Summary
İskelet kası, her biri kas homeostazına ve rejenerasyonuna özel bir katkısı olan yerleşik kök hücreler de dahil olmak üzere birden fazla hücre tipinden oluşur. Burada, fizyolojik, in vivo ve çevresel özelliklerin çoğunu koruyan ex vivo bir ortamda kas kök hücrelerinin 2 boyutlu kültürü ve kas hücresi nişi açıklanmaktadır.
Abstract
İskelet kası vücudun en büyük dokusudur ve hareketten vücut ısısı kontrolüne kadar birçok işlevi yerine getirir. İşlevselliği ve yaralanmalardan iyileşmesi, çok sayıda hücre tipine ve çekirdek kas hücreleri (miyofiberler, kas kök hücreleri) ve bunların nişleri arasındaki moleküler sinyallere bağlıdır. Deneysel ortamların çoğu bu karmaşık fizyolojik mikro ortamı korumaz ve onlar için çok önemli olan bir hücre durumu olan sessizlik içindeki kas kök hücrelerinin ex vivo çalışmasına da izin vermez. Burada, kas kök hücrelerinin nişlerinin hücresel bileşenleri ile ex vivo kültürü için bir protokol özetlenmiştir. Kasların mekanik ve enzimatik parçalanması yoluyla, 2D kültüre konan hücre tiplerinin bir karışımı elde edilir. İmmün boyama, 1 hafta içinde, miyofiberlerin ve daha da önemlisi, hareketsiz kas kök hücrelerinin özelliklerini gösteren Pax7 pozitif hücrelerin yanı sıra kültürde birden fazla niş hücrenin bulunduğunu göstermektedir. Bu benzersiz özellikler, bu protokolü hücre amplifikasyonu ve temel ve translasyonel soruları ele almak için kullanılabilecek hareketsiz benzeri kök hücrelerin üretilmesi için güçlü bir araç haline getirir.
Introduction
Hareket, solunum, metabolizma, vücut duruşu ve vücut ısısının korunması iskelet kasına bağlıdır ve iskelet kasındaki arızalar bu nedenle zayıflatıcı patolojilere (yani miyopatiler, kas distrofileri, vb.) neden olabilir. 1. Temel işlevleri ve bolluğu göz önüne alındığında, iskelet kası, normal kas fonksiyonunu destekleyen ve terapötik hedefler olarak hizmet edebilecek temel yönleri anlamaya çalışan dünya çapındaki araştırma laboratuvarlarının dikkatini çekmiştir. Ek olarak, iskelet kası, rejenerasyon ve kök hücre fonksiyonunu incelemek için yaygın olarak kullanılan bir modeldir, çünkü sağlıklı kas, çoğunlukla yerleşik kök hücreleri nedeniyle tam yaralanma ve dejenerasyondan sonra tamamen kendi kendini onarabilir2; Bunlar aynı zamanda uydu hücreleri olarak da adlandırılır ve kas liflerinin çevresindeki bazal lamina altında lokalizedir3.
Yetişkin iskelet kasının çekirdek hücreleri, miyolifler (uzun sinsityal multinükleer hücreler) ve uydu hücreleridir (bir yaralanma onları aktive edene kadar hareketsiz olan miyojenik potansiyele sahip kök hücreler). İkinci hücreler, kas rejenerasyonunun merkezi hücreleridir ve bu süreç onların yokluğunda gerçekleşemez 4,5,6,7. Yakın mikro çevrelerinde, onlara sinyal veren çok sayıda hücre tipi ve moleküler faktör vardır. Bu niş, gelişim boyunca ve yetişkinliğe kadar kademeli olarak kurulur8. Yetişkin kası birden fazla hücre tipi içerir (endotel hücreleri, perisitler, makrofajlar, fibro-adipojenik progenitörler-FAP'ler, düzenleyici T hücreleri, vb.) 9,10 ve hücre dışı matriks bileşenleri (lamininler, kollajenler, fibronektin, fibrilinler, periostin vb.) Sağlık, hastalık ve rejenerasyon bağlamında birbirleriyle ve uydu hücreleriyle etkileşime giren 11.
Bu karmaşık nişi deneysel ortamlarda korumak temel ama zordur. Aynı derecede zor olan, uydu hücreleri için kritik olan bir hücre durumu olan sessizliği korumak veya geri dönmektir9. Bu zorlukların kısmen üstesinden gelmek için, her birinin avantajları ve dezavantajları olan çeşitli yöntemler tanıtılmıştır (tartışma bölümünde ayrıntılı olarak açıklanmıştır). Burada, bu iki engeli kısmen aşabilecek bir yöntem sunulmaktadır. Kaslar başlangıçta toplanır ve daha sonra heterojen hücre karışımı kültüre sokulmadan önce mekanik ve enzimatik olarak parçalanır. Kültür boyunca, nişin birçok hücre tipi tespit edilir ve sessizliğe geri dönen uydu hücreleri gözlenir. Protokolün son adımı olarak, evrensel olarak kabul edilmiş belirteçlerin kullanılmasıyla her hücre tipinin saptanmasına izin veren immünofloresan adımları sunulmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm deneyler, Institut Mondor de Recherche Biomédicale'deki (INSERM U955) Fransız ve AB hayvan yönetmeliklerine, özellikle de 2010/63/UE direktifine uygundur. Hayvanlar, A94 028 379 ve D94-028-028 sertifika numaralı hayvan tesislerinde kontrollü ve zenginleştirilmiş bir ortamda tutuldu; Sadece yetkili araştırmacılar ve hayvan bakıcıları tarafından ele alındılar ve yaşamları boyunca rahatsızlık belirtileri için hayvan barınağı personeli tarafından görsel olarak incelendiler. Diseksiyon öncesi servikal çıkık ile ötenazi yapıldı. Hayvanların yaşamları boyunca hiçbir girişimsel işlem yapılmamıştır; bu nedenle, prosedür için bir Etik Komite ve Fransa Yüksek Öğrenim, Araştırma ve Yenilik Bakanlığı'ndan onay almak gerekli değildi. Gerçekten de, 2010/63/UE direktifine göre ötenazi ve ölüm sonrası diseksiyon için herhangi bir etik izni gerekli değildir. Bu yazıda sunulan sonuçlar, vahşi tip C57BL/6NRj hattından (Malzeme Tablosuna bakınız) ve transgenik Tg:Pax7-nGFP hattı12'den (ekibimiz tarafından yetiştirilmiştir) alınmıştır. Protokol, 8-12 haftalık erkek ve dişi farelere uygulandı.
1. Reaktif ve ekipman hazırlama ön sindirimi
- Diseksiyon aletlerine (düz ve kavisli makaslar, forseps, Malzeme Tablosuna bakınız) %70 etanol püskürtün ve kağıtla kurulayın. Bir mantar plakayı alüminyum folyo ile kaplayın ve yakınınızda 10 cm'lik Petri kapları (hayvan başına bir tane) bulundurun. Elinizin altında kağıt ve %70 etanol bulundurun.
NOT: Diseksiyon sonunda diseksiyon aletlerini suyla durulayın, ardından %70 etanol püskürtün ve kağıtla kurulayın. - Dönen bir su banyosunu 37 °C'ye ayarlayın ve DMEM'i %1 penisilin-streptomisin, 0,5 U/mL kollajenaz, 3 U/mL dispas ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve 50 mL tüp(ler)de %0,2 BSA ile birleştirerek sindirim karışımını (20 mL/hayvan) hazırlayın.
- Sindirim karışımını bir hücre kültürü davlumbazındaki 0.22 μm'lik bir filtreden geçirin.
NOT: Sindirim karışımının her seferinde taze olarak hazırlanması tavsiye edilir.
2. Sindirim sonrası reaktif ve ekipman hazırlama
- Sindirim sonrası, karışım dondurulabilir veya kültürlenebilir. Dondurmak için,% 10 DMSO:% 90 fetal sığır serumu (FBS) ve ayrıca bir dizi kriyotüp (2 mL kriyotüp başına 1 mL hücre süspansiyonu) hazırlayın. Kültür için kültür ortamı (% 1 penisilin-streptomisin, 4 ng / mL bFGF ve% 20 FBS ile desteklenmiş DMEM) ve bir dizi 8 oyuklu plaka hazırlayın. Hücreler kaplanmadan önce plakalar kaplanmalıdır (ayrıntılar adım 7.1'de verilmiştir).
- Boyama için, fosfat tamponlu salin (PBS) (8 oyuklu plakanın 0.15 mL / oyuğu) ve bloke edici çözelti (PBS'de% 5 IgG içermeyen sığır serum albümini [BSA]; 0.15 mL / kuyucuk 8 oyuklu plaka).
DİKKAT: PFA tozunu solumayın; Kimyasal bir başlık altında hazırlayın ve kullanın.
3. Diseksiyon
- Ötenazi yapılan hayvana% 70 etanol püskürtün. Karın hizasında büyük bir makasla yatay bir kesi (vücudun sol tarafından sağ tarafa) yapın ve bel çevresini kesin. Kasları ortaya çıkarmak için arka ayaklardaki deriyi çekin (Şekil 1A).
- Hayvanı alüminyum folyo kaplı mantar plakaya yerleştirin ve karşı ön ayağı ve arka ayağı sabitleyin. Tüm arka bacak kaslarını (ön ve arka) buz üzerine yerleştirilmiş 10 cm'lik bir Petri kabına hızla çıkarın (Şekil 1B,C). Kuadriseps ve arka kasların etrafındaki alanlardan yağ dokusunu çıkarmak için özel dikkat gösterin. Fasya, sinirler ve tendonlar da diseksiyon için harcanan toplam süreyi tehlikeye atmıyorsa bu noktada çıkarılabilir.
NOT: Her iki arka bacak için optimal diseksiyon süresi yaklaşık 15-20 dakika olmalıdır. Diseksiyon süresinin 30 dakikayı geçmemesi tavsiye edilir. - Nemli kalmaları için ara sıra kaslara DMEM damlaları ekleyin, ancak çok fazla değil, çünkü bu doğramayı zorlaştıracaktır. Diğer arka bacak için tekrarlayın. Bir hayvanın tüm kasları Petri kabına girdikten sonra (Şekil 1D), pürüzsüz bir homojenat elde etmek için 7-10 dakika makasla ince ince doğrayın (Şekil 1E).
NOT: Bu protokolde L-glutamin, piruvat ve 4.5 g/L D-glikoz ile desteklenmiş DMEM kullanılır.
Şekil 1: Kültür öncesi kas hazırlığı. (A) Adım 3.1'de açıklandığı gibi arka bacak kaslarını ortaya çıkarmak için deri çıkarılır. (B,C) Tüm arka bacak kasları, adım 3.2'de açıklandığı gibi kemiklerin etrafında (B) ve (C) kemikler arasında toplanır. (D) Hasat edilen kaslar, adım 3.3'te açıklandığı gibi, nemli kalmaları için DMEM damlaları ile buz üzerinde 10 cm'lik bir Petri kabına yerleştirilir. (E) Kaslar, bu resimde gösterilen kıvamda pürüzsüz bir macun elde edilene kadar makasla ince ince doğranır. (F) Son santrifüjlemeden sonra peletin bir görüntüsü; Mavi ok, kesikli mavi çizginin altında tüpe karşı olan peleti vurgular. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
4. Sindirim
NOT: Çürütmenin sonunda, bölüm 5 için 4 °C'de bir santrifüj, bir kova buz, üç hücre süzgeci (100 um, 70 um, 40 um) ve üç adet 50 mL tüp (hayvan başına) gereklidir.
- Sindirim karışımını adım 1.2'de açıklandığı gibi hazırlayın ve süzün. Karışımı buz üzerinde tutun.
- Tüm kaslar doğrandıktan sonra, homojenatı 20 mL sindirim karışımı ile 50 mL'lik bir tüpe koyun. Sızıntıyı önlemek için kapağın kenarlarını esnek bir filmle sarın ve tüpü düşük ila orta hızda (50 rpm) 37 °C çalkalama suyu banyosuna yerleştirin.
- 37 °C'de 1 saat bekledikten sonra kapağı açın ve homojen bir karışım elde etmek için 10 mL'lik bir pipetle yukarı ve aşağı yedi kez hafifçe pipetleyerek karıştırın. Kapağın etrafına yeni film uygulayın ve çalkalama suyu banyosuna geri yerleştirin. 1 saat sonra tüpü çıkarın ve banyoyu kapatın.
NOT: Kültür için, bölüm 7.1'e geçmeden önce plakaları adım 5'de açıklandığı gibi kaplamak için bu inkübasyon süresini kullanın.
5. Filtrasyon
- Sindirim tüpünü 50 mL'ye kadar soğuk DMEM (% 1 penisilin-streptomisin ile desteklenmiş) ile doldurun. Tüpü üç kez ters çevirerek karıştırın. Sonraki adımlar için DMEM'i bir buz kovasında tutun.
- 50 mL'lik yeni bir tüpe 100 μm'lik bir hücre süzgeci yerleştirin. Sindirilmiş karışımı hücre süzgecinden geçirerek yeni tüpe aktarın. 4 °C'de 5 dakika boyunca 600 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı sıvı bir atık kabına dökün.
- Peletleri 1 mL soğuk DMEM'de (% 1 penisilin-streptomisin ile desteklenmiş) yeniden süspanse edin. Tüpü aynı DMEM ile 50 mL'ye kadar doldurun. NOT: Santrifüjleme atlanırsa, bir sonraki peletin tanımlanması ve bakımı daha zor olacaktır.
- Yeni bir 50 mL'lik tüpe 70 μm'lik bir hücre süzgeci yerleştirin. Santrifüjlenmiş/yeniden süspanse edilmiş karışımı hücre süzgecinden yeni tüpe geçirin. 4 °C'de 5 dakika boyunca 80 x g'da santrifüjleyin.
NOT: Bu adım zorunlu değildir, ancak hücre kalıntılarını ortadan kaldırmak için önerilir. - 50 mL'lik yeni bir tüpe 40 μm'lik bir hücre süzgeci yerleştirin. Süpernatanı hücre süzgecinden yeni tüpe geçirin. 4 °C'de 5 dakika boyunca 600 x g'da santrifüjleyin, süpernatanı sıvı bir atık kabına dökün ve peleti kültür kaputunun altında FBS'de yeniden süspanse edin. Pelet bu adımda çok küçüktür (Şekil 1F).
NOT: 40 μm'lik süzgeçten filtreleme, kültürlerin daha sonraki boyanmasında spesifik olmayan bir sinyal verecek olan kalıntıları giderir.
6. (İsteğe bağlı) Dondurma
NOT: Bölüm 6 isteğe bağlıdır. Protokol filtrelemeden sonra duraklatılabilir, ancak bu hücre sağkalımını ve kültür başarısını azaltabilir.
- %10 DMSO:%90 FBS oranı elde etmek için DMSO ekleyin ve kriyotüplere aktarın (2 mL kriyotüp başına 1 mL yeniden süspansiyonlu pelet).
- Kriyotüpü gece boyunca −80 °C'de bir polistiren kutuya koyun. Uzun süreli depolama için ertesi gün −150 °C'ye taşıyın.
NOT: −80 °C'de kısa süreli depolama da mümkündür. - Kültüre başlarken, kriyotüpü hücre süspansiyonu çözülene kadar 37 °C'lik bir su banyosunda hızlı bir şekilde çözdürün. Kültür kaputunun altında 4 mL DMEM ile karıştırın. 600 x g'da 4 °C'de 5 dakika döndürün. Süpernatanı pipetleyin ve adım 7.2'de açıklandığı gibi devam edin.
7. Kültürleme
NOT: Dondurulmuş veya taze hücre süspansiyonlarının, üç ila dört adet 8 oyuklu plakadan oluşan 24-32 kuyuyu doldurması beklenebilir.
- 8 oyuklu plakaları 4 °C'de veya buz üzerinde çözülmesi gereken kaplama solüsyonu ile kaplayın (stok kaplama solüsyonu normalde −20 °C'de tutulur). Bir kuyucuğa 0,4 mL kaplama çözeltisi ekleyin ve kuyudan kuyuya pipetleyin. Kaplama çözeltisi tüm kuyucuklardan aktarıldıktan sonra, gelecekteki kültürler için yeniden toplanabilir ve yeniden dondurulabilir. Hücreleri kaplamadan önce kaplanmış plakaları 37 °C'de 30 dakika tutun.
- % 20 FBS:% 80 DMEM oranı elde etmek için FBS hücre süspansiyonuna 4 ng / mL bFGF (Malzeme Tablosuna bakınız) ile desteklenmiş DMEM (% 1 penisilin-streptomisin ile desteklenmiş) ekleyin.
NOT: bFGF ilavesi, birincil miyoblast kültürlerinde ve toplu kültürlerde uydu benzeri hücre üretiminde faydalı olabilse de, ~7 günlük toplu kültürlerde ihmal edilmesi hücre verimini ciddi şekilde tehlikeye atmadığından eklenmesi isteğe bağlıdır. - Kaplanmış 8 oyuklu plakalarda oyuk başına (adım 7.2'den itibaren) 0.4 mL süspansiyon plakası.
NOT: Dondurulmuş ve taze müstahzarlar için hayvan başına 30cm2 kültür hesaplayın. - Kültürleri 37 °C'de %5CO2 ile 10 güne kadar inkübe edin, kültür sarımsı bir renge dönüşmeye başladıktan sonra ortamı her gün değiştirin (genellikle 5-7 gün).
NOT: Hücre döngüsünün 13 S fazındaki hücreleri ölçmek için, fiksasyondan 2 saat önce10 μM EdU ekleyin. İlk S fazını yakalamak için, kaplamadan 10 μM EdU ekleyin ve 40 saatlik kültürde sabitleyin.
8. Sabitleme
NOT: Bölüm 8-10, aksi belirtilmedikçe oda sıcaklığında yapılmalıdır.
- Kültür ortamını pipetleyin ve hücreleri% 4 PFA (0.15 mL / kuyu) ile sabitleyin.
DİKKAT: Kimyasal bir kaputun altına PFA ekleyin.
NOT: Tüm kuyucuklar aynı anda sabitlenirse, PFA ile oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. Kuyucuklar farklı zaman noktalarında sabitlenirse, sabitlenecek kuyucuklara PFA ekleyin ve plakayı inkübatörde 37 °C'de 5 dakika tutun. - PFA'yı pipetleyin ve 10 saniye (0.15 mL/kuyu) PBS ekleyin. PBS'yi pipetleyin ve 5 dakika (0.15 mL / kuyu) taze PBS ekleyin.
NOT: Tüm kuyucuklar aynı anda sabitlenirse, oda sıcaklığında PBS ile inkübe edin. Kuyucuklar farklı zaman noktalarında sabitlenirse, sabit kuyucuklara PBS ekleyin ve plakayı inkübatörde 37 °C'de 5 dakika tutun. Ardından, 0.4 mL PBS ekleyin ve plakayı 1 haftaya kadar inkübatörde tutun.
9. Geçirgenlik ve engelleme
- Boyamaya hazır olduğunuzda, PBS'yi pipetleyin ve 8 dakika boyunca PBS'de (0,15 mL/kuyu) %0,5 TritonX 100 ile geçirgenleştirin. TritonX 100'ü pipetleyin, PBS ile 10 saniye (0,15 mL/kuyu) durulayın, PBS'yi pipetleyin ve PBS ile 5 dakika (0,15 mL/kuyu) yıkayın.
- PBS'de 30-60 dakika (0.15 mL / kuyu) boyunca% 5 IgG içermeyen BSA ile bloklayın.
10. Boyama
- BSA'yı pipetleyin ve PBS (0.15 mL / kuyucuk) ile seyreltilmiş birincil antikor karışımını ekleyin (Malzeme Tablosuna bakın; dilüsyonlar: anti-CD31 1:100, anti-FOSB 1:200, anti-GFP 1:1.000, anti-KI67 1:1.000, anti-MyHC 1:400, anti-MYOD 1:200, anti-MYOG 1:150, anti-PAX7 1:100, anti-PDGFRa 1:50) 4 °C'de gece inkübasyonu için.
NOT: Antikor inkübasyonundan sonra, antikor karışımını toplayın, sodyum azid ekleyin ve ileride yeniden kullanmak üzere 4 °C veya -20 °C'de (antikor üreticisinin talimatlarına göre) tutun. - Antikor karışımını pipetleyin, PBS ile 10 saniye (0.15 mL/kuyucuk) durulayın, PBS'yi pipetleyin ve PBS ile 5 dakika (0.15 mL/kuyu) yıkayın.
- Yıkama PBS'sini pipetleyin, ikincil antikor karışımını ekleyin (keçi anti-fare Alexa Fluor 488, keçi anti-tavşan Alexa Fluor 555, keçi anti-sıçan Alexa Fluor 647, keçi anti-fare Alexa Fluor 555, keçi anti-tavuk Alexa Fluor 488, tümü 1:500-1,000 dilüsyonlarda kullanılır) ve PBS (0.15 mL/kuyucuk) içinde seyreltilmiş çekirdek işaretleyici (örneğin, DAPI) (bkz. Malzeme Tablosu), ve ışıktan korunarak oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.
- İkincil antikor karışımını pipetleyin, PBS ile 10 saniye (0.15 mL/kuyucuk) durulayın, PBS'yi pipetleyin, PBS ile 5 dakika (0.15 mL/kuyu) yıkayın, PBS'yi pipetleyin ve monte edin.
NOT: Çıkarılabilir ayırıcılara sahip 8 oyuklu plakalar kullanılıyorsa, montajdan önce ayırıcıları soyun.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu protokol, uydu hücrelerini ve çoğu hücreyi endojen nişlerinden korurken kas hücresi kültürüne izin verir. Şekil 2, protokolün ana adımlarını özetlerken, diseksiyon ve sindirimin temel kısımları Şekil 1'de sunulmaktadır. Arka bacak kas sisteminin diseksiyonu önerilir (Şekil 1A-C), çünkü bu kas grubu iyi çalışılmıştır ve gelişimsel bir kökeni ve moleküler hiyerarşileri paylaşır14. Tüm karışımların steril koşullar altında hazırlanması tavsiye edilir. Ek olarak, sindirim karışımı bir hücre kültürü başlığı altında 0.22 μm'lik bir filtreden geçirildiğinde daha düşük kültür kontaminasyonu fark edildi.
Kaplanmış 1cm2 oyuklu plakalar üzerine 1/30 yığın preparat kaplanırken, kültür başladıktan 3-4 gün sonra uzamış hücreler görülebilir. Bununla birlikte, bu, hücre konsantrasyonuna bağlı olarak değişebilir ve uzun hücreler, özellikle donmuş yığın preparatlarını genişletirken daha sonra ortaya çıkmaya başlayabilir. Yaklaşık 7 gün sonra besiyerinin sararmış olması gerekir ve bu noktada günlük besiyeri değişimleri gerekir. Ek olarak, bu noktada, kuyuların miyotüplerle kapatılması gerekir. Endotel hücreleri, kültürün küçük bir kısmını oluşturur. Başarılı bir kültürün ana göstergesi, fiksasyon ve boyama gerektirebilen bol miktarda PAX7+ hücresidir. Mümkün olduğunda kullanılabilecek kullanışlı bir fare modeli, PAX7 pozitifliğinin GFP ekspresyonu şeklinde görselleştirilmesine izin veren Tg:Pax7-nGFP satır12'dir; Böylece, uydu hücreleri muhabir GFP tarafından kolayca tespit edilebilir. GFP, ters çevrilmiş bir epifloresan mikroskopta 20x büyütmede gözlemlenebilir, böylece kültür devam ederken kültür başarısının analizine izin verir. Bu aynı zamanda PAX7-GFP hücrelerinin toplu kültürlerde canlı görüntülenmesini de mümkün kılar. Kültürler 10 günden fazla bırakılmamalıdır. Bundan sonra, yedek hücreler sayıca azalmaya başlar ve miyotüpler plakadan ayrılabilir. Donmuş hücrelerden elde edilen kültürlerle ilgili son deneyimlere dayananlar da dahil olmak üzere başarısız kültürler, hala büyük oranda lif üretebilir, ancak çok az PAX7-GFP hücresi üretebilir. PAX7 için floresan işaretleyicisi olmayan fareler kullanıldığında, yedek hücre üretiminin etkinliğini değerlendirmek için boyama yapmak gerekir.
Aşağıdaki antikorlar test edilmiştir ve protokol bölüm 10'da sunulan boyama protokolü ile iyi çalışır: anti-PAX7 (uydu hücrelerinin ve aktive edilmiş miyoblastların 15 bir belirteci; ayrıca bu kültürde ortaya çıkan yedek hücrelerin bir belirteci), anti-miyozin (miyotüplerin bir belirteci 15), anti-CD31 (endotel hücrelerininbir belirteci 16), anti-GFP (muhabir fareler kullanılıyorsa), anti-MYOD (miyoblastların 15 bir belirteci), anti-MYOG (miyositlerin 15 farklılaşmasının bir belirteci), anti-KI67 (çoğalan hücrelerin17 bir belirteci) ve anti-PDGFRa (FAP'lerin15'in bir belirteci). Şekil 3, kültürde 7 gün sonra miyojenik ve niş hücreleri göstermektedir. Şekil 3A-C ile ilgili olarak, kas kütleleri vahşi tip farelerden kültürlenirken, Şekil 3D-F için kas kütleleri yukarıda belirtilen Tg:Pax7-nGFP hattından kültürlendi. PAX7 ve KI67 ile çift boyama (Şekil 3A), kültürde 5 gün sonra ortaya çıkan ve hücre döngüsünden çıkış (KI67 durumu) ve oluşturulan miyotüplere "uydular" olarak lokalizasyon gibi kas kök hücre özelliklerine sahip yedek hücrelerin işaretlenmesine izin verdi. MyHC ve MYOG ile çift boyama (Şekil 3B, D, E), kas farklılaşması yoluyla ilerleyen hücrelerin işaretlenmesine izin verdi ve böylece aşamalı olarak MYOG'yi eksprese etti ve daha sonra çok çekirdekli MyHC+ miyotüpleri oluşturmak üzere birleşti. CD31 veya PDGFRa ile boyama, endotel hücreleri ve FAP'ler gibi niş hücrelerin işaretlenmesine izin verdi (Şekil 3C). Şekil 3D,E, GFP ile işaretlenmiş ortaya çıkan rezerv hücrelerini göstermektedir. GFP ve MyHC ile birlikte boyama, rezerv hücrelerin uydu hücresi pozisyonunun değerlendirilmesine izin verirken (Şekil 3E), GFP ve diğer aktivasyon/farklılaşma belirteçleri ile birlikte boyama, rezerv hücrelerin hareketsiz benzeri doğasının değerlendirilmesine izin verdi (Şekil 3F).
Şekil 2: Protokol adımlarına genel bakış. (A-D) (A) diseksiyon, (B) sindirim, (C) filtrasyon ve (D) kültürün sıralı adımları. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Hücre popülasyonlarının immün boyanması. (A) Miyojenik (PAX7 ile işaretlenmiş; yeşil) ve döngüsel (KI67 ile işaretlenmiş; kırmızı) hücrelerin immünofloresansı. Çekirdekler DAPI (mavi) ile boyanır. Döngü yapmayan miyojenik hücrelerin (KI67-PAX7 +) varlığı, protokolün 7 günlük kültürde bol miktarda bulunan vahşi tip farelerden hareketsiz hücreler üretebileceğini göstermektedir. (B) Yabani tip farelerden alınan hücrelerin 7 günlük kültüründen sonra miyotüplerin (miyozin ağır zinciri [MyHC] ile işaretlenmiş; yeşil) ve miyositlerin (MYOG ile işaretlenmiş; kırmızı) immünofloresansı. Çekirdekler DAPI (mavi) ile boyanır. (C) Miyojenik hücrelerin immünofloresansı (PAX7 ile işaretlenmiş; yeşil), mezenkimal fibro-adipojenik progenitörler (PDGFRa ile işaretlenmiş; kırmızı) ve endotel hücreleri (CD31 ile işaretlenmiş; macenta) vahşi tip farelerden 7 günlük hücre kültüründen sonra. Çekirdekler DAPI (mavi) ile boyanır. (D) PAX7 eksprese eden hücrelerin nükleer GFP ile işaretlendiği Tg: Pax7-nGFP farelerinden alınan 8 günlük hücre kültüründen sonra GFP + hücrelerinin (yeşil) ve miyositlerin (MYOG; macenta ile işaretlenmiş) immünofloresansı. (E) Tg: Pax7-nGFP farelerinden alınan 7 günlük hücre kültüründen sonra GFP + hücrelerinin (yeşil) ve miyotüplerin (MyHC ile işaretlenmiş; kırmızı) immünofloresansı. Uydu hücresi benzeri hücrelerin 7 gün sonra kültürde göründüğüne dikkat edin. (F) Uydu hücrelerinin belirteçlerini (PAX7), aktivasyonu (FOSB), proliferasyonu (KI67) veya miyojenik farklılaşmayı (MYOD, MYOG) birlikte eksprese eden GFP + hücre oranının ölçülmesi. Hata çubukları standart sapmayı gösterir. Ölçek çubuğu: 100 um. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Yetişkin iskelet kası fonksiyonu, ince bir şekilde düzenlenmiş bir dizi hücresel etkileşim ve moleküler sinyal ile desteklenir. Burada, bu parametrelerin fizyolojik mikro çevreye çok benzeyen bir ex vivo ortamda incelenmesine izin veren bir yöntem sunulmaktadır.
Birkaç grup, miyojenik hücreleri kültürlemek için in vitro yöntemler bildirmiştir. Bu yöntemler, miyojenik progenitör özelliklerini incelemek için uydu hücrelerini izole etmeyi amaçladı. Saf uydu hücrelerini, soleus ve/veya EDL kaslarından18izole edilmiş lif kültürlerinden veya FACS-izole edilmiş uydu hücrelerinden, pozitif seçim için Pax7, CD34 ve a7-integrin için bir antikor paneli ve negatif seçim için CD45, CD31 ve Sca1 19,20,21. Diğerleri ayrıca, FAP'ler22,23 gibi diğer hücrelere kıyasla kırılgan yapışma özelliklerinden dolayı jelatin kaplı plakalar üzerindeki dökme kültürlerden birincil miyoblastları izole etmek için mekanik musluklar kullanmışlardır. Bu yaklaşımlar, uydu hücrelerinin aktivasyonunu incelemek veya kültürde genişletmek için uygun olsa da, hücreler genellikle nişlerine katkıda bulunan destekleyici hücrelerden yoksun bir ortamda büyürler. Ek olarak, bu yaklaşımlar, yüksek Pax7 ekspresyonu18 ile hareketsiz mononüklee rezerv hücreler oluşturmak için miyojenik progenitörlerin 2 haftadan fazla tutulmasını gerektirir. Uydu hücrelerinin ve makrofajlar gibi diğer hücre tiplerinin ko-kültürleri de bildirilmiştir. Bu, belirli bir hücrenin proliferasyon, farklılaşma ve füzyon gibi miyojenik özelliklere doğrudan katkısının incelenmesini sağlamıştır24. Birkaç tek hücreli RNA-seq çalışması, iskelet kasının hücresel yapısını detaylandırmıştır25,26. Kültür koşullarımız miyojenik hücrelerin oluşumunu desteklediğinden, bu in vivo çalışmalara kıyasla toplu kültürlerde çok daha yüksek oranda yedek hücre ve daha düşük oranda destek hücresi gözlemledik.
Burada açıklanan yöntemde verimliliği artırabilecek üç kritik adım tanımlanmıştır. İlk olarak, 2 saatlik sindirim sırasında optimal kas ayrışmasını ve ardından daha yüksek bir hücre verimini sağlamak için hızlı ve verimli doğrama gereklidir. İkincisi, enzimlerin doku boyunca uygun şekilde difüzyonunu sağlamak için sindirim sırasında sürekli rotasyon çok önemlidir. Son olarak, optimal doku ayrışması için nazik mekanik ayrışma da önemlidir.
Bu protokolün dört ana sınırlaması vardır. Birincisi, ex vivo bir sistem olarak kalır, bu da bazı fizyolojik ve biyofiziksel ipuçlarının kaybolabileceği veya değiştirilebileceği anlamına gelir. Bu, lifler kaplamadan önce kaybolduğu ve miyotüpler kültür sırasında yeniden oluşturulduğu için kas liflerine / kas liflerinden sinyal vermeyi içerir. İkinci olarak, oluşan miyotüplerin embriyonik veya yetişkin özelliklere sahip olup olmadığı ve yavaş ve hızlı kaslarda farklı lif tiplerini temsil edip etmedikleri görülmeye devam etmektedir. Referans olarak, C2C12 kas hücresi hattı ve insan miyoblastlarının kültürleri, 2D kültürdeki miyotüplerin in vivo muadillerinden daha az olgun olduğunu göstermiştir 27,28, birincil fare miyoblast kültürleri, in vivo 29'da bulunanları temsil eden miyozin tiplerine yol açıyor gibi görünmektedir. Üçüncüsü, bu yöntemle, hücreler doku ayrışması sırasında in situ konumlarını kaybeder ve yeni oluşan miyotüpler nöromüsküler ve myotendinöz bağlantılardan yoksundur; Bu nedenle, mekansal özelliklerle ilgili sonuçlar dikkatle yorumlanmalıdır. Dördüncüsü, sunulan protokol sağlıklı yetişkin kasları için optimize edilmiştir, ancak başlangıç materyali geniş fibroz, artmış adipojenik birikim veya bozulmuş hücre aktivasyonu sunan yaşlı veya miyopatik kaslardan kaynaklanıyorsa uyarlamalar gerekli olabilir.
Bu sınırlamaların çoğu, diğer ex vivo kas çalışmaları yöntemlerinde ortaktır, ancak bu protokolün bunlara göre çeşitli avantajları vardır. Çok sayıda hareketsiz benzeri yedek uydu hücresinin toplanmasına izin veren tek protokoldür. Ek olarak, indüklenmiş pluripotent kök hücreler, embriyonik kök hücreler, miyosfer kültürü veya organoid kültür ile ilişkili özel kültür koşullarını veya uzmanlığını gerektirmeyen ucuz ve basit bir yöntemi temsil eder. Ayrıca, yığın kültür, hidrojeller veya diğer iskelelerdeki miyojenik hücrelerin kültürleri ile ilişkili karmaşık altyapıya ve standardizasyona bağlı değildir. İzole edilmiş miyofiberlerin, FACS ile izole edilmiş primer hücrelerin veya önceden kaplama ile zenginleştirilmiş primer hücrelerin kültürleriyle karşılaştırıldığında, toplu kültür, fizyolojik kas ortamında bulunan daha fazla hücre popülasyonunu korur. Bu hücreler, in vivo kas rejenerasyonunu incelemek için yaygın olarak kullanılan yılan zehirlerinden gelen aşırı ve olağandışı sinyallerden ziyade, kültür ortamının büyüme faktörleri tarafından yönlendirilen nispeten fizyolojik bir aktivasyon ve farklılaşma yolundan geçer 30,31. Son olarak, sunulan hücre kültürü, herhangi bir hücre hattında olduğu gibi, endojen veya birincil hücrelere kıyasla genetik değişikliklere sahip olan C2C12 hücrelerinin kullanılmasına göre avantajlıdır.
Yukarıdaki avantajlar, bu protokolü, hücre tedavileri geliştirmek ve hatta sessizlik ve hücresel/moleküler düzenleme ile ilgili temel soruları yanıtlamak için gerekli olan hücre amplifikasyonu ve hareketsiz benzeri bir uydu hücre havuzunun oluşturulması gibi uygulamalar için güçlü bir araç haline getirir. Ek olarak, protokol, ilgilenilen faktörlerin baskın negatif formlarının aşırı ekspresyonunu veya ekspresyonunu indükleyen vektörler, siRNA hedeflemesi veya vektörlerle (plazmid, virüsler) transfeksiyon yoluyla moleküler sinyallemeyi değiştirmek için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmezler.
Acknowledgments
Şekil 2 için Servier Medical Art (https://smart.servier.com/) şablonlarından yararlanılmıştır. FR laboratuvarı, Association Française contre les Myopathies - AFM via TRANSLAMUSCLE (19507 ve 22946 hibeleri), Fondation pour la Recherche Médicale - FRM (EQU202003010217, ENV202004011730, ECO201806006793), Agence Nationale pour la Recherche - ANR (ANR-21-CE13-0006-02, ANR-19-CE13-0010, ANR-10-LABX-73) ve La Ligue Contre le Cancer (IP/SC-17130) tarafından desteklenmektedir. Yukarıdaki fon sağlayıcıların bu çalışmanın tasarımında, toplanmasında, analizinde, yorumlanmasında veya raporlanmasında veya bu makalenin yazılmasında hiçbir rolü yoktu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-CD31 | BD | 550274 | dilution 1:100 |
| anti-FOSB | Santa Cruz | sc-7203 | dilution 1:200 |
| anti-GFP | Abcam | ab13970 | dilution 1:1000 |
| anti-Ki67 | Abcam | ab16667 | dilution 1:1000 |
| anti-MyHC | DSHB | MF20-c | dilution 1:400 |
| anti-MYOD | Active Motif | 39991 | dilution 1:200 |
| anti-MYOG | Santa Cruz | sc-576 | dilution 1:150 |
| anti-Pax7 | Santa Cruz | sc-81648 | dilution 1:100 |
| anti-PDGFRα | Invitrogen | PA5-16571 | dilution 1:50 |
| b-FGF | Peprotech | 450-33 | concentration 4 ng/mL |
| Bovine serum albumin (BSA) – used for digestion | Sigma Aldrich | A7906-1006 | concentration 0.2% |
| BSA IgG-free, protease-free – used for staining | Jackson ImmunoResearch | 001-000-162 | concentration 5% |
| Cell strainer 40 um | Dominique Dutscher | 352340 | |
| Cell strainer 70 um | Dominique Dutscher | 352350 | |
| Cell strainer 100 um | Dominique Dutscher | 352360 | |
| Collagenase | Roche | 10103586001 | concentration 0.5 U/mL |
| Culture plate | Sarstedt | 94.6140.802 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Euromedex | UD8050-05-A | |
| Dispase | Roche | 4942078001 | concentration 3 U/mL |
| Dissection forceps size 5 | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Dissection forceps size 55 | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Dissection scissors (big, straight) | Fine Science Tools | 9146-11 | ideal for chopping |
| Dissection scissors (small, curved) | Fine Science Tools | 15017-10 | |
| Dissection scissors (small, straight) | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | ThermoFisher | 41966-029 | |
| EdU Click-iT kit | ThermoFisher | C10340 | |
| Fetal bovine serum – option 1 | Eurobio | CVF00-01 | |
| Fetal bovine serum – option 2 | Gibco | 10270-106 | |
| Matrigel | Corning Life Sciences | 354234 | coating solution |
| Parafilm | Dominique Dutscher | 090261 | flexible film |
| Paraformaldehyde – option 1 | PanReac AppliChem ITW Reagents | 211511.1209 | concentration 4% |
| Paraformaldeyde – option 2 | ThermoFisher | 28908 | concentration 4% |
| Penicillin streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Shaking water bath | ThermoFisher | TSSWB27 | |
| TritonX100 | Sigma Aldrich | T8532-500 ML | concentration 0.5% |
| Wild-type mice | Janvier | C57BL/6NRj |
References
- Frontera, W. R., Ochala, J. Skeletal muscle: A brief review of structure and function. Calcified Tissue International. 96 (3), 183-195 (2015).
- Forcina, L., Cosentino, M., Musarò, A. Mechanisms regulating muscle regeneration: Insights into the interrelated and time-dependent phases of tissue healing. Cells. 9 (5), 1297 (2020).
- Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 9 (2), 493-495 (1961).
- Lepper, C., Partridge, T. A., Fan, C. -M. An absolute requirement for Pax7-positive satellite cells in acute injury-induced skeletal muscle regeneration. Development. 138 (17), 3639-3646 (2011).
- McCarthy, J. J., et al. Effective fiber hypertrophy in satellite cell-depleted skeletal muscle. Development. 138 (17), 3657-3666 (2011).
- Murphy, M. M., Lawson, J. A., Mathew, S. J., Hutcheson, D. A., Kardon, G. Satellite cells, connective tissue fibroblasts and their interactions are crucial for muscle regeneration. Development. 138 (17), 3625-3637 (2011).
- Sambasivan, R., et al. Pax7-expressing satellite cells are indispensable for adult skeletal muscle regeneration. Development. 138 (17), 3647-3656 (2011).
- Hicks, M. R., Pyle, A. D. The emergence of the stem cell niche. Trends in Cell Biology. 33 (22), 112-123 (2022).
- Relaix, F., et al. Perspectives on skeletal muscle stem cells. Nature Communications. 12 (1), 692 (2021).
- Gama, J. F. G., et al. Role of regulatory T cells in skeletal muscle regeneration: A systematic review. Biomolecules. 12 (6), 817 (2022).
- Loreti, M., Sacco, A. The jam session between muscle stem cells and the extracellular matrix in the tissue microenvironment. NPJ Regenerative Medicine. 7 (1), 16 (2022).
- Sambasivan, R., et al. Distinct regulatory cascades govern extraocular and pharyngeal arch muscle progenitor cell fates. Developmental Cell. 16 (6), 810-821 (2009).
- Pereira, P. D., et al. Quantification of cell cycle kinetics by EdU (5-ethynyl-2'-deoxyuridine)-coupled-fluorescence-intensity analysis. Oncotarget. 8 (25), 40514-40532 (2017).
- Bismuth, K., Relaix, F. Genetic regulation of skeletal muscle development. Experimental Cell Research. 316 (18), 3081-3086 (2010).
- Yin, H., Price, F., Rudnicki, M. A. Satellite cells and the muscle stem cell niche. Physiological Reviews. 93 (1), 23-67 (2013).
- Lertkiatmongkol, P., Liao, D., Mei, H., Hu, Y., Newman, P. J. Endothelial functions of platelet/endothelial cell adhesion molecule-1 (CD31). Current Opinion in Hematology. 23 (3), 253-259 (2016).
- Scholzen, T., Gerdes, J. The Ki-67 protein: From the known and the unknown. Journal of Cellular Physiology. 182 (3), 311-322 (2000).
- Abou-Khalil, R., Le Grand, F., Chazaud, B. Human and murine skeletal muscle reserve cells. Stem Cell Niche. 1035, 165-177 (2013).
- Pasut, A., Oleynik, P., Rudnicki, M. A. Isolation of muscle stem cells by fluorescence activated cell sorting cytometry. Methods in Molecular Biology. 798, 53-64 (2011).
- Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nature Protocols. 10 (10), 1612-1624 (2015).
- Montarras, D., et al. Direct isolation of satellite cells for skeletal muscle regeneration. Science. 309 (5743), 2064-2067 (2005).
- Qu, Y., Edwards, K., Barrow, J. Isolation, culture, and use of primary murine myoblasts in small-molecule screens. STAR Protocols. 4 (2), 102149 (2023).
- Danoviz, M. E., Yablonka-Reuveni, Z. Skeletal muscle satellite cells: Background and methods for isolation and analysis in a primary culture system. Methods in Molecular Biology. 798, 21-52 (2011).
- Saclier, M., Theret, M., Mounier, R., Chazaud, B. Effects of macrophage conditioned-medium on murine and human muscle cells: analysis of proliferation, differentiation, and fusion. Methods in Molecular Biology. 1556, 317-327 (2017).
- Giordani, L., et al. High-dimensional single-cell cartography reveals novel skeletal muscle-resident cell populations. Molecular Cell. 74 (3), 609-621 (2019).
- Tabula Muris Consortium et al. Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris. Nature. 562 (7727), 367-372 (2018).
- Brunetti, J., Koenig, S., Monnier, A., Frieden, M. Nanopattern surface improves cultured human myotube maturation. Skeletal Muscle. 11 (1), 12 (2021).
- Denes, L. T., et al. Culturing C2C12 myotubes on micromolded gelatin hydrogels accelerates myotube maturation. Skeletal Muscle. 9 (1), 17 (2019).
- LaFramboise, W. A., et al. Effect of muscle origin and phenotype on satellite cell muscle-specific gene expression. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 35 (10), 1307-1318 (2003).
- Azhar, M., Wardhani, B. W. K., Renesteen, E. The regenerative potential of Pax3/Pax7 on skeletal muscle injury. Journal of Generic Engineering and Biotechnology. 20 (1), 143 (2022).
- Hardy, D., et al. Comparative study of injury models for studying muscle regeneration in mice. PLoS One. 11 (1), e0147198 (2016).
