Culture en vrac non fractionnée de muscles squelettiques de souris pour récapituler la niche et la quiescence des cellules souches

Summary

Le muscle squelettique comprend plusieurs types de cellules, y compris les cellules souches résidentes, chacune ayant une contribution particulière à l’homéostasie et à la régénération musculaires. Ici, la culture 2D de cellules souches musculaires et la niche des cellules musculaires dans un environnement ex vivo qui préserve de nombreuses caractéristiques physiologiques, in vivo et environnementales sont décrites.

Abstract

Le muscle squelettique est le plus grand tissu du corps et remplit de multiples fonctions, de la locomotion au contrôle de la température corporelle. Sa fonctionnalité et sa récupération après des blessures dépendent d’une multitude de types de cellules et de signaux moléculaires entre les cellules musculaires centrales (myofibres, cellules souches musculaires) et leur niche. La plupart des contextes expérimentaux ne préservent pas ce microenvironnement physiologique complexe, et ne permettent pas non plus l’étude ex vivo des cellules souches musculaires en quiescence, un état cellulaire crucial pour elles. Ici, un protocole est décrit pour la culture ex vivo de cellules souches musculaires avec des composants cellulaires de leur niche. Grâce à la dégradation mécanique et enzymatique des muscles, on obtient un mélange de types cellulaires, qui est mis en culture 2D. L’immunomarquage montre qu’en l’espace d’une semaine, plusieurs cellules de niche sont présentes en culture aux côtés de myofibres et, surtout, de cellules Pax7-positives qui présentent les caractéristiques des cellules souches musculaires au repos. Ces propriétés uniques font de ce protocole un outil puissant pour l’amplification cellulaire et la génération de cellules souches de type quiescent qui peuvent être utilisées pour répondre à des questions fondamentales et translationnelles.

Introduction

Le mouvement, la respiration, le métabolisme, la posture corporelle et le maintien de la température corporelle dépendent tous du muscle squelettique, et des dysfonctionnements du muscle squelettique peuvent ainsi provoquer des pathologies débilitantes (c’est-à-dire des myopathies, des dystrophies musculaires, etc.) ¹. Compte tenu de ses fonctions essentielles et de son abondance, le muscle squelettique a attiré l’attention des laboratoires de recherche du monde entier qui s’efforcent de comprendre les aspects clés qui soutiennent une fonction musculaire normale et peuvent servir de cibles thérapeutiques. De plus, le muscle squelettique est un modèle largement utilisé pour étudier la régénération et la fonction des cellules souches, car un muscle sain peut s’autoréparer complètement après une blessure et une dégénérescence complètes, principalement en raison de ses cellules souches résidentes² ; Celles-ci sont également appelées cellules satellites et sont localisées sous la lame basale à la périphérie des fibres musculaires³.

Les cellules centrales du muscle squelettique adulte sont les myofibres (longues cellules multinucléées syncytiales) et les cellules satellites (cellules souches à potentiel myogénique qui sont au repos jusqu’à ce qu’une blessure les active). Ces dernières cellules sont les cellules centrales de la régénération musculaire, et ce processus ne peut pas se produire en leur absence 4,5,6,7. Dans leur microenvironnement immédiat, il existe de multiples types de cellules et de facteurs moléculaires qui leur signalent. Ce créneau s’établit progressivement tout au long du développement et jusqu’à l’âge adulte⁸. Le muscle adulte contient plusieurs types de cellules (cellules endothéliales, péricytes, macrophages, progéniteurs fibro-adipogènes-FAP, lymphocytes T régulateurs, etc.) ^9,10 et composants de la matrice extracellulaire (laminines, collagènes, fibronectine, fibrillines, périostine, etc.) ¹¹ qui interagissent entre elles et avec les cellules satellites dans le contexte de la santé, de la maladie et de la régénération.

La préservation de ce créneau complexe dans des contextes expérimentaux est fondamentale, mais difficile. Il est tout aussi difficile de maintenir ou de revenir à la quiescence, un état cellulaire critique pour les cellules satellites⁹. Plusieurs méthodes ont été introduites pour relever partiellement ces défis, chacune ayant ses avantages et ses inconvénients (détaillés dans la section de discussion). Nous présentons ici une méthode qui permet de surmonter partiellement ces deux barrières. Les muscles sont d’abord prélevés, puis décomposés mécaniquement et enzymatiquement avant que le mélange de cellules hétérogènes ne soit mis en culture. Au cours de la culture, de nombreux types de cellules de la niche sont détectés et des cellules satellites qui sont revenues à la quiescence sont observées. Comme dernière étape du protocole, les étapes d’immunofluorescence qui permettent la détection de chaque type de cellule grâce à l’utilisation de marqueurs universellement acceptés, sont présentées.

Protocol

Toutes les expérimentations ont été conformes à la réglementation animale française et européenne de l’Institut Mondor de Recherche Biomédicale (INSERM U955), notamment la directive 2010/63/UE. Les animaux ont été gardés dans un environnement contrôlé et enrichi dans les animaleries portant les numéros de certification A94 028 379 et D94-028-028 ; Ils n’ont été manipulés que par des chercheurs et des soigneurs d’animaux autorisés, et ils ont été inspectés visuellement par le personnel de l’?…

Representative Results

Ce protocole permet la culture de cellules musculaires tout en préservant les cellules satellites et la plupart des cellules de leur niche endogène. La figure 2 résume les principales étapes du protocole, tandis que les parties essentielles de la dissection et de la digestion sont présentées à la figure 1. La dissection de la musculature des membres postérieurs est recommandée (Figure 1A-C)…

Discussion

La fonction des muscles squelettiques adultes est sous-tendue par un ensemble finement orchestré d’interactions cellulaires et de signaux moléculaires. Ici, une méthode est présentée qui permet d’étudier ces paramètres dans un cadre ex vivo qui ressemble beaucoup au microenvironnement physiologique.

Plusieurs groupes ont rapporté des méthodes in vitro pour la culture de cellules myogéniques. Ces méthodes visaient à isoler des cellules satellites afin d’étud…

Materials

anti-CD31	BD	550274	dilution 1:100
anti-FOSB	Santa Cruz	sc-7203	dilution 1:200
anti-GFP	Abcam	ab13970	dilution 1:1000
anti-Ki67	Abcam	ab16667	dilution 1:1000
anti-MyHC	DSHB	MF20-c	dilution 1:400
anti-MYOD	Active Motif	39991	dilution 1:200
anti-MYOG	Santa Cruz	sc-576	dilution 1:150
anti-Pax7	Santa Cruz	sc-81648	dilution 1:100
anti-PDGFRα	Invitrogen	PA5-16571	dilution 1:50
b-FGF	Peprotech	450-33	concentration 4 ng/mL
bovine serum albumin (BSA) – used for digestion	Sigma Aldrich	A7906-1006	concentration 0.2%
BSA IgG-free, protease-free – used for staining	Jackson ImmunoResearch	001-000-162	concentration 5%
cell strainer 40 um	Dominique Dutscher	352340
cell strainer 70 um	Dominique Dutscher	352350
cell strainer 100 um	Dominique Dutscher	352360
Collagenase	Roche	10103586001	concentration 0.5 U/mL
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Euromedex	UD8050-05-A
Dispase	Roche	4942078001	concentration 3 U/mL
Dissection forceps size 5	Fine Science Tools	91150-20
Dissection forceps size 55	Fine Science Tools	11295-51
Dissection scissors (big, straight)	Fine Science Tools	9146-11	ideal for chopping
Dissection scissors (small, curved)	Fine Science Tools	15017-10
Dissection scissors (small, straight)	Fine Science Tools	14084-08
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	ThermoFisher	41966-029
EdU Click-iT kit	ThermoFisher	C10340
Fetal bovine serum – option 1	Eurobio	CVF00-01
Fetal bovine serum – option 2	Gibco	10270-106
Matrigel	Corning Life Sciences	354234	coating solution
Parafilm	Dominique Dutscher	090261	flexible film
Penicillin streptomycin	Gibco	15140-122
Paraformaldehyde – option 1	PanReac AppliChem ITW Reagents	211511.1209	concentration 4%
Paraformaldeyde – option 2	ThermoFisher	28908	concentration 4%
Shaking water bath	ThermoFisher	TSSWB27
TritonX100	Sigma Aldrich	T8532-500 ML	concentration 0.5%
Wild-type mice	Janvier	C57BL/6NRj