Summary
Skeletspieren bestaan uit meerdere celtypen, waaronder residente stamcellen, elk met een speciale bijdrage aan de homeostase en regeneratie van spieren. Hier worden de 2D-kweek van spierstamcellen en de spiercelniche in een ex vivo setting beschreven die veel van de fysiologische, in vivo en omgevingskenmerken behoudt.
Abstract
Skeletspieren zijn het grootste weefsel van het lichaam en vervullen meerdere functies, van voortbeweging tot het regelen van de lichaamstemperatuur. De functionaliteit en het herstel van blessures zijn afhankelijk van een veelheid aan celtypen en van moleculaire signalen tussen de kernspiercellen (myovezels, spierstamcellen) en hun niche. De meeste experimentele instellingen behouden deze complexe fysiologische micro-omgeving niet, en ze laten ook niet de ex vivo studie van spierstamcellen in rust toe, een celtoestand die voor hen cruciaal is. Hier wordt een protocol geschetst voor de ex vivo kweek van spierstamcellen met cellulaire componenten van hun niche. Door de mechanische en enzymatische afbraak van spieren wordt een mengsel van celtypen verkregen, dat in 2D-kweek wordt gebracht. Immunokleuring toont aan dat binnen 1 week meerdere nichecellen in kweek aanwezig zijn naast myovezels en, belangrijker nog, Pax7-positieve cellen die de kenmerken vertonen van slapende spierstamcellen. Deze unieke eigenschappen maken dit protocol tot een krachtig hulpmiddel voor celamplificatie en het genereren van rustgevende stamcellen die kunnen worden gebruikt om fundamentele en translationele vragen te beantwoorden.
Introduction
Beweging, ademhaling, metabolisme, lichaamshouding en het handhaven van de lichaamstemperatuur zijn allemaal afhankelijk van skeletspieren, en storingen in de skeletspier kunnen dus slopende pathologieën veroorzaken (d.w.z. myopathieën, spierdystrofieën, enz.) 1. Gezien de essentiële functies en overvloed ervan, hebben skeletspieren de aandacht getrokken van onderzoekslaboratoria over de hele wereld die ernaar streven de belangrijkste aspecten te begrijpen die de normale spierfunctie ondersteunen en als therapeutische doelen kunnen dienen. Bovendien zijn skeletspieren een veelgebruikt model om regeneratie en stamcelfunctie te bestuderen, aangezien gezonde spieren zichzelf volledig kunnen herstellen na volledig letsel en degeneratie, voornamelijk dankzij de inwonendestamcellen2; Deze worden ook wel satellietcellen genoemd en zijn gelokaliseerd onder de basale lamina in de periferie van de spiervezels3.
De kerncellen van volwassen skeletspieren zijn de myofibers (lange syncytiële multinucleaire cellen) en de satellietcellen (stamcellen met myogeen potentieel die in rust zijn totdat een verwonding ze activeert). De laatste cellen zijn de centrale cellen van spierregeneratie en dit proces kan niet plaatsvinden in hun afwezigheid 4,5,6,7. In hun directe micro-omgeving zijn er meerdere celtypen en moleculaire factoren die hen signaleren. Deze niche wordt geleidelijk tot stand gebracht tijdens de ontwikkeling en tot de volwassenheid8. Volwassen spieren bevatten meerdere celtypen (endotheelcellen, pericyten, macrofagen, fibro-adipogene voorlopercellen-FAP's, regulerende T-cellen, enz.) 9,10 en extracellulaire matrixcomponenten (laminines, collagenen, fibronectine, fibrillines, periostin, enz.) 11 die met elkaar en met de satellietcellen interageren in de context van gezondheid, ziekte en regeneratie.
Het behoud van deze complexe niche in experimentele omgevingen is fundamenteel maar uitdagend. Even moeilijk is het om rust te handhaven of terug te keren naar rust, een celtoestand die cruciaal is voor satellietcellen9. Er zijn verschillende methoden geïntroduceerd om deze uitdagingen gedeeltelijk aan te pakken, elk met zijn voor- en nadelen (gedetailleerd in het discussiegedeelte). Hier wordt een methode gepresenteerd die deze twee barrières gedeeltelijk kan overwinnen. Spieren worden eerst geoogst en vervolgens mechanisch en enzymatisch afgebroken voordat het heterogene celmengsel in kweek wordt gebracht. In de loop van de kweek worden veel celtypen van de niche gedetecteerd en worden satellietcellen waargenomen die zijn teruggekeerd naar rust. Als laatste stap van het protocol worden de immunofluorescentiestappen gepresenteerd die de detectie van elk celtype mogelijk maken door het gebruik van universeel aanvaarde markers.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle proeven voldeden aan de Franse en EU-voorschriften voor dieren van het Institut Mondor de Recherche Biomédicale (INSERM U955), met name de richtlijn 2010/63/UE. De dieren werden gehouden in een gecontroleerde en verrijkte omgeving in de dierenfaciliteiten met certificeringsnummers A94 028 379 en D94-028-028; Ze werden alleen gehanteerd door geautoriseerde onderzoekers en dierenverzorgers, en ze werden tijdens hun leven visueel geïnspecteerd door personeel van dierenverblijven op tekenen van ongemak. Ze werden geëuthanaseerd door cervicale dislocatie voorafgaand aan dissectie. Tijdens het leven van de dieren werden geen interventieprocedures uitgevoerd; het was dus niet nodig om goedkeuring voor de procedure te krijgen van een ethische commissie en het Franse ministerie van Hoger Onderwijs, Onderzoek en Innovatie. Er is namelijk geen ethische verklaring vereist voor euthanasie en postmortale dissectie volgens de richtlijn 2010/63/UE. De resultaten in dit manuscript zijn afkomstig van de wildtype C57BL/6NRj-lijn (zie Materiaaltabel) en de transgene Tg:Pax7-nGFP-lijn 12 (gefokt door ons team). Het protocol werd toegepast op mannelijke en vrouwelijke muizen in de leeftijd van 8-12 weken.
1. Reagens en voorbereiding van apparatuur voorvertering
- Spuit de dissectiegereedschappen (rechte en gebogen schaar, pincet, zie de materiaaltabel) in met 70% ethanol en droog ze af met papier. Smeer een kurkbord in met aluminiumfolie en houd petrischaaltjes van 10 cm (één per dier) in de buurt. Zorg dat je papier en 70% ethanol binnen handbereik hebt.
NOTITIE: Spoel aan het einde van de dissectie de dissectie-instrumenten af met water, spuit ze vervolgens in met 70% ethanol en droog ze af met papier. - Stel een roterend waterbad in op 37 °C en bereid het digestiemengsel (20 ml/dier) door DMEM te combineren met 1% penicilline-streptomycine, 0,5 E/ml collagenase, 3 E/ml dispase (zie de materiaaltabel) en 0,2% BSA in buis(jes) van 50 ml.
- Haal het digestiemengsel door een filter van 0,22 μm in een celkweekkap.
LET OP: Het is aan te raden om de digestiemix elke keer vers te bereiden.
2. Bereiding van reagens en apparatuur na vertering
- Na de vergisting kan het mengsel worden ingevroren of gekweekt. Bereid voor het invriezen 10% DMSO: 90% foetaal runderserum (FBS), evenals een set cryobuisjes (1 ml celsuspensie per 2 ml cryobuis). Bereid voor de kweek kweekmedium (DMEM aangevuld met 1% penicilline-streptomycine, 4 ng/ml bFGF en 20% FBS) en een set platen met 8 putjes. De platen moeten worden gecoat voordat de cellen worden geplateerd (zie stap 7.1 voor meer informatie).
- Bereid voor de kleuring 4% paraformaldehyde (PFA) in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) (0,15 ml/putje van de 8-putjesplaat) en blokkeeroplossing (5% IgG-vrij runderserumalbumine [BSA] in PBS; 0,15 ml/putje van de 8-putjesplaat).
LET OP: Adem het PFA-poeder niet in; Bereid het voor en behandel het onder een chemische kap.
3. Dissectie
- Besproei het geëuthanaseerde dier met 70% ethanol. Maak een horizontale incisie (linkerkant van het lichaam naar de rechterkant) met een grote schaar ter hoogte van de buik en knip rond de taille. Trek de huid van de achterpoten om de spieren te onthullen (Figuur 1A).
- Plaats het dier op de met aluminiumfolie bedekte kurkplaat en speld de tegenoverliggende voorpoot en achterpoot vast. Verwijder snel alle spieren van de achterpoten (voor- en achterkant) in een petrischaal van 10 cm die op ijs is geplaatst (Figuur 1B,C). Wees extra voorzichtig met het verwijderen van het vetweefsel uit de gebieden rond de quadriceps en de achterste spieren. Fascia, zenuwen en pezen kunnen op dit punt ook worden verwijderd als dit de totale tijd die aan dissectie wordt besteed niet in gevaar brengt.
OPMERKING: Een optimale dissectietijd voor beide achterpoten moet ongeveer 15-20 minuten zijn. Het wordt geadviseerd om de dissectietijd niet langer dan 30 minuten te laten duren. - Voeg af en toe druppels DMEM toe aan de spieren om ze vochtig te houden, maar niet te veel, omdat dit het hakken bemoeilijkt. Herhaal dit voor de andere achterpoot. Zodra alle spieren van één dier in de petrischaal zitten (Figuur 1D), hakt u ze 7-10 minuten fijn met een schaar om een glad homogenaat te verkrijgen (Figuur 1E).
OPMERKING: In dit protocol wordt DMEM aangevuld met L-glutamine, pyruvaat en 4,5 g/L D-glucose gebruikt.
Figuur 1: Pre-kweek spiervoorbereiding. (A) De huid wordt verwijderd om de spieren van de achterpoten zichtbaar te maken, zoals beschreven in stap 3.1. (B,C) Alle spieren van de achterpoten worden geoogst (B) rond en (C) tussen de botten, zoals beschreven in stap 3.2. (D) De geoogste spieren worden in een petrischaal van 10 cm op ijs geplaatst met DMEM-druppels om ze vochtig te houden, zoals beschreven in stap 3.3. (E) De spieren worden fijngehakt met een schaar totdat een gladde pasta is verkregen met de consistentie die in deze afbeelding is afgebeeld. (F) een afbeelding van de pellet na de laatste centrifugatie; De blauwe pijl markeert de pellet, die zich tegen de buis bevindt, onder de blauwe stippellijn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
4. Spijsvertering
OPMERKING: Aan het einde van de digestie zijn een centrifuge bij 4 °C, een emmer ijs, drie celzeefjes (100 um, 70 um, 40 um) en drie buisjes van 50 ml (per dier) nodig voor sectie 5.
- Bereid en filtreer het digestiemengsel zoals beschreven in stap 1.2. Bewaar het mengsel op ijs.
- Zodra alle spieren zijn gehakt, plaatst u het homogenaat in een buis van 50 ml met 20 ml digestiemix. Wikkel de randen van het deksel in flexibele folie om lekken te voorkomen en plaats de buis in een schudwaterbad van 37 °C met een lage tot gemiddelde snelheid (50 rpm).
- Na 1 uur bij 37 °C opent u het deksel en mengt u door zeven keer zachtjes op en neer te pipetteren met een pipet van 10 ml om een homogeen mengsel te verkrijgen. Breng nieuwe folie aan rond het deksel en plaats deze terug in het schudwaterbad. Verwijder na 1 uur de slang en zet het bad uit.
OPMERKING: Gebruik voor cultuur deze incubatietijd om de platen te coaten zoals beschreven in stap 7.1 voordat u naar sectie 5 gaat.
5. Filtratie
- Vul de digestiebuis met koude DMEM (aangevuld met 1% penicilline-streptomycine) tot 50 ml. Meng door de buis drie keer om te keren. Bewaar de DMEM in een ijsemmer voor de volgende stappen.
- Plaats een celzeef van 100 μm op een nieuw buisje van 50 ml. Giet het verteerde mengsel door de celzeef in de nieuwe buis. Centrifugeer op 600 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Giet het supernatans in een container voor vloeibaar afval.
- Resuspendeer de pellet in 1 ml koude DMEM (aangevuld met 1% penicilline-streptomycine). Vul de tube tot 50 ml met dezelfde DMEM. OPMERKING: Als het centrifugeren wordt overgeslagen, zal de volgende pellet moeilijker te identificeren en te onderhouden zijn.
- Plaats een celzeef van 70 μm op een nieuw buisje van 50 ml. Giet het gecentrifugeerde/geresuspendeerde mengsel door de celzeef in de nieuwe buis. Centrifugeer op 80 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
OPMERKING: Deze stap is niet verplicht, maar wordt aanbevolen om celresten te verwijderen. - Plaats een celzeef van 40 μm op een nieuw buisje van 50 ml. Leid het supernatans door de celzeef in de nieuwe buis. Centrifugeer op 600 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C, giet het supernatans in een container voor vloeibaar afval en resuspendeer de pellet in FBS onder de kweekkap. De pellet is in deze stap erg klein (Figuur 1F).
OPMERKING: Filteren door de zeef van 40 μm verwijdert vuil, wat een niet-specifiek signaal zou geven bij de latere kleuring van de culturen.
6. (Optioneel) bevriezen
NOTITIE: Sectie 6 is optioneel. Het protocol kan na het filteren worden gepauzeerd, maar dit kan de overleving van de cel en het kweeksucces verminderen.
- Voeg DMSO toe om een DMSO:90% FBS-verhouding van 10% te verkrijgen en breng over naar cryobuizen (1 ml geresuspendeerde pellet per cryobuis van 2 ml).
- Plaats de cryobuis bij -80 °C een nacht in een polystyreendoos. Verplaats de volgende dag naar -150 °C voor langdurige opslag.
OPMERKING: Kortstondige opslag bij -80 °C is ook mogelijk. - Ontdooi bij het starten van de kweek de cryobuis snel in een waterbad van 37 °C totdat de celsuspensie is ontdooid. Meng met 4 ml DMEM onder de kweekkap. Centrifugeren op 600 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Pipetteer de supernatant en ga verder zoals beschreven in stap 7.2.
7. Cultiveren
OPMERKING: Van ingevroren of verse celsuspensies kan worden verwacht dat ze 24-32 putjes van drie tot vier platen met 8 putjes vullen.
- Smeer de platen met 8 putjes in met de coatingoplossing, die bij 4 °C of op ijs moet worden ontdooid (de standaard coatingoplossing wordt normaal gesproken bij −20 °C bewaard). Voeg 0,4 ml coatingoplossing toe aan een putje en pipetteer het van well-to-well. Nadat de coatingoplossing door alle putten is overgebracht, kan deze worden verzameld en opnieuw worden ingevroren voor toekomstige culturen. Houd de gecoate platen 30 minuten op 37 °C voordat u de cellen plateert.
- Voeg DMEM (aangevuld met 1% penicilline-streptomycine) aangevuld met 4 ng/ml bFGF (zie materiaaltabel) toe aan de FBS-celsuspensie om een 20% FBS:80% DMEM-verhouding te verkrijgen.
OPMERKING: Hoewel de toevoeging van bFGF gunstig kan zijn in primaire myoblastculturen en bij satellietachtige celproductie in bulkculturen, is de toevoeging ervan optioneel, aangezien het weglaten ervan in bulkculturen van ~7 dagen de celopbrengsten niet ernstig in gevaar brengt. - Plaat 0,4 ml van de suspensie per putje (uit stap 7.2) in de gecoate 8-wells platen.
OPMERKING: Reken 30cm2 cultuur per dier voor diepgevroren en verse bereidingen. - Incubeer de culturen bij 37 °C met 5% CO2 gedurende maximaal 10 dagen, waarbij het medium elke dag wordt vervangen nadat de cultuur begint te veranderen in een gelige kleur (meestal 5-7 dagen).
OPMERKING: Om cellen in de S-fase van de celcyclus 13 te kwantificeren, voegt u 2 uur voor de fixatie10 μM EdU toe. Om de eerste S-fase vast te leggen, voegt u 10 μM EdU van de beplating toe en fixeert u op 40 uur cultuur.
8. Fixatie
NOTITIE: Secties 8-10 moeten bij kamertemperatuur worden uitgevoerd, tenzij anders vermeld.
- Pipeteer het kweekmedium uit en fixeer de cellen met 4% PFA (0,15 ml/putje).
LET OP: Voeg PFA toe onder een chemische kap.
NOTITIE: Als alle putjes tegelijkertijd zijn gefixeerd, incubeer dan met PFA bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Als de putjes op verschillende tijdstippen zijn bevestigd, voeg dan PFA toe aan de te fixeren putjes en houd de plaat in de incubator gedurende 5 minuten op 37 °C. - Pipetteer de PFA en voeg PBS toe gedurende 10 s (0,15 ml/putje). Pipetteer de PBS en voeg verse PBS toe gedurende 5 minuten (0,15 ml/putje).
NOTITIE: Als alle putjes tegelijkertijd zijn gefixeerd, incubeer dan met PBS bij kamertemperatuur. Als de putjes op verschillende tijdstippen zijn bevestigd, voeg dan PBS toe aan de vaste putjes en houd de plaat in de incubator gedurende 5 minuten op 37 °C. Voeg vervolgens 0,4 ml PBS toe en bewaar de plaat maximaal 1 week in de couveuse.
9. Permeabilisatie en blokkering
- Als u klaar bent om te kleuren, pipetteert u de PBS uit en doormeabiliseert u deze gedurende 8 minuten met 0,5% TritonX 100 in PBS (0,15 ml/putje). Pipeteer de TritonX 100, spoel gedurende 10 s (0,15 ml/well) met PBS, pipetteer de PBS uit en was gedurende 5 minuten met PBS (0,15 ml/well).
- Blokkeer met 5% IgG-vrij BSA in PBS gedurende 30-60 minuten (0,15 ml/putje).
10. Vlekken
- Pipetteer de BSA en voeg het primaire antilichaammengsel verdund in PBS (0,15 ml/putje) toe (zie de materiaaltabel; verdunningen: anti-CD31 1:100, anti-FOSB 1:200, anti-GFP 1:1.000, anti-KI67 1:1.000, anti-MyHC 1:400, anti-MYOD 1:200, anti-MYOG 1:150, anti-PAX7 1:100, anti-PDGFRa 1:50) voor nachtelijke incubatie bij 4 °C.
OPMERKING: Verzamel na de incubatie van de antilichamen het antilichaammengsel, voeg natriumazide toe en bewaar het op 4 °C of -20 °C (volgens de instructies van de fabrikant van het antilichaam) voor toekomstig hergebruik. - Pipeteer het antilichaammengsel, spoel gedurende 10 s (0,15 ml/well), pipetteer de PBS uit en was gedurende 5 minuten met PBS (0,15 ml/well).
- Pipetteer de was-PBS uit het wassen, voeg de secundaire antilichaammix toe (geit anti-muis Alexa Fluor 488, geit anti-konijn Alexa Fluor 555, geit anti-rat Alexa Fluor 647, geit anti-muis Alexa Fluor 555, geit anti-kip Alexa Fluor 488, allemaal gebruikt bij verdunningen van 1:500-1.000) en nucleus marker (bijv. DAPI) verdund in PBS (0,15 ml/putje) (zie tabel met materialen), en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht.
- Pipeteer het secundaire antilichaammengsel, spoel gedurende 10 s (0,15 ml/well) met PBS, pipetteer de PBS eruit, was gedurende 5 minuten met PBS (0,15 ml/well), pipetteer de PBS en monteer.
NOTITIE: Als 8-wells platen met verwijderbare scheiders worden gebruikt, verwijder dan de scheiders voordat u ze monteert.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dit protocol maakt het mogelijk om spiercellen te kweken met behoud van de satellietcellen en de meeste cellen uit hun endogene niche. Figuur 2 vat de belangrijkste stappen van het protocol samen, terwijl essentiële onderdelen van de dissectie en vertering worden weergegeven in figuur 1. Dissectie van de musculatuur van de achterpoten wordt aanbevolen (Figuur 1A-C), aangezien deze groep spieren goed bestudeerd is en een ontwikkelingsoorsprong en moleculaire hiërarchieën deelt14. Het wordt aangeraden om alle mengsels onder steriele omstandigheden te bereiden. Bovendien werd een lagere kweekcontaminatie opgemerkt wanneer het digestiemengsel door een filter van 0,22 μm onder een celcultuurkap werd geleid.
Bij het uitplateren van 1/30 van een bulkprep op gecoate platen van 1 cmen 2 putjes, zijn langwerpige cellen 3-4 dagen na het begin van de kweek zichtbaar. Dit kan echter variëren afhankelijk van de celconcentratie, en langwerpige cellen kunnen later verschijnen, vooral bij het uitbreiden van diepgevroren bulkpreparaten. Ongeveer 7 dagen later zou het medium geel moeten zijn geworden en op dit punt zijn dagelijkse mediumveranderingen vereist. Bovendien moeten de putten op dit punt worden afgedekt met myotubes. De endotheelcellen vormen een klein deel van de kweek. De belangrijkste indicatie van een succesvolle kweek zijn overvloedige PAX7+-cellen, die mogelijk moeten worden gefixeerd en gekleurd. Een handig muismodel dat indien mogelijk kan worden gebruikt, is de Tg:Pax7-nGFP-lijn 12, die de visualisatie van PAX7-positiviteit in de vorm van GFP-expressie mogelijk maakt; zo kunnen de satellietcellen gemakkelijk worden gedetecteerd door de verslaggever GFP. GFP kan worden waargenomen bij een vergroting van 20x op een omgekeerde epifluorescentiemicroscoop, waardoor het succes van de kweek kan worden geanalyseerd terwijl de kweek aan de gang is. Dit maakt ook de live beeldvorming van PAX7-GFP-cellen in bulkculturen mogelijk. Culturen mogen niet langer dan 10 dagen worden bewaard. Daarna beginnen de reservecellen in aantal af te nemen en kunnen de myotubes loskomen van de plaat. Mislukte culturen, onder meer op basis van recente ervaring met culturen uit ingevroren cellen, kunnen nog steeds een groot deel van de vezels genereren, maar zeer weinig PAX7-GFP-cellen. Bij gebruik van muizen zonder fluorescerende marker voor PAX7 is het noodzakelijk om kleuring uit te voeren om de werkzaamheid van de aanmaak van reservecellen te beoordelen.
De volgende antilichamen zijn getest en werken goed met het kleuringsprotocol dat wordt gepresenteerd in protocolsectie 10: anti-PAX7 (een marker van satellietcellen en geactiveerde myoblasten 15; ook een marker van reservecellen die in deze cultuur ontstaan), anti-myosine (een marker van myotubes15), anti-CD31 (een marker van endotheelcellen16), anti-GFP (als reportermuizen worden gebruikt), anti-MYOD (een marker van myoblasten 15), anti-MYOG (een marker van differentiërende myocyten 15), anti-KI67 (een marker van prolifererende cellen17) en anti-PDGFRα (een marker van FAP's15). Figuur 3 toont myogene en nichecellen na 7 dagen in kweek. Met betrekking tot figuur 3A-C werden spiermassa's gekweekt uit wildtype muizen, terwijl voor figuur 3D-F spiermassa's werden gekweekt uit de eerder genoemde Tg:Pax7-nGFP-lijn. Dubbele kleuring met PAX7 en KI67 (Figuur 3A) maakte het mogelijk om de reservecellen te markeren die na 5 dagen in kweek verschenen en spierstamcelkenmerken hadden, zoals het verlaten van de celcyclus (KI67-status) en een lokalisatie als "satellieten" naar de gevormde myotubes. Dubbele kleuring met MyHC en MYOG (Figuur 3B,D,E) maakte het mogelijk om de cellen te markeren die door spierdifferentiatie gingen en dus geleidelijk MYOG tot expressie brachten en vervolgens samensmolten tot meerkernige MyHC+ myotubes. Kleuring met CD31 of PDGFRα maakte het mogelijk om nichecellen te markeren (Figuur 3C), zoals endotheelcellen en FAP's. Figuur 3D,E toont opkomende reservecellen gemarkeerd door GFP. Co-kleuring met GFP en MyHC maakte het mogelijk om de positie van de satellietcellen van de reservecellen te evalueren (Figuur 3E), terwijl co-kleuring met GFP en andere activerings-/differentiatiemarkers het mogelijk maakte om de rustachtige aard van de reservecellen te evalueren (Figuur 3F).
Figuur 2: Een overzicht van de protocolstappen. (A–D) Opeenvolging van (A) dissectie, (B) vertering, (C) filtratie en (D) kweek. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Immunokleuring van de celpopulaties. (A) Immunofluorescentie van myogene (gemarkeerd door PAX7; groen) en cyclische (gemarkeerd door KI67; rood) cellen. De kernen worden tegengekleurd met DAPI (blauw). De aanwezigheid van niet-cyclische myogene cellen (KI67-PAX7+) toont aan dat het protocol rustgevende cellen kan produceren van wildtype muizen die overvloedig aanwezig zijn na 7 dagen kweek. (B) Immunofluorescentie van myotubes (gemarkeerd door myosine zware keten [MyHC]; groen) en myocyten (gemarkeerd met MYOG; rood) na 7 dagen kweek van cellen van wildtype muizen. De kernen worden tegengekleurd met DAPI (blauw). (C) Immunofluorescentie van myogene cellen (gemarkeerd door PAX7; groen), mesenchymale fibro-adipogene voorlopercellen (gemarkeerd door PDGFRa; rood) en endotheelcellen (gemarkeerd met CD31; magenta) na 7 dagen kweek van cellen van wildtype muizen. Kernen worden tegengekleurd met DAPI (blauw). (D) Immunofluorescentie van GFP+-cellen (groen) en myocyten (gemarkeerd met MYOG; magenta) na 8 dagen kweek van cellen van Tg:Pax7-nGFP-muizen , waarin cellen die PAX7 tot expressie brengen, worden gemarkeerd door nucleair GFP. (E) Immunofluorescentie van GFP+-cellen (groen) en myotubes (gemarkeerd met MyHC; rood) na 7 dagen kweek van cellen van Tg:Pax7-nGFP-muizen . Merk op dat de satellietcelachtige cellen na 7 dagen in de kweek verschijnen. (F) Kwantificering van het aandeel GFP+-cellen dat markers van satellietcellen (PAX7), activering (FOSB), proliferatie (KI67) of myogene differentiatie (MYOD, MYOG) tot expressie brengt. De foutbalken geven de standaarddeviatie aan. Schaalbalk: 100 um. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De volwassen skeletspierfunctie wordt ondersteund door een fijn georkestreerde reeks cellulaire interacties en moleculaire signalen. Hier wordt een methode gepresenteerd die het mogelijk maakt om deze parameters te bestuderen in een ex vivo setting die sterk lijkt op de fysiologische micro-omgeving.
Verschillende groepen hebben in vitro methoden gerapporteerd om myogene cellen te kweken. Deze methoden waren gericht op het isoleren van satellietcellen om hun myogene voorlopereigenschappen te bestuderen. Er worden twee hoofdbenaderingen gebruikt om pure satellietcellen te isoleren, hetzij uit culturen van geïsoleerde vezels uit soleus- en/of EDL-spieren18of uit FACS-geïsoleerde satellietcellen, uit bulkspieren, met behulp van een panel van antilichamen voor Pax7, CD34 en a7-integrine voor positieve selectie en CD45, CD31 en Sca1 voor negatieve selectie 19,20,21. Anderen hebben ook mechanische kranen gebruikt om primaire myoblasten te isoleren uit bulkculturen op gelatineplaten vanwege hun fragiele hechtingseigenschappen in vergelijking met andere cellen zoals FAP's22,23. Hoewel deze benaderingen geschikt zijn om de activering van satellietcellen te bestuderen of om ze in kweek uit te breiden, groeien de cellen in een omgeving zonder de ondersteunende cellen die gewoonlijk bijdragen aan hun niche. Bovendien vereisen deze benaderingen dat de myogene voorlopercellen langer dan 2 weken worden bewaard om rustige mononucleaire reservecellen met een hoge Pax7-expressie te vestigen18. Co-culturen van satellietcellen en andere celtypen, zoals macrofagen, zijn ook gerapporteerd. Dit heeft het mogelijk gemaakt om de directe bijdrage van een specifieke cel aan myogene eigenschappen zoals proliferatie, differentiatie en fusie te bestuderen24. Verschillende single-cell RNA-seq-studies hebben de cellulaire samenstelling van de skeletspier gedetailleerd beschreven25,26. Omdat onze kweekomstandigheden de aanmaak van myogene cellen bevorderen, hebben we een veel hoger aandeel reservecellen en een lager aandeel steuncellen waargenomen in bulkculturen in vergelijking met deze in vivo studies.
In de hier beschreven methode zijn drie kritische stappen geïdentificeerd die de efficiëntie kunnen verhogen. Ten eerste is snel en efficiënt hakken noodzakelijk om te zorgen voor een optimale spierdissociatie tijdens de 2 uur van de spijsvertering en vervolgens voor een hogere celopbrengst. Ten tweede is continue rotatie tijdens de spijsvertering erg belangrijk om de juiste diffusie van de enzymen door het weefsel te garanderen. Ten slotte is zachte mechanische dissociatie ook belangrijk voor een optimale weefseldissociatie.
Er zijn vier belangrijke beperkingen van dit protocol. Ten eerste blijft het een ex vivo-systeem, wat betekent dat sommige fysiologische en biofysische signalen verloren kunnen gaan of kunnen veranderen. Dit omvat signalering van/naar de spiervezels, aangezien de vezels verloren gaan voordat ze worden plateren en de myotubes tijdens de kweek opnieuw worden opgebouwd. Ten tweede valt nog te bezien of de gevormde myotubes embryonale of volwassen kenmerken hebben en of ze de verschillende vezeltypes in langzame en snelle spieren vertegenwoordigen. Ter referentie: culturen van de C2C12-spiercellijn en menselijke myoblasten hebben aangetoond dat myotubes in 2D-kweek minder volwassen zijn dan hun in vivo tegenhangers27,28, terwijl primaire myoblastculturen van muizen lijken te leiden tot myosinetypen die representatief zijn voor die in vivo29. Ten derde verliezen de cellen met deze methode hun in situ positie tijdens weefseldissociatie, en missen de nieuw gevormde myotubes neuromusculaire en myotendineuze verbindingen; Resultaten over ruimtelijke kenmerken moeten dus met de nodige voorzichtigheid worden geïnterpreteerd. Ten vierde is het gepresenteerde protocol geoptimaliseerd voor gezonde volwassen spieren, maar aanpassingen kunnen nodig zijn als het uitgangsmateriaal afkomstig is van verouderde of myopathische spieren die uitgebreide fibrose, verhoogde adipogene afzetting of gecompromitteerde celactivering vertonen.
De meeste van deze beperkingen zijn gemeenschappelijk voor andere methoden van ex vivo spierstudies, maar dit protocol heeft verschillende voordelen ten opzichte van hen. Het is het enige protocol dat het mogelijk maakt om grote aantallen rustgevende reservesatellietcellen te oogsten. Bovendien vertegenwoordigt het een goedkope en ongecompliceerde methode die niet de speciale kweekomstandigheden of expertise vereist die gepaard gaan met geïnduceerde pluripotente stamcellen, embryonale stamcellen, myosfeercultuur of organoïdecultuur. Bovendien is de bulkcultuur niet afhankelijk van de gecompliceerde infrastructuur en standaardisatie die gepaard gaat met culturen van myogene cellen in hydrogels of andere steigers. Vergeleken met culturen van geïsoleerde myovezels, FACS-geïsoleerde primaire cellen of met preplating verrijkte primaire cellen, behoudt de bulkcultuur meer celpopulaties die aanwezig zijn in de fysiologische spieromgeving. Deze cellen doorlopen een relatief fysiologisch pad van activering en differentiatie dat wordt aangedreven door de groeifactoren van het kweekmedium in plaats van de extreme en ongebruikelijke signalen van het slangengif dat gewoonlijk wordt gebruikt om spierregeneratie in vivo te bestuderen 30,31. Ten slotte is de gepresenteerde celkweek voordelig ten opzichte van het gebruik van C2C12-cellen, die, zoals bij elke cellijn, genetische veranderingen vertonen in vergelijking met endogene of primaire cellen.
De bovenstaande voordelen maken dit protocol tot een krachtig hulpmiddel voor toepassingen zoals celamplificatie en het genereren van een rustgevende satellietcelpool, die nodig zijn om celtherapieën te ontwikkelen of zelfs fundamentele vragen over rust en cellulaire/moleculaire regulatie te beantwoorden. Bovendien kan het protocol worden gebruikt om moleculaire signalering te wijzigen via medicijnen, siRNA-targeting of transfectie met vectoren (plasmide, virussen) die de overexpressie of expressie van dominante negatieve vormen van de factoren van belang induceren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat er geen sprake is van belangenverstrengeling.
Acknowledgments
Voor figuur 2 zijn sjablonen van Servier Medical Art (https://smart.servier.com/) gebruikt. Het FR-lab wordt ondersteund door de Association Française contre les Myopathies - AFM via TRANSLAMUSCLE (subsidies 19507 en 22946), de Fondation pour la Recherche Médicale - FRM (EQU202003010217, ENV202004011730, ECO201806006793), het Agence Nationale pour la Recherche - ANR (ANR-21-CE13-0006-02, ANR-19-CE13-0010, ANR-10-LABX-73) en de La Ligue Contre le Cancer (IP/SC-17130). De bovengenoemde financiers hadden geen rol in het ontwerp, de verzameling, de analyse, de interpretatie of de rapportage van deze studie of het schrijven van dit manuscript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-CD31 | BD | 550274 | dilution 1:100 |
| anti-FOSB | Santa Cruz | sc-7203 | dilution 1:200 |
| anti-GFP | Abcam | ab13970 | dilution 1:1000 |
| anti-Ki67 | Abcam | ab16667 | dilution 1:1000 |
| anti-MyHC | DSHB | MF20-c | dilution 1:400 |
| anti-MYOD | Active Motif | 39991 | dilution 1:200 |
| anti-MYOG | Santa Cruz | sc-576 | dilution 1:150 |
| anti-Pax7 | Santa Cruz | sc-81648 | dilution 1:100 |
| anti-PDGFRα | Invitrogen | PA5-16571 | dilution 1:50 |
| b-FGF | Peprotech | 450-33 | concentration 4 ng/mL |
| Bovine serum albumin (BSA) – used for digestion | Sigma Aldrich | A7906-1006 | concentration 0.2% |
| BSA IgG-free, protease-free – used for staining | Jackson ImmunoResearch | 001-000-162 | concentration 5% |
| Cell strainer 40 um | Dominique Dutscher | 352340 | |
| Cell strainer 70 um | Dominique Dutscher | 352350 | |
| Cell strainer 100 um | Dominique Dutscher | 352360 | |
| Collagenase | Roche | 10103586001 | concentration 0.5 U/mL |
| Culture plate | Sarstedt | 94.6140.802 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Euromedex | UD8050-05-A | |
| Dispase | Roche | 4942078001 | concentration 3 U/mL |
| Dissection forceps size 5 | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Dissection forceps size 55 | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Dissection scissors (big, straight) | Fine Science Tools | 9146-11 | ideal for chopping |
| Dissection scissors (small, curved) | Fine Science Tools | 15017-10 | |
| Dissection scissors (small, straight) | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | ThermoFisher | 41966-029 | |
| EdU Click-iT kit | ThermoFisher | C10340 | |
| Fetal bovine serum – option 1 | Eurobio | CVF00-01 | |
| Fetal bovine serum – option 2 | Gibco | 10270-106 | |
| Matrigel | Corning Life Sciences | 354234 | coating solution |
| Parafilm | Dominique Dutscher | 090261 | flexible film |
| Paraformaldehyde – option 1 | PanReac AppliChem ITW Reagents | 211511.1209 | concentration 4% |
| Paraformaldeyde – option 2 | ThermoFisher | 28908 | concentration 4% |
| Penicillin streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Shaking water bath | ThermoFisher | TSSWB27 | |
| TritonX100 | Sigma Aldrich | T8532-500 ML | concentration 0.5% |
| Wild-type mice | Janvier | C57BL/6NRj |
References
- Frontera, W. R., Ochala, J. Skeletal muscle: A brief review of structure and function. Calcified Tissue International. 96 (3), 183-195 (2015).
- Forcina, L., Cosentino, M., Musarò, A. Mechanisms regulating muscle regeneration: Insights into the interrelated and time-dependent phases of tissue healing. Cells. 9 (5), 1297 (2020).
- Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 9 (2), 493-495 (1961).
- Lepper, C., Partridge, T. A., Fan, C. -M. An absolute requirement for Pax7-positive satellite cells in acute injury-induced skeletal muscle regeneration. Development. 138 (17), 3639-3646 (2011).
- McCarthy, J. J., et al. Effective fiber hypertrophy in satellite cell-depleted skeletal muscle. Development. 138 (17), 3657-3666 (2011).
- Murphy, M. M., Lawson, J. A., Mathew, S. J., Hutcheson, D. A., Kardon, G. Satellite cells, connective tissue fibroblasts and their interactions are crucial for muscle regeneration. Development. 138 (17), 3625-3637 (2011).
- Sambasivan, R., et al. Pax7-expressing satellite cells are indispensable for adult skeletal muscle regeneration. Development. 138 (17), 3647-3656 (2011).
- Hicks, M. R., Pyle, A. D. The emergence of the stem cell niche. Trends in Cell Biology. 33 (22), 112-123 (2022).
- Relaix, F., et al. Perspectives on skeletal muscle stem cells. Nature Communications. 12 (1), 692 (2021).
- Gama, J. F. G., et al. Role of regulatory T cells in skeletal muscle regeneration: A systematic review. Biomolecules. 12 (6), 817 (2022).
- Loreti, M., Sacco, A. The jam session between muscle stem cells and the extracellular matrix in the tissue microenvironment. NPJ Regenerative Medicine. 7 (1), 16 (2022).
- Sambasivan, R., et al. Distinct regulatory cascades govern extraocular and pharyngeal arch muscle progenitor cell fates. Developmental Cell. 16 (6), 810-821 (2009).
- Pereira, P. D., et al. Quantification of cell cycle kinetics by EdU (5-ethynyl-2'-deoxyuridine)-coupled-fluorescence-intensity analysis. Oncotarget. 8 (25), 40514-40532 (2017).
- Bismuth, K., Relaix, F. Genetic regulation of skeletal muscle development. Experimental Cell Research. 316 (18), 3081-3086 (2010).
- Yin, H., Price, F., Rudnicki, M. A. Satellite cells and the muscle stem cell niche. Physiological Reviews. 93 (1), 23-67 (2013).
- Lertkiatmongkol, P., Liao, D., Mei, H., Hu, Y., Newman, P. J. Endothelial functions of platelet/endothelial cell adhesion molecule-1 (CD31). Current Opinion in Hematology. 23 (3), 253-259 (2016).
- Scholzen, T., Gerdes, J. The Ki-67 protein: From the known and the unknown. Journal of Cellular Physiology. 182 (3), 311-322 (2000).
- Abou-Khalil, R., Le Grand, F., Chazaud, B. Human and murine skeletal muscle reserve cells. Stem Cell Niche. 1035, 165-177 (2013).
- Pasut, A., Oleynik, P., Rudnicki, M. A. Isolation of muscle stem cells by fluorescence activated cell sorting cytometry. Methods in Molecular Biology. 798, 53-64 (2011).
- Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nature Protocols. 10 (10), 1612-1624 (2015).
- Montarras, D., et al. Direct isolation of satellite cells for skeletal muscle regeneration. Science. 309 (5743), 2064-2067 (2005).
- Qu, Y., Edwards, K., Barrow, J. Isolation, culture, and use of primary murine myoblasts in small-molecule screens. STAR Protocols. 4 (2), 102149 (2023).
- Danoviz, M. E., Yablonka-Reuveni, Z. Skeletal muscle satellite cells: Background and methods for isolation and analysis in a primary culture system. Methods in Molecular Biology. 798, 21-52 (2011).
- Saclier, M., Theret, M., Mounier, R., Chazaud, B. Effects of macrophage conditioned-medium on murine and human muscle cells: analysis of proliferation, differentiation, and fusion. Methods in Molecular Biology. 1556, 317-327 (2017).
- Giordani, L., et al. High-dimensional single-cell cartography reveals novel skeletal muscle-resident cell populations. Molecular Cell. 74 (3), 609-621 (2019).
- Tabula Muris Consortium et al. Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris. Nature. 562 (7727), 367-372 (2018).
- Brunetti, J., Koenig, S., Monnier, A., Frieden, M. Nanopattern surface improves cultured human myotube maturation. Skeletal Muscle. 11 (1), 12 (2021).
- Denes, L. T., et al. Culturing C2C12 myotubes on micromolded gelatin hydrogels accelerates myotube maturation. Skeletal Muscle. 9 (1), 17 (2019).
- LaFramboise, W. A., et al. Effect of muscle origin and phenotype on satellite cell muscle-specific gene expression. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 35 (10), 1307-1318 (2003).
- Azhar, M., Wardhani, B. W. K., Renesteen, E. The regenerative potential of Pax3/Pax7 on skeletal muscle injury. Journal of Generic Engineering and Biotechnology. 20 (1), 143 (2022).
- Hardy, D., et al. Comparative study of injury models for studying muscle regeneration in mice. PLoS One. 11 (1), e0147198 (2016).
