Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

תרבית בתפזורת בלתי מופרעת של שרירי שלד עכבר כדי לשחזר נישה ושקט תאי גזע

Published: June 2, 2023 doi: 10.3791/65433
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1, 1, 1, 1,2,3,4
1Univ Paris Est Creteil, INSERM, IMRB, F-94010 Creteil, France, 2Ecole nationale vétérinaire d'Alfort, IMRB, F-94700 Maisons-Alfort, France, 3EFS, IMRB, F-94010 Creteil, France, 4AP-HP, Hopital Mondor, Service d'histologie, F-94010 Creteil, France
* These authors contributed equally

Summary

שרירי השלד מורכבים ממספר סוגי תאים, כולל תאי גזע תושבים, שלכל אחד מהם תרומה מיוחדת להומאוסטזיס והתחדשות שרירים. כאן מתוארת התרבית הדו-ממדית של תאי גזע שריריים ונישת תאי השריר בסביבה ex vivo המשמרת רבים מהמאפיינים הפיזיולוגיים, in vivo וסביבתיים.

Abstract

שרירי השלד הם הרקמה הגדולה ביותר בגוף ומבצעים תפקודים רבים, החל מתנועה ועד בקרת טמפרטורת הגוף. תפקודו והחלמתו מפציעות תלויים במספר רב של סוגי תאים ובאותות מולקולריים בין תאי שריר הליבה (מיופייבר, תאי גזע שריריים) לבין הנישה שלהם. רוב סביבות הניסוי אינן משמרות את המיקרו-סביבה הפיזיולוגית המורכבת הזו, והן גם אינן מאפשרות מחקר אקס ויו של תאי גזע שריריים במצב תא, מצב תאי חיוני עבורם. כאן, פרוטוקול מתואר עבור תרבית ex vivo של תאי גזע שריר עם רכיבים תאיים של הנישה שלהם. באמצעות פירוק מכני ואנזימטי של השרירים, מתקבלת תערובת של סוגי תאים, אשר מוכנס לתרבות דו-ממדית. Immunostaining מראה כי בתוך שבוע אחד, תאי נישה מרובים נמצאים בתרבית לצד myofibers, וחשוב מכך, תאים חיוביים Pax7 המציגים את המאפיינים של תאי גזע שריר שקט. תכונות ייחודיות אלה הופכות פרוטוקול זה לכלי רב עוצמה להגברת תאים וליצירת תאי גזע דמויי שקט שניתן להשתמש בהם כדי לענות על שאלות בסיסיות ותרגומיות.

Introduction

תנועה, נשימה, חילוף חומרים, תנוחת הגוף ושמירה על טמפרטורת הגוף תלויים כולם בשרירי השלד, ותקלות בשרירי השלד יכולות, לפיכך, לגרום לפתולוגיות מתישות (כלומר, מיופתיות, ניוון שרירים וכו '). 1. לאור תפקודיו החיוניים ושפעו, שרירי השלד משכו את תשומת ליבן של מעבדות מחקר ברחבי העולם השואפות להבין את ההיבטים המרכזיים התומכים בתפקוד תקין של השרירים ויכולים לשמש כמטרות טיפוליות. בנוסף, שרירי השלד הם מודל בשימוש נרחב לחקר התחדשות ותפקוד תאי גזע, שכן שריר בריא יכול לתקן את עצמו באופן מלא לאחר פציעה וניוון מוחלטים, בעיקר בשל תאי הגזע השוכנים בו2; אלה נקראים גם תאי לוויין והם ממוקמים מתחת ללמינה הבסיסית בפריפריה של סיבי השריר3.

תאי הליבה של שרירי השלד הבוגרים הם המיופייבר (תאים רב-גרעיניים סינסיטיאליים ארוכים) ותאי הלוויין (תאי גזע בעלי פוטנציאל מיוגני, שקטים עד שפציעה מפעילה אותם). התאים האחרונים הם התאים המרכזיים של התחדשות השריר, ותהליך זה אינו יכול להתרחש בהיעדרם 4,5,6,7. במיקרו-סביבה הקרובה שלהם, ישנם מספר סוגי תאים וגורמים מולקולריים שמאותתים להם. נישה זו מתבססת בהדרגה לאורך ההתפתחות ועד לבגרות8. שריר בוגר מכיל סוגי תאים מרובים (תאי אנדותל, פריציטים, מקרופאגים, אבות פיברו-אדיפוגניים-FAPs, תאי T רגולטוריים וכו ') 9,10 ורכיבי מטריצה חוץ-תאיים (למינינים, קולגן, פיברונקטין , פיברילינים, פריוסטין וכו') 11 המקיימים אינטראקציה זה עם זה ועם תאי הלוויין בהקשר של בריאות, מחלות והתחדשות.

שימור נישה מורכבת זו במסגרות ניסיוניות הוא בסיסי אך מאתגר. קשה לא פחות הוא לשמור או לחזור למצב שקט, מצב תאי שהוא קריטי עבור תאי לוויין9. הוכנסו מספר שיטות להתמודדות חלקית עם אתגרים אלה, כל אחת על יתרונותיה וחסרונותיה (המפורטת בחלק הדיון). כאן מוצגת שיטה שיכולה להתגבר חלקית על שני המחסומים הללו. השרירים נקצרים בתחילה ולאחר מכן מפורקים באופן מכני ואנזימטי לפני הכנסת תערובת התאים ההטרוגניים לתרבית. במהלך התרבית מתגלים סוגי תאים רבים של הגומחה ונצפים תאי לוויין שחזרו לשקט. כשלב אחרון של הפרוטוקול, מוצגים השלבים האימונופלואורסנטיים המאפשרים זיהוי של כל סוג תא באמצעות שימוש בסמנים מקובלים אוניברסליים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הניסויים עמדו בתקנות בעלי החיים של צרפת והאיחוד האירופי במכון Mondor de Recherche Biomédicale (INSERM U955), ובמיוחד ההנחיה 2010/63/UE. בעלי החיים הוחזקו בסביבה מבוקרת ומועשרת במתקני בעלי החיים עם מספרי הסמכה A94 028 379 ו-D94-028-028; הם טופלו רק על ידי חוקרים מוסמכים ומטפלים בבעלי חיים, והם נבדקו חזותית על ידי אנשי דיור לבעלי חיים לסימנים של אי נוחות במהלך חייהם. הם הומתו על ידי פריקת צוואר הרחם לפני הנתיחה. לא בוצעו הליכים התערבותיים במהלך חיי בעלי החיים; לפיכך, לא היה צורך בקבלת אישור להליך מוועדת אתיקה וממשרד ההשכלה הגבוהה, המחקר והחדשנות הצרפתי. אכן, לא נדרש אישור אתי להמתת חסד ולנתיחה לאחר המוות על פי ההנחיה 2010/63/UE. התוצאות המוצגות בכתב יד זה הן מקו C57BL/6NRj מסוג פרא (ראה טבלת חומרים) ומהקו המהונדס Tg:Pax7-nGFP 12 (שגודל על ידי הצוות שלנו). הפרוטוקול יושם על עכברים זכרים ונקבות בגילאי 8-12 שבועות.

1. מגיב וציוד הכנת מראש העיכול

  1. רססו את כלי הדיסקציה (מספריים ישרים ומעוקלים, מלקחיים, ראו טבלת חומרים) באתנול 70%, וייבשו אותם בנייר. מצפים צלחת שעם ברדיד אלומיניום, ושומרים בקרבת מקום צלחות פטרי בקוטר 10 ס"מ (אחת לכל חיה). יש נייר ו-70% אתנול בהישג יד.
    הערה: בסוף הדיסקציה יש לשטוף את כלי הדיסקציה במים, לרסס אותם באתנול 70% ולייבש אותם בנייר.
  2. הגדר אמבט מים מסתובב ל 37 ° C, והכן את תערובת העיכול (20 מ"ל / חי) על ידי שילוב DMEM עם 1% פניצילין-סטרפטומיצין, 0.5 U/mL collagenase, 3 U/mL dispase (ראה טבלה של חומרים), ו 0.2% BSA ב 50 מ"ל tube(s).
  3. מעבירים את תערובת העיכול דרך מסנן של 0.22 מיקרומטר במכסה מנוע של תרבית תאים.
    הערה: מומלץ להכין את תערובת העיכול טרי בכל פעם.

2. ריאגנטים והכנת ציוד לאחר העיכול

  1. לאחר העיכול, התערובת יכולה להיות קפואה או בתרבית. להקפאה, להכין 10% DMSO: 90% סרום בקר עוברי (FBS), כמו גם קבוצה של cryotubes (1 מ"ל של השעיית תאים לכל 2 מ"ל cryotube). עבור התרבית, להכין מדיום תרבית (DMEM בתוספת 1% פניצילין-סטרפטומיצין, 4 ng / mL bFGF, ו 20% FBS) וקבוצה של 8 צלחות באר. יש לצפות את הלוחות לפני ציפוי התאים (פרטים מפורטים בשלב 7.1).
  2. עבור הצביעה, הכינו 4% פרפורמלדהיד (PFA) במי מלח חוצצי פוספט (PBS) (0.15 מ"ל/באר של צלחת 8 בארות) ותמיסת חסימה (אלבומין בסרום בקר 5% ללא IgG [BSA] ב-PBS; 0.15 מ"ל/באר של צלחת 8 הקידוחים).
    אזהרה: אין לנשום את אבקת ה-PFA; הכינו וטפלו בו מתחת למכסה מנוע כימי.

3. דיסקציה

  1. רססו את בעל החיים שעבר המתת חסד באתנול 70%. בצע חתך אופקי (צד שמאל של הגוף לצד ימין) עם מספריים גדולים בגובה הבטן, ולחתוך סביב המותניים. משכו את העור מהגפיים האחוריות כדי לחשוף את השרירים (איור 1A).
  2. הניחו את בעל החיים על צלחת השעם המכוסה ברדיד אלומיניום, ונעצו את הגפה הקדמית והגפה האחורית הנגדיות. הסירו במהירות את כל שרירי הגפיים האחוריות (מלפנים ומאחור) לתוך צלחת פטרי בקוטר 10 ס"מ שהונחה על קרח (איור 1B,C). יש להקפיד במיוחד להסיר את רקמת השומן מהאזורים סביב הארבע ראשי והשרירים האחוריים. ניתן גם להסיר פאשיה, עצבים וגידים בשלב זה אם זה לא פוגע בזמן הכולל המושקע בדיסקציה.
    הערה: זמן דיסקציה אופטימלי עבור שתי הגפיים האחוריות צריך להיות סביב 15-20 דקות. מומלץ כי זמן הנתיחה אינו עולה על 30 דקות.
  3. הוסף טיפות DMEM לשרירים מדי פעם כדי לשמור אותם לחים, אבל לא יותר מדי, כמו זה יהפוך את חיתוך קשה. חזור על הפעולה עבור הגפה האחורית השנייה. ברגע שכל השרירים של חיה אחת נמצאים בצלחת הפטרי (איור 1D), קצצו אותם דק עם מספריים במשך 7-10 דקות כדי לקבל הומוגנט חלק (איור 1E).
    הערה: בפרוטוקול זה, DMEM בתוספת L-גלוטמין, פירובט, ו 4.5 גרם / L D-גלוקוז משמש.

Figure 1
איור 1: הכנת שרירים לפני תרבית. (A) העור מוסר כדי לחשוף את שרירי הגפיים האחוריות, כמתואר בשלב 3.1. (ב,ג) כל שרירי הגפיים האחוריות נקצרים (B) סביב ו-(C) בין העצמות, כמתואר בשלב 3.2. (D) השרירים שנקטפו מונחים בצלחת פטרי בקוטר 10 ס"מ על קרח עם טיפות DMEM כדי לשמור עליהם לחים, כמתואר בשלב 3.3. (E) השרירים קצוצים דק במספריים עד לקבלת עיסה חלקה עם העקביות המתוארת בתמונה זו. (ו) תמונה של הגלולה לאחר הצנטריפוגה הסופית; החץ הכחול מדגיש את הכדור, שנמצא כנגד הצינור, מתחת לקו הכחול המקווקו. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

4. עיכול

הערה: בסוף העיכול, צנטריפוגה ב 4 ° C, דלי קרח, שלוש מסננות תאים (100 אום, 70 אום, 40 אום), ושלושה צינורות 50 מ"ל (לכל חיה) נדרשים עבור סעיף 5.

  1. הכן וסנן את תערובת העיכול כמתואר בשלב 1.2. שומרים את התערובת על קרח.
  2. לאחר שכל השרירים קצוצים, מניחים את הומוגנט בצינור 50 מ"ל עם 20 מ"ל של תערובת העיכול. עטפו את שולי המכסה בסרט גמיש למניעת דליפה, והכניסו את הצינור לאמבט מים מטלטל בטמפרטורה של 37°C במהירות נמוכה עד בינונית (50 סל"ד).
  3. לאחר שעה אחת בטמפרטורה של 37°C, יש לפתוח את המכסה ולערבב בעדינות שבע פעמים למעלה ולמטה עם פיפטה של 10 מ"ל לקבלת תערובת הומוגנית. מרחו סרט חדש סביב המכסה, והחזירו אותו לאמבט המים הרועדים. לאחר שעה, הסר את הצינור וכבה את האמבטיה.
    הערה: עבור תרבית, השתמש בזמן דגירה זה כדי לצפות את הצלחות כמתואר בשלב 7.1 לפני המעבר לסעיף 5.

5. סינון

  1. מלא את צינור העיכול עם DMEM קר (בתוספת 1% פניצילין-סטרפטומיצין) עד 50 מ"ל. מערבבים על ידי היפוך הצינור שלוש פעמים. שמור את DMEM בדלי קרח לשלבים הבאים.
  2. הניחו מסננת תאים של 100 מיקרומטר על צינור חדש של 50 מ"ל. מעבירים את התערובת המעוכלת דרך מסננת התאים לתוך הצינור החדש. צנטריפוגה ב 600 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. יוצקים את הסופרנאטנט לתוך מיכל פסולת נוזלית.
  3. להשעות את הגלולה ב 1 מ"ל של DMEM קר (בתוספת 1% פניצילין-סטרפטומיצין). מלא את הצינור עד 50 מ"ל עם אותו DMEM. הערה: אם מדלגים על הצנטריפוגה, יהיה קשה יותר לזהות ולתחזק את הגלולה הבאה.
  4. הניחו מסננת תאים של 70 מיקרומטר על צינור חדש של 50 מ"ל. העבירו את תערובת הצנטריפוגות/מרחפים דרך מסננת התא לתוך הצינור החדש. צנטריפוגה ב 80 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C.
    הערה: שלב זה אינו חובה, אך מומלץ לסלק פסולת תאים.
  5. הניחו מסננת תאים בגודל 40 מיקרומטר על צינור חדש של 50 מ"ל. העבירו את הסופרנאטנט דרך מסננת התא לתוך הצינור החדש. צנטריפוגה ב 600 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C, לשפוך את supernatant לתוך מיכל פסולת נוזלית, ולהשעות מחדש את הגלולה ב FBS מתחת מכסה המנוע תרבית. הגלולה קטנה מאוד בשלב הזה (איור 1F).
    הערה: סינון דרך מסננת 40 מיקרומטר מסיר פסולת, אשר ייתן אות לא ספציפי בצביעה מאוחרת יותר של התרביות.

6. הקפאה (אופציונלית)

הערה: סעיף 6 הוא אופציונלי. ניתן להשהות את הפרוטוקול לאחר הסינון, אך זה יכול להפחית את הישרדות התא ואת הצלחת התרבית.

  1. הוסף DMSO כדי לקבל יחס של 10% DMSO:90% FBS, והעבר ל- cryotubes (1 מ"ל של גלולה תלויה לכל 2 מ"ל cryotube).
  2. הניחו את צינור ההקפאה בטמפרטורה של -80°C בקופסת פוליסטירן למשך הלילה. עבור ל -150 ° C למחרת לאחסון לטווח ארוך.
    הערה: אחסון לטווח קצר ב -80 ° C אפשרי גם.
  3. בעת הפעלת התרבית, הפשיר את צינור ההקפאה במהירות באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס עד שתרחיף התא יפשיר. מערבבים עם 4 מ"ל DMEM מתחת למכסה המנוע של התרבית. סחור ב 600 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. פיפטה החוצה את supernatant, ולהמשיך כמתואר בשלב 7.2.

7. טיפוח

הערה: מתלי תאים קפואים או טריים צפויים למלא 24-32 בארות של שלוש עד ארבע צלחות 8 בארות.

  1. מצפים צלחות 8 בארות בתמיסת הציפוי, אותה יש להפשיר ב -4 מעלות צלזיוס או על קרח (תמיסת ציפוי מלאי נשמרת בדרך כלל ב -20 מעלות צלזיוס). מוסיפים 0.4 מ"ל של תמיסת ציפוי לבאר אחת, ומפיפטים אותה מבאר לבאר. לאחר העברת תמיסת הציפוי דרך כל הבארות, ניתן לאסוף אותה מחדש ולהקפיא אותה מחדש לתרבויות עתידיות. שמרו את הלוחות המצופים בטמפרטורה של 37°C למשך 30 דקות לפני ציפוי התאים.
  2. הוסף DMEM (בתוספת 1% פניצילין-סטרפטומיצין) בתוספת bFGF של 4 ננוגרם/מ"ל (ראה טבלת חומרים) לתרחיף תאי FBS כדי לקבל יחס DMEM של 20% FBS:80%.
    הערה: למרות שהתוספת של bFGF יכולה להועיל בתרביות מיובלסטים ראשוניות ובייצור תאים דמויי לוויין בתרביות בתפזורת, הוספתו היא אופציונלית, מכיוון שהשמטתו בתרביות בתפזורת של ~7 ימים אינה פוגעת קשות בתפוקת התא.
  3. צלחת 0.4 מ"ל של המתלה לכל באר (משלב 7.2) בצלחות 8 בארות מצופות.
    הערה: חישוב 30 ס"מ2 של תרבית לכל בעל חיים עבור תכשירים קפואים וטריים.
  4. לדגור את התרביות ב 37 ° C עם 5% CO2 עד 10 ימים, שינוי המדיום כל יום לאחר התרבות מתחיל להשתנות לצבע צהבהב (בדרך כלל 5-7 ימים).
    הערה: כדי לכמת תאים בשלב S של מחזור התא13, הוסף 10 μM EdU שעתיים לפני הקיבוע. כדי ללכוד את שלב ה-S הראשון, הוסיפו 10 μM EdU מהציפוי וקבעו בתרבית של 40 שעות.

8. קיבעון

הערה: מקטעים 8-10 צריכים להתבצע בטמפרטורת החדר, אלא אם צוין אחרת.

  1. פיפטה החוצה את מדיום התרבית, ולתקן את התאים עם 4% PFA (0.15 מ"ל / טוב).
    אזהרה: יש להוסיף PFA מתחת למכסה מנוע כימי.
    הערה: אם כל הבארות קבועות בו זמנית, יש לדגור עם PFA בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. אם הבארות קבועות בנקודות זמן שונות, הוסף PFA לבארות שיש לתקן, ושמור את הצלחת באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
  2. פיפטה החוצה את PFA, ולהוסיף PBS עבור 10 שניות (0.15 מ"ל / טוב). פיפטה החוצה PBS, ולהוסיף PBS טרי במשך 5 דקות (0.15 מ"ל / טוב).
    הערה: אם כל הבארות קבועות בו זמנית, לדגור עם PBS בטמפרטורת החדר. אם הבארות קבועות בנקודות זמן שונות, הוסף PBS לבארות הקבועות, ושמור את הצלחת באינקובטור ב 37 ° C למשך 5 דקות. לאחר מכן, להוסיף 0.4 מ"ל של PBS, ולשמור את הצלחת באינקובטור עד 1 שבוע.

9. חדירה וחסימה

  1. כאשר הוא מוכן להכתים, יש לשטוף את ה-PBS ולחדור עם 0.5% TritonX 100 ב-PBS (0.15 מ"ל/באר) למשך 8 דקות. פיפטה החוצה את TritonX 100, לשטוף עם PBS במשך 10 שניות (0.15 מ"ל / טוב), פיפטה החוצה, PBS, ולשטוף עם PBS במשך 5 דקות (0.15 מ"ל / טוב).
  2. חסום עם 5% BSA ללא IgG ב- PBS למשך 30-60 דקות (0.15 מ"ל / טוב).

10. צביעה

  1. פיפטה החוצה את BSA, ולהוסיף את תערובת הנוגדנים הראשונית מדוללת PBS (0.15 מ"ל / באר) (ראה טבלת החומרים; דילולים: anti-CD31 1:100, anti-FOSB 1:200, anti-GFP 1:1,000, anti-KI67 1:1,000, anti-MyHC 1:400, anti-MYOD 1:200, anti-MYOG 1:150, anti-PAX7 1:100, anti-PDGFRa 1:50) לדגירת לילה ב 4 ° C.
    הערה: לאחר דגירה של נוגדנים, יש לאסוף את תערובת הנוגדנים, להוסיף נתרן אזיד ולשמור על טמפרטורה של 4°C או -20°C (בהתאם להוראות יצרן הנוגדנים) לשימוש חוזר עתידי.
  2. פיפטה החוצה את תערובת הנוגדנים, לשטוף עם PBS במשך 10 s (0.15 מ"ל / טוב), פיפטה החוצה, PBS, ולשטוף עם PBS במשך 5 דקות (0.15 מ"ל / טוב).
  3. יש להוציא את PBS הכביסה, להוסיף את תערובת הנוגדנים המשנית (עז נגד עכבר Alexa Fluor 488, עז נגד ארנב Alexa Fluor 555, עז נגד חולדה Alexa Fluor 647, עז נגד עכבר Alexa Fluor 555, עז נגד עוף Alexa Fluor 488, כולם בשימוש בדילול של 1:500-1,000) וסמן גרעין (למשל, DAPI) מדולל PBS (0.15 מ"ל / באר) (ראה טבלת חומרים), ולדגור במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר, מוגן מפני אור.
  4. פיפטה החוצה את תערובת הנוגדנים המשנית, לשטוף עם PBS במשך 10 שניות (0.15 מ"ל / טוב), פיפטה החוצה PBS, לשטוף עם PBS במשך 5 דקות (0.15 מ"ל / טוב), פיפטה החוצה, PBS, ולהרכיב.
    הערה: אם משתמשים בצלחות בנות 8 בארות עם מפרידים נשלפים, יש לקלף את המפרידים לפני ההרכבה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

פרוטוקול זה מאפשר תרבית תאי שריר תוך שימור תאי הלוויין ורוב התאים מהנישה האנדוגנית שלהם. איור 2 מסכם את השלבים העיקריים של הפרוטוקול, בעוד שחלקים חיוניים של הדיסקציה והעיכול מוצגים באיור 1. מומלץ לבצע דיסקציה של שרירי הגפה האחורית (איור 1A-C), מאחר שקבוצת שרירים זו נחקרת היטב וחולקת מקור התפתחותי והיררכיות מולקולריות14. מומלץ להכין את כל התערובות בתנאים סטריליים. בנוסף, זיהום תרבית נמוכה יותר הבחין כאשר תערובת העיכול הועברה דרך מסנן 0.22 מיקרומטר מתחת למכסה מנוע של תרבית תאים.

כאשר מצפים 1/30 של הכנה בתפזורת על 1 ס"מ מצופה2 צלחות באר, תאים מוארכים נראים 3-4 ימים לאחר תחילת התרבית. עם זאת, זה עשוי להשתנות בהתאם לריכוז התא, ותאים מוארכים עשויים להתחיל להופיע מאוחר יותר, במיוחד כאשר מרחיבים תכשירים בתפזורת קפואה. כעבור כ-7 ימים, המדיום היה אמור להפוך לצהוב, ובשלב זה נדרשים שינויים יומיים במדיום. בנוסף, בשלב זה, הבארות צריכות להיות מכוסות בצינורות מיו. תאי האנדותל מהווים חלק קטן מהתרבית. האינדיקציה העיקרית לתרבית מוצלחת היא שפע תאי PAX7+, שעשויים לדרוש קיבוע והכתמה. מודל עכבר נוח שניתן להשתמש בו במידת האפשר הוא Tg:Pax7-nGFP שורה12, המאפשר הדמיה של חיוביות PAX7 בצורה של ביטוי GFP; לפיכך, תאי הלוויין יכולים להיות מזוהים בקלות על ידי הכתב GFP. ניתן לצפות ב-GFP בהגדלה של פי 20 במיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי הפוך, ובכך לאפשר ניתוח של הצלחת התרבות בזמן שהתרבות נמשכת. זה גם מאפשר הדמיה חיה של תאי PAX7-GFP בתרביות בתפזורת. אסור להשאיר תרבויות יותר מ-10 ימים. לאחר מכן, תאי המילואים מתחילים לרדת במספרים, ואת myotubes עשוי להתנתק מן הצלחת. תרביות כושלות, כולל בהתבסס על ניסיון עדכני עם תרביות מתאים קפואים, עדיין יכולות לייצר חלק גדול מהסיבים אך מעט מאוד תאי PAX7-GFP. בעת שימוש בעכברים ללא סמן פלואורסצנטי עבור PAX7, יש צורך לבצע צביעה כדי להעריך את היעילות של ייצור תאי מילואים.

הנוגדנים הבאים נבדקו ועובדים היטב עם פרוטוקול הצביעה המוצג בסעיף 10 לפרוטוקול: anti-PAX7 (סמן של תאי לוויין ומיובלסטים מופעלים 15; גם סמן של תאי מילואים המופיעים בתרבית זו), אנטי-מיוזין (סמן של מיו-צינוריות15), אנטי-CD31 (סמן של תאי אנדותל16), אנטי-GFP (אם משתמשים בעכברי כתב), anti-MYOD (סמן של מיובלסטים 15), anti-MYOG (סמן של מיוציטים מתמיינים 15), anti-KI67 (סמן של תאים מתרבים17), ואנטי PDGFRα (סמן של FAPs15). איור 3 מראה תאים מיוגניים ותאי נישה לאחר 7 ימים בתרבית. באיור 3A-C, נפחי שריר גודלו בתרבית מעכברי בר, בעוד שבאיור 3D-F נפחי שריר תורבתו מקו Tg:Pax7-nGFP שהוזכר לעיל. צביעה כפולה עם PAX7 ו-KI67 (איור 3A) אפשרה לסמן את תאי הרזרבה שהופיעו לאחר 5 ימים בתרבית והיו להם מאפיינים של תאי גזע שריריים, כמו למשל יציאה ממחזור התא (מצב KI67) ולוקליזציה כ"לוויינים" לצינורות המיו-צינור שנוצרו. צביעה כפולה עם MyHC ו-MYOG (איור 3B,D,E) אפשרה לסמן את התאים שהתקדמו באמצעות התמיינות שרירים, וכך ביטאו בהדרגה MYOG ואז התמזגו ליצירת MyHC+ myotubes מרובי גרעינים. צביעה עם CD31 או PDGFRα אפשרה סימון תאי נישה (איור 3C), כגון תאי אנדותל ותאי FAPs. איור 3D,E מראה תאי רזרבה מתפתחים המסומנים על-ידי GFP. צביעה משותפת עם GFP ו-MyHC אפשרה להעריך את מיקום תאי הלוויין של תאי המילואים (איור 3E), בעוד שצביעה משותפת עם GFP וסמני הפעלה/התמיינות אחרים אפשרה להעריך את האופי דמוי השקט של תאי המילואים (איור 3F).

Figure 2
איור 2: סקירה כללית של שלבי הפרוטוקול. (א-ד) שלבים עוקבים של (A) דיסקציה, (B) עיכול, (C) סינון ו-(D) תרבית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: צביעה חיסונית של אוכלוסיות תאים. (A) אימונופלואורסנציה של תאים מיוגניים (מסומנים ב-PAX7; ירוק) ומחזוריים (מסומנים ב-KI67; אדום). הגרעינים מוכתמים ב-DAPI (כחול). נוכחותם של תאים מיוגניים שאינם מחזוריים (KI67-PAX7+) מראה כי הפרוטוקול יכול לייצר תאים דמויי שקט מעכברי בר הנמצאים בשפע לאחר 7 ימי תרבית. (B) אימונופלואורסנציה של צינוריות מיו-צינוריות (מסומנות בשרשרת מיוזין כבדה [MyHC]; ירוק) ומיוציטים (מסומנות ב-MYOG; אדום) לאחר 7 ימים של תרבית תאים מעכברי בר. הגרעינים מוכתמים ב-DAPI (כחול). (C) אימונופלואורסנציה של תאים מיוגניים (מסומנים ב-PAX7; ירוק), אבות פיברו-אדיפוגניים מזנכימליים (מסומנים ב-PDGFRa; אדום) ותאי אנדותל (מסומנים ב-CD31; מגנטה) לאחר 7 ימי תרבית של תאים מעכברי בר. גרעינים מוכתמים ב-DAPI (כחול). (D) אימונופלואורסצנטיות של תאי GFP+ (ירוקים) ומיוציטים (מסומנים על ידי MYOG; מגנטה) לאחר 8 ימים של תרבית תאים מעכברי Tg:Pax7-nGFP , שבהם תאים המבטאים PAX7 מסומנים על ידי GFP גרעיני. (E) אימונופלואורסנציה של תאי GFP+ (ירוק) ומיו-צינוריות (מסומנות ב-MyHC; אדום) לאחר 7 ימים של תרבית תאים מעכברי Tg:Pax7-nGFP . שימו לב שהתאים דמויי תאי הלוויין מופיעים בתרבית לאחר 7 ימים. (F) כימות של יחס תאי GFP+ המבטא יחד סמנים של תאי לוויין (PAX7), הפעלה (FOSB), התפשטות (KI67) או התמיינות מיוגנית (MYOD, MYOG). קווי השגיאה מציינים את סטיית התקן. סרגל קנה מידה: 100 אממ. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

תפקוד שרירי השלד הבוגרים מבוסס על מערכת מתוזמרת היטב של אינטראקציות תאיות ואותות מולקולריים. כאן, מוצגת שיטה המאפשרת ללמוד פרמטרים אלה בסביבה ex vivo הדומה מאוד microenvironment פיזיולוגי.

מספר קבוצות דיווחו על שיטות במבחנה לתרבית תאים מיוגניים. שיטות אלה נועדו לבודד תאי לוויין כדי לחקור את תכונות האב המיוגניות שלהם. שתי גישות עיקריות משמשות לבידוד תאי לוויין טהורים, או מתרביות של סיבים מבודדים משרירי סולאוס ו/או EDL18או מתאי לוויין מבודדים ב-FACS, משרירים בתפזורת, תוך שימוש בלוח נוגדנים עבור Pax7, CD34 ו-a7-integrin לברירה חיובית ו-CD45, CD31 ו-Sca1 לברירה שלילית 19,20,21 . אחרים השתמשו גם בברזים מכניים כדי לבודד מיובלסטים ראשוניים מתרביות בתפזורת על לוחות מצופים ג'לטין בשל תכונות ההדבקה השבירות שלהם בהשוואה לתאים אחרים כגון FAPs22,23. בעוד שגישות אלה מתאימות לחקר ההפעלה של תאי לוויין או להרחבתם בתרבית, התאים גדלים בסביבה נטולת התאים התומכים שבדרך כלל תורמים לנישה שלהם. בנוסף, גישות אלה דורשות שמירה על האבות המיוגניים במשך יותר משבועיים כדי להקים תאי מילואים חד-גרעיניים שקטים עם ביטוי Pax7 גבוה18. כמו כן דווח על תרביות משותפות של תאי לוויין וסוגי תאים אחרים, כגון מקרופאגים. זה איפשר לחקור את התרומה הישירה של תא מסוים לתכונות מיוגניות כגון התפשטות, התמיינות ואיחוי24. מספר מחקרי RNA-seq חד-תאיים פירטו את ההרכב התאי של שריר השלד25,26. מכיוון שתנאי התרבית שלנו מעדיפים יצירת תאים מיוגניים, ראינו שיעור גבוה בהרבה של תאי מילואים ושיעור נמוך יותר של תאי תמיכה בתרביות בתפזורת בהשוואה למחקרי in vivo אלה.

זוהו שלושה שלבים קריטיים בשיטה המתוארת כאן שיכולים להגביר את היעילות. ראשית, קיצוץ מהיר ויעיל הוא הכרחי כדי להבטיח דיסוציאציה אופטימלית של שרירים במהלך 2 שעות של עיכול, ולאחר מכן, תפוקת תאים גבוהה יותר. שנית, סיבוב רציף במהלך העיכול חשוב מאוד כדי להבטיח את הדיפוזיה הנכונה של האנזימים דרך הרקמה. לבסוף, דיסוציאציה מכנית עדינה חשובה גם לדיסוציאציה אופטימלית של רקמות.

ישנן ארבע מגבלות עיקריות של פרוטוקול זה. ראשית, היא נשארת מערכת ex vivo, כלומר רמזים פיזיולוגיים וביופיזיים מסוימים עשויים ללכת לאיבוד או להשתנות. זה כולל איתות אל / מסיבי השריר, מכיוון שהסיבים הולכים לאיבוד לפני הציפוי, וצינורות השריר נבנים מחדש במהלך התרבית. שנית, נותר לראות אם לצינורות העצם שנוצרו יש מאפיינים עובריים או בוגרים והאם הם מייצגים את סוגי הסיבים השונים בשרירים איטיים ומהירים. לשם השוואה, תרביות של קו תאי השריר C2C12 ושל מיובלסטים אנושיים הראו כי צינורות מיובלסטים בתרבית דו-ממדית הם פחות בוגרים מעמיתיהם in vivo 27,28, בעוד שתרביות מיובלסטים ראשוניים של עכברים מובילים לסוגי מיוזין המייצגים את אלה שנמצאו ב-vivo 29. שלישית, בשיטה זו, התאים מאבדים את מיקומם באתרם במהלך דיסוציאציה של רקמות, והצינורות החדשים שנוצרו חסרים צמתים עצביים-שריריים ומיוטנדיניים; לפיכך, תוצאות על תכונות מרחביות יש לפרש בזהירות. רביעית, הפרוטוקול המוצג הותאם לשרירים בוגרים בריאים, אך ייתכן שיהיה צורך בהתאמות אם חומר המוצא מקורו בשרירים מזדקנים או מיופתיים המציגים פיברוזיס נרחב, שקיעה אדיפוגנית מוגברת או הפעלת תאים פגומה.

רוב המגבלות הללו משותפות לשיטות אחרות של מחקרי שרירי ex vivo, אך לפרוטוקול זה יש מספר יתרונות על פניהן. זהו הפרוטוקול היחיד המאפשר קצירת מספר רב של תאי לוויין עתודות דמויי שקט. בנוסף, היא מייצגת שיטה זולה ופשוטה שאינה דורשת את תנאי התרבית המיוחדים או המומחיות הקשורים לתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים, תאי גזע עובריים, תרבית מיוספרה או תרבית אורגנואידים. יתר על כן, תרבית הצובר אינה תלויה בתשתית המסובכת ובתקינה הקשורה לתרביות של תאים מיוגניים בהידרוג'לים או פיגומים אחרים. בהשוואה לתרביות של מיוסיבים מבודדים, תאים ראשוניים שבודדו ב-FACS, או תאים ראשוניים מועשרים בציפוי מראש, התרבית בתפזורת משמרת יותר אוכלוסיות תאים שנמצאות בסביבת השרירים הפיזיולוגית. תאים אלה עוברים דרך מסלול פיזיולוגי יחסית של הפעלה והתמיינות המונעים על ידי גורמי הגדילה של מדיום התרבית ולא על ידי האותות הקיצוניים ויוצאי הדופן מארס הנחשים המשמשים בדרך כלל לחקר התחדשות שרירים in vivo30,31. לבסוף, תרבית התאים המוצגת היא יתרון על פני שימוש בתאי C2C12, אשר, כמו בכל קו תאים, יש שינויים גנטיים בהשוואה לתאים אנדוגניים או ראשוניים.

היתרונות הנ"ל הופכים פרוטוקול זה לכלי רב עוצמה ליישומים כגון הגברה של תאים ויצירת מאגר תאי לוויין דמוי שקט, הנחוצים לפיתוח טיפולים תאיים או אפילו לענות על שאלות בסיסיות בנושא שקט וויסות תאי/מולקולרי. בנוסף, ניתן להשתמש בפרוטוקול כדי לשנות איתות מולקולרי באמצעות תרופות, מיקוד siRNA, או טרנספקציה עם וקטורים (פלסמיד, וירוסים) הגורמים לביטוי יתר או ביטוי של צורות שליליות דומיננטיות של גורמי העניין.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים.

Acknowledgments

עבור איור 2 נעשה שימוש בתבניות מ-Servier Medical Art (https://smart.servier.com/). מעבדת FR נתמכת על ידי האגודה הצרפתית contre les Myopathies - AFM באמצעות TRANSLAMUSCLE (מענקים 19507 ו- 22946), Fondation pour la Recherche Médicale - FRM (EQU202003010217, ENV202004011730, ECO201806006793), Agence Nationale pour la Recherche - ANR (ANR-21-CE13-0006-02, ANR-19-CE13-0010, ANR-10-LABX-73), ו- La Ligue Contre le Cancer (IP/SC-17130). למממנים הנ"ל לא היה כל תפקיד בעיצוב, באיסוף, בניתוח, בפרשנות או בדיווח של מחקר זה או בכתיבת כתב יד זה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
anti-CD31 BD 550274 dilution 1:100
anti-FOSB Santa Cruz sc-7203 dilution 1:200
anti-GFP Abcam ab13970 dilution 1:1000
anti-Ki67 Abcam ab16667 dilution 1:1000
anti-MyHC DSHB MF20-c dilution 1:400
anti-MYOD Active Motif 39991 dilution 1:200
anti-MYOG Santa Cruz sc-576 dilution 1:150
anti-Pax7 Santa Cruz sc-81648 dilution 1:100
anti-PDGFRα Invitrogen PA5-16571 dilution 1:50
b-FGF Peprotech 450-33 concentration 4 ng/mL
Bovine serum albumin (BSA) – used for digestion  Sigma Aldrich A7906-1006 concentration 0.2%
BSA IgG-free, protease-free – used for staining Jackson ImmunoResearch 001-000-162 concentration 5%
Cell strainer 40 um Dominique Dutscher 352340
Cell strainer 70 um Dominique Dutscher 352350
Cell strainer 100 um Dominique Dutscher 352360
Collagenase Roche 10103586001 concentration 0.5 U/mL
Culture plate Sarstedt 94.6140.802
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Euromedex UD8050-05-A
Dispase Roche 4942078001 concentration 3 U/mL
Dissection forceps size 5 Fine Science Tools 91150-20
Dissection forceps size 55 Fine Science Tools 11295-51
Dissection scissors (big, straight) Fine Science Tools 9146-11 ideal for chopping
Dissection scissors (small, curved) Fine Science Tools 15017-10
Dissection scissors (small, straight) Fine Science Tools 14084-08
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) ThermoFisher 41966-029
EdU Click-iT kit ThermoFisher C10340
Fetal bovine serum – option 1 Eurobio CVF00-01
Fetal bovine serum – option 2 Gibco 10270-106 
Matrigel Corning Life Sciences 354234 coating solution
Parafilm Dominique Dutscher 090261 flexible film
Paraformaldehyde – option 1 PanReac AppliChem ITW Reagents 211511.1209 concentration 4%
Paraformaldeyde – option 2 ThermoFisher 28908 concentration 4%
Penicillin streptomycin Gibco 15140-122
Shaking water bath ThermoFisher TSSWB27
TritonX100 Sigma Aldrich T8532-500 ML concentration 0.5%
Wild-type mice Janvier C57BL/6NRj

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Frontera, W. R., Ochala, J. Skeletal muscle: A brief review of structure and function. Calcified Tissue International. 96 (3), 183-195 (2015).
  2. Forcina, L., Cosentino, M., Musarò, A. Mechanisms regulating muscle regeneration: Insights into the interrelated and time-dependent phases of tissue healing. Cells. 9 (5), 1297 (2020).
  3. Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 9 (2), 493-495 (1961).
  4. Lepper, C., Partridge, T. A., Fan, C. -M. An absolute requirement for Pax7-positive satellite cells in acute injury-induced skeletal muscle regeneration. Development. 138 (17), 3639-3646 (2011).
  5. McCarthy, J. J., et al. Effective fiber hypertrophy in satellite cell-depleted skeletal muscle. Development. 138 (17), 3657-3666 (2011).
  6. Murphy, M. M., Lawson, J. A., Mathew, S. J., Hutcheson, D. A., Kardon, G. Satellite cells, connective tissue fibroblasts and their interactions are crucial for muscle regeneration. Development. 138 (17), 3625-3637 (2011).
  7. Sambasivan, R., et al. Pax7-expressing satellite cells are indispensable for adult skeletal muscle regeneration. Development. 138 (17), 3647-3656 (2011).
  8. Hicks, M. R., Pyle, A. D. The emergence of the stem cell niche. Trends in Cell Biology. 33 (22), 112-123 (2022).
  9. Relaix, F., et al. Perspectives on skeletal muscle stem cells. Nature Communications. 12 (1), 692 (2021).
  10. Gama, J. F. G., et al. Role of regulatory T cells in skeletal muscle regeneration: A systematic review. Biomolecules. 12 (6), 817 (2022).
  11. Loreti, M., Sacco, A. The jam session between muscle stem cells and the extracellular matrix in the tissue microenvironment. NPJ Regenerative Medicine. 7 (1), 16 (2022).
  12. Sambasivan, R., et al. Distinct regulatory cascades govern extraocular and pharyngeal arch muscle progenitor cell fates. Developmental Cell. 16 (6), 810-821 (2009).
  13. Pereira, P. D., et al. Quantification of cell cycle kinetics by EdU (5-ethynyl-2'-deoxyuridine)-coupled-fluorescence-intensity analysis. Oncotarget. 8 (25), 40514-40532 (2017).
  14. Bismuth, K., Relaix, F. Genetic regulation of skeletal muscle development. Experimental Cell Research. 316 (18), 3081-3086 (2010).
  15. Yin, H., Price, F., Rudnicki, M. A. Satellite cells and the muscle stem cell niche. Physiological Reviews. 93 (1), 23-67 (2013).
  16. Lertkiatmongkol, P., Liao, D., Mei, H., Hu, Y., Newman, P. J. Endothelial functions of platelet/endothelial cell adhesion molecule-1 (CD31). Current Opinion in Hematology. 23 (3), 253-259 (2016).
  17. Scholzen, T., Gerdes, J. The Ki-67 protein: From the known and the unknown. Journal of Cellular Physiology. 182 (3), 311-322 (2000).
  18. Abou-Khalil, R., Le Grand, F., Chazaud, B. Human and murine skeletal muscle reserve cells. Stem Cell Niche. 1035, 165-177 (2013).
  19. Pasut, A., Oleynik, P., Rudnicki, M. A. Isolation of muscle stem cells by fluorescence activated cell sorting cytometry. Methods in Molecular Biology. 798, 53-64 (2011).
  20. Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nature Protocols. 10 (10), 1612-1624 (2015).
  21. Montarras, D., et al. Direct isolation of satellite cells for skeletal muscle regeneration. Science. 309 (5743), 2064-2067 (2005).
  22. Qu, Y., Edwards, K., Barrow, J. Isolation, culture, and use of primary murine myoblasts in small-molecule screens. STAR Protocols. 4 (2), 102149 (2023).
  23. Danoviz, M. E., Yablonka-Reuveni, Z. Skeletal muscle satellite cells: Background and methods for isolation and analysis in a primary culture system. Methods in Molecular Biology. 798, 21-52 (2011).
  24. Saclier, M., Theret, M., Mounier, R., Chazaud, B. Effects of macrophage conditioned-medium on murine and human muscle cells: analysis of proliferation, differentiation, and fusion. Methods in Molecular Biology. 1556, 317-327 (2017).
  25. Giordani, L., et al. High-dimensional single-cell cartography reveals novel skeletal muscle-resident cell populations. Molecular Cell. 74 (3), 609-621 (2019).
  26. Tabula Muris Consortium et al. Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris. Nature. 562 (7727), 367-372 (2018).
  27. Brunetti, J., Koenig, S., Monnier, A., Frieden, M. Nanopattern surface improves cultured human myotube maturation. Skeletal Muscle. 11 (1), 12 (2021).
  28. Denes, L. T., et al. Culturing C2C12 myotubes on micromolded gelatin hydrogels accelerates myotube maturation. Skeletal Muscle. 9 (1), 17 (2019).
  29. LaFramboise, W. A., et al. Effect of muscle origin and phenotype on satellite cell muscle-specific gene expression. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 35 (10), 1307-1318 (2003).
  30. Azhar, M., Wardhani, B. W. K., Renesteen, E. The regenerative potential of Pax3/Pax7 on skeletal muscle injury. Journal of Generic Engineering and Biotechnology. 20 (1), 143 (2022).
  31. Hardy, D., et al. Comparative study of injury models for studying muscle regeneration in mice. PLoS One. 11 (1), e0147198 (2016).

Tags

תרבית בתפזורת בלתי מפוצלת שרירי שלד עכבר נישה שקט תאי גזע פונקציונליות שרירים התאוששות שרירים סוגי תאים אותות מולקולריים מיוסיבים תאי גזע שריר מיקרו-סביבה פיזיולוגית מחקר Ex Vivo מצב שקט פרוטוקול תרבית דו-ממדית צביעת חיסון תאים חיוביים ל-Pax7 הגברת תאים יצירת תאי גזע דמויי שקט שאלות יסוד שאלות תרגום
תרבית בתפזורת בלתי מופרעת של שרירי שלד עכבר כדי לשחזר נישה ושקט תאי גזע
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zaidan, L., Geara, P., Borok, M. J., … More

Zaidan, L., Geara, P., Borok, M. J., Machado, L., Mademtzoglou, D., Mourikis, P., Relaix, F. Unfractionated Bulk Culture of Mouse Skeletal Muscle to Recapitulate Niche and Stem Cell Quiescence. J. Vis. Exp. (196), e65433, doi:10.3791/65433 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter