Niş ve Kök Hücre Sessizliğini Özetlemek için Fare İskelet Kasının Fraksiyone Edilmemiş Toplu Kültürü
Summary
İskelet kası, her biri kas homeostazına ve rejenerasyonuna özel bir katkısı olan yerleşik kök hücreler de dahil olmak üzere birden fazla hücre tipinden oluşur. Burada, fizyolojik, in vivo ve çevresel özelliklerin çoğunu koruyan ex vivo bir ortamda kas kök hücrelerinin 2 boyutlu kültürü ve kas hücresi nişi açıklanmaktadır.
Abstract
İskelet kası vücudun en büyük dokusudur ve hareketten vücut ısısı kontrolüne kadar birçok işlevi yerine getirir. İşlevselliği ve yaralanmalardan iyileşmesi, çok sayıda hücre tipine ve çekirdek kas hücreleri (miyofiberler, kas kök hücreleri) ve bunların nişleri arasındaki moleküler sinyallere bağlıdır. Deneysel ortamların çoğu bu karmaşık fizyolojik mikro ortamı korumaz ve onlar için çok önemli olan bir hücre durumu olan sessizlik içindeki kas kök hücrelerinin ex vivo çalışmasına da izin vermez. Burada, kas kök hücrelerinin nişlerinin hücresel bileşenleri ile ex vivo kültürü için bir protokol özetlenmiştir. Kasların mekanik ve enzimatik parçalanması yoluyla, 2D kültüre konan hücre tiplerinin bir karışımı elde edilir. İmmün boyama, 1 hafta içinde, miyofiberlerin ve daha da önemlisi, hareketsiz kas kök hücrelerinin özelliklerini gösteren Pax7 pozitif hücrelerin yanı sıra kültürde birden fazla niş hücrenin bulunduğunu göstermektedir. Bu benzersiz özellikler, bu protokolü hücre amplifikasyonu ve temel ve translasyonel soruları ele almak için kullanılabilecek hareketsiz benzeri kök hücrelerin üretilmesi için güçlü bir araç haline getirir.
Introduction
Hareket, solunum, metabolizma, vücut duruşu ve vücut ısısının korunması iskelet kasına bağlıdır ve iskelet kasındaki arızalar bu nedenle zayıflatıcı patolojilere (yani miyopatiler, kas distrofileri, vb.) neden olabilir. 1. Temel işlevleri ve bolluğu göz önüne alındığında, iskelet kası, normal kas fonksiyonunu destekleyen ve terapötik hedefler olarak hizmet edebilecek temel yönleri anlamaya çalışan dünya çapındaki araştırma laboratuvarlarının dikkatini çekmiştir. Ek olarak, iskelet kası, rejenerasyon ve kök hücre fonksiyonunu incelemek için yaygın olarak kullanılan bir modeldir, çünkü sağlıklı kas, çoğunlukla yerleşik kök hücreleri nedeniyle tam yaralanma ve dejenerasyondan sonra tamamen kendi kendini onarabilir2; Bunlar aynı zamanda uydu hücreleri olarak da adlandırılır ve kas liflerinin çevresindeki bazal lamina altında lokalizedir3.
Yetişkin iskelet kasının çekirdek hücreleri, miyolifler (uzun sinsityal multinükleer hücreler) ve uydu hücreleridir (bir yaralanma onları aktive edene kadar hareketsiz olan miyojenik potansiyele sahip kök hücreler). İkinci hücreler, kas rejenerasyonunun merkezi hücreleridir ve bu süreç onların yokluğunda gerçekleşemez 4,5,6,7. Yakın mikro çevrelerinde, onlara sinyal veren çok sayıda hücre tipi ve moleküler faktör vardır. Bu niş, gelişim boyunca ve yetişkinliğe kadar kademeli olarak kurulur8. Yetişkin kası birden fazla hücre tipi içerir (endotel hücreleri, perisitler, makrofajlar, fibro-adipojenik progenitörler-FAP’ler, düzenleyici T hücreleri, vb.) 9,10 ve hücre dışı matriks bileşenleri (lamininler, kollajenler, fibronektin, fibrilinler, periostin vb.) Sağlık, hastalık ve rejenerasyon bağlamında birbirleriyle ve uydu hücreleriyle etkileşime giren 11.
Bu karmaşık nişi deneysel ortamlarda korumak temel ama zordur. Aynı derecede zor olan, uydu hücreleri için kritik olan bir hücre durumu olan sessizliği korumak veya geri dönmektir9. Bu zorlukların kısmen üstesinden gelmek için, her birinin avantajları ve dezavantajları olan çeşitli yöntemler tanıtılmıştır (tartışma bölümünde ayrıntılı olarak açıklanmıştır). Burada, bu iki engeli kısmen aşabilecek bir yöntem sunulmaktadır. Kaslar başlangıçta toplanır ve daha sonra heterojen hücre karışımı kültüre sokulmadan önce mekanik ve enzimatik olarak parçalanır. Kültür boyunca, nişin birçok hücre tipi tespit edilir ve sessizliğe geri dönen uydu hücreleri gözlenir. Protokolün son adımı olarak, evrensel olarak kabul edilmiş belirteçlerin kullanılmasıyla her hücre tipinin saptanmasına izin veren immünofloresan adımları sunulmaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Yetişkin iskelet kası fonksiyonu, ince bir şekilde düzenlenmiş bir dizi hücresel etkileşim ve moleküler sinyal ile desteklenir. Burada, bu parametrelerin fizyolojik mikro çevreye çok benzeyen bir ex vivo ortamda incelenmesine izin veren bir yöntem sunulmaktadır.
Birkaç grup, miyojenik hücreleri kültürlemek için in vitro yöntemler bildirmiştir. Bu yöntemler, miyojenik progenitör özelliklerini incelemek için uydu hücrelerini izole etmeyi amaçladı. Saf …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Şekil 2 için Servier Medical Art (https://smart.servier.com/) şablonlarından yararlanılmıştır. FR laboratuvarı, Association Française contre les Myopathies – AFM via TRANSLAMUSCLE (19507 ve 22946 hibeleri), Fondation pour la Recherche Médicale – FRM (EQU202003010217, ENV202004011730, ECO201806006793), Agence Nationale pour la Recherche – ANR (ANR-21-CE13-0006-02, ANR-19-CE13-0010, ANR-10-LABX-73) ve La Ligue Contre le Cancer (IP/SC-17130) tarafından desteklenmektedir. Yukarıdaki fon sağlayıcıların bu çalışmanın tasarımında, toplanmasında, analizinde, yorumlanmasında veya raporlanmasında veya bu makalenin yazılmasında hiçbir rolü yoktu.
Materials
| anti-CD31 | BD | 550274 | dilution 1:100 |
| anti-FOSB | Santa Cruz | sc-7203 | dilution 1:200 |
| anti-GFP | Abcam | ab13970 | dilution 1:1000 |
| anti-Ki67 | Abcam | ab16667 | dilution 1:1000 |
| anti-MyHC | DSHB | MF20-c | dilution 1:400 |
| anti-MYOD | Active Motif | 39991 | dilution 1:200 |
| anti-MYOG | Santa Cruz | sc-576 | dilution 1:150 |
| anti-Pax7 | Santa Cruz | sc-81648 | dilution 1:100 |
| anti-PDGFRα | Invitrogen | PA5-16571 | dilution 1:50 |
| b-FGF | Peprotech | 450-33 | concentration 4 ng/mL |
| bovine serum albumin (BSA) – used for digestion | Sigma Aldrich | A7906-1006 | concentration 0.2% |
| BSA IgG-free, protease-free – used for staining | Jackson ImmunoResearch | 001-000-162 | concentration 5% |
| cell strainer 40 um | Dominique Dutscher | 352340 | |
| cell strainer 70 um | Dominique Dutscher | 352350 | |
| cell strainer 100 um | Dominique Dutscher | 352360 | |
| Collagenase | Roche | 10103586001 | concentration 0.5 U/mL |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Euromedex | UD8050-05-A | |
| Dispase | Roche | 4942078001 | concentration 3 U/mL |
| Dissection forceps size 5 | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Dissection forceps size 55 | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Dissection scissors (big, straight) | Fine Science Tools | 9146-11 | ideal for chopping |
| Dissection scissors (small, curved) | Fine Science Tools | 15017-10 | |
| Dissection scissors (small, straight) | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | ThermoFisher | 41966-029 | |
| EdU Click-iT kit | ThermoFisher | C10340 | |
| Fetal bovine serum – option 1 | Eurobio | CVF00-01 | |
| Fetal bovine serum – option 2 | Gibco | 10270-106 | |
| Matrigel | Corning Life Sciences | 354234 | coating solution |
| Parafilm | Dominique Dutscher | 090261 | flexible film |
| Penicillin streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Paraformaldehyde – option 1 | PanReac AppliChem ITW Reagents | 211511.1209 | concentration 4% |
| Paraformaldeyde – option 2 | ThermoFisher | 28908 | concentration 4% |
| Shaking water bath | ThermoFisher | TSSWB27 | |
| TritonX100 | Sigma Aldrich | T8532-500 ML | concentration 0.5% |
| Wild-type mice | Janvier | C57BL/6NRj |
References
- Frontera, W. R., Ochala, J. Skeletal muscle: A brief review of structure and function. Calcified Tissue International. 96 (3), 183-195 (2015).
- Forcina, L., Cosentino, M., Musarò, A. Mechanisms regulating muscle regeneration: Insights into the interrelated and time-dependent phases of tissue healing. Cells. 9 (5), 1297 (2020).
- Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 9 (2), 493-495 (1961).
- Lepper, C., Partridge, T. A., Fan, C. -. M. An absolute requirement for Pax7-positive satellite cells in acute injury-induced skeletal muscle regeneration. Development. 138 (17), 3639-3646 (2011).
- McCarthy, J. J., et al. Effective fiber hypertrophy in satellite cell-depleted skeletal muscle. Development. 138 (17), 3657-3666 (2011).
- Murphy, M. M., Lawson, J. A., Mathew, S. J., Hutcheson, D. A., Kardon, G. Satellite cells, connective tissue fibroblasts and their interactions are crucial for muscle regeneration. Development. 138 (17), 3625-3637 (2011).
- Sambasivan, R., et al. Pax7-expressing satellite cells are indispensable for adult skeletal muscle regeneration. Development. 138 (17), 3647-3656 (2011).
- Hicks, M. R., Pyle, A. D. The emergence of the stem cell niche. Trends in Cell Biology. 33 (22), 112-123 (2022).
- Relaix, F., et al. Perspectives on skeletal muscle stem cells. Nature Communications. 12 (1), 692 (2021).
- Gama, J. F. G., et al. Role of regulatory T cells in skeletal muscle regeneration: A systematic review. Biomolecules. 12 (6), 817 (2022).
- Loreti, M., Sacco, A. The jam session between muscle stem cells and the extracellular matrix in the tissue microenvironment. NPJ Regenerative Medicine. 7 (1), 16 (2022).
- Sambasivan, R., et al. Distinct regulatory cascades govern extraocular and pharyngeal arch muscle progenitor cell fates. Developmental Cell. 16 (6), 810-821 (2009).
- Pereira, P. D., et al. Quantification of cell cycle kinetics by EdU (5-ethynyl-2′-deoxyuridine)-coupled-fluorescence-intensity analysis. Oncotarget. 8 (25), 40514-40532 (2017).
- Bismuth, K., Relaix, F. Genetic regulation of skeletal muscle development. Experimental Cell Research. 316 (18), 3081-3086 (2010).
- Yin, H., Price, F., Rudnicki, M. A. Satellite cells and the muscle stem cell niche. Physiological Reviews. 93 (1), 23-67 (2013).
- Lertkiatmongkol, P., Liao, D., Mei, H., Hu, Y., Newman, P. J. Endothelial functions of platelet/endothelial cell adhesion molecule-1 (CD31). Current Opinion in Hematology. 23 (3), 253-259 (2016).
- Scholzen, T., Gerdes, J. The Ki-67 protein: From the known and the unknown. Journal of Cellular Physiology. 182 (3), 311-322 (2000).
- Abou-Khalil, R., Le Grand, F., Chazaud, B. Human and murine skeletal muscle reserve cells. Stem Cell Niche. 1035, 165-177 (2013).
- Pasut, A., Oleynik, P., Rudnicki, M. A. Isolation of muscle stem cells by fluorescence activated cell sorting cytometry. Methods in Molecular Biology. 798, 53-64 (2011).
- Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nature Protocols. 10 (10), 1612-1624 (2015).
- Montarras, D., et al. Direct isolation of satellite cells for skeletal muscle regeneration. Science. 309 (5743), 2064-2067 (2005).
- Qu, Y., Edwards, K., Barrow, J. Isolation, culture, and use of primary murine myoblasts in small-molecule screens. STAR Protocols. 4 (2), 102149 (2023).
- Danoviz, M. E., Yablonka-Reuveni, Z. Skeletal muscle satellite cells: Background and methods for isolation and analysis in a primary culture system. Methods in Molecular Biology. 798, 21-52 (2011).
- Saclier, M., Theret, M., Mounier, R., Chazaud, B. Effects of macrophage conditioned-medium on murine and human muscle cells: analysis of proliferation, differentiation, and fusion. Methods in Molecular Biology. 1556, 317-327 (2017).
- Giordani, L., et al. High-dimensional single-cell cartography reveals novel skeletal muscle-resident cell populations. Molecular Cell. 74 (3), 609-621 (2019).
- Tabula Muris Consortium et al. Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris. Nature. 562 (7727), 367-372 (2018).
- Brunetti, J., Koenig, S., Monnier, A., Frieden, M. Nanopattern surface improves cultured human myotube maturation. Skeletal Muscle. 11 (1), 12 (2021).
- Denes, L. T., et al. Culturing C2C12 myotubes on micromolded gelatin hydrogels accelerates myotube maturation. Skeletal Muscle. 9 (1), 17 (2019).
- LaFramboise, W. A., et al. Effect of muscle origin and phenotype on satellite cell muscle-specific gene expression. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 35 (10), 1307-1318 (2003).
- Azhar, M., Wardhani, B. W. K., Renesteen, E. The regenerative potential of Pax3/Pax7 on skeletal muscle injury. Journal of Generic Engineering and Biotechnology. 20 (1), 143 (2022).
- Hardy, D., et al. Comparative study of injury models for studying muscle regeneration in mice. PLoS One. 11 (1), e0147198 (2016).
