틈새 및 줄기 세포 정지를 재현하기 위한 쥐 골격근의 분획되지 않은 대량 배양
Summary
골격근은 상주 줄기세포를 포함한 여러 세포 유형으로 구성되어 있으며, 각 세포 유형은 근육 항상성과 재생에 특별한 기여를 합니다. 여기에서는 근육 줄기 세포의 2D 배양과 생리학적, in vivo 및 환경적 특성의 많은 부분을 보존하는 ex vivo 환경에서의 근육 세포 틈새에 대해 설명합니다.
Abstract
골격근은 신체에서 가장 큰 조직이며 운동에서 체온 조절에 이르기까지 다양한 기능을 수행합니다. 그 기능과 부상으로부터의 회복은 다양한 세포 유형과 핵심 근육 세포(근섬유, 근육 줄기 세포)와 틈새 사이의 분자 신호에 달려 있습니다. 대부분의 실험 환경은 이 복잡한 생리학적 미세환경을 보존하지 않으며, 근육 줄기 세포에 중요한 세포 상태인 정지 상태의 생체 외 연구도 허용하지 않습니다. 여기에서는 틈새 시장의 세포 성분을 가진 근육 줄기 세포의 생체 외 배양을 위한 프로토콜이 요약되어 있습니다. 근육의 기계적 및 효소적 분해를 통해 세포 유형의 혼합물을 얻어 2D 배양에 넣습니다. 면역염색은 1주일 이내에 여러 틈새 세포가 근섬유와 함께 배양에 존재하며, 중요하게는 정지된 근육 줄기 세포의 특성을 나타내는 Pax7 양성 세포가 존재한다는 것을 보여줍니다. 이러한 고유한 특성으로 인해 이 프로토콜은 세포 증폭 및 근본적이고 중개 문제를 해결하는 데 사용할 수 있는 정지 유사 줄기 세포 생성을 위한 강력한 도구입니다.
Introduction
운동, 호흡, 신진대사, 자세 및 체온 유지는 모두 골격근에 의존하며, 골격근의 오작동은 쇠약해지는 병리학(예: 근육병증, 근이영양증 등)을 유발할 수 있습니다. 1. 골격근은 본질적인 기능과 풍부함을 감안할 때 정상적인 근육 기능을 지원하고 치료 표적이 될 수 있는 주요 측면을 이해하기 위해 노력하는 전 세계 연구 실험실의 관심을 끌었습니다. 또한, 골격근은 재생과 줄기세포 기능을 연구하는 데 널리 사용되는 모델인데, 건강한 근육은 주로 줄기세포에 의해 완전한 손상과 퇴화 후 완전히 자가 회복할 수 있기 때문이다2; 이들은 위성 세포라고도 불리며, 근육 섬유의 주변부에 있는 기저층(basal lamina) 아래에 국한되어 있다3.
성인 골격근의 핵심 세포는 근섬유(긴 세포융합 다핵 세포)와 위성 세포(근육 생성 전위가 있는 줄기 세포로 부상으로 활성화될 때까지 정지 상태)입니다. 후자의 세포는 근육 재생의 중심 세포이며,이 과정은 부재 할 때 발생할 수 없습니다 4,5,6,7. 즉각적인 미세 환경에는 신호를 보내는 여러 세포 유형과 분자 요인이 있습니다. 이 틈새 시장은 발달 과정과 성인기까지 점진적으로 확립된다8. 성인 근육에는 여러 세포 유형(내피 세포, 주위 세포, 대식세포, 섬유-지방 생성 전구-FAP, 조절 T 세포 등)이 포함되어 있습니다. 9,10 및 세포외 기질 성분(라미닌, 콜라겐, 피브로넥틴, 피브릴린, 페리오스틴 등) 11 건강, 질병 및 재생의 맥락에서 서로 상호 작용하고 위성 세포와 상호 작용합니다.
실험 환경에서 이 복잡한 틈새를 보존하는 것은 기본적이지만 어려운 일입니다. 마찬가지로 어려운 것은 정지 상태로 돌아가거나 정지 상태로 돌아가는 것인데, 이는 위성 셀(satellite cell)9에 매우 중요하다. 이러한 문제를 부분적으로 해결하기 위해 몇 가지 방법이 도입되었으며, 각 방법에는 장점과 단점이 있습니다(자세한 내용은 토론 섹션 참조). 여기에서는 이 두 가지 장벽을 부분적으로 극복할 수 있는 방법을 제시합니다. 근육은 처음에 채취된 다음 이질적인 세포 혼합물을 배양하기 전에 기계적, 효소적으로 분해됩니다. 배양 과정에서 틈새의 많은 세포 유형이 검출되고 정지 상태로 돌아온 위성 세포가 관찰됩니다. 프로토콜의 마지막 단계로, 보편적으로 허용되는 마커를 사용하여 각 세포 유형을 검출할 수 있는 면역형광 단계가 제시됩니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
성인의 골격근 기능은 정교하게 조율된 일련의 세포 상호 작용과 분자 신호에 의해 뒷받침됩니다. 여기에서, 생리학적 미세환경과 매우 유사한 생체외 환경에서 이러한 파라미터를 연구할 수 있는 방법이 제시된다.
몇몇 그룹은 근육 세포를 배양하기 위한 시험관 내 방법을 보고했습니다. 이러한 방법은 위성 세포를 분리하여 근육 전구 세포의 특성을 연구하는 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
그림 2에서는 Servier Medical Art(https://smart.servier.com/)의 템플릿이 사용되었습니다. FR 연구소는 Association Française contre les Myopathies – AFM via TRANSLAMUSCLE (보조금 19507 및 22946), Fondation pour la Recherche Médicale – FRM (EQU202003010217, ENV202004011730, ECO201806006793), Agence Nationale pour la Recherche – ANR (ANR-21-CE13-0006-02, ANR-19-CE13-0010, ANR-10-LABX-73) 및 La Ligue Contre le Cancer (IP/SC-17130)의 지원을 받습니다. 위의 연구비 제공자는 본 연구의 설계, 수집, 분석, 해석 또는 보고나 본 원고의 작성에 어떠한 역할도 하지 않았다.
Materials
| anti-CD31 | BD | 550274 | dilution 1:100 |
| anti-FOSB | Santa Cruz | sc-7203 | dilution 1:200 |
| anti-GFP | Abcam | ab13970 | dilution 1:1000 |
| anti-Ki67 | Abcam | ab16667 | dilution 1:1000 |
| anti-MyHC | DSHB | MF20-c | dilution 1:400 |
| anti-MYOD | Active Motif | 39991 | dilution 1:200 |
| anti-MYOG | Santa Cruz | sc-576 | dilution 1:150 |
| anti-Pax7 | Santa Cruz | sc-81648 | dilution 1:100 |
| anti-PDGFRα | Invitrogen | PA5-16571 | dilution 1:50 |
| b-FGF | Peprotech | 450-33 | concentration 4 ng/mL |
| bovine serum albumin (BSA) – used for digestion | Sigma Aldrich | A7906-1006 | concentration 0.2% |
| BSA IgG-free, protease-free – used for staining | Jackson ImmunoResearch | 001-000-162 | concentration 5% |
| cell strainer 40 um | Dominique Dutscher | 352340 | |
| cell strainer 70 um | Dominique Dutscher | 352350 | |
| cell strainer 100 um | Dominique Dutscher | 352360 | |
| Collagenase | Roche | 10103586001 | concentration 0.5 U/mL |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Euromedex | UD8050-05-A | |
| Dispase | Roche | 4942078001 | concentration 3 U/mL |
| Dissection forceps size 5 | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Dissection forceps size 55 | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Dissection scissors (big, straight) | Fine Science Tools | 9146-11 | ideal for chopping |
| Dissection scissors (small, curved) | Fine Science Tools | 15017-10 | |
| Dissection scissors (small, straight) | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | ThermoFisher | 41966-029 | |
| EdU Click-iT kit | ThermoFisher | C10340 | |
| Fetal bovine serum – option 1 | Eurobio | CVF00-01 | |
| Fetal bovine serum – option 2 | Gibco | 10270-106 | |
| Matrigel | Corning Life Sciences | 354234 | coating solution |
| Parafilm | Dominique Dutscher | 090261 | flexible film |
| Penicillin streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Paraformaldehyde – option 1 | PanReac AppliChem ITW Reagents | 211511.1209 | concentration 4% |
| Paraformaldeyde – option 2 | ThermoFisher | 28908 | concentration 4% |
| Shaking water bath | ThermoFisher | TSSWB27 | |
| TritonX100 | Sigma Aldrich | T8532-500 ML | concentration 0.5% |
| Wild-type mice | Janvier | C57BL/6NRj |
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