Ofraktionerad bulkodling av musskelettmuskulatur för att rekapitulera nisch- och stamcellsvila
Summary
Skelettmuskulaturen består av flera celltyper, inklusive stamceller, var och en med ett särskilt bidrag till muskelhomeostas och regenerering. Här beskrivs 2D-odlingen av muskelstamceller och muskelcellnischen i en ex vivo-miljö som bevarar många av de fysiologiska, in vivo– och miljöegenskaperna.
Abstract
Skelettmuskulaturen är den största vävnaden i kroppen och utför flera funktioner, från rörelse till kroppstemperaturkontroll. Dess funktionalitet och återhämtning från skador beror på en mängd olika celltyper och på molekylära signaler mellan kärnmuskelcellerna (myofibrer, muskelstamceller) och deras nisch. De flesta experimentella miljöer bevarar inte denna komplexa fysiologiska mikromiljö, och de tillåter inte heller ex vivo-studier av muskelstamceller i vila, ett celltillstånd som är avgörande för dem. Här beskrivs ett protokoll för ex vivo-odling av muskelstamceller med cellulära komponenter i deras nisch. Genom mekanisk och enzymatisk nedbrytning av muskler erhålls en blandning av celltyper, som sätts i 2D-odling. Immunfärgning visar att inom 1 vecka finns flera nischceller i odling tillsammans med myofibrer och, viktigare, Pax7-positiva celler som uppvisar egenskaperna hos vilande muskelstamceller. Dessa unika egenskaper gör detta protokoll till ett kraftfullt verktyg för cellamplifiering och generering av vilande stamceller som kan användas för att ta itu med grundläggande och translationella frågor.
Introduction
Rörelse, andning, ämnesomsättning, kroppshållning och upprätthållande av kroppstemperatur beror alla på skelettmuskulaturen, och funktionsstörningar i skelettmuskulaturen kan därför orsaka försvagande patologier (dvs. myopatier, muskeldystrofier, etc.) 1. Med tanke på dess väsentliga funktioner och överflöd har skelettmuskulaturen uppmärksammats av forskningslaboratorier över hela världen som strävar efter att förstå de viktigaste aspekterna som stöder normal muskelfunktion och kan fungera som terapeutiska mål. Dessutom är skelettmuskulatur en allmänt använd modell för att studera regenerering och stamcellsfunktion, eftersom friska muskler kan reparera sig själva helt efter fullständig skada och degeneration, främst på grund av dess inneboende stamceller2; Dessa kallas också satellitceller och är lokaliserade under den basala laminan i periferin av muskelfibrerna3.
Kärncellerna i vuxen skelettmuskulatur är myofibrerna (långa syncytiala multinukleära celler) och satellitcellerna (stamceller med myogen potential som är vilande tills en skada aktiverar dem). De senare cellerna är de centrala cellerna för muskelregenerering, och denna process kan inte ske i deras frånvaro 4,5,6,7. I deras omedelbara mikromiljö finns det flera celltyper och molekylära faktorer som signalerar till dem. Denna nisch etableras gradvis under hela utvecklingen och fram till vuxen ålder8. Vuxna muskler innehåller flera celltyper (endotelceller, pericyter, makrofager, fibro-adipogenic progenitors-FAPs, regulatoriska T-celler, etc.) 9,10 och extracellulära matriskomponenter (lamininer, kollagener, fibronektin, fibrillliner, periostin, etc.) 11 som interagerar med varandra och med satellitcellerna i samband med hälsa, sjukdom och regenerering.
Att bevara denna komplexa nisch i experimentella miljöer är grundläggande men utmanande. Lika svårt är det att bibehålla eller återgå till vila, ett celltillstånd som är kritiskt för satellitceller9. Flera metoder har introducerats för att delvis ta itu med dessa utmaningar, var och en med sina för- och nackdelar (beskrivs i diskussionsavsnittet). Här presenteras en metod som delvis kan överbrygga dessa två hinder. Musklerna skördas först och bryts sedan ner mekaniskt och enzymatiskt innan den heterogena cellblandningen odlas. Under odlingens gång detekteras många celltyper i nischen, och satellitceller som har återgått till vila observeras. Som ett sista steg i protokollet presenteras de immunofluorescenssteg som gör det möjligt att detektera varje celltyp genom användning av universellt accepterade markörer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Funktionen hos vuxna skelettmuskler stöds av en fint orkestrerad uppsättning cellulära interaktioner och molekylära signaler. Här presenteras en metod som gör det möjligt att studera dessa parametrar i en ex vivo-miljö som liknar den fysiologiska mikromiljön.
Flera grupper har rapporterat in vitro-metoder för att odla myogena celler. Dessa metoder syftade till att isolera satellitceller för att studera deras myogena stamegenskaper. Två huvudsakliga metoder använd…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
För figur 2 användes mallar från Servier Medical Art (https://smart.servier.com/). FR-laboratoriet stöds av Association Française contre les Myopathies – AFM via TRANSLAMUSCLE (bidrag 19507 och 22946), Fondation pour la Recherche Médicale – FRM (EQU202003010217, ENV202004011730, ECO201806006793), Agence Nationale pour la Recherche – ANR (ANR-21-CE13-0006-02, ANR-19-CE13-0010, ANR-10-LABX-73) och La Ligue Contre le Cancer (IP/SC-17130). Ovanstående finansiärer hade ingen roll i utformningen, insamlingen, analysen, tolkningen eller rapporteringen av denna studie eller skrivandet av detta manuskript.
Materials
| anti-CD31 | BD | 550274 | dilution 1:100 |
| anti-FOSB | Santa Cruz | sc-7203 | dilution 1:200 |
| anti-GFP | Abcam | ab13970 | dilution 1:1000 |
| anti-Ki67 | Abcam | ab16667 | dilution 1:1000 |
| anti-MyHC | DSHB | MF20-c | dilution 1:400 |
| anti-MYOD | Active Motif | 39991 | dilution 1:200 |
| anti-MYOG | Santa Cruz | sc-576 | dilution 1:150 |
| anti-Pax7 | Santa Cruz | sc-81648 | dilution 1:100 |
| anti-PDGFRα | Invitrogen | PA5-16571 | dilution 1:50 |
| b-FGF | Peprotech | 450-33 | concentration 4 ng/mL |
| bovine serum albumin (BSA) – used for digestion | Sigma Aldrich | A7906-1006 | concentration 0.2% |
| BSA IgG-free, protease-free – used for staining | Jackson ImmunoResearch | 001-000-162 | concentration 5% |
| cell strainer 40 um | Dominique Dutscher | 352340 | |
| cell strainer 70 um | Dominique Dutscher | 352350 | |
| cell strainer 100 um | Dominique Dutscher | 352360 | |
| Collagenase | Roche | 10103586001 | concentration 0.5 U/mL |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Euromedex | UD8050-05-A | |
| Dispase | Roche | 4942078001 | concentration 3 U/mL |
| Dissection forceps size 5 | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Dissection forceps size 55 | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Dissection scissors (big, straight) | Fine Science Tools | 9146-11 | ideal for chopping |
| Dissection scissors (small, curved) | Fine Science Tools | 15017-10 | |
| Dissection scissors (small, straight) | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | ThermoFisher | 41966-029 | |
| EdU Click-iT kit | ThermoFisher | C10340 | |
| Fetal bovine serum – option 1 | Eurobio | CVF00-01 | |
| Fetal bovine serum – option 2 | Gibco | 10270-106 | |
| Matrigel | Corning Life Sciences | 354234 | coating solution |
| Parafilm | Dominique Dutscher | 090261 | flexible film |
| Penicillin streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Paraformaldehyde – option 1 | PanReac AppliChem ITW Reagents | 211511.1209 | concentration 4% |
| Paraformaldeyde – option 2 | ThermoFisher | 28908 | concentration 4% |
| Shaking water bath | ThermoFisher | TSSWB27 | |
| TritonX100 | Sigma Aldrich | T8532-500 ML | concentration 0.5% |
| Wild-type mice | Janvier | C57BL/6NRj |
References
- Frontera, W. R., Ochala, J. Skeletal muscle: A brief review of structure and function. Calcified Tissue International. 96 (3), 183-195 (2015).
- Forcina, L., Cosentino, M., Musarò, A. Mechanisms regulating muscle regeneration: Insights into the interrelated and time-dependent phases of tissue healing. Cells. 9 (5), 1297 (2020).
- Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 9 (2), 493-495 (1961).
- Lepper, C., Partridge, T. A., Fan, C. -. M. An absolute requirement for Pax7-positive satellite cells in acute injury-induced skeletal muscle regeneration. Development. 138 (17), 3639-3646 (2011).
- McCarthy, J. J., et al. Effective fiber hypertrophy in satellite cell-depleted skeletal muscle. Development. 138 (17), 3657-3666 (2011).
- Murphy, M. M., Lawson, J. A., Mathew, S. J., Hutcheson, D. A., Kardon, G. Satellite cells, connective tissue fibroblasts and their interactions are crucial for muscle regeneration. Development. 138 (17), 3625-3637 (2011).
- Sambasivan, R., et al. Pax7-expressing satellite cells are indispensable for adult skeletal muscle regeneration. Development. 138 (17), 3647-3656 (2011).
- Hicks, M. R., Pyle, A. D. The emergence of the stem cell niche. Trends in Cell Biology. 33 (22), 112-123 (2022).
- Relaix, F., et al. Perspectives on skeletal muscle stem cells. Nature Communications. 12 (1), 692 (2021).
- Gama, J. F. G., et al. Role of regulatory T cells in skeletal muscle regeneration: A systematic review. Biomolecules. 12 (6), 817 (2022).
- Loreti, M., Sacco, A. The jam session between muscle stem cells and the extracellular matrix in the tissue microenvironment. NPJ Regenerative Medicine. 7 (1), 16 (2022).
- Sambasivan, R., et al. Distinct regulatory cascades govern extraocular and pharyngeal arch muscle progenitor cell fates. Developmental Cell. 16 (6), 810-821 (2009).
- Pereira, P. D., et al. Quantification of cell cycle kinetics by EdU (5-ethynyl-2′-deoxyuridine)-coupled-fluorescence-intensity analysis. Oncotarget. 8 (25), 40514-40532 (2017).
- Bismuth, K., Relaix, F. Genetic regulation of skeletal muscle development. Experimental Cell Research. 316 (18), 3081-3086 (2010).
- Yin, H., Price, F., Rudnicki, M. A. Satellite cells and the muscle stem cell niche. Physiological Reviews. 93 (1), 23-67 (2013).
- Lertkiatmongkol, P., Liao, D., Mei, H., Hu, Y., Newman, P. J. Endothelial functions of platelet/endothelial cell adhesion molecule-1 (CD31). Current Opinion in Hematology. 23 (3), 253-259 (2016).
- Scholzen, T., Gerdes, J. The Ki-67 protein: From the known and the unknown. Journal of Cellular Physiology. 182 (3), 311-322 (2000).
- Abou-Khalil, R., Le Grand, F., Chazaud, B. Human and murine skeletal muscle reserve cells. Stem Cell Niche. 1035, 165-177 (2013).
- Pasut, A., Oleynik, P., Rudnicki, M. A. Isolation of muscle stem cells by fluorescence activated cell sorting cytometry. Methods in Molecular Biology. 798, 53-64 (2011).
- Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nature Protocols. 10 (10), 1612-1624 (2015).
- Montarras, D., et al. Direct isolation of satellite cells for skeletal muscle regeneration. Science. 309 (5743), 2064-2067 (2005).
- Qu, Y., Edwards, K., Barrow, J. Isolation, culture, and use of primary murine myoblasts in small-molecule screens. STAR Protocols. 4 (2), 102149 (2023).
- Danoviz, M. E., Yablonka-Reuveni, Z. Skeletal muscle satellite cells: Background and methods for isolation and analysis in a primary culture system. Methods in Molecular Biology. 798, 21-52 (2011).
- Saclier, M., Theret, M., Mounier, R., Chazaud, B. Effects of macrophage conditioned-medium on murine and human muscle cells: analysis of proliferation, differentiation, and fusion. Methods in Molecular Biology. 1556, 317-327 (2017).
- Giordani, L., et al. High-dimensional single-cell cartography reveals novel skeletal muscle-resident cell populations. Molecular Cell. 74 (3), 609-621 (2019).
- Tabula Muris Consortium et al. Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris. Nature. 562 (7727), 367-372 (2018).
- Brunetti, J., Koenig, S., Monnier, A., Frieden, M. Nanopattern surface improves cultured human myotube maturation. Skeletal Muscle. 11 (1), 12 (2021).
- Denes, L. T., et al. Culturing C2C12 myotubes on micromolded gelatin hydrogels accelerates myotube maturation. Skeletal Muscle. 9 (1), 17 (2019).
- LaFramboise, W. A., et al. Effect of muscle origin and phenotype on satellite cell muscle-specific gene expression. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 35 (10), 1307-1318 (2003).
- Azhar, M., Wardhani, B. W. K., Renesteen, E. The regenerative potential of Pax3/Pax7 on skeletal muscle injury. Journal of Generic Engineering and Biotechnology. 20 (1), 143 (2022).
- Hardy, D., et al. Comparative study of injury models for studying muscle regeneration in mice. PLoS One. 11 (1), e0147198 (2016).
