Summary
骨格筋は、常在幹細胞を含む複数の細胞タイプで構成されており、それぞれが筋肉の恒常性と再生に特別な貢献をしています。ここでは、生理学的、in vivo、および環境的特性の多くを保持するex vivo環境での筋幹細胞および筋細胞ニッチの2D培養について説明します。
Abstract
骨格筋は体の中で最大の組織であり、運動から体温調節まで、複数の機能を果たします。その機能と損傷からの回復は、多数の細胞タイプと、コア筋細胞(筋繊維、筋幹細胞)とそのニッチの間の分子シグナルに依存しています。ほとんどの実験環境では、この複雑な生理学的微小環境は維持されず、筋幹細胞にとって重要な細胞状態である休止状態のex vivo 研究も許可されていません。ここでは、ニッチの細胞成分を持つ筋幹細胞の ex vivo 培養のためのプロトコルが概説されています。筋肉の機械的および酵素的分解を通じて、細胞タイプの混合物が得られ、それは2D培養に入れられます。免疫染色は、1週間以内に、筋線維、そして重要なことに、静止筋幹細胞の特徴を示すPax7陽性細胞とともに、複数のニッチ細胞が培養中に存在することを示しています。これらの独特な特性はこのプロトコルに基本的で、translational質問に演説するのに使用することができる静止そっくりの幹細胞の細胞拡大そして生成のための強力な用具をする。
Introduction
運動、呼吸、代謝、姿勢、体温の維持はすべて骨格筋に依存しており、骨格筋の機能不全は衰弱性の病状(ミオパチー、筋ジストロフィーなど)を引き起こす可能性があります。1.骨格筋は、その本質的な機能と豊富さから、正常な筋肉機能をサポートし、治療標的として役立つ重要な側面を理解しようと努力する世界中の研究機関の注目を集めています。さらに、骨格筋は、主にその常在幹細胞2により、健康な筋肉が完全な損傷や変性の後に完全に自己修復できるため、再生と幹細胞機能を研究するために広く使用されているモデルです。これらはサテライト細胞とも呼ばれ、筋線維3の周辺の基底層の下に局在している。
成人の骨格筋の中核となる細胞は、筋線維(長い合胞体多核細胞)とサテライト細胞(筋原性を有する幹細胞で、損傷によって活性化されるまで静止している)です。後者の細胞は筋肉再生の中心細胞であり、このプロセスはそれらがない場合には起こり得ません4,5,6,7。その身近な微小環境には、複数の細胞タイプとそれらにシグナルを送る分子因子があります。このニッチは、発達を通じて成人期8まで徐々に確立されます。成体筋には、複数の細胞タイプ(内皮細胞、周皮細胞、マクロファージ、線維脂肪形成前駆細胞-FAP、制御性T細胞など)が含まれています。9,10および細胞外マトリックス成分(ラミニン、コラーゲン、フィブロネクチン、フィブリリン、ペリオスチンなど)11は、健康、病気、および再生の文脈で互いに、および衛星細胞と相互作用します。
この複雑なニッチを実験環境で維持することは、基本的ではあるが困難である。同様に難しいのは、サテライトセル9にとって重要なセル状態である静止状態を維持または回復させることである。これらの課題に部分的に取り組むためにいくつかの方法が導入されており、それぞれに長所と短所があります(説明のセクションで詳しく説明します)。ここでは、これら2つの障壁を部分的に克服できる方法を紹介します。筋肉は最初に採取され、次に機械的および酵素的に分解されてから、不均一な細胞混合物が培養されます。培養の過程で、ニッチの多くの細胞タイプが検出され、静止状態に戻ったサテライト細胞が観察されます。プロトコルの最後のステップとして、広く受け入れられているマーカーを使用して各細胞タイプの検出を可能にする免疫蛍光法のステップが提示されます。
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Protocol
すべての実験は、Institut Mondor de Recherche Biomédicale(INSERM U955)のフランスおよびEUの動物規制、特に指令2010/63/UEに準拠しています。動物は、認証番号A94、028、379およびD94-028-028の動物施設で管理され、充実した環境で飼育されました。それらは許可された研究者と動物の世話人によってのみ取り扱われ、動物飼育施設の職員によって目視検査が行われ、生涯にわたって不快感の兆候がないか確認されました。彼らは解剖前に子宮頸部脱臼によって安楽死させられた。動物の生涯の間に介入処置は行われなかった。したがって、倫理委員会とフランス高等教育研究イノベーション省から手続きの承認を得る必要はありませんでした。実際、指令2010/63/UEによると、安楽死と死後解剖には倫理的クリアランスは必要ありません。本稿で発表した結果は、野生型C57BL/6NRj系統( 材料表参照)とトランスジェニック Tg:Pax7-nGFP 系統12(我々のチームで作製)によるものです。プロトコルは、8〜12週齢の雄および雌のマウスに適用されました。
1. 試薬および装置調製、前消化
- 解剖器具(直線および湾曲したハサミ、鉗子、 材料表を参照)に70%エタノールをスプレーし、紙で乾かします。コルク板にアルミホイルを塗り、10cmのシャーレ(1匹につき1枚)を近くに置いておく。紙と70%エタノールを手の届くところに用意してください。
注意: 解剖の最後に、解剖ツールを水ですすぎ、70%エタノールをスプレーし、紙で乾かします。 - 回転式ウォーターバスを 37 °C に設定し、DMEM と 1% ペニシリン-ストレプトマイシン、0.5 U/mL コラゲナーゼ、3 U/mL ディスパーゼ( 材料表を参照)、0.2% BSA を 50 mL チューブに混ぜて消化ミックス(20 mL/動物)を調製します。
- 消化ミックスを細胞培養フード内の0.22 μmフィルターに通します。
注意: 消化ミックスは毎回新鮮に準備することをお勧めします。
2. 試薬と機器の準備:消化後
- 消化後、ミックスは凍結または培養できます。凍結には、10% DMSO:90% ウシ胎児血清 (FBS) とクライオチューブのセット (クライオチューブ 2 mL あたり 1 mL の細胞懸濁液) を用意します。培養には、培地(DMEMに1%ペニシリン-ストレプトマイシン、4 ng/mLのbFGF、および20%FBSを添加)と8ウェルプレートのセットを準備します。セルをめっきする前に、プレートをコーティングする必要があります(詳細はステップ7.1で説明します)。
- 染色には、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)(8ウェルプレートの0.15 mL/ウェル)およびブロッキング溶液(PBS中の5%IgGフリーウシ血清アルブミン[BSA]、8ウェルプレートの0.15 mL/ウェル)に4%パラホルムアルデヒド(PFA)を調製します。
注意:PFAパウダーを吸い込まないでください。化学フードの下で準備して取り扱ってください。
3.解剖
- 安楽死させた動物に70%エタノールをスプレーします。腹部の高さに大きなハサミで横切り(体の左側から右側)を行い、腰の周りを切ります。後肢の皮膚を引き剥がして筋肉を露出させます(図1A)。
- アルミホイルで覆われたコルクプレートに動物を置き、反対側の前肢と後肢を固定します。すべての後肢の筋肉(前部と後部)を氷の上に置かれた10cmのシャーレにすばやく取り出します(図1B、C)。大腿四頭筋と後頭筋の周りの領域から脂肪組織を取り除くように特別な注意を払ってください。筋膜、神経、腱も、解剖に費やす全体的な時間を損なわなければ、この時点で切除することができます。
注:両方の後肢の最適な解剖時間は約15〜20分です。解剖時間は30分を超えないことをお勧めします。 - 時々DMEMを筋肉に滴下して湿らせますが、切り刻みが難しくなるため、多すぎないようにします。もう一方の後肢についても繰り返します。1匹の動物のすべての筋肉がシャーレに入ったら(図1D)、はさみで7〜10分間細かく刻み、滑らかな均質体を得ます(図1E)。
注:このプロトコルでは、L-グルタミン、ピルビン酸、および4.5 g / L D-グルコースを添加したDMEMが使用されます。
図1:培養前の筋肉の準備。(A)ステップ3.1で説明したように、皮膚を切除して後肢の筋肉を露出させます。(B、C)すべての後肢の筋肉は、ステップ3.2で説明したように、骨の周り(B)と骨の間(C)に採取されます。(D)採取した筋肉を、ステップ3.3で説明したように、DMEM滴で氷上の10cmのシャーレに入れ、湿らせておきます。(E)筋肉をハサミで細かく刻み、この画像に描かれている粘稠度のある滑らかなペーストが得られます。(f)最終遠心分離後のペレットの画像。青い矢印は、青い破線の下で、チューブに接しているペレットを強調表示します。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
4.消化
注:消化の最後に、セクション5には、4°Cの遠心分離機、氷の入ったバケツ、3つのセルストレーナー(100 um、70 um、40 um)、および3つの50 mLチューブ(動物あたり)が必要です。
- ステップ1.2の説明に従って、分解ミックスを調製し、ろ過します。ミックスを氷の上に置いてください。
- すべての筋肉をみじん切りにしたら、ホモジネートを20 mLの消化ミックスが入った50 mLチューブに入れます。蓋の端をフレキシブルフィルムで包んで漏れを防ぎ、チューブを低速から中速(50rpm)で37°Cの振とう水浴に入れます。
- 37°Cで1時間後、蓋を開け、10 mLのピペットで7回静かにピペッティングして混合し、均一な混合液を得ます。蓋の周りに新しいフィルムを貼り、振とう水浴に戻します。1時間後、チューブを取り外し、浴槽を止めます。
注:培養の場合は、このインキュベーション時間を使用して、セクション5に進む前に、ステップ7.1の説明に従ってプレートをコーティングします。
5. 濾過
- 消化チューブに最大50 mLの冷たいDMEM(1%ペニシリン-ストレプトマイシンを添加)を充填します。チューブを3回ひっくり返して混ぜます。次のステップのために、DMEMをアイスペールに入れておきます。
- 新しい 50 mL チューブに 100 μm のセルストレーナーを置きます。消化した混合物をセルストレーナーに通し、新しいチューブに通します。600 x g で4°Cで5分間遠心分離します。 上澄み液を廃液容器に注ぎます。
- ペレットを1 mLのコールドDMEM(1%ペニシリン-ストレプトマイシンを添加)に再懸濁します。チューブに最大 50 mL の同じ DMEM を充填します。注:遠心分離をスキップすると、次のペレットの識別と維持が難しくなります。
- 新しい 50 mL チューブに 70 μm のセルストレーナーを置きます。遠心分離/再懸濁した混合物をセルストレーナーに通し、新しいチューブに通します。4°Cで5分間、80 x g で遠心分離します。
メモ: この手順は必須ではありませんが、細胞の破片を取り除くために推奨されます。 - 新しい 50 mL チューブに 40 μm セルストレーナーを置きます。上清をセルストレーナーに通して新しいチューブに通します。600 x g で4°Cで5分間遠心分離し、上清を廃液容器に注ぎ、培養フード下のFBSにペレットを再懸濁します。このステップでは、ペレットは非常に小さいです(図1F)。
注:40 μmのストレーナーでろ過すると、培養物の後の染色で非特異的なシグナルが得られる破片が除去されます。
6.(オプション)凍結
注: セクション 6 はオプションです。プロトコルはろ過の後で停止することができますが、これは細胞の生存および培養の成功を減らすことができます。
- DMSO を添加して 10% DMSO:90% FBS 比が得られるようにし、クライオチューブ (クライオチューブ 2 mL あたり 1 mL の再懸濁ペレット) に移します。
- クライオチューブを-80°Cのポリスチレンボックスに入れて一晩置きます。翌日-150°Cに移し、長期保存します。
注:-80°Cでの短期保存も可能です。 - 培養を開始するときは、細胞懸濁液が融解するまで、クライオチューブを37°Cのウォーターバスで素早く解凍します。培養フードの下で4 mLのDMEMと混合します。600 x g で 4 °C で 5 分間スピンします。 上清をピペットで取り出し、ステップ7.2の説明に従って続行します。
7. 培養
注:凍結または新鮮な細胞懸濁液は、3〜4枚の8ウェルプレートの24〜32ウェルを満たすことが期待できます。
- 8ウェルプレートをコーティング溶液でコーティングし、4°Cまたは氷上で解凍します(ストックコーティング溶液は通常-20°Cに保たれます)。1つのウェルに0.4 mLのコーティング溶液を加え、ウェルからウェルへとピペットで移動させます。コーティング液をすべてのウェルに移した後、将来の培養のために再回収して再凍結することができます。セルをプレーティングする前に、コーティングされたプレートを37°Cで30分間保持します。
- 4 ng/mL bFGF( 資料表を参照)を添加したDMEM(1%ペニシリン-ストレプトマイシンを添加)をFBS細胞懸濁液に添加し、20%FBS:80%DMEM比を得ます。
注:bFGFの添加は、初代筋芽細胞培養およびバルク培養におけるサテライト様細胞産生において有益ですが、~7日間のバルク培養でbFGFを省略しても細胞収量が著しく損なわれないため、その添加は任意です。 - ウェルあたり0.4 mLの懸濁液(ステップ7.2から)をコーティングされた8ウェルプレートにプレートします。
注:凍結および生鮮調製の場合、動物あたり30 cm2 の培養を計算します。 - 培養物を37°Cで5%CO2 で最大10日間インキュベートし、培養物が黄色がかった色に変化し始めたら毎日培地を交換します(通常は5〜7日)。
注:細胞周期13のS期の細胞を定量するには、固定の2時間前に10μMのEdUを添加します。最初のS相を捕捉するには、プレーティングから10 μM EdUを添加し、40時間の培養で固定します。
8.固定
注意: セクション8〜10は、特に明記されていない限り、室温で実施する必要があります。
- 培地をピペットで取り出し、細胞を4% PFA(0.15 mL/ウェル)で固定します。
注意:化学フードの下にPFAを追加します。
注:すべてのウェルが同時に固定されている場合は、室温で PFA と 10 分間インキュベートします。ウェルが異なる時点で固定されている場合は、固定するウェルにPFAを添加し、プレートをインキュベーター内で37°Cで5分間保持します。 - PFA をピペットで取り出し、PBS を 10 秒間添加します(0.15 mL/ウェル)。PBSをピペットで取り出し、新鮮なPBSを5分間加えます(0.15 mL/ウェル)。
注:すべてのウェルが同時に固定されている場合は、室温でPBSとインキュベートします。ウェルが異なる時点で固定されている場合は、固定ウェルにPBSを添加し、プレートをインキュベーター内で37°Cで5分間保持します。次に、0.4 mLのPBSを添加し、プレートをインキュベーターで最大1週間保持します。
9. 透過処理とブロッキング
- 染色の準備ができたら、PBSをピペットで取り出し、0.5% TritonX 100 in PBS(0.15 mL/ウェル)で8分間透過処理します。TritonX 100 をピペットで取り出し、PBS で 10 秒間すすぎ(0.15 mL/ウェル)、PBS をピペットで取り出し、PBS で 5 分間(0.15 mL/ウェル)洗浄します。
- PBS中の5%IgGフリーBSAで30〜60分間(0.15 mL/ウェル)ブロックします。
10. 染色
- BSAをピペットで取り出し、PBS(0.15 mL/ウェル)で希釈した一次抗体混合物( 希釈倍率:抗CD31 1:100、抗FOSB 1:200、抗GFP 1:1,000、抗KI67 1:1,000、抗MyHC 1:400、抗MYOD 1:200、抗MYOG 1:150、抗PAX7 1:100、抗PDGFRa 1:50)を加え、4°Cで一晩インキュベーションします。
注:抗体のインキュベーション後、抗体混合物を回収し、アジ化ナトリウムを添加し、将来の再利用のために4°Cまたは-20°C(抗体メーカーの指示に従う)で保管します。 - 抗体ミックスをピペットで取り出し、PBSで10秒間(0.15 mL/ウェル)すすぎ、PBSをピペットで取り出し、PBSで5分間(0.15 mL/ウェル)洗浄します。
- 洗浄PBSをピペットで取り出し、二次抗体ミックス(ヤギ抗マウスAlexa Fluor 488、ヤギ抗ウサギAlexa Fluor 555、ヤギ抗ラットAlexa Fluor 647、ヤギ抗マウスAlexa Fluor 555、ヤギ抗ニワトリAlexa Fluor 488、すべて1:500-1,000の希釈で使用)およびPBS(0.15 mL/ウェル)で希釈した核マーカー(DAPIなど)を添加します( 資料表参照)。 光から保護して室温で1時間インキュベートします。
- 二次抗体混合物をピペットで取り出し、PBSで10秒間すすぎ(0.15 mL/ウェル)、PBSをピペットで取り出し、PBSで5分間(0.15 mL/ウェル)洗浄し、PBSをピペットで取り出し、マウントします。
注意: 取り外し可能なセパレーター付きの8ウェルプレートを使用する場合は、取り付ける前にセパレーターをはがしてください。
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Representative Results
このプロトコルは内生ニッチから衛星細胞そしてほとんどのセルを維持している間筋肉細胞培養を可能にする。図 2 はプロトコルの主なステップをまとめたもので、図 1 は解剖と消化の重要な部分を示しています。後肢の筋肉組織の解剖が推奨されます(図1A-C)、この筋肉群はよく研究されており、発達の起源と分子階層を共有しているためです14。すべての混合物を無菌条件下で調製することをお勧めします。さらに、消化ミックスを細胞培養フードの下の 0.22 μm フィルターに通すと、培養コンタミネーションの低下が認められました。
バルク調製物の1/30をコーティングされた1cm2 ウェルプレートに播種すると、培養開始から3〜4日後に細長い細胞が見えます。ただし、これは細胞濃度によって異なる場合があり、特に凍結バルク調製物を増殖させる場合、細長い細胞が後で現れ始めることがあります。約7日後、培地は黄色に変色しているはずであり、この時点で、毎日培地を交換する必要があります。さらに、この時点で、ウェルを筋チューブで覆う必要があります。内皮細胞は培養液のごく一部を占めています。培養が成功した主な指標は、固定と染色を必要とする可能性のある豊富なPAX7+細胞です。可能な場合に使用できる便利なマウスモデルは、GFP発現の形でPAX7陽性を視覚化できる Tg:Pax7-nGFP ライン12です。したがって、サテライト細胞は、レポーターGFPによって容易に検出され得る。GFPは、倒立落射蛍光顕微鏡で20倍の倍率で観察できるため、培養中の培養の成功を分析できます。これにより、バルク培養におけるPAX7-GFP細胞のライブイメージングも可能になります。培養物は10日以上放置してはなりません。その後、予備細胞の数が減少し始め、筋管がプレートから剥がれることがあります。凍結細胞からの培養に関する最近の経験に基づくものを含め、培養に失敗した場合でも、繊維の大部分は生成されますが、PAX7-GFP細胞はごくわずかです。PAX7の蛍光マーカーを持たないマウスを用いる場合は、染色を行い、予備細胞産生の有効性を評価する必要があります。
以下の抗体はテスト済みであり、プロトコルセクション10に示されている染色プロトコルでうまく機能します:抗PAX7(衛星細胞および活性化筋芽細胞15のマーカー;この培養で出現する予備細胞のマーカーでもある)、抗ミオシン(筋管15のマーカー)、抗CD31(内皮細胞16のマーカー)、抗GFP(レポーターマウスを使用する場合)、 抗MYOD(筋芽細胞のマーカー15)、抗MYOG(筋細胞の分化マーカー15)、抗KI67(増殖細胞のマーカー17)、および抗PDGFRα(FAPのマーカー15)。図3は、培養7日後の筋原性細胞とニッチ細胞を示しています。図3A-Cでは、野生型マウスから筋塊を培養し、図3D-Fでは、前述のTg:Pax7-nGFP株から筋塊を培養した。PAX7とKI67(図3A)による二重染色により、培養5日後に出現し、細胞周期からの出口(KI67状態)や形成された筋管への「サテライト」としての局在などの筋幹細胞特性を持つ予備細胞をマーキングすることができました。MyHCとMYOG(図3B、D、E)による二重染色により、筋肉分化によって進行した細胞をマーキングし、MYOGを徐々に発現させ、その後融合して多核MyHC+筋管を形成しました。CD31またはPDGFRαで染色することで、内皮細胞やFAPなどのニッチ細胞のマーキングが可能になりました(図3C)。図3D、Eは、GFPによってマークされた新興予備細胞を示しています。GFPおよびMyHCとの共染色により、予備細胞のサテライト細胞位置を評価でき(図3E)、GFPおよびその他の活性化/分化マーカーとの共染色により、予備細胞の静止様性を評価することができました(図3F)。
図2:プロトコル手順の概要 (A-D)(A)解剖、(B)消化、(C)濾過、(D)培養の連続ステップ。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図3:細胞集団の免疫染色。 (A)筋原性細胞(PAX7でマーク;緑)およびサイクリング細胞(KI67でマーク;赤)の免疫蛍光。核はDAPI(青色)で対比染色されています。非循環筋原性細胞(KI67-PAX7+)の存在はプロトコルが培養の7日に豊富にある野生型マウスから静止そっくりのセルを作り出すことができることを示す。(B)野生型マウスの細胞を7日間培養した後の筋チューブ(ミオシン重鎖[MyHC]でマーク;緑)および筋細胞(MYOGでマーク;赤)の免疫蛍光。核はDAPI(青色)で対比染色されています。(C)野生型マウスの細胞を7日間培養した後の筋原性細胞(PAX7;緑)、間葉系線維脂肪原性前駆細胞(PDGFRa;赤)、および内皮細胞(CD31;マゼンタ)の免疫蛍光。核はDAPI(青)で対比染色されています。(D)PAX7発現細胞が核GFPでマークされている Tg:Pax7-nGFP マウス由来の細胞を8日間培養した後のGFP+細胞(緑色)および筋細胞(MYOGでマーク;マゼンタ)の免疫蛍光。(E) Tg:Pax7-nGFP マウス由来の細胞を7日間培養した後のGFP+細胞(緑)および筋チューブ(MyHCでマーク;赤)の免疫蛍光。サテライト細胞様細胞は、7日後に培養物に現れることに注意してください。(F)サテライト細胞(PAX7)、活性化(FOSB)、増殖(KI67)、または筋原性分化(MYOD、MYOG)のマーカーを共発現するGFP+細胞の割合の定量。エラーバーは標準偏差を示します。スケールバー:100um。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
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Discussion
成人の骨格筋の機能は、精巧に調整された一連の細胞間相互作用と分子シグナルによって支えられています。ここでは、生理学的微小環境によく似た ex vivo 環境でこれらのパラメータの研究を可能にする方法を提示する。
いくつかのグループは、筋原性細胞を培養するためのin vitro法を報告しています。これらの方法は、サテライト細胞を単離して、その筋原性前駆細胞特性を研究することを目的としていました。ポジティブセレクションにはPax7、CD34、a7-インテグリン、ネガティブセレクションにはCD45、CD31、Sca1の抗体パネルを使用して、ヒラメ筋および/またはEDL筋18、またはFACS単離サテライト細胞からバルク筋から純粋なサテライト細胞を単離するために、2つの主要なアプローチが使用されます19,20,21.また、FAPなどの他の細胞と比較して接着性が脆弱なため、ゼラチンメッキプレート上のバルク培養物から初代筋芽細胞を分離するために機械タップを使用しているものもあります22,23。これらのアプローチは、サテライト細胞の活性化の研究や培養での増殖に適していますが、細胞は、通常はニッチに寄与する支持細胞が奪われた環境で増殖します。さらに、これらのアプローチでは、Pax7発現の高い静止単核予備細胞を確立するために、筋原性前駆細胞を2週間以上保持する必要があります18。サテライト細胞とマクロファージなどの他の細胞タイプの共培養も報告されています。これにより、増殖、分化、融合などの筋原性特性に対する特定の細胞の直接的な寄与の研究が可能になりました24。いくつかのシングルセルRNA-seq研究により、骨格筋の細胞構成が詳細に説明されています25,26。私たちの培養条件は筋原性細胞の生成に有利であるため、バルク培養では、これらのin vivo研究と比較して、予備細胞の割合がはるかに高く、支持細胞の割合が低いことが観察されています。
ここで説明する方法では、効率を高めることができる 3 つの重要なステップが特定されています。第一に、2時間の消化中に最適な筋肉の解離を確実にし、その後、より高い細胞収量を確保するために、迅速かつ効率的な粉砕が必要です。第二に、消化中の連続的な回転は、組織を通る酵素の適切な拡散を確実にするために非常に重要です。最後に、穏やかな機械的解離も、最適な組織解離のために重要です。
このプロトコルには、主に 4 つの制限があります。第一に、それはex vivoシステムのままであり、いくつかの生理学的および生物物理学的手がかりが失われたり変化したりする可能性があることを意味します。これには、筋線維はプレーティング前に失われ、筋管は培養中に再構築されるため、筋線維との間のシグナル伝達が含まれます。第二に、形成された筋管が胎児的または成体的特徴を持っているかどうか、およびそれらが遅筋と速筋のさまざまな繊維タイプを表しているかどうかは、まだわかりません。参考までに、C2C12筋細胞株とヒト筋芽細胞の培養では、2D培養の筋管はin vivoの対応するものよりも成熟度が低いことが示されていますが27,28、初代マウス筋芽細胞培養物は、in vivoで見つかったものを代表するミオシン型につながるようです29。第三に、この方法では、細胞は組織の解離中にその場での位置を失い、新しく形成された筋管は神経筋および筋腱接合部を欠いています。したがって、空間フィーチャの結果は慎重に解釈する必要があります。第 4 に、提示されたプロトコルは健康な成人の筋肉に最適化されていますが、出発物質が広範囲の線維化、脂肪形成性沈着の増加、または細胞活性化の低下を示す老化またはミオパシー性筋肉に由来する場合は、適応が必要になる可能性があります。
これらの制限のほとんどは、ex vivo筋肉研究の他の方法に共通していますが、このプロトコルにはそれらよりもいくつかの利点があります。これは、静止状態のような予備衛星セルを大量に収集できる唯一のプロトコルです。さらに、人工多能性幹細胞、胚性幹細胞、筋圏培養、オルガノイド培養に関連する特別な培養条件や専門知識を必要としない、安価で簡単な方法を表しています。さらに、バルク培養は、ハイドロゲルまたは他の足場での筋原性細胞の培養に関連する複雑なインフラストラクチャおよび標準化に依存しません。単離された筋線維、FACSで単離された初代細胞、またはプレプレーティングで濃縮された初代細胞の培養と比較して、バルク培養は生理学的筋肉環境に存在するより多くの細胞集団を保持します。これらの細胞は、in vivoでの筋肉再生の研究に一般的に使用されるヘビ毒からの極端で異常なシグナルではなく、培地の成長因子によって引き起こされる活性化と分化の比較的生理学的な経路を通過します30,31。最後に、提示された細胞培養は、他の細胞株と同様に、内因性または初代細胞と比較して遺伝的変化を有するC2C12細胞を使用するよりも有利である。
上記の利点により、このプロトコルは、細胞治療を開発したり、休止期間や細胞/分子規制に関する基本的な質問に答えたりするために必要な、細胞増幅や静止そっくりのサテライトセルプールの生成などのアプリケーションのための強力なツールになります。さらに、プロトコルが薬剤、siRNAのターゲットとすること、または興味の要因の支配的な陰性の形態の過剰発現か表現を誘発するベクトル(プラスミッド、ウイルス)とのトランスフェクション によって 分子シグナリングを変更するのに使用することができる。
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Disclosures
著者は利益相反がないことを宣言します。
Acknowledgments
図 2 では、Servier Medical Art (https://smart.servier.com/) のテンプレートを使用しました。FRラボは、Association Française contre les Myopathies - AFM via TRANSLAMUSCLE(助成金19507および22946)、Fondation pour la Recherche Médicale - FRM(EQU202003010217、ENV202004011730、ECO201806006793)、Agence Nationale pour la Recherche - ANR(ANR-21-CE13-0006-02、ANR-19-CE13-0010、ANR-10-LABX-73)、およびLa Ligue Contre le Cancer(IP/SC-17130)の支援を受けています。上記の資金提供者は、この研究のデザイン、収集、分析、解釈、報告、またはこの原稿の執筆に何の役割も果たしていませんでした。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-CD31 | BD | 550274 | dilution 1:100 |
| anti-FOSB | Santa Cruz | sc-7203 | dilution 1:200 |
| anti-GFP | Abcam | ab13970 | dilution 1:1000 |
| anti-Ki67 | Abcam | ab16667 | dilution 1:1000 |
| anti-MyHC | DSHB | MF20-c | dilution 1:400 |
| anti-MYOD | Active Motif | 39991 | dilution 1:200 |
| anti-MYOG | Santa Cruz | sc-576 | dilution 1:150 |
| anti-Pax7 | Santa Cruz | sc-81648 | dilution 1:100 |
| anti-PDGFRα | Invitrogen | PA5-16571 | dilution 1:50 |
| b-FGF | Peprotech | 450-33 | concentration 4 ng/mL |
| Bovine serum albumin (BSA) – used for digestion | Sigma Aldrich | A7906-1006 | concentration 0.2% |
| BSA IgG-free, protease-free – used for staining | Jackson ImmunoResearch | 001-000-162 | concentration 5% |
| Cell strainer 40 um | Dominique Dutscher | 352340 | |
| Cell strainer 70 um | Dominique Dutscher | 352350 | |
| Cell strainer 100 um | Dominique Dutscher | 352360 | |
| Collagenase | Roche | 10103586001 | concentration 0.5 U/mL |
| Culture plate | Sarstedt | 94.6140.802 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Euromedex | UD8050-05-A | |
| Dispase | Roche | 4942078001 | concentration 3 U/mL |
| Dissection forceps size 5 | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Dissection forceps size 55 | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Dissection scissors (big, straight) | Fine Science Tools | 9146-11 | ideal for chopping |
| Dissection scissors (small, curved) | Fine Science Tools | 15017-10 | |
| Dissection scissors (small, straight) | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | ThermoFisher | 41966-029 | |
| EdU Click-iT kit | ThermoFisher | C10340 | |
| Fetal bovine serum – option 1 | Eurobio | CVF00-01 | |
| Fetal bovine serum – option 2 | Gibco | 10270-106 | |
| Matrigel | Corning Life Sciences | 354234 | coating solution |
| Parafilm | Dominique Dutscher | 090261 | flexible film |
| Paraformaldehyde – option 1 | PanReac AppliChem ITW Reagents | 211511.1209 | concentration 4% |
| Paraformaldeyde – option 2 | ThermoFisher | 28908 | concentration 4% |
| Penicillin streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Shaking water bath | ThermoFisher | TSSWB27 | |
| TritonX100 | Sigma Aldrich | T8532-500 ML | concentration 0.5% |
| Wild-type mice | Janvier | C57BL/6NRj |
References
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