Cultura não fracionada em massa de músculo esquelético de camundongo para recapitular nicho e quiescência de células-tronco
Summary
O músculo esquelético compreende vários tipos celulares, incluindo células-tronco residentes, cada uma com uma contribuição especial para a homeostase e regeneração muscular. Aqui, a cultura 2D de células-tronco musculares e o nicho de células musculares em um ambiente ex vivo que preserva muitas das características fisiológicas, in vivo e ambientais são descritas.
Abstract
O músculo esquelético é o maior tecido do corpo e desempenha múltiplas funções, desde a locomoção até o controle da temperatura corporal. Sua funcionalidade e recuperação de lesões dependem de uma infinidade de tipos celulares e de sinais moleculares entre as células musculares centrais (miofibras, células-tronco musculares) e seu nicho. A maioria dos cenários experimentais não preserva esse microambiente fisiológico complexo, e tampouco permite o estudo ex vivo de células-tronco musculares em quiescência, um estado celular crucial para elas. Aqui, um protocolo é delineado para o cultivo ex vivo de células-tronco musculares com componentes celulares de seu nicho. Através da quebra mecânica e enzimática dos músculos, obtém-se uma mistura de tipos celulares, que é colocada em cultura 2D. A imunomarcação mostra que, dentro de 1 semana, várias células de nicho estão presentes em cultura ao lado de miofibras e, importante, células Pax7-positivas que exibem as características de células-tronco musculares quiescentes. Essas propriedades únicas tornam este protocolo uma ferramenta poderosa para amplificação celular e geração de células-tronco quiescentes que podem ser usadas para abordar questões fundamentais e translacionais.
Introduction
O movimento, a respiração, o metabolismo, a postura corporal e a manutenção da temperatura corporal dependem do músculo esquelético, e o mau funcionamento do músculo esquelético pode, portanto, causar patologias debilitantes (por exemplo, miopatias, distrofias musculares, etc.) 1. Dadas suas funções essenciais e abundância, o músculo esquelético tem chamado a atenção de laboratórios de pesquisa em todo o mundo que se esforçam para entender os principais aspectos que suportam a função muscular normal e podem servir como alvos terapêuticos. Além disso, o músculo esquelético é um modelo amplamente utilizado para estudar a regeneração e a função das células-tronco, uma vez que o músculo saudável pode se auto-reparar completamente após lesão e degeneração completas, principalmente devido às suas células-troncoresidentes2; São também chamadas de células satélites e estão localizadas sob a lâmina basal, na periferia das fibrasmusculares3.
As células centrais do músculo esquelético adulto são as miofibras (células multinucleares sinciciais longas) e as células satélites (células-tronco com potencial miogênico que ficam quiescentes até que uma lesão as ative). Estas últimas células são as células centrais da regeneração muscular, e esse processo não pode ocorrer na sua ausência 4,5,6,7. Em seu microambiente imediato, existem múltiplos tipos celulares e fatores moleculares que sinalizam para eles. Esse nicho vai se estabelecendo ao longo do desenvolvimento e até a idadeadulta8. O músculo adulto contém vários tipos celulares (células endoteliais, pericitos, macrófagos, progenitores fibroadipogênicos-FAPs, células T reguladoras, etc.) 9,10 e componentes da matriz extracelular (lamininas, colágenos, fibronectina, fibrilinas, periostina, etc.) 11 que interagem entre si e com as células satélites no contexto da saúde, doença e regeneração.
Preservar esse nicho complexo em ambientes experimentais é fundamental, mas desafiador. Igualmente difícil é manter ou retornar à quiescência, um estado celular crítico para as células satélites9. Vários métodos foram introduzidos para enfrentar parcialmente esses desafios, cada um com suas vantagens e desvantagens (detalhado na seção de discussão). Aqui, é apresentado um método que pode superar parcialmente essas duas barreiras. Os músculos são inicialmente colhidos e, em seguida, quebrados mecânica e enzimaticamente antes que a mistura de células heterogêneas seja colocada em cultura. Ao longo da cultura, muitos tipos celulares do nicho são detectados, e células satélites que retornaram à quiescência são observadas. Como última etapa do protocolo, são apresentadas as etapas de imunofluorescência que permitem a detecção de cada tipo celular por meio do uso de marcadores universalmente aceitos.
Protocol
Representative Results
Discussion
A função muscular esquelética adulta é sustentada por um conjunto finamente orquestrado de interações celulares e sinais moleculares. Aqui, é apresentado um método que permite o estudo desses parâmetros em um ambiente ex vivo que se assemelha muito ao microambiente fisiológico.
Vários grupos têm relatado métodos in vitro para cultivo de células miogênicas. Estes métodos visavam isolar células satélites para estudar suas propriedades progenitoras miogênicas….
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Para a Figura 2, foram utilizados modelos da Servier Medical Art (https://smart.servier.com/). O laboratório FR é apoiado pela Association Française contre les Myopathies – AFM via TRANSLAMUSCLE (subsídios 19507 e 22946), pela Fondation pour la Recherche Médicale – FRM (EQU202003010217, ENV202004011730, ECO201806006793), pela Agence Nationale pour la Recherche – ANR (ANR-21-CE13-0006-02, ANR-19-CE13-0010, ANR-10-LABX-73) e pela La Ligue Contre le Cancer (IP/SC-17130). Os financiadores acima não tiveram nenhum papel na concepção, coleta, análise, interpretação ou relato deste estudo ou na redação deste manuscrito.
Materials
| anti-CD31 | BD | 550274 | dilution 1:100 |
| anti-FOSB | Santa Cruz | sc-7203 | dilution 1:200 |
| anti-GFP | Abcam | ab13970 | dilution 1:1000 |
| anti-Ki67 | Abcam | ab16667 | dilution 1:1000 |
| anti-MyHC | DSHB | MF20-c | dilution 1:400 |
| anti-MYOD | Active Motif | 39991 | dilution 1:200 |
| anti-MYOG | Santa Cruz | sc-576 | dilution 1:150 |
| anti-Pax7 | Santa Cruz | sc-81648 | dilution 1:100 |
| anti-PDGFRα | Invitrogen | PA5-16571 | dilution 1:50 |
| b-FGF | Peprotech | 450-33 | concentration 4 ng/mL |
| bovine serum albumin (BSA) – used for digestion | Sigma Aldrich | A7906-1006 | concentration 0.2% |
| BSA IgG-free, protease-free – used for staining | Jackson ImmunoResearch | 001-000-162 | concentration 5% |
| cell strainer 40 um | Dominique Dutscher | 352340 | |
| cell strainer 70 um | Dominique Dutscher | 352350 | |
| cell strainer 100 um | Dominique Dutscher | 352360 | |
| Collagenase | Roche | 10103586001 | concentration 0.5 U/mL |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Euromedex | UD8050-05-A | |
| Dispase | Roche | 4942078001 | concentration 3 U/mL |
| Dissection forceps size 5 | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Dissection forceps size 55 | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Dissection scissors (big, straight) | Fine Science Tools | 9146-11 | ideal for chopping |
| Dissection scissors (small, curved) | Fine Science Tools | 15017-10 | |
| Dissection scissors (small, straight) | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | ThermoFisher | 41966-029 | |
| EdU Click-iT kit | ThermoFisher | C10340 | |
| Fetal bovine serum – option 1 | Eurobio | CVF00-01 | |
| Fetal bovine serum – option 2 | Gibco | 10270-106 | |
| Matrigel | Corning Life Sciences | 354234 | coating solution |
| Parafilm | Dominique Dutscher | 090261 | flexible film |
| Penicillin streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Paraformaldehyde – option 1 | PanReac AppliChem ITW Reagents | 211511.1209 | concentration 4% |
| Paraformaldeyde – option 2 | ThermoFisher | 28908 | concentration 4% |
| Shaking water bath | ThermoFisher | TSSWB27 | |
| TritonX100 | Sigma Aldrich | T8532-500 ML | concentration 0.5% |
| Wild-type mice | Janvier | C57BL/6NRj |
References
- Frontera, W. R., Ochala, J. Skeletal muscle: A brief review of structure and function. Calcified Tissue International. 96 (3), 183-195 (2015).
- Forcina, L., Cosentino, M., Musarò, A. Mechanisms regulating muscle regeneration: Insights into the interrelated and time-dependent phases of tissue healing. Cells. 9 (5), 1297 (2020).
- Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 9 (2), 493-495 (1961).
- Lepper, C., Partridge, T. A., Fan, C. -. M. An absolute requirement for Pax7-positive satellite cells in acute injury-induced skeletal muscle regeneration. Development. 138 (17), 3639-3646 (2011).
- McCarthy, J. J., et al. Effective fiber hypertrophy in satellite cell-depleted skeletal muscle. Development. 138 (17), 3657-3666 (2011).
- Murphy, M. M., Lawson, J. A., Mathew, S. J., Hutcheson, D. A., Kardon, G. Satellite cells, connective tissue fibroblasts and their interactions are crucial for muscle regeneration. Development. 138 (17), 3625-3637 (2011).
- Sambasivan, R., et al. Pax7-expressing satellite cells are indispensable for adult skeletal muscle regeneration. Development. 138 (17), 3647-3656 (2011).
- Hicks, M. R., Pyle, A. D. The emergence of the stem cell niche. Trends in Cell Biology. 33 (22), 112-123 (2022).
- Relaix, F., et al. Perspectives on skeletal muscle stem cells. Nature Communications. 12 (1), 692 (2021).
- Gama, J. F. G., et al. Role of regulatory T cells in skeletal muscle regeneration: A systematic review. Biomolecules. 12 (6), 817 (2022).
- Loreti, M., Sacco, A. The jam session between muscle stem cells and the extracellular matrix in the tissue microenvironment. NPJ Regenerative Medicine. 7 (1), 16 (2022).
- Sambasivan, R., et al. Distinct regulatory cascades govern extraocular and pharyngeal arch muscle progenitor cell fates. Developmental Cell. 16 (6), 810-821 (2009).
- Pereira, P. D., et al. Quantification of cell cycle kinetics by EdU (5-ethynyl-2′-deoxyuridine)-coupled-fluorescence-intensity analysis. Oncotarget. 8 (25), 40514-40532 (2017).
- Bismuth, K., Relaix, F. Genetic regulation of skeletal muscle development. Experimental Cell Research. 316 (18), 3081-3086 (2010).
- Yin, H., Price, F., Rudnicki, M. A. Satellite cells and the muscle stem cell niche. Physiological Reviews. 93 (1), 23-67 (2013).
- Lertkiatmongkol, P., Liao, D., Mei, H., Hu, Y., Newman, P. J. Endothelial functions of platelet/endothelial cell adhesion molecule-1 (CD31). Current Opinion in Hematology. 23 (3), 253-259 (2016).
- Scholzen, T., Gerdes, J. The Ki-67 protein: From the known and the unknown. Journal of Cellular Physiology. 182 (3), 311-322 (2000).
- Abou-Khalil, R., Le Grand, F., Chazaud, B. Human and murine skeletal muscle reserve cells. Stem Cell Niche. 1035, 165-177 (2013).
- Pasut, A., Oleynik, P., Rudnicki, M. A. Isolation of muscle stem cells by fluorescence activated cell sorting cytometry. Methods in Molecular Biology. 798, 53-64 (2011).
- Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nature Protocols. 10 (10), 1612-1624 (2015).
- Montarras, D., et al. Direct isolation of satellite cells for skeletal muscle regeneration. Science. 309 (5743), 2064-2067 (2005).
- Qu, Y., Edwards, K., Barrow, J. Isolation, culture, and use of primary murine myoblasts in small-molecule screens. STAR Protocols. 4 (2), 102149 (2023).
- Danoviz, M. E., Yablonka-Reuveni, Z. Skeletal muscle satellite cells: Background and methods for isolation and analysis in a primary culture system. Methods in Molecular Biology. 798, 21-52 (2011).
- Saclier, M., Theret, M., Mounier, R., Chazaud, B. Effects of macrophage conditioned-medium on murine and human muscle cells: analysis of proliferation, differentiation, and fusion. Methods in Molecular Biology. 1556, 317-327 (2017).
- Giordani, L., et al. High-dimensional single-cell cartography reveals novel skeletal muscle-resident cell populations. Molecular Cell. 74 (3), 609-621 (2019).
- Tabula Muris Consortium et al. Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris. Nature. 562 (7727), 367-372 (2018).
- Brunetti, J., Koenig, S., Monnier, A., Frieden, M. Nanopattern surface improves cultured human myotube maturation. Skeletal Muscle. 11 (1), 12 (2021).
- Denes, L. T., et al. Culturing C2C12 myotubes on micromolded gelatin hydrogels accelerates myotube maturation. Skeletal Muscle. 9 (1), 17 (2019).
- LaFramboise, W. A., et al. Effect of muscle origin and phenotype on satellite cell muscle-specific gene expression. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 35 (10), 1307-1318 (2003).
- Azhar, M., Wardhani, B. W. K., Renesteen, E. The regenerative potential of Pax3/Pax7 on skeletal muscle injury. Journal of Generic Engineering and Biotechnology. 20 (1), 143 (2022).
- Hardy, D., et al. Comparative study of injury models for studying muscle regeneration in mice. PLoS One. 11 (1), e0147198 (2016).
