マウス骨格筋の未分画バルク培養によるニッチおよび幹細胞の静止を再現
Summary
骨格筋は、常在幹細胞を含む複数の細胞タイプで構成されており、それぞれが筋肉の恒常性と再生に特別な貢献をしています。ここでは、生理学的、in vivo、および環境的特性の多くを保持するex vivo環境での筋幹細胞および筋細胞ニッチの2D培養について説明します。
Abstract
骨格筋は体の中で最大の組織であり、運動から体温調節まで、複数の機能を果たします。その機能と損傷からの回復は、多数の細胞タイプと、コア筋細胞(筋繊維、筋幹細胞)とそのニッチの間の分子シグナルに依存しています。ほとんどの実験環境では、この複雑な生理学的微小環境は維持されず、筋幹細胞にとって重要な細胞状態である休止状態のex vivo 研究も許可されていません。ここでは、ニッチの細胞成分を持つ筋幹細胞の ex vivo 培養のためのプロトコルが概説されています。筋肉の機械的および酵素的分解を通じて、細胞タイプの混合物が得られ、それは2D培養に入れられます。免疫染色は、1週間以内に、筋線維、そして重要なことに、静止筋幹細胞の特徴を示すPax7陽性細胞とともに、複数のニッチ細胞が培養中に存在することを示しています。これらの独特な特性はこのプロトコルに基本的で、translational質問に演説するのに使用することができる静止そっくりの幹細胞の細胞拡大そして生成のための強力な用具をする。
Introduction
運動、呼吸、代謝、姿勢、体温の維持はすべて骨格筋に依存しており、骨格筋の機能不全は衰弱性の病状(ミオパチー、筋ジストロフィーなど)を引き起こす可能性があります。1.骨格筋は、その本質的な機能と豊富さから、正常な筋肉機能をサポートし、治療標的として役立つ重要な側面を理解しようと努力する世界中の研究機関の注目を集めています。さらに、骨格筋は、主にその常在幹細胞2により、健康な筋肉が完全な損傷や変性の後に完全に自己修復できるため、再生と幹細胞機能を研究するために広く使用されているモデルです。これらはサテライト細胞とも呼ばれ、筋線維3の周辺の基底層の下に局在している。
成人の骨格筋の中核となる細胞は、筋線維(長い合胞体多核細胞)とサテライト細胞(筋原性を有する幹細胞で、損傷によって活性化されるまで静止している)です。後者の細胞は筋肉再生の中心細胞であり、このプロセスはそれらがない場合には起こり得ません4,5,6,7。その身近な微小環境には、複数の細胞タイプとそれらにシグナルを送る分子因子があります。このニッチは、発達を通じて成人期8まで徐々に確立されます。成体筋には、複数の細胞タイプ(内皮細胞、周皮細胞、マクロファージ、線維脂肪形成前駆細胞-FAP、制御性T細胞など)が含まれています。9,10および細胞外マトリックス成分(ラミニン、コラーゲン、フィブロネクチン、フィブリリン、ペリオスチンなど)11は、健康、病気、および再生の文脈で互いに、および衛星細胞と相互作用します。
この複雑なニッチを実験環境で維持することは、基本的ではあるが困難である。同様に難しいのは、サテライトセル9にとって重要なセル状態である静止状態を維持または回復させることである。これらの課題に部分的に取り組むためにいくつかの方法が導入されており、それぞれに長所と短所があります(説明のセクションで詳しく説明します)。ここでは、これら2つの障壁を部分的に克服できる方法を紹介します。筋肉は最初に採取され、次に機械的および酵素的に分解されてから、不均一な細胞混合物が培養されます。培養の過程で、ニッチの多くの細胞タイプが検出され、静止状態に戻ったサテライト細胞が観察されます。プロトコルの最後のステップとして、広く受け入れられているマーカーを使用して各細胞タイプの検出を可能にする免疫蛍光法のステップが提示されます。
Protocol
Representative Results
Discussion
成人の骨格筋の機能は、精巧に調整された一連の細胞間相互作用と分子シグナルによって支えられています。ここでは、生理学的微小環境によく似た ex vivo 環境でこれらのパラメータの研究を可能にする方法を提示する。
いくつかのグループは、筋原性細胞を培養するためのin vitro法を報告しています。これらの方法は、サテライト細胞を単離して、その筋…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
図 2 では、Servier Medical Art (https://smart.servier.com/) のテンプレートを使用しました。FRラボは、Association Française contre les Myopathies – AFM via TRANSLAMUSCLE(助成金19507および22946)、Fondation pour la Recherche Médicale – FRM(EQU202003010217、ENV202004011730、ECO201806006793)、Agence Nationale pour la Recherche – ANR(ANR-21-CE13-0006-02、ANR-19-CE13-0010、ANR-10-LABX-73)、およびLa Ligue Contre le Cancer(IP/SC-17130)の支援を受けています。上記の資金提供者は、この研究のデザイン、収集、分析、解釈、報告、またはこの原稿の執筆に何の役割も果たしていませんでした。
Materials
| anti-CD31 | BD | 550274 | dilution 1:100 |
| anti-FOSB | Santa Cruz | sc-7203 | dilution 1:200 |
| anti-GFP | Abcam | ab13970 | dilution 1:1000 |
| anti-Ki67 | Abcam | ab16667 | dilution 1:1000 |
| anti-MyHC | DSHB | MF20-c | dilution 1:400 |
| anti-MYOD | Active Motif | 39991 | dilution 1:200 |
| anti-MYOG | Santa Cruz | sc-576 | dilution 1:150 |
| anti-Pax7 | Santa Cruz | sc-81648 | dilution 1:100 |
| anti-PDGFRα | Invitrogen | PA5-16571 | dilution 1:50 |
| b-FGF | Peprotech | 450-33 | concentration 4 ng/mL |
| bovine serum albumin (BSA) – used for digestion | Sigma Aldrich | A7906-1006 | concentration 0.2% |
| BSA IgG-free, protease-free – used for staining | Jackson ImmunoResearch | 001-000-162 | concentration 5% |
| cell strainer 40 um | Dominique Dutscher | 352340 | |
| cell strainer 70 um | Dominique Dutscher | 352350 | |
| cell strainer 100 um | Dominique Dutscher | 352360 | |
| Collagenase | Roche | 10103586001 | concentration 0.5 U/mL |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Euromedex | UD8050-05-A | |
| Dispase | Roche | 4942078001 | concentration 3 U/mL |
| Dissection forceps size 5 | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Dissection forceps size 55 | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Dissection scissors (big, straight) | Fine Science Tools | 9146-11 | ideal for chopping |
| Dissection scissors (small, curved) | Fine Science Tools | 15017-10 | |
| Dissection scissors (small, straight) | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | ThermoFisher | 41966-029 | |
| EdU Click-iT kit | ThermoFisher | C10340 | |
| Fetal bovine serum – option 1 | Eurobio | CVF00-01 | |
| Fetal bovine serum – option 2 | Gibco | 10270-106 | |
| Matrigel | Corning Life Sciences | 354234 | coating solution |
| Parafilm | Dominique Dutscher | 090261 | flexible film |
| Penicillin streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Paraformaldehyde – option 1 | PanReac AppliChem ITW Reagents | 211511.1209 | concentration 4% |
| Paraformaldeyde – option 2 | ThermoFisher | 28908 | concentration 4% |
| Shaking water bath | ThermoFisher | TSSWB27 | |
| TritonX100 | Sigma Aldrich | T8532-500 ML | concentration 0.5% |
| Wild-type mice | Janvier | C57BL/6NRj |
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