Summary
骨骼肌由多种细胞类型组成，包括常驻干细胞，每种细胞都对肌肉稳态和再生有特殊贡献。在这里，描述了肌肉干细胞的 2D 培养和肌肉细胞生态位在 离体 环境中保留了许多生理、 体内和环境特征。
Abstract
骨骼肌是身体最大的组织，具有从运动到体温控制的多种功能。它的功能和从损伤中恢复取决于多种细胞类型以及核心肌肉细胞（肌纤维、肌肉干细胞）与其生态位之间的分子信号。大多数实验环境不能保留这种复杂的生理微环境，也不允许对静止的肌肉干细胞进行 离体 研究，这种细胞状态对它们至关重要。在这里，概述了具有其生态位的细胞成分的肌肉干细胞的 离体 培养方案。通过肌肉的机械和酶促分解，获得细胞类型的混合物，并将其放入 2D 培养物中。免疫染色显示，在 1 周内，培养物中存在多个生态位细胞以及具有静止肌肉干细胞特征的 Pax7 阳性细胞。这些独特的特性使该协议成为细胞扩增和产生可用于解决基本和转化问题的静止样干细胞的强大工具。
Introduction
运动、呼吸、新陈代谢、身体姿势和体温维持都依赖于骨骼肌，因此骨骼肌功能障碍会导致使人衰弱的病症（即肌病、肌营养不良等）。1. 鉴于其基本功能和丰富性，骨骼肌引起了全球研究实验室的关注，这些实验室致力于了解支持正常肌肉功能并可作为治疗靶点的关键方面。此外，骨骼肌是研究再生和干细胞功能的广泛使用模型，因为健康的肌肉在完全损伤和退化后可以完全自我修复，这主要是由于其驻留的干细胞2;这些也称为卫星细胞，位于肌纤维外围的基底层下3.
成人骨骼肌的核心细胞是肌纤维（长合胞体多核细胞）和卫星细胞（具有肌源性潜力的干细胞，在损伤激活它们之前处于静止状态）。后者细胞是肌肉再生的中心细胞，在没有它们的情况下，这个过程不会发生4,5,6,7。在它们的直接微环境中，有多种细胞类型和分子因子向它们发出信号。这个生态位在整个发育过程中逐渐建立，直到成年8.成人肌肉含有多种细胞类型（内皮细胞、周细胞、巨噬细胞、纤维脂肪祖细胞-FAPs、调节性T细胞等）9,10和细胞外基质成分（层粘连蛋白，胶原蛋白，纤连蛋白，原纤维蛋白，骨膜蛋白等）11 在健康、疾病和再生的背景下相互相互作用以及与卫星细胞相互作用。
在实验环境中保留这个复杂的生态位是基本的，但具有挑战性。同样困难的是保持或恢复静止状态，这是对卫星小区至关重要的细胞状态9。已经引入了几种方法来部分应对这些挑战，每种方法都有其优点和缺点（详见讨论部分）。在这里，提出了一种可以部分克服这两个障碍的方法。肌肉最初被收获，然后在异质细胞混合物被放入培养物之前通过机械和酶促分解。在培养过程中，检测到生态位的许多细胞类型，并观察到已恢复静止的卫星细胞。作为协议的最后一步，介绍了允许通过使用普遍接受的标记物检测每种细胞类型的免疫荧光步骤。
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Protocol
所有实验均符合法国和欧盟的动物法规，特别是指令2010/63/UE。动物被饲养在动物设施的受控和富集环境中，认证编号为A94 028 379和D94-028-028;它们仅由授权的研究人员和动物看护人处理，并由动物饲养人员目视检查其一生中是否有不适迹象。他们在解剖前因颈椎脱位而被安乐死。在动物的一生中没有进行任何介入手术;因此，没有必要获得伦理委员会和法国高等教育、研究和创新部对该程序的批准。事实上，根据 2010/63/UE 指令，安乐死和尸后解剖不需要伦理许可。本手稿中介绍的结果来自野生型C57BL / 6NRj系（见 材料表）和转基因 Tg：Pax7-nGFP 系12（由我们团队培育）。该方案应用于8-12周龄的雄性和雌性小鼠。
1.试剂和设备制备预消化
- 用70%乙醇喷洒解剖工具（直剪刀和弯剪刀，镊子，见 材料表），并用纸擦干。在软木板上涂上铝箔，并在附近放置 10 厘米的培养皿（每只动物一个）。将纸张和 70% 乙醇放在触手可及的地方。
注意：在解剖结束时，用水冲洗解剖工具，然后用70%乙醇喷洒，并用纸擦干。 - 将旋转水浴设置为37°C，并通过将DMEM与1%青霉素 - 链霉素，0.5U / mL胶原酶，3U / mL分散酶（参见 材料表）和0.2%BSA在50mL管中混合来制备消化混合物（20mL /动物）。
- 将消化混合物通过细胞培养罩中的0.22μm过滤器。
注意：建议每次都新鲜准备消化混合物。
2. 酶解后的试剂和设备准备
- 消化后，混合物可以冷冻或培养。冷冻时，准备 10% DMSO：90% 胎牛血清 （FBS） 以及一组冻存管（每 2 mL 冻存管 1 mL 细胞悬液）。对于培养，准备培养基（补充有 1% 青霉素 - 链霉素、4 ng/mL bFGF 和 20% FBS 的 DMEM）和一组 8 孔板。在电镀细胞之前，必须对板进行涂层（步骤7.1中提供了详细信息）。
- 对于染色，在磷酸盐缓冲盐水（PBS）（0.15 mL /孔的8孔板）和封闭溶液（PBS中的5%无IgG牛血清白蛋白[BSA];0.15mL /孔的8孔板）中制备4%多聚甲醛（PFA）。
注意：不要吸入PFA粉末;在化学罩下准备和处理。
3. 解剖
- 用70%乙醇喷洒安乐死的动物。用大剪刀在腹部水平处做一个水平切口（身体左侧到右侧），并在腰部周围剪开。将皮肤从后肢上拉下来，露出肌肉（图1A）。
- 将动物放在铝箔覆盖的软木板上，然后固定相对的前肢和后肢。快速将所有后肢肌肉（前部和后部）放入放置在冰上的10厘米培养皿中（图1B，C）。特别注意从股四头肌和后肌周围区域去除脂肪组织。筋膜、神经和肌腱也可以在这一点上切除，前提是这不会影响解剖所花费的总时间。
注意：双侧后肢的最佳解剖时间应约为 15-20 分钟。建议解剖时间不超过30分钟。 - 偶尔向肌肉中滴入DMEM以保持肌肉湿润，但不要太多，因为这会使切碎变得困难。对另一只后肢重复上述步骤。一旦一只动物的所有肌肉都在培养皿中（图1D），用剪刀将它们切碎7-10分钟以获得光滑的匀浆（图1E）。
注：在该方案中，使用补充有L-谷氨酰胺，丙酮酸和4.5g / L D-葡萄糖的DMEM。
图 1：培养前肌肉准备。（A） 去除皮肤以露出后肢肌肉，如步骤 3.1 所述。（乙，丙）如步骤3.2所述，所有后肢肌肉都收获（B）在骨头周围和（C）之间。（D） 如步骤3.3所述，将收获的肌肉放入冰上的10厘米培养皿中，并用DMEM滴液保持湿润。（E） 用剪刀将肌肉切碎，直到获得具有本图像中描绘的稠度的光滑糊状物。（F） 最终离心后的颗粒图像;蓝色箭头突出显示了蓝色虚线下方的颗粒，该颗粒与管子相对。 请点击这里查看此图的较大版本.
4. 消化
注意：在消化结束时，第5部分需要4°C的离心机，一桶冰，三个细胞过滤器（100um，70um，40um）和三个50mL管（每只动物）。
- 按照步骤1.2中的说明制备和过滤消化混合物。将混合物放在冰上。
- 一旦所有肌肉都被切碎，将匀浆放入装有 20 mL 消化混合物的 50 mL 试管中。用柔性薄膜包裹盖子的边缘以防止泄漏，并将试管置于37°C振荡水浴中以中低速（50rpm）进行。
- 在37°C下1小时后，打开盖子，用10mL移液管轻轻上下移液7次，以获得均匀的混合物。在盖子周围涂上新薄膜，然后将其放回摇晃的水浴中。1小时后，取出管子，关闭浴液。
注意：对于培养物，在移至第 5 节之前，使用该孵育时间按照步骤 7.1 中的说明涂覆板。
5. 过滤
- 用冷DMEM（补充有1%青霉素 - 链霉素）填充消化管，最多50mL。将试管倒置三次混合。将 DMEM 保存在冰桶中以备后续步骤使用。
- 将 100 μm 细胞过滤器放在新的 50 mL 试管上。将消化的混合物通过细胞过滤器进入新管中。在4°C下以600× g 离心5分钟。 将上清液倒入液体废物容器中。
- 将沉淀重悬于 1 mL 冷 DMEM（补充有 1% 青霉素 - 链霉素）中。用相同的 DMEM 填充试管至 50 mL。注意：如果跳过离心机，下一个颗粒将更难识别和维护。
- 将 70 μm 细胞过滤器放在新的 50 mL 试管上。将离心/重悬的混合物通过细胞过滤器进入新管中。在4°C下以80× g 离心5分钟。
注意：此步骤不是强制性的，但建议用于消除细胞碎片。 - 将 40 μm 细胞过滤器放在新的 50 mL 管上。将上清液通过细胞过滤器进入新管中。在4°C下以600× g 离心5分钟，将上清液倒入液体废物容器中，并将沉淀重悬于培养罩下的FBS中。在此步骤中，颗粒非常小（图1F）。
注意：通过40μm过滤器过滤可去除碎屑，这些碎屑将在培养物的后期染色中产生非特异性信号。
6.（可选）冻结
注意：第 6 部分是可选的。过滤后可以暂停实验方案，但这会降低细胞存活率和培养成功率。
- 加入DMSO以获得10%DMSO：90%FBS比例，并转移到冷冻管中（每2mL冷冻管1mL重悬沉淀）。
- 将冷冻管在-80°C下放入聚苯乙烯盒中过夜。第二天移至-150°C进行长期储存。
注意：也可以在-80°C下短期储存。 - 开始培养时，在37°C水浴中快速解冻冻管，直到细胞悬液解冻。在培养罩下与 4 mL DMEM 混合。在4°C下以600× g 旋转5分钟。 移出上清液，然后按照步骤7.2中的说明继续。
7. 培养
注：冷冻或新鲜细胞悬浮液可预期填充 24-32 孔，每孔 3 至 4 个 8 孔板。
- 用包被溶液包被8孔板，该溶液应在4°C或冰上解冻（储备包被溶液通常保持在-20°C）。向一个孔中加入 0.4 mL 包衣溶液，然后从一个孔移液到另一个孔。将包衣溶液转移至所有孔后，可将其回收并重新冷冻，以备将来培养。在铺板细胞之前，将涂层板在37°C下保持30分钟。
- 将补充有 4 ng/mL bFGF（参见 材料表）的 DMEM（补充有 1% 青霉素 - 链霉素）添加到 FBS 细胞悬液中，以获得 20% FBS：80% DMEM 比率。
注意：尽管添加 bFGF 在原代成肌细胞培养和批量培养中的卫星样细胞生产中是有益的，但其添加是可选的，因为在 ~7 天的批量培养中省略它不会严重影响细胞产量。 - 在包被的 8 孔板中每孔板（来自步骤 7.2）板 0.4 mL 悬浮液。
注意：计算每只动物30cm2 的冷冻和新鲜制剂的培养物。 - 将培养物在37°C下用5%CO2 孵育长达10天，在培养物开始变为淡黄色（通常为5-7天）后每天更换培养基。
注：要定量细胞周期13 的 S 期细胞，请在固定前 2 小时加入 10 μM EdU。为了捕获第一个S期，从板中加入10μM EdU，并在培养40小时时固定。
8. 固定
注意：除非另有说明，否则第 8-10 节应在室温下进行。
- 移出培养基，并用 4% PFA（0.15 mL/孔）固定细胞。
注意：在化学罩下添加 PFA。
注意：如果所有孔同时固定，则在室温下与PFA孵育10分钟。如果孔固定在不同的时间点，则在要固定的孔中加入PFA，并将板在37°C的培养箱中保持5分钟。 - 移出 PFA，加入 PBS 10 秒（0.15 mL/孔）。移出 PBS，加入新鲜 PBS 5 分钟（0.15 mL/孔）。
注意：如果所有孔同时固定，则在室温下与PBS一起孵育。如果孔固定在不同的时间点，则向固定孔中加入PBS，并将板保持在37°C的培养箱中5分钟。然后，加入 0.4 mL PBS，并将板在培养箱中保存长达 1 周。
9.透化和封闭
- 准备染色时，移出PBS，并用0.5%TritonX 100在PBS（0.15mL /孔）中透化8分钟。移出TritonX 100，用PBS冲洗10秒（0.15mL /孔），移出PBS，用PBS洗涤5分钟（0.15mL /孔）。
- 用不含 5% IgG 的 BSA 在 PBS 中封闭 30-60 分钟（0.15 mL/孔）。
10. 染色
- 移出BSA，加入在PBS（0.15mL /孔）中稀释的一抗混合物（参见 材料表;稀释度：抗CD31 1：100，抗FOSB 1：200，抗GFP 1：1,000，抗KI67 1：1,000，抗MyHC 1：400，抗MYOD 1：200，抗MYOG 1：150，抗PAX7 1：100，抗PDGFRa 1：50）在4°C下孵育过夜。
注：抗体孵育后，收集抗体混合物，加入叠氮化钠，并保持在4°C或-20°C（根据抗体制造商的说明）以备将来重复使用。 - 移出抗体混合物，用 PBS 冲洗 10 秒（0.15 mL/孔），移出 PBS，然后用 PBS 洗涤 5 分钟（0.15 mL/孔）。
- 移出洗涤的PBS，加入二抗混合物（山羊抗小鼠Alexa Fluor 488，山羊抗兔Alexa Fluor 555，山羊抗大鼠Alexa Fluor 647，山羊抗小鼠Alexa Fluor 555，山羊抗鸡Alexa Fluor 488，均以1：500-1,000的稀释度使用）和在PBS（0.15mL/孔）中稀释的细胞核标记物（例如DAPI）（参见 材料表）， 并在室温下孵育1小时，避光。
- 移出二抗混合物，用 PBS 冲洗 10 秒（0.15 mL/孔），移出 PBS，用 PBS 洗涤 5 分钟（0.15 mL/孔），移出 PBS，然后安装。
注意： 如果使用带有可拆卸分离器的 8 孔板，请在安装前撕下分离器。
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Representative Results
该协议允许肌肉细胞培养，同时保留卫星细胞和大多数细胞的内源性生态位。图 2 总结了协议的主要步骤，而解剖和消化的基本部分如图 1 所示。建议对后肢肌肉组织进行解剖（图1A-C），因为这组肌肉经过充分研究，并且具有发育起源和分子层次结构14。建议在无菌条件下制备所有混合物。此外，当消化混合物通过细胞培养罩下的 0.22 μm 过滤器时，观察到较低的培养污染。
当将 1/30 的散装制备物接种到包被的 1 cm2 孔板上时，培养开始后 3-4 天可以看到细长的细胞。然而，这可能因细胞浓度而异，并且细长的细胞可能会在较晚开始出现，特别是在扩展冷冻散装制剂时。大约 7 天后，培养基应该变黄，此时需要每天更换培养基。此外，在这一点上，孔需要用肌管覆盖。内皮细胞只占培养物的一小部分。成功培养的主要指标是丰富的 PAX7+ 细胞，这可能需要固定和染色。 Tg：Pax7-nGFP line12 是一种方便的小鼠模型，它允许以 GFP 表达的形式可视化 PAX7 阳性;因此，卫星小区可以很容易地被报告体GFP检测到。可以在倒置落射荧光显微镜上以 20 倍放大倍率观察到 GFP，从而可以在培养过程中分析培养成功率。这也使得在散装培养物中对PAX7-GFP细胞进行活体成像成为可能。培养物的放置时间不得超过 10 天。之后，储备细胞的数量开始下降，肌管可能会从板上脱落。失败的培养，包括基于最近冷冻细胞培养的经验，仍然可以产生大部分纤维，但很少产生 PAX7-GFP 细胞。当使用没有PAX7荧光标记物的小鼠时，有必要进行染色以评估储备细胞生成的功效。
以下抗体已经过测试，并且与方案第 10 节中介绍的染色方案配合良好：抗 PAX7（卫星细胞和活化成肌细胞的标志物 15;也是该培养物中出现的储备细胞的标志物）、抗肌球蛋白（肌管的标志物15）、抗 CD31（内皮细胞的标志物16）、抗 GFP（如果使用报告小鼠）、 抗 MYOD（成肌细胞的标志物 15）、抗 MYOG（分化肌细胞的标志物15）、抗 KI67（增殖细胞的标志物17）和抗 PDGFRα（FAP 的标志物15）。图 3 显示了培养 7 天后的肌原性和生态位细胞。关于图3A-C，肌肉块是从野生型小鼠中培养的，而对于图3D-F，肌肉块是从上述Tg：Pax7-nGFP系中培养的。用 PAX7 和 KI67 进行双重染色（图 3A）可以标记培养 5 天后出现的储备细胞并具有肌肉干细胞特征，例如退出细胞周期（KI67-状态）和定位为形成的肌管的“卫星”。用MyHC和MYOG进行双重染色（图3B，D，E）可以标记通过肌肉分化进展的细胞，从而逐渐表达MYOG，然后合并形成多核MyHC +肌管。用CD31或PDGFRα染色允许标记生态位细胞（图3C），例如内皮细胞和FAP。图3D，E显示了由GFP标记的新兴储备单元。与GFP和MyHC共染色可以评估储备细胞的卫星细胞位置（图3E），而与GFP和其他活化/分化标志物共染色可以评估储备细胞的静止样性质（图3F）。
图 2：协议步骤概述。 （A-D）（A）解剖，（B）消化，（C）过滤和（D）培养的顺序步骤。 请点击这里查看此图的较大版本.
图3：细胞群的免疫染色。 （A） 肌源性（以 PAX7 标记;绿色）和循环（以 KI67 标记;红色）细胞的免疫荧光。细胞核用DAPI（蓝色）复染。非循环肌原细胞（KI67-PAX7+）的存在表明，该方案可以从野生型小鼠中产生静止样细胞，这些细胞在培养7天时是丰富的。（B） 野生型小鼠细胞培养 7 天后肌管（以肌球蛋白重链 [MyHC] 标记;绿色）和肌细胞（以 MYOG 标记;红色）的免疫荧光。细胞核用DAPI（蓝色）复染。（C） 野生型小鼠细胞培养 7 天后，肌原细胞（以 PAX7 标记;绿色）、间充质纤维-成脂祖细胞（以 PDGFRa 标记;红色）和内皮细胞（以 CD31 标记;品红色）的免疫荧光。细胞核用DAPI（蓝色）复染。（D） 培养 Tg：Pax7-nGFP 小鼠细胞 8 天后 GFP+ 细胞（绿色）和肌细胞（以 MYOG 标记;品红色）的免疫荧光，其中表达 PAX7 的细胞以核 GFP 标记。（E） 培养 Tg：Pax7-nGFP 小鼠细胞 7 天后 GFP+ 细胞（绿色）和肌管（用 MyHC 标记;红色）的免疫荧光。请注意，卫星细胞样细胞在 7 天后出现在培养物中。（F） 共表达卫星细胞 （PAX7）、激活 （FOSB）、增殖 （KI67） 或肌源性分化 （MYOD、MYOG） 标志物的 GFP+ 细胞比例的定量。误差线表示标准偏差。比例尺：100 um。 请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
成人骨骼肌功能由一组精心编排的细胞相互作用和分子信号支撑。在这里，提出了一种方法，该方法允许在与生理微环境非常相似的 离体 环境中研究这些参数。
一些小组已经报道了体外培养肌原细胞的方法。这些方法旨在分离卫星细胞以研究其肌源祖细胞特性。使用两种主要方法分离纯卫星细胞，从比目鱼肌和/或 EDL 肌肉18的分离纤维培养物或从 FACS 分离的卫星细胞中分离的卫星细胞，使用一组 Pax7、CD34 和 a7-整合素抗体进行阳性选择，CD45、CD31 和 Sca1 进行阴性选择 19,20,21.其他人还使用机械穿刺从明胶板上的散装培养物中分离原代成肌细胞，因为与其他细胞（如FAPs 22,23）相比，它们的粘附特性很脆弱。虽然这些方法适用于研究卫星细胞的活化或在培养中扩增它们，但细胞在缺乏通常有助于其生态位的支持细胞的环境中生长。此外，这些方法需要将肌源性祖细胞保留 2 周以上，以建立具有高 Pax7 表达的静止单核储备细胞18。卫星细胞和其他细胞类型（如巨噬细胞）的共培养也有报道。这使得研究特定细胞对增殖、分化和融合等肌原特性的直接贡献成为可能24。几项单细胞 RNA-seq 研究详细介绍了骨骼肌的细胞组成25,26。由于我们的培养条件有利于肌原细胞的产生，因此与这些体内研究相比，我们观察到批量培养中的储备细胞比例要高得多，支持细胞的比例要低得多。
本文所述的方法中已经确定了三个关键步骤，可以提高效率。首先，快速有效的切碎是必要的，以确保在消化的2小时内实现最佳的肌肉解离，从而获得更高的细胞产量。其次，消化过程中的连续旋转对于确保酶在组织中的适当扩散非常重要。最后，温和的机械解离对于最佳组织解离也很重要。
该协议有四个主要限制。首先，它仍然是一个离体系统，这意味着一些生理和生物物理线索可能会丢失或改变。这包括与肌纤维之间的信号传导，因为纤维在电镀前丢失，肌管在培养过程中重建。其次，形成的肌管是否具有胚胎或成人特征，以及它们是否代表慢肌和快肌中的不同纤维类型还有待观察。作为参考，C2C12 肌肉细胞系和人成肌细胞的培养表明，2D 培养物中的肌管不如体内肌管成熟27,28，而原代小鼠成肌细胞培养物似乎导致肌球蛋白类型代表体内发现的肌球蛋白类型 29。第三，采用这种方法，细胞在组织解离过程中失去原位位置，新形成的肌管缺乏神经肌肉和肌腱连接;因此，应谨慎解释空间要素的结果。第四，所提出的方案已针对健康的成人肌肉进行了优化，但如果起始材料来自老化或肌病性肌肉，则可能需要进行调整，这些肌肉表现出广泛的纤维化，脂肪沉积增加或细胞活化受损。
这些限制中的大多数对于其他离体肌肉研究方法很常见，但该协议与它们相比有几个优点。它是唯一允许收获大量类似静止的备用卫星单元的协议。此外，它代表了一种廉价而直接的方法，不需要与诱导多能干细胞、胚胎干细胞、肌层培养或类器官培养相关的特殊培养条件或专业知识。此外，散装培养不依赖于与水凝胶或其他支架中肌原细胞培养相关的复杂基础设施和标准化。与分离的肌纤维、FACS分离的原代细胞或预铺板富集的原代细胞的培养物相比，散装培养物保留了生理肌肉环境中存在的更多细胞群。这些细胞通过由培养基的生长因子驱动的相对生理激活和分化路径，而不是通常用于研究体内肌肉再生的蛇毒的极端和不寻常的信号 30,31。最后，所呈现的细胞培养物优于使用 C2C12 细胞，与任何细胞系一样，与内源性或原代细胞相比，C2C12 细胞具有遗传改变。
上述优点使该协议成为细胞扩增和生成类似静止的卫星细胞池等应用的强大工具，这些应用对于开发细胞疗法甚至回答有关静止和细胞/分子调控的基本问题都是必要的。此外，该方案可用于 通过 药物、siRNA靶向或转染载体（质粒、病毒）来修饰分子信号转导，这些载体诱导目标因子的显性阴性形式的过表达或表达。
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Disclosures
作者声明没有利益冲突。
Acknowledgments
在图2中，使用了施维雅Medical Art（https://smart.servier.com/）的模板。FR 实验室得到了法国抗肌病协会 - 通过 TRANSLAMUSCLE 的 AFM（赠款 19507 和 22946）、Fondation pour la Recherche Médicale - FRM（EQU202003010217、ENV202004011730、ECO201806006793）、Agence Nationale pour la Recherche - ANR （ANR-21-CE13-0006-02、ANR-19-CE13-0010、ANR-10-LABX-73） 和 La Ligue Contre le Cancer （IP/SC-17130） 的支持。上述资助者在本研究的设计、收集、分析、解释或报告或本手稿的撰写中没有任何作用。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-CD31 | BD | 550274 | dilution 1:100 |
| anti-FOSB | Santa Cruz | sc-7203 | dilution 1:200 |
| anti-GFP | Abcam | ab13970 | dilution 1:1000 |
| anti-Ki67 | Abcam | ab16667 | dilution 1:1000 |
| anti-MyHC | DSHB | MF20-c | dilution 1:400 |
| anti-MYOD | Active Motif | 39991 | dilution 1:200 |
| anti-MYOG | Santa Cruz | sc-576 | dilution 1:150 |
| anti-Pax7 | Santa Cruz | sc-81648 | dilution 1:100 |
| anti-PDGFRα | Invitrogen | PA5-16571 | dilution 1:50 |
| b-FGF | Peprotech | 450-33 | concentration 4 ng/mL |
| Bovine serum albumin (BSA) – used for digestion | Sigma Aldrich | A7906-1006 | concentration 0.2% |
| BSA IgG-free, protease-free – used for staining | Jackson ImmunoResearch | 001-000-162 | concentration 5% |
| Cell strainer 40 um | Dominique Dutscher | 352340 | |
| Cell strainer 70 um | Dominique Dutscher | 352350 | |
| Cell strainer 100 um | Dominique Dutscher | 352360 | |
| Collagenase | Roche | 10103586001 | concentration 0.5 U/mL |
| Culture plate | Sarstedt | 94.6140.802 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Euromedex | UD8050-05-A | |
| Dispase | Roche | 4942078001 | concentration 3 U/mL |
| Dissection forceps size 5 | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Dissection forceps size 55 | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Dissection scissors (big, straight) | Fine Science Tools | 9146-11 | ideal for chopping |
| Dissection scissors (small, curved) | Fine Science Tools | 15017-10 | |
| Dissection scissors (small, straight) | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | ThermoFisher | 41966-029 | |
| EdU Click-iT kit | ThermoFisher | C10340 | |
| Fetal bovine serum – option 1 | Eurobio | CVF00-01 | |
| Fetal bovine serum – option 2 | Gibco | 10270-106 | |
| Matrigel | Corning Life Sciences | 354234 | coating solution |
| Parafilm | Dominique Dutscher | 090261 | flexible film |
| Paraformaldehyde – option 1 | PanReac AppliChem ITW Reagents | 211511.1209 | concentration 4% |
| Paraformaldeyde – option 2 | ThermoFisher | 28908 | concentration 4% |
| Penicillin streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Shaking water bath | ThermoFisher | TSSWB27 | |
| TritonX100 | Sigma Aldrich | T8532-500 ML | concentration 0.5% |
| Wild-type mice | Janvier | C57BL/6NRj |
References
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