Niet-gefractioneerde bulkkweek van skeletspieren van muizen om niche- en stamcelrust te recapituleren
Summary
Skeletspieren bestaan uit meerdere celtypen, waaronder residente stamcellen, elk met een speciale bijdrage aan de homeostase en regeneratie van spieren. Hier worden de 2D-kweek van spierstamcellen en de spiercelniche in een ex vivo setting beschreven die veel van de fysiologische, in vivo en omgevingskenmerken behoudt.
Abstract
Skeletspieren zijn het grootste weefsel van het lichaam en vervullen meerdere functies, van voortbeweging tot het regelen van de lichaamstemperatuur. De functionaliteit en het herstel van blessures zijn afhankelijk van een veelheid aan celtypen en van moleculaire signalen tussen de kernspiercellen (myovezels, spierstamcellen) en hun niche. De meeste experimentele instellingen behouden deze complexe fysiologische micro-omgeving niet, en ze laten ook niet de ex vivo studie van spierstamcellen in rust toe, een celtoestand die voor hen cruciaal is. Hier wordt een protocol geschetst voor de ex vivo kweek van spierstamcellen met cellulaire componenten van hun niche. Door de mechanische en enzymatische afbraak van spieren wordt een mengsel van celtypen verkregen, dat in 2D-kweek wordt gebracht. Immunokleuring toont aan dat binnen 1 week meerdere nichecellen in kweek aanwezig zijn naast myovezels en, belangrijker nog, Pax7-positieve cellen die de kenmerken vertonen van slapende spierstamcellen. Deze unieke eigenschappen maken dit protocol tot een krachtig hulpmiddel voor celamplificatie en het genereren van rustgevende stamcellen die kunnen worden gebruikt om fundamentele en translationele vragen te beantwoorden.
Introduction
Beweging, ademhaling, metabolisme, lichaamshouding en het handhaven van de lichaamstemperatuur zijn allemaal afhankelijk van skeletspieren, en storingen in de skeletspier kunnen dus slopende pathologieën veroorzaken (d.w.z. myopathieën, spierdystrofieën, enz.) 1. Gezien de essentiële functies en overvloed ervan, hebben skeletspieren de aandacht getrokken van onderzoekslaboratoria over de hele wereld die ernaar streven de belangrijkste aspecten te begrijpen die de normale spierfunctie ondersteunen en als therapeutische doelen kunnen dienen. Bovendien zijn skeletspieren een veelgebruikt model om regeneratie en stamcelfunctie te bestuderen, aangezien gezonde spieren zichzelf volledig kunnen herstellen na volledig letsel en degeneratie, voornamelijk dankzij de inwonendestamcellen2; Deze worden ook wel satellietcellen genoemd en zijn gelokaliseerd onder de basale lamina in de periferie van de spiervezels3.
De kerncellen van volwassen skeletspieren zijn de myofibers (lange syncytiële multinucleaire cellen) en de satellietcellen (stamcellen met myogeen potentieel die in rust zijn totdat een verwonding ze activeert). De laatste cellen zijn de centrale cellen van spierregeneratie en dit proces kan niet plaatsvinden in hun afwezigheid 4,5,6,7. In hun directe micro-omgeving zijn er meerdere celtypen en moleculaire factoren die hen signaleren. Deze niche wordt geleidelijk tot stand gebracht tijdens de ontwikkeling en tot de volwassenheid8. Volwassen spieren bevatten meerdere celtypen (endotheelcellen, pericyten, macrofagen, fibro-adipogene voorlopercellen-FAP’s, regulerende T-cellen, enz.) 9,10 en extracellulaire matrixcomponenten (laminines, collagenen, fibronectine, fibrillines, periostin, enz.) 11 die met elkaar en met de satellietcellen interageren in de context van gezondheid, ziekte en regeneratie.
Het behoud van deze complexe niche in experimentele omgevingen is fundamenteel maar uitdagend. Even moeilijk is het om rust te handhaven of terug te keren naar rust, een celtoestand die cruciaal is voor satellietcellen9. Er zijn verschillende methoden geïntroduceerd om deze uitdagingen gedeeltelijk aan te pakken, elk met zijn voor- en nadelen (gedetailleerd in het discussiegedeelte). Hier wordt een methode gepresenteerd die deze twee barrières gedeeltelijk kan overwinnen. Spieren worden eerst geoogst en vervolgens mechanisch en enzymatisch afgebroken voordat het heterogene celmengsel in kweek wordt gebracht. In de loop van de kweek worden veel celtypen van de niche gedetecteerd en worden satellietcellen waargenomen die zijn teruggekeerd naar rust. Als laatste stap van het protocol worden de immunofluorescentiestappen gepresenteerd die de detectie van elk celtype mogelijk maken door het gebruik van universeel aanvaarde markers.
Protocol
Representative Results
Discussion
De volwassen skeletspierfunctie wordt ondersteund door een fijn georkestreerde reeks cellulaire interacties en moleculaire signalen. Hier wordt een methode gepresenteerd die het mogelijk maakt om deze parameters te bestuderen in een ex vivo setting die sterk lijkt op de fysiologische micro-omgeving.
Verschillende groepen hebben in vitro methoden gerapporteerd om myogene cellen te kweken. Deze methoden waren gericht op het isoleren van satellietcellen om hun myogene voorlopere…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Voor figuur 2 zijn sjablonen van Servier Medical Art (https://smart.servier.com/) gebruikt. Het FR-lab wordt ondersteund door de Association Française contre les Myopathies – AFM via TRANSLAMUSCLE (subsidies 19507 en 22946), de Fondation pour la Recherche Médicale – FRM (EQU202003010217, ENV202004011730, ECO201806006793), het Agence Nationale pour la Recherche – ANR (ANR-21-CE13-0006-02, ANR-19-CE13-0010, ANR-10-LABX-73) en de La Ligue Contre le Cancer (IP/SC-17130). De bovengenoemde financiers hadden geen rol in het ontwerp, de verzameling, de analyse, de interpretatie of de rapportage van deze studie of het schrijven van dit manuscript.
Materials
| anti-CD31 | BD | 550274 | dilution 1:100 |
| anti-FOSB | Santa Cruz | sc-7203 | dilution 1:200 |
| anti-GFP | Abcam | ab13970 | dilution 1:1000 |
| anti-Ki67 | Abcam | ab16667 | dilution 1:1000 |
| anti-MyHC | DSHB | MF20-c | dilution 1:400 |
| anti-MYOD | Active Motif | 39991 | dilution 1:200 |
| anti-MYOG | Santa Cruz | sc-576 | dilution 1:150 |
| anti-Pax7 | Santa Cruz | sc-81648 | dilution 1:100 |
| anti-PDGFRα | Invitrogen | PA5-16571 | dilution 1:50 |
| b-FGF | Peprotech | 450-33 | concentration 4 ng/mL |
| bovine serum albumin (BSA) – used for digestion | Sigma Aldrich | A7906-1006 | concentration 0.2% |
| BSA IgG-free, protease-free – used for staining | Jackson ImmunoResearch | 001-000-162 | concentration 5% |
| cell strainer 40 um | Dominique Dutscher | 352340 | |
| cell strainer 70 um | Dominique Dutscher | 352350 | |
| cell strainer 100 um | Dominique Dutscher | 352360 | |
| Collagenase | Roche | 10103586001 | concentration 0.5 U/mL |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Euromedex | UD8050-05-A | |
| Dispase | Roche | 4942078001 | concentration 3 U/mL |
| Dissection forceps size 5 | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Dissection forceps size 55 | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Dissection scissors (big, straight) | Fine Science Tools | 9146-11 | ideal for chopping |
| Dissection scissors (small, curved) | Fine Science Tools | 15017-10 | |
| Dissection scissors (small, straight) | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | ThermoFisher | 41966-029 | |
| EdU Click-iT kit | ThermoFisher | C10340 | |
| Fetal bovine serum – option 1 | Eurobio | CVF00-01 | |
| Fetal bovine serum – option 2 | Gibco | 10270-106 | |
| Matrigel | Corning Life Sciences | 354234 | coating solution |
| Parafilm | Dominique Dutscher | 090261 | flexible film |
| Penicillin streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Paraformaldehyde – option 1 | PanReac AppliChem ITW Reagents | 211511.1209 | concentration 4% |
| Paraformaldeyde – option 2 | ThermoFisher | 28908 | concentration 4% |
| Shaking water bath | ThermoFisher | TSSWB27 | |
| TritonX100 | Sigma Aldrich | T8532-500 ML | concentration 0.5% |
| Wild-type mice | Janvier | C57BL/6NRj |
References
- Frontera, W. R., Ochala, J. Skeletal muscle: A brief review of structure and function. Calcified Tissue International. 96 (3), 183-195 (2015).
- Forcina, L., Cosentino, M., Musarò, A. Mechanisms regulating muscle regeneration: Insights into the interrelated and time-dependent phases of tissue healing. Cells. 9 (5), 1297 (2020).
- Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 9 (2), 493-495 (1961).
- Lepper, C., Partridge, T. A., Fan, C. -. M. An absolute requirement for Pax7-positive satellite cells in acute injury-induced skeletal muscle regeneration. Development. 138 (17), 3639-3646 (2011).
- McCarthy, J. J., et al. Effective fiber hypertrophy in satellite cell-depleted skeletal muscle. Development. 138 (17), 3657-3666 (2011).
- Murphy, M. M., Lawson, J. A., Mathew, S. J., Hutcheson, D. A., Kardon, G. Satellite cells, connective tissue fibroblasts and their interactions are crucial for muscle regeneration. Development. 138 (17), 3625-3637 (2011).
- Sambasivan, R., et al. Pax7-expressing satellite cells are indispensable for adult skeletal muscle regeneration. Development. 138 (17), 3647-3656 (2011).
- Hicks, M. R., Pyle, A. D. The emergence of the stem cell niche. Trends in Cell Biology. 33 (22), 112-123 (2022).
- Relaix, F., et al. Perspectives on skeletal muscle stem cells. Nature Communications. 12 (1), 692 (2021).
- Gama, J. F. G., et al. Role of regulatory T cells in skeletal muscle regeneration: A systematic review. Biomolecules. 12 (6), 817 (2022).
- Loreti, M., Sacco, A. The jam session between muscle stem cells and the extracellular matrix in the tissue microenvironment. NPJ Regenerative Medicine. 7 (1), 16 (2022).
- Sambasivan, R., et al. Distinct regulatory cascades govern extraocular and pharyngeal arch muscle progenitor cell fates. Developmental Cell. 16 (6), 810-821 (2009).
- Pereira, P. D., et al. Quantification of cell cycle kinetics by EdU (5-ethynyl-2′-deoxyuridine)-coupled-fluorescence-intensity analysis. Oncotarget. 8 (25), 40514-40532 (2017).
- Bismuth, K., Relaix, F. Genetic regulation of skeletal muscle development. Experimental Cell Research. 316 (18), 3081-3086 (2010).
- Yin, H., Price, F., Rudnicki, M. A. Satellite cells and the muscle stem cell niche. Physiological Reviews. 93 (1), 23-67 (2013).
- Lertkiatmongkol, P., Liao, D., Mei, H., Hu, Y., Newman, P. J. Endothelial functions of platelet/endothelial cell adhesion molecule-1 (CD31). Current Opinion in Hematology. 23 (3), 253-259 (2016).
- Scholzen, T., Gerdes, J. The Ki-67 protein: From the known and the unknown. Journal of Cellular Physiology. 182 (3), 311-322 (2000).
- Abou-Khalil, R., Le Grand, F., Chazaud, B. Human and murine skeletal muscle reserve cells. Stem Cell Niche. 1035, 165-177 (2013).
- Pasut, A., Oleynik, P., Rudnicki, M. A. Isolation of muscle stem cells by fluorescence activated cell sorting cytometry. Methods in Molecular Biology. 798, 53-64 (2011).
- Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nature Protocols. 10 (10), 1612-1624 (2015).
- Montarras, D., et al. Direct isolation of satellite cells for skeletal muscle regeneration. Science. 309 (5743), 2064-2067 (2005).
- Qu, Y., Edwards, K., Barrow, J. Isolation, culture, and use of primary murine myoblasts in small-molecule screens. STAR Protocols. 4 (2), 102149 (2023).
- Danoviz, M. E., Yablonka-Reuveni, Z. Skeletal muscle satellite cells: Background and methods for isolation and analysis in a primary culture system. Methods in Molecular Biology. 798, 21-52 (2011).
- Saclier, M., Theret, M., Mounier, R., Chazaud, B. Effects of macrophage conditioned-medium on murine and human muscle cells: analysis of proliferation, differentiation, and fusion. Methods in Molecular Biology. 1556, 317-327 (2017).
- Giordani, L., et al. High-dimensional single-cell cartography reveals novel skeletal muscle-resident cell populations. Molecular Cell. 74 (3), 609-621 (2019).
- Tabula Muris Consortium et al. Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris. Nature. 562 (7727), 367-372 (2018).
- Brunetti, J., Koenig, S., Monnier, A., Frieden, M. Nanopattern surface improves cultured human myotube maturation. Skeletal Muscle. 11 (1), 12 (2021).
- Denes, L. T., et al. Culturing C2C12 myotubes on micromolded gelatin hydrogels accelerates myotube maturation. Skeletal Muscle. 9 (1), 17 (2019).
- LaFramboise, W. A., et al. Effect of muscle origin and phenotype on satellite cell muscle-specific gene expression. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 35 (10), 1307-1318 (2003).
- Azhar, M., Wardhani, B. W. K., Renesteen, E. The regenerative potential of Pax3/Pax7 on skeletal muscle injury. Journal of Generic Engineering and Biotechnology. 20 (1), 143 (2022).
- Hardy, D., et al. Comparative study of injury models for studying muscle regeneration in mice. PLoS One. 11 (1), e0147198 (2016).
