Coltura di massa non frazionata di muscolo scheletrico di topo per ricapitolare la quiescenza di nicchie e cellule staminali
Summary
Il muscolo scheletrico comprende più tipi di cellule, comprese le cellule staminali residenti, ognuna con un contributo speciale all’omeostasi e alla rigenerazione muscolare. Qui vengono descritte la coltura 2D di cellule staminali muscolari e la nicchia delle cellule muscolari in un ambiente ex vivo che conserva molte delle caratteristiche fisiologiche, in vivo e ambientali.
Abstract
Il muscolo scheletrico è il tessuto più grande del corpo e svolge molteplici funzioni, dalla locomozione al controllo della temperatura corporea. La sua funzionalità e il recupero dagli infortuni dipendono da una moltitudine di tipi di cellule e da segnali molecolari tra le cellule muscolari centrali (miofibre, cellule staminali muscolari) e la loro nicchia. La maggior parte delle impostazioni sperimentali non preserva questo complesso microambiente fisiologico, e non consente nemmeno lo studio ex vivo delle cellule staminali muscolari in quiescenza, uno stato cellulare che è cruciale per loro. Qui, viene delineato un protocollo per la coltura ex vivo di cellule staminali muscolari con componenti cellulari della loro nicchia. Attraverso la scomposizione meccanica ed enzimatica dei muscoli, si ottiene una miscela di tipi cellulari, che viene messa in coltura 2D. L’immunocolorazione mostra che entro 1 settimana, più cellule di nicchia sono presenti in coltura insieme alle miofibre e, soprattutto, alle cellule Pax7-positive che mostrano le caratteristiche delle cellule staminali muscolari quiescenti. Queste proprietà uniche rendono questo protocollo un potente strumento per l’amplificazione cellulare e la generazione di cellule staminali quiescenti che possono essere utilizzate per affrontare domande fondamentali e traslazionali.
Introduction
Il movimento, la respirazione, il metabolismo, la postura del corpo e il mantenimento della temperatura corporea dipendono tutti dal muscolo scheletrico e i malfunzionamenti del muscolo scheletrico possono, quindi, causare patologie debilitanti (ad esempio, miopatie, distrofie muscolari, ecc.) 1. Date le sue funzioni essenziali e l’abbondanza, il muscolo scheletrico ha attirato l’attenzione dei laboratori di ricerca di tutto il mondo che si sforzano di comprendere gli aspetti chiave che supportano la normale funzione muscolare e possono fungere da bersagli terapeutici. Inoltre, il muscolo scheletrico è un modello ampiamente utilizzato per studiare la rigenerazione e la funzione delle cellule staminali, poiché il muscolo sano può autoripararsi completamente dopo una lesione completa e una degenerazione, principalmente a causa delle sue cellule staminali residenti2; Queste sono anche chiamate cellule satelliti e sono localizzate sotto la lamina basale nella periferia delle fibre muscolari3.
Le cellule centrali del muscolo scheletrico adulto sono le miofibre (cellule multinucleate sinciziali lunghe) e le cellule satelliti (cellule staminali con potenziale miogenico che sono quiescenti fino a quando una lesione non le attiva). Queste ultime cellule sono le cellule centrali della rigenerazione muscolare e questo processo non può avvenire in loro assenza 4,5,6,7. Nel loro microambiente immediato, ci sono più tipi di cellule e fattori molecolari che segnalano loro. Questa nicchia si stabilisce gradualmente durante lo sviluppo e fino all’età adulta8. Il muscolo adulto contiene più tipi di cellule (cellule endoteliali, periciti, macrofagi, progenitori fibro-adipogenici-FAP, cellule T regolatorie, ecc.) 9,10 e componenti della matrice extracellulare (laminine, collageni, fibronectina, fibrilline, periostina, ecc.) 11 che interagiscono tra loro e con le cellule satelliti nel contesto della salute, della malattia e della rigenerazione.
Preservare questa complessa nicchia in contesti sperimentali è fondamentale ma impegnativo. Altrettanto difficile è mantenere o tornare alla quiescenza, uno stato cellulare che è critico per le cellule satelliti9. Sono stati introdotti diversi metodi per affrontare parzialmente queste sfide, ognuno con i suoi vantaggi e svantaggi (dettagliati nella sezione di discussione). Qui viene presentato un metodo che può superare parzialmente queste due barriere. I muscoli vengono inizialmente raccolti e poi scomposti meccanicamente ed enzimaticamente prima che la miscela di cellule eterogenee venga messa in coltura. Nel corso della coltura, vengono rilevati molti tipi di cellule della nicchia e si osservano cellule satelliti che sono tornate in quiescenza. Come ultima fase del protocollo, vengono presentate le fasi di immunofluorescenza che consentono la rilevazione di ciascun tipo di cellula attraverso l’uso di marcatori universalmente accettati.
Protocol
Representative Results
Discussion
La funzione del muscolo scheletrico adulto è sostenuta da un insieme finemente orchestrato di interazioni cellulari e segnali molecolari. Qui viene presentato un metodo che consente lo studio di questi parametri in un ambiente ex vivo che assomiglia molto al microambiente fisiologico.
Diversi gruppi hanno riportato metodi in vitro per la coltura di cellule miogeniche. Questi metodi miravano a isolare le cellule satelliti per studiare le loro proprietà progenitrici miogenich…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Per la Figura 2 sono stati utilizzati i modelli di Servier Medical Art (https://smart.servier.com/). Il laboratorio FR è sostenuto dall’Association Française contre les Myopathies – AFM tramite TRANSLAMUSCLE (sovvenzioni 19507 e 22946), dalla Fondation pour la Recherche Médicale – FRM (EQU202003010217, ENV202004011730, ECO201806006793), dall’Agence Nationale pour la Recherche – ANR (ANR-21-CE13-0006-02, ANR-19-CE13-0010, ANR-10-LABX-73) e da La Ligue Contre le Cancer (IP/SC-17130). I finanziatori di cui sopra non hanno avuto alcun ruolo nella progettazione, nella raccolta, nell’analisi, nell’interpretazione o nella stesura di questo studio o nella stesura di questo manoscritto.
Materials
| anti-CD31 | BD | 550274 | dilution 1:100 |
| anti-FOSB | Santa Cruz | sc-7203 | dilution 1:200 |
| anti-GFP | Abcam | ab13970 | dilution 1:1000 |
| anti-Ki67 | Abcam | ab16667 | dilution 1:1000 |
| anti-MyHC | DSHB | MF20-c | dilution 1:400 |
| anti-MYOD | Active Motif | 39991 | dilution 1:200 |
| anti-MYOG | Santa Cruz | sc-576 | dilution 1:150 |
| anti-Pax7 | Santa Cruz | sc-81648 | dilution 1:100 |
| anti-PDGFRα | Invitrogen | PA5-16571 | dilution 1:50 |
| b-FGF | Peprotech | 450-33 | concentration 4 ng/mL |
| bovine serum albumin (BSA) – used for digestion | Sigma Aldrich | A7906-1006 | concentration 0.2% |
| BSA IgG-free, protease-free – used for staining | Jackson ImmunoResearch | 001-000-162 | concentration 5% |
| cell strainer 40 um | Dominique Dutscher | 352340 | |
| cell strainer 70 um | Dominique Dutscher | 352350 | |
| cell strainer 100 um | Dominique Dutscher | 352360 | |
| Collagenase | Roche | 10103586001 | concentration 0.5 U/mL |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Euromedex | UD8050-05-A | |
| Dispase | Roche | 4942078001 | concentration 3 U/mL |
| Dissection forceps size 5 | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Dissection forceps size 55 | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Dissection scissors (big, straight) | Fine Science Tools | 9146-11 | ideal for chopping |
| Dissection scissors (small, curved) | Fine Science Tools | 15017-10 | |
| Dissection scissors (small, straight) | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | ThermoFisher | 41966-029 | |
| EdU Click-iT kit | ThermoFisher | C10340 | |
| Fetal bovine serum – option 1 | Eurobio | CVF00-01 | |
| Fetal bovine serum – option 2 | Gibco | 10270-106 | |
| Matrigel | Corning Life Sciences | 354234 | coating solution |
| Parafilm | Dominique Dutscher | 090261 | flexible film |
| Penicillin streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Paraformaldehyde – option 1 | PanReac AppliChem ITW Reagents | 211511.1209 | concentration 4% |
| Paraformaldeyde – option 2 | ThermoFisher | 28908 | concentration 4% |
| Shaking water bath | ThermoFisher | TSSWB27 | |
| TritonX100 | Sigma Aldrich | T8532-500 ML | concentration 0.5% |
| Wild-type mice | Janvier | C57BL/6NRj |
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