav upphov till en hög andel icke-lyserade celler som detekterades som levande, vilket indikerar olämplig celllys (kompletterande figur 1A). Aggregat och icke-individuella celler observerades trots filtrering genom filter (kompletterande figur 1A, B).
De isolerade kärnorna användes för att generera bibliotek för gemensam snATAC-seq och snRNA-seq. Figur 4 illustrerar kvalitetskontrollresultaten för cDNA som används för konstruktion av genuttrycksbiblioteket (GEX) och ATAC-biblioteket. Kvalitetskontrollen utfördes med hjälp av automatiserad elektrofores (figur 5A). De mRNA-härledda cDNA: erna kvantifierades och utbytet var tillräckligt för efterföljande användning i GEX-bibliotekskonstruktion. Ett högkvalitativt GEX-bibliotek som sträcker sig från ~ 300 bp till 600 bp och ett högkvalitativt ATAC-bibliotek med periodisk nukleosomlindning från 200 bp till 7 kbp erhölls. Dessa bibliotek sekvenserades genom sekvensering med hög genomströmning och genererade framgångsrikt genuttryck med en kärna och kromatintillgänglighet (figur 5A). Dessa rådata var redo att demultiplexeras och analyseras bioinformatiskt för att generera transkriptionell och epigenetisk profilering av mus E9.5 hjärtprogenitorceller. SnRNA-seq och snATAC-seq klustrades, identifierades och märktes baserat på kända markörgener med hjälp av oövervakad klustring med Seurat toolkit for single genomics24 . Denna initiala analys bekräftade närvaron av alla förväntade hjärtcellstyper vid E9.5 (figur 5B).
Alla ovanstående resultat stöder framgången för detta protokoll för att isolera kärnor som är lämpliga för nedströms enkelkärnor från frysta embryonala hjärtceller.
Figur 1: Representation av huvudstegen i provberedningen för kombinerad snRNA-seq- och snATAC-seq-profilering. Detta flödesschema rekapitulerar alla steg, inklusive hjärtvävnadsdissektion och hjärtcellsdissociation, cellfrysning och upptining, rening av levande celler genom att avlägsna döda celler och isolering av kärnor, som utförs för samtidig detektion av mRNA och kromatintillgänglighet från samma cell. Förkortningar: PBS = fosfatbuffrad saltlösning; BSA = bovint serumalbumin, RT = rumstemperatur. Skapad med BioRender.com Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Livskraften hos de optimerade tinade cellerna efter sortering av döda celler. Bilder som visar cellantal och livskraft med hjälp av en automatiserad cellräknare före (överst) och efter (nederst) borttagning av döda celler med trypanblått uteslutningsfärgämne. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Kvalitetskontroll av kärnberedningen. (A,B) Bilder som visar cellantal och livskraft med hjälp av en automatiserad cellräknare före (överst) och efter (nedre) kärnisolering. Två räknemetoder användes: (A) fluorescerande mortalitetsanalys och (B) trypan blue-analys. (C) Bilder som visar kvaliteten på kärnisoleringen. Bilderna togs vid 20x (skalstapel = 50 μm) med ljusfälts- och fluorescensmikroskopi. Ljusfältsbilden (vänster) visar kärnmorfologi; RFP (mitten) visar celler som förlorade sin membranintegritet, med andra ord isolerade kärnor; och GFP (höger) som normalt indikerar esterasaktiviteten hos levande celler här bekräftar frånvaron av levande celler i kärnsuspensionen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Kvalitetskontroll av encellsgenuttrycket och ATAC-biblioteken. DNA-analys med automatiserad elektrofores som visar kvalitet och storleksfördelning av cDNA (överst), GEX-biblioteket (mitten) och ATAC-biblioteket (botten). För cDNA-kvantifieringen valdes zonen från 200 bp till 8 900 bp och bioanalysatorn uppskattade cDNA-koncentrationen (i pg / μL; röd cirkel). Ett tillräckligt cDNA-utbyte erhölls för att fortsätta med GEX-bibliotekskonstruktionen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Provprestanda bedömd med Cell Ranger-programvaran25. (A) Diagram över korskänslighet som visar transponeringshändelserna i toppar per streckkod på x-axeln och unika molekylära RNA-identifierare (UMI) per streckkod på y-axeln. Som förväntat är cellerna huvudsakligen belägna i det övre högra hörnet, med höga RNA- och ATAC-data. En tydlig separation mellan cellerna och icke-cellerna (tomma GEM, bakgrundssignal) observerades. (B) Representativ enhetlig mångfaldig approximation och projektion (UMAP) av alla fångade celler i scRNA-seq (vänster) och scATAC-seq (höger) färgad av klusteridentitet och grupperad baserat på celltyper. En bra separation av kluster observerades. Gemensamma GEX- och ATAC-rådata erhölls från sekvensering av 7 000 kärnor från den dissekerade E9.5-musembryonala hjärtregionen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Kompletterande figur 1: Kvalitetskontroll av isolering av kärnor från den befintliga metoden som innebär frysning av färsk vävnad direkt i flytande kväve. (A) Bilder som visar antalet isolerade kärnor med hjälp av en automatiserad cellräknare och trypanblått som uteslutningsfärgämne före (överst) och efter (nederst) filtrering genom en 40 μm sil. En hög andel icke-lyserade celler detekterades som levande. Detektion av 20% levande celler indikerar olämplig celllys. De svarta pilarna indikerar aggregat. b) Bilder som visar kvaliteten på de isolerade kärnorna. Bilderna togs vid 20x (topp och mitten med en skalstapel på 50 μm) och 40x (botten med en skalstapel på 25 μm) med hjälp av ljusfälts- och fluorescensmikroskopi. Ljusfältsbilden (vänster) visar kärnmorfologin; RFP (höger) visar celler som förlorat sin membranintegritet, med andra ord isolerade kärnor. De svarta pilarna indikerar multipletter av kärnor fästa vid skräp. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Tabell 1: Tabell över buffertar och lösningar som används i förfarandet. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Tilläggsprotokoll 1: Bedömning av mängden isolerade kärnor. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Tilläggsprotokoll 2: Isolering av kärnor från flashfrusen vävnad. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Analysen av den cellulära sammansättningen av det utvecklande hjärtat genom kombinerade snRNA-seq- och snATAC-seq-studier ger en djupare förståelse för ursprunget till medfödd hjärtsjukdom26. Flera forskningslaboratorier har studerat effekterna av kryokonservering av hjärtvävnad på snRNA-seq27. Att genomföra snRNA-seq och snATAC-seq med hjälp av färsk mikrodissekerad vävnad från musmodeller av mänsklig sjukdom kan vara logistiskt utmanande när man jämför olika experimentella förhållanden. För ett givet utvecklingsstadium är en svårighet att kontroll- och experimentgrupperna måste bearbetas i samma omgång för att minska den tekniska variabilitet som införs genom provbearbetning. När bearbetning av färsk vävnad inte är möjlig rekommenderas det, baserat på våra resultat, att dissociera och sedan frysa hela embryonal hjärtvävnad snarare än att snäppfrysa hela embryonal hjärtvävnad. Valet av en metod framför den andra baseras på det faktum att om hjärtvävnaden är frusen hel, är det mycket mer utmanande att isolera livskraftiga enskilda celler efter upptining. Men om vävnadsdissociationsprotokollet inte är optimerat kan det vara bättre att snäppfrysa vävnaden hel. Dissociation följt av kryokonservering är att föredra med tanke på att detta vävnadsdissociationsprotokoll ger >90% färska livskraftiga celler utan celltypsbias.
Detta tillvägagångssätt har flera fördelar, såsom användningen av frysta celler, vilket eliminerar kravet på färsk vävnad och användningen av ett encellsdissociationssteg, vilket möjliggör isolering av intakta enskilda kärnor; Detta är faktiskt avgörande för nedströms encellsanalys. Den enzymatiska dissociationen kan dock inducera transkriptionell bias i cellpopulationer. Enzymatisk celldissociation stör den cellulära mikromiljön och inducerar därmed transkriptionsförändringar i de flesta celltyper28. Den primära determinanten för dessa förändringar är dissociationstiden, inte celltypen29. För att moderera dissociationsinducerade artefakter är det viktigt att följa den rekommenderade matsmältningstiden. Den publicerade litteraturen i olika vävnader indikerar att en matsmältningstid på 30 min eller mindre inducerar mindre transkriptionsförändringar28,30. Dessutom kan bioinformatiska interventioner användas för att minimera dataförvrängningar31,32.
Att erhålla rena och intakta enstaka kärnor är den viktigaste faktorn i enkärngenomik. Igensättning av mikrofluidiska kamrar i encellsplattformar på grund av närvaron av cellkluster eller organiska skräp leder till dålig datakvalitet eller, mer problematiskt, till experimentellt misslyckande. I denna procedur modifierades befintliga protokoll genom att kombinera enzymatisk dissociation, kryokonservering och rening av livskraftiga hjärtstamceller. Vår procedur möjliggör isolering av rena kärnor utan behov av FACS-sortering. Med hjälp av denna procedur fick vi en högkvalitativ kärnsuspension utan klumpar, nästan inget skräp och intakta enskilda kärnor. Cellisoleringssteget är avgörande för att undvika potentiell klumpning av kärnor; Detta kan faktiskt undvikas genom försiktig pipettering med stora pipettspetsar eller genom att filtrera kärnorna. Användningen av filter i olika steg och efterföljande observation under ett ljusmikroskop kan förhindra sådana problem.
Protokollet som beskrivs här användes framgångsrikt för snRNA-seq och snATAC-seq-profilering från samma kärnpreparat erhållet från E9.5 hjärtstamceller. Denna metod kan användas i gravida vildtypsmöss kontra musmodeller för medfödda hjärtfel. Medfödda hjärtfel uppstår sannolikt på grund av störning av vägar som styr differentiering, multiplikation, migration och överlevnad av hjärtstamceller33,34. För att bättre förstå ursprunget till dessa defekter fokuserade denna studie specifikt på embryonalt stadium 9.5, där förfäderna till de viktigaste områdena som påverkas av medfödda hjärtfel är närvarande, särskilt hjärtprogenitorerna i det andra hjärtfältet11 och neuralkammen35. Tillämpningen av denna procedur på celler i det vuxna mushjärtat och det mänskliga hjärtat kräver optimering av protokollet, särskilt när det gäller celldissociation och lyssteg.
De viktigaste övervägandena mellan manuell och automatiserad cellräkning är kostnader, arbetskraft och noggrannhet. Automatiserade räknare är snabbare än de flesta skickliga forskare som utför en manuell räkning. Speciellt när det handlar om ett stort antal prover är det till stor fördel att enkelt kunna trycka på räkna och se resultatet. Detta är en viktig punkt, för när kärnorna är isolerade måste de bearbetas snabbt för att undvika förlust av deras integritet. Den främsta noggrannhetsfördelen med automatiserade system är att dessa system eliminerar variationer mellan användare eller laboratorier. En annan fördel är att automatiserade system vanligtvis har ett större synfält än hemocytometrar. När antalet celler / kärnor eller koncentrationen av cellerna / kärnorna är lägre, är detta större synfält verkligen en fördel jämfört med den traditionella manuella metoden.
En hög andel mitokondriell DNA-kontaminering kan observeras när koncentrationen av det icke-joniska tvättmedlet är för hög. Genom att minska dess koncentration i lysbufferten kan denna kontaminering minskas utan att minska utbytet av kärnorna. De mest tillfredsställande resultaten erhölls i våra experiment med en lysbuffert innehållande 0,1% tvättmedel. Att snurra kärnorna i en svänghink kan också minska antalet mitokondrier i pelleten.
Att ha ett lämpligt förhållande mellan Tn5-transposas och kärnor är avgörande för framgångsrik snATAC-seq13,14. Till exempel kan för mycket Tn5 leda till en hög bakgrund på grund av slutet kromatin och låg komplexitet i sekvenseringsbiblioteken, medan sublys kanske inte resulterar i ett komplett PCR-förstärkt bibliotek13. För att bestämma antalet kärnor exakt använde vi två komplementära metoder.
Multimodala omics-dataset ger möjlighet att undersöka flera nivåer av genomisk organisation samtidigt 9,36. Det gemensamma RNA- och ATAC-multimodala tillvägagångssättet möjliggör studier av uppströms regulatorer och nedströms metaboliska gener och ger ett omfattande tillvägagångssätt för studier av transkriptionsnätverk och kromatinarkitektur i samband med hjärtutveckling vid encellsupplösningen. Detta protokoll för isolering med en kärna är kompatibelt med både individuell och gemensam utvärdering av expressions- och kromatindataset. Kromatintillgänglighet är en viktig epigenetisk regleringsnivå eftersom den möjliggör aktiviteten hos transkriptionsregulatorer vid specifika genomiska platser 8,9,10,11,12,13. En mängd information om identiteten och målplatserna för dussintals möjliga transkriptionsfaktorer tillhandahålls således av DNA-sekvensen i kromatinprofilen. Jämförelsen av informationen som erhållits av snATAC-seq med snRNA-uttrycksprofilering kan hjälpa till att identifiera de mest relevanta transkriptionsfaktorerna, som sedan kan analyseras ytterligare av Cut&Run37. Vi hoppas att detta förfarande kommer att hjälpa intresserade forskare och uppmuntra dem att använda denna kraftfulla metod för sin forskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Denna forskning stöddes av ERA-CVD-2019 och ANR-JCJC-2020 till SS. Vi tackar Genomics and Bioinformatics facility (GBiM) från U 1251 / Marseille Medical Genetics lab och de anonyma granskarna för att ge värdefulla kommentarer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2100 Bioanalyzer Instrument | Agilent | No catalog number | |
| 5M Sodium chloride (NaCl) | Sigma | 59222C-500ML | |
| BSA 10% | Sigma | A1595-50ML | |
| Chromium Next GEM Chip J Single Cell Kit, 16 rxns | 10X Genomics | 1000230 | |
| Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression Reagent Bundle, 4 rxns (including Nuclei Buffer 20X) | 10X Genomics | 1000285 | |
| Countess cell counting chamber slides | Invitrogen | C10283 | |
| Countess III FL | Thermofisher | No catalog number | |
| Digitonin (5%) | Thermofisher | BN2006 | |
| DMSO | Sigma | D2650-5x5ML | |
| DNA LoBind Tubes | Eppendorf | 22431021 | |
| D-PBS | Thermofisher | 14190094 | Sterile and RNase-free |
| Dual Index Kit TT Set A 96 rxns | 10X Genomics | 1000215 | |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 352096 | |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 10788561 | |
| HI-FBS | Thermofisher | A3840001 | Heat inactivated |
| High sensitivity DNA kit | Agilent | 5067-4626 | |
| Igepal CA-630 | Sigma | I8896-50ML | |
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit | Thermofisher | L3224 | |
| MACS Dead Cell Removal kit: Dead Cell Romoval MicroBeads, Binding Buffer 20X | Miltenyi Biotec | 130-090-101 | |
| MACS SmartStrainers (30 µm) | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma | M1028-100ML | |
| Milieu McCoy 5A | Thermofisher | 16600082 | |
| MS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| NovaSeq 6000 S2 | Illumina | No catalog number | |
| Penicillin Streptomycin (Pen/Strep) | Thermofisher | 15070063 | |
| PluriStrainer Mini 40µm | PluriSelect | V-PM15-2021-12 | |
| Rock inhibitor | Enzo Life Sciences | ALX-270-333-M005 | |
| Single Index Kit N Set A, 96 rxn | 10X Genomics | 1000212 | |
| Standard 90mm Petri dish Sterilin | Thermofisher | 101R20 | |
| Sterile double-distilled water | Thermofisher | R0582 | |
| Trizma Hydrochloride solution (HCl) | Sigma | T2194-100ML | |
| Trypan Blue stain (0.4%) | Invitrogen | T10282 | |
| Trypsin 0.05% - EDTA 1X | Thermofisher | 25300054 | |
| Tween20 | Sigma | P9416-50ML | |
| Wide orifice filtered pipette tips 200 μl | Labcon | 1152-965-008-9 | |
| ZEISS SteREO Discovery.V8 | ZEISS | No catalog number |
References
- vander Bom, T., et al. The changing epidemiology of congenital heart disease. Nature Reviews. Cardiology. 8 (1), 50-60 (2011).
- Bouma, B. J., Mulder, B. J. Changing landscape of congenital heart disease. Circulation Research. 120 (6), 908-922 (2017).
- Postma, A. V., Bezzina, C. R., Christoffels, V. M. Genetics of congenital heart disease: The contribution of the noncoding regulatory genome. Journal of Human Genetics. 61 (1), 13-19 (2016).
- Buijtendijk, M. F. J., Barnett, P., vanden Hoff, M. J. B.
- Sylva, M., vanden Hoff, M. J., Moorman, A. F.
- Gromova, T., Gehred, N. D., Vondriska, T. M. Single-cell transcriptomes in the heart: When every epigenome counts. Cardiovascular Research. 119 (1), 64-78 (2022).
- Tanay, A., Regev, A. Scaling single-cell genomics from phenomenology to mechanism. Nature. 541 (7637), 331-338 (2017).
- Schwartzman, O., Tanay, A. Single-cell epigenomics: Techniques and emerging applications. Nature Reviews. Genetics. 16 (12), 716-726 (2015).
- Macaulay, I. C., Ponting, C. P., Voet, T. Single-cell multiomics: Multiple measurements from single cells. Trends in Genetics. 33 (2), 155-168 (2017).
- Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. ATAC-seq: A method for assaying chromatin accessibility genome-wide. Current Protocols in Molecular Biology. 109, 1-9 (2015).
- Stefanovic, S., et al. Hox-dependent coordination of mouse cardiac progenitor cell patterning and differentiation. Elife. 9, e55124 (2020).
- Xu, W., et al. A plate-based single-cell ATAC-seq workflow for fast and robust profiling of chromatin accessibility. Nature Protocols. 16 (8), 4084-4107 (2021).
- Buenrostro, J. D., et al. Single-cell chromatin accessibility reveals principles of regulatory variation. Nature. 523 (7561), 486-490 (2015).
- Denisenko, E., et al. Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus RNA-seq workflows. Genome Biology. 21 (1), 130 (2020).
- Safabakhsh, S., et al. Isolating nuclei from frozen human heart tissue for single-nucleus RNA sequencing. Current Protocols. 2 (7), e480 (2022).
- Pimpalwar, N., et al. Methods for isolation and transcriptional profiling of individual cells from the human heart. Heliyon. 6 (12), 05810 (2020).
- 10x Genomics. Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression Reagent Kits User Guide. 10x Genomics. , CG000338_ChromiumNextGEM_Multiome_ATAC_GEX_User_Guide_RevF.pdf (2022).
- Jia, G., et al. Single cell RNA-seq and ATAC-seq analysis of cardiac progenitor cell transition states and lineage settlement. Nature Communications. 9 (1), 4877 (2018).
- Wang, L., et al. Single-cell dual-omics reveals the transcriptomic and epigenomic diversity of cardiac non-myocytes. Cardiovascular Research. 118 (6), 1548-1563 (2022).
- Wang, Z., et al. Cell-type-specific gene regulatory networks underlying murine neonatal heart regeneration at single-cell resolution. Cell Reports. 35 (8), 109211 (2021).
- Ameen, M., et al. Integrative single-cell analysis of cardiogenesis identifies developmental trajectories and non-coding mutations in congenital heart disease. Cell. 185 (26), 4937-4953 (2022).
- Gao, R., et al. Pioneering function of Isl1 in the epigenetic control of cardiomyocyte cell fate. Cell Research. 29 (6), 486-501 (2019).
- Manivannan, S., et al. Single-cell transcriptomic profiling unveils dysregulation of cardiac progenitor cells and cardiomyocytes in a mouse model of maternal hyperglycemia. Communications Biology. 5 (1), 820 (2022).
- Cao, Y., et al. Integrated analysis of multimodal single-cell data with structural similarity. Nucleic Acids Research. 50 (21), e121 (2022).
- What is CellRanger. 10x Genomics. , Available from: https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/what-is-cell-ranger (2023).
- Hill, M. C. Integrated multi-omic characterization of congenital heart disease. Nature. 608 (7921), 181-191 (2022).
- Chen, Z., Wei, L., Duru, F., Chen, L. Single-cell RNA sequencing: In-depth decoding of heart biology and cardiovascular diseases. Current Genomics. 21 (8), 585-601 (2020).
- Machado, L., Relaix, F., Mourikis, P. Stress relief: Emerging methods to mitigate dissociation-induced artefacts. Trends in Cell Biology. 31 (11), 888-897 (2021).
- Tabula Muris, C., et al. Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris. Nature. 562 (7727), 367-372 (2018).
- Machado, L., et al. Tissue damage induces a conserved stress response that initiates quiescent muscle stem cell activation. Cell Stem Cell. 28 (6), 1125-1135 (2021).
- Haghverdi, L., Lun, A. T. L., Morgan, M. D., Marioni, J. C. Batch effects in single-cell RNA-sequencing data are corrected by matching mutual nearest neighbors. Nature Biotechnology. 36 (5), 421-427 (2018).
- Yang, Y., et al. SMNN: Batch effect correction for single-cell RNA-seq data via supervised mutual nearest neighbor detection. Briefings in Bioinformatics. 22 (3), 097 (2021).
- Stefanovic, S., Christoffels, V. M. GATA-dependent transcriptional and epigenetic control of cardiac lineage specification and differentiation. Cellular and Molecular Life Sciences. 72 (20), 3871-3881 (2015).
- Gunthel, M., Barnett, P., Christoffels, V. M. Development, proliferation, and growth of the mammalian heart. Molecular Therapy. 26 (7), 1599-1609 (2018).
- Stefanovic, S., Etchevers, H. C., Zaffran, S. Outflow tract formation-embryonic origins of conotruncal congenital heart disease. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 8 (4), 42 (2021).
- Hao, Y., et al. Integrated analysis of multimodal single-cell data. Cell. 184 (13), 3573-3587 (2021).
- Bai, H., Lin, M., Meng, Y., Bai, H., Cai, S. An improved CUT&RUN method for regulation network reconstruction of low abundance transcription factor. Cellular Signalling. 96, 110361 (2022).
