Summary
Die Skelettmuskulatur besteht aus mehreren Zelltypen, einschließlich residenter Stammzellen, von denen jede einen besonderen Beitrag zur Muskelhomöostase und -regeneration leistet. Hier werden die 2D-Kultur von Muskelstammzellen und die Muskelzellnische in einer ex vivo Umgebung beschrieben, die viele der physiologischen, in vivo und Umwelteigenschaften bewahrt.
Abstract
Der Skelettmuskel ist das größte Gewebe des Körpers und erfüllt mehrere Funktionen, von der Fortbewegung bis zur Kontrolle der Körpertemperatur. Seine Funktionalität und Genesung nach Verletzungen hängt von einer Vielzahl von Zelltypen und von molekularen Signalen zwischen den Kernmuskelzellen (Myofasern, Muskelstammzellen) und ihrer Nische ab. Die meisten Versuchsumgebungen bewahren diese komplexe physiologische Mikroumgebung nicht, und sie erlauben auch nicht die Ex-vivo-Untersuchung von Muskelstammzellen in Ruhezustand, einem Zellzustand, der für sie entscheidend ist. Hier wird ein Protokoll für die ex vivo Kultur von Muskelstammzellen mit zellulären Komponenten ihrer Nische skizziert. Durch den mechanischen und enzymatischen Abbau von Muskeln erhält man eine Mischung von Zelltypen, die in eine 2D-Kultur gegeben wird. Die Immunfärbung zeigt, dass innerhalb von 1 Woche mehrere Nischenzellen in Kultur neben Myofasern und vor allem Pax7-positiven Zellen vorhanden sind, die die Eigenschaften ruhender Muskelstammzellen aufweisen. Diese einzigartigen Eigenschaften machen dieses Protokoll zu einem leistungsstarken Werkzeug für die Zellamplifikation und die Erzeugung von ruhenden Stammzellen, die zur Beantwortung grundlegender und translationaler Fragen verwendet werden können.
Introduction
Bewegung, Atmung, Stoffwechsel, Körperhaltung und Aufrechterhaltung der Körpertemperatur hängen alle von der Skelettmuskulatur ab, und Fehlfunktionen in der Skelettmuskulatur können daher schwächende Pathologien (d. h. Myopathien, Muskeldystrophien usw.) verursachen. 1. Aufgrund seiner wesentlichen Funktionen und seines Überflusses hat die Skelettmuskulatur die Aufmerksamkeit von Forschungslabors weltweit auf sich gezogen, die sich bemühen, die Schlüsselaspekte zu verstehen, die eine normale Muskelfunktion unterstützen und als therapeutische Ziele dienen können. Darüber hinaus ist die Skelettmuskulatur ein weit verbreitetes Modell zur Untersuchung der Regeneration und Stammzellfunktion, da sich ein gesunder Muskel nach einer vollständigen Verletzung und Degeneration vollständig selbst reparieren kann, hauptsächlich aufgrund seiner ansässigen Stammzellen2; Diese werden auch Satellitenzellen genannt und sind unter der Basallamina in der Peripherie der Muskelfasern lokalisiert3.
Die Kernzellen der adulten Skelettmuskulatur sind die Myofasern (lange synzytiale multinukleäre Zellen) und die Satellitenzellen (Stammzellen mit myogenem Potenzial, die ruhen, bis eine Verletzung sie aktiviert). Die letztgenannten Zellen sind die zentralen Zellen der Muskelregeneration, und dieser Prozess kann in ihrer Abwesenheit nicht stattfinden 4,5,6,7. In ihrer unmittelbaren Mikroumgebung gibt es mehrere Zelltypen und molekulare Faktoren, die ihnen Signale geben. Diese Nische etabliert sich allmählich im Laufe der Entwicklung und bis ins Erwachsenenalter8. Der adulte Muskel enthält mehrere Zelltypen (Endothelzellen, Perizyten, Makrophagen, fibroadipogene Vorläuferzellen (FAPs), regulatorische T-Zellen usw.) 9,10 und extrazelluläre Matrixkomponenten (Laminine, Kollagene, Fibronektin, Fibrilline, Periostin, etc.) 11, die miteinander und mit den Satellitenzellen im Kontext von Gesundheit, Krankheit und Regeneration interagieren.
Die Bewahrung dieser komplexen Nische in experimentellen Umgebungen ist grundlegend, aber auch eine Herausforderung. Ebenso schwierig ist es, die Ruhe aufrechtzuerhalten oder wieder herzustellen, ein Zellzustand, der für Satellitenzellen kritisch ist9. Es wurden mehrere Methoden eingeführt, um diese Herausforderungen teilweise zu bewältigen, jede mit ihren Vor- und Nachteilen (ausführlich im Diskussionsabschnitt). Hier wird eine Methode vorgestellt, die diese beiden Barrieren teilweise überwinden kann. Muskeln werden zunächst entnommen und dann mechanisch und enzymatisch abgebaut, bevor die heterogene Zellmischung in Kultur gegeben wird. Im Verlauf der Kultur werden viele Zelltypen der Nische nachgewiesen und Satellitenzellen beobachtet, die in den Ruhezustand zurückgekehrt sind. Als letzter Schritt des Protokolls werden die Immunfluoreszenzschritte vorgestellt, die den Nachweis jedes Zelltyps durch die Verwendung allgemein anerkannter Marker ermöglichen.
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Protocol
Alle Versuche entsprachen den französischen und EU-Tierschutzvorschriften des Institut Mondor de Recherche Biomédicale (INSERM U955), insbesondere der Richtlinie 2010/63/EU. Die Tiere wurden in einer kontrollierten und angereicherten Umgebung in den Tiereinrichtungen mit den Zertifizierungsnummern A94 028 379 und D94-028-028 gehalten. Sie wurden nur von autorisierten Forschern und Tierpflegern angefasst und vom Personal der Tierhaltung visuell auf Anzeichen von Unbehagen während ihres Lebens untersucht. Sie wurden vor der Sektion durch Gebärmutterhalsluxation euthanasiert. Zu Lebzeiten der Tiere wurden keine interventionellen Eingriffe durchgeführt; Daher war es nicht erforderlich, die Zustimmung einer Ethikkommission und des französischen Ministeriums für Hochschulbildung, Forschung und Innovation für das Verfahren einzuholen. In der Tat ist für die Euthanasie und die postmortale Sektion gemäß der Richtlinie 2010/63/EU keine Ethik-Unbedenklichkeitsbescheinigung erforderlich. Die in diesem Manuskript vorgestellten Ergebnisse stammen aus der Wildtyp-Linie C57BL/6NRj (siehe Materialtabelle) und der transgenen Tg:Pax7-nGFP-Linie 12 (gezüchtet von unserem Team). Das Protokoll wurde auf männliche und weibliche Mäuse im Alter von 8-12 Wochen angewendet.
1. Vorbereitung des Reagenzes und der Ausrüstung vor dem Verdau
- Besprühen Sie die Sezierwerkzeuge (gerade und gebogene Schere, Pinzette, siehe Materialtabelle) mit 70%igem Ethanol und trocknen Sie sie mit Papier. Beschichten Sie eine Korkplatte mit Alufolie und halten Sie 10 cm Petrischalen (eine pro Tier) in der Nähe. Halten Sie Papier und 70% Ethanol in Reichweite.
HINWEIS: Spülen Sie die Sezierwerkzeuge am Ende der Sektion mit Wasser ab, besprühen Sie sie dann mit 70%igem Ethanol und trocknen Sie sie mit Papier. - Stellen Sie ein rotierendes Wasserbad auf 37 °C ein und bereiten Sie die Aufschlussmischung (20 ml/Tier) zu, indem Sie DMEM mit 1 % Penicillin-Streptomycin, 0,5 U/ml-Kollagenase, 3 U/ml-Dispase (siehe Materialtabelle) und 0,2 % BSA in 50-ml-Röhrchen kombinieren.
- Die Aufschlussmischung wird durch einen 0,22-μm-Filter in einer Zellkulturhaube geleitet.
HINWEIS: Es wird empfohlen, die Verdauungsmischung jedes Mal frisch zuzubereiten.
2. Vorbereitung des Reagenzes und der Ausrüstung nach dem Aufschluss
- Nach der Verdauung kann die Mischung eingefroren oder kultiviert werden. Zum Einfrieren bereiten Sie 10 % DMSO: 90 % fötales Kälberserum (FBS) sowie einen Satz Kryoröhrchen (1 ml Zellsuspension pro 2 ml Kryoröhrchen) vor. Für die Kultur bereiten Sie das Nährmedium (DMEM ergänzt mit 1 % Penicillin-Streptomycin, 4 ng/ml bFGF und 20 % FBS) und einen Satz 8-Well-Platten vor. Die Platten müssen vor dem Beschichten der Zellen beschichtet werden (Details finden Sie in Schritt 7.1).
- Für die Färbung werden 4 % Paraformaldehyd (PFA) in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) (0,15 ml/Well der 8-Well-Platte) und Blockierungslösung (5 % IgG-freies Rinderserumalbumin [BSA] in PBS; 0,15 ml/Well der 8-Well-Platte) vorbereitet.
VORSICHT: Atmen Sie das PFA-Pulver nicht ein; Bereiten Sie es vor und handhaben Sie es unter einer chemischen Haube.
3. Sezieren
- Besprühen Sie das eingeschläferte Tier mit 70%igem Ethanol. Machen Sie einen horizontalen Schnitt (linke Körperseite zur rechten Seite) mit einer großen Schere auf Höhe des Bauches und schneiden Sie um die Taille herum. Ziehen Sie die Haut von den Hintergliedmaßen ab, um die Muskeln freizulegen (Abbildung 1A).
- Lege das Tier auf die mit Aluminiumfolie überzogene Korkplatte und stecke die gegenüberliegende Vorder- und Hintergliedmaße fest. Entfernen Sie schnell alle Muskeln der Hintergliedmaßen (vorne und hinten) in eine 10 cm lange Petrischale, die auf Eis gestellt wird (Abbildung 1B,C). Achten Sie besonders darauf, das Fettgewebe aus den Bereichen um den Quadrizeps und die hinteren Muskeln zu entfernen. Zu diesem Zeitpunkt können auch Faszien, Nerven und Sehnen entfernt werden, wenn dies die Gesamtzeit für die Präparation nicht beeinträchtigt.
HINWEIS: Eine optimale Dissektionszeit für beide Hintergliedmaßen sollte etwa 15-20 Minuten betragen. Es wird empfohlen, dass die Präparierzeit 30 Minuten nicht überschreitet. - Geben Sie gelegentlich DMEM-Tropfen in die Muskeln, um sie feucht zu halten, aber nicht zu viel, da dies das Hacken erschwert. Wiederholen Sie den Vorgang für die andere Hintergliedmaße. Sobald sich alle Muskeln eines Tieres in der Petrischale befinden (Abbildung 1D), schneiden Sie sie 7-10 Minuten lang mit einer Schere fein zusammen, um ein glattes Homogenat zu erhalten (Abbildung 1E).
HINWEIS: In diesem Protokoll wird DMEM mit L-Glutamin, Pyruvat und 4,5 g/L D-Glucose ergänzt.
Abbildung 1: Vorbereitung der Muskeln vor der Kultur. (A) Die Haut wird entfernt, um die Muskeln der Hintergliedmaßen freizulegen, wie in Schritt 3.1 beschrieben. (B,C) Alle Muskeln der Hintergliedmaßen werden (B) um und (C) zwischen den Knochen entnommen, wie in Schritt 3.2 beschrieben. (D) Die entnommenen Muskeln werden in einer 10 cm großen Petrischale mit DMEM-Tropfen auf Eis gelegt, um sie feucht zu halten, wie in Schritt 3.3 beschrieben. (E) Die Muskeln werden mit einer Schere fein gehackt, bis eine glatte Paste mit der in diesem Bild dargestellten Konsistenz entsteht. (F) ein Bild des Pellets nach der abschließenden Zentrifugation; Der blaue Pfeil hebt das Pellet hervor, das sich gegen das Rohr befindet, unter der gestrichelten blauen Linie. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
4. Verdauung
HINWEIS: Am Ende des Aufschlusses werden eine Zentrifuge bei 4 °C, ein Eimer Eis, drei Zellsiebe (100 μm, 70 μm, 40 μm) und drei 50-ml-Röhrchen (pro Tier) für Abschnitt 5 benötigt.
- Bereiten Sie die Aufschlussmischung vor und filtern Sie sie, wie in Schritt 1.2 beschrieben. Halte die Mischung auf Eis.
- Sobald alle Muskeln zerkleinert sind, geben Sie das Homogenat in ein 50-ml-Röhrchen mit 20 ml Aufschlussmischung. Umwickeln Sie die Ränder des Deckels mit flexibler Folie, um ein Auslaufen zu verhindern, und legen Sie das Röhrchen in ein 37 °C heißes Schüttelwasserbad mit niedriger bis mittlerer Geschwindigkeit (50 U/min).
- Öffnen Sie nach 1 Stunde bei 37 °C den Deckel und mischen Sie, indem Sie mit einer 10-ml-Pipette siebenmal vorsichtig auf und ab pipettieren, um eine homogene Mischung zu erhalten. Legen Sie eine neue Folie um den Deckel und legen Sie ihn wieder in das Schüttelwasserbad. Entfernen Sie nach 1 Stunde den Schlauch und schalten Sie das Bad aus.
HINWEIS: Verwenden Sie diese Inkubationszeit für die Kultur, um die Platten wie in Schritt 7.1 beschrieben zu beschichten, bevor Sie mit Abschnitt 5 fortfahren.
5. Filtration
- Füllen Sie das Aufschlussröhrchen mit kaltem DMEM (ergänzt mit 1% Penicillin-Streptomycin) bis zu 50 ml. Mischen Sie, indem Sie die Tube dreimal umdrehen. Bewahren Sie das DMEM für die nächsten Schritte in einem Eiskübel auf.
- Legen Sie ein 100-μm-Zellsieb auf ein neues 50-ml-Röhrchen. Führen Sie die verdaute Mischung durch das Zellsieb in das neue Röhrchen. Bei 600 x g 5 min bei 4 °C zentrifugieren. Gießen Sie den Überstand in einen flüssigen Abfallbehälter.
- Resuspendieren Sie das Pellet in 1 ml kaltem DMEM (ergänzt mit 1% Penicillin-Streptomycin). Füllen Sie das Röhrchen bis zu 50 ml mit demselben DMEM. HINWEIS: Wenn die Zentrifugation übersprungen wird, ist das nächste Pellet schwieriger zu identifizieren und zu warten.
- Legen Sie ein 70-μm-Zellsieb auf ein neues 50-ml-Röhrchen. Führen Sie die zentrifugierte/resuspendierte Mischung durch das Zellsieb in das neue Röhrchen. Bei 80 x g 5 min bei 4 °C zentrifugieren.
HINWEIS: Dieser Schritt ist nicht obligatorisch, wird aber empfohlen, um Zelltrümmer zu beseitigen. - Legen Sie ein 40-μm-Zellsieb auf ein neues 50-ml-Röhrchen. Führen Sie den Überstand durch das Zellsieb in das neue Röhrchen. Bei 600 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren, den Überstand in einen Behälter für flüssige Abfälle gießen und das Pellet in FBS unter der Kulturhaube resuspendieren. Das Pellet ist in diesem Schritt sehr klein (Abbildung 1F).
HINWEIS: Durch das Filtern durch das 40-μm-Sieb werden Ablagerungen entfernt, die bei der späteren Färbung der Kulturen ein unspezifisches Signal abgeben würden.
6. (Optional) Einfrieren
HINWEIS: Abschnitt 6 ist optional. Das Protokoll kann nach der Filterung pausiert werden, was jedoch das Überleben der Zellen und den Kulturerfolg verringern kann.
- Fügen Sie DMSO hinzu, um ein Verhältnis von 10 % DMSO zu 90 % FBS zu erhalten, und überführen Sie es in Kryoröhrchen (1 ml resuspendiertes Pellet pro 2 ml Kryoröhrchen).
- Legen Sie das Kryoröhrchen bei −80 °C über Nacht in eine Styroporbox. Am nächsten Tag auf −150 °C für eine langfristige Lagerung umstellen.
HINWEIS: Eine kurzzeitige Lagerung bei −80 °C ist ebenfalls möglich. - Zu Beginn der Kultur wird das Kryoröhrchen in einem 37 °C warmen Wasserbad schnell aufgetaut, bis die Zellsuspension aufgetaut ist. Mischen Sie mit 4 ml DMEM unter der Kultivierungshaube. Bei 600 x g 5 min bei 4 °C schleudern. Pipettieren Sie den Überstand heraus und fahren Sie fort, wie in Schritt 7.2 beschrieben.
7. Kultivierung
HINWEIS: Es kann davon ausgegangen werden, dass gefrorene oder frische Zellsuspensionen 24-32 Wells mit drei bis vier 8-Well-Platten füllen.
- Beschichten Sie 8-Well-Platten mit der Beschichtungslösung, die bei 4 °C oder auf Eis aufgetaut werden sollte (Standardbeschichtungslösung wird normalerweise bei −20 °C aufbewahrt). Geben Sie 0,4 ml Beschichtungslösung in eine Vertiefung und pipettieren Sie sie von Vertiefung zu Vertiefung. Nachdem die Beschichtungslösung alle Vertiefungen durchlaufen hat, kann sie für zukünftige Kulturen wieder aufgefangen und wieder eingefroren werden. Halten Sie die beschichteten Platten 30 Minuten lang bei 37 °C, bevor Sie die Zellen plattieren.
- DMEM (ergänzt mit 1% Penicillin-Streptomycin) ergänzt mit 4 ng/ml bFGF (siehe Materialtabelle) zur FBS-Zellsuspension hinzufügen, um ein FBS:80%-DMEM-Verhältnis von 20 % zu erhalten.
HINWEIS: Auch wenn die Zugabe von bFGF in primären Myoblastenkulturen und bei der satellitenähnlichen Zellproduktion in Massenkulturen von Vorteil sein kann, ist ihre Zugabe optional, da ihre Auslassung in Massenkulturen von ~7 Tagen die Zellausbeute nicht ernsthaft beeinträchtigt. - Platte 0,4 ml der Suspension pro Vertiefung (aus Schritt 7.2) in die beschichteten 8-Vertiefungsplatten.
HINWEIS: Berechnen Sie 30cm2 Kultur pro Tier für gefrorene und frische Zubereitungen. - Inkubieren Sie die Kulturen bei 37 °C mit 5 % CO2 für bis zu 10 Tage, wobei das Medium jeden Tag gewechselt wird, nachdem die Kultur beginnt, eine gelbliche Farbe anzunehmen (normalerweise 5-7 Tage).
HINWEIS: Um Zellen in der S-Phase des Zellzyklus 13 zu quantifizieren, fügen Sie 2 h vor der Fixierung10 μM EdU hinzu. Um die erste S-Phase einzufangen, fügen Sie 10 μM EdU von der Beschichtung hinzu und fixieren Sie sie bei 40 h Kultur.
8. Fixierung
HINWEIS: Die Abschnitte 8-10 sollten bei Raumtemperatur durchgeführt werden, sofern nicht anders angegeben.
- Pipettieren Sie das Kulturmedium heraus und fixieren Sie die Zellen mit 4 % PFA (0,15 ml/Well).
VORSICHT: Fügen Sie PFA unter einer chemischen Haube hinzu.
HINWEIS: Wenn alle Vertiefungen gleichzeitig fixiert sind, 10 Minuten lang mit PFA bei Raumtemperatur inkubieren. Wenn die Vertiefungen zu unterschiedlichen Zeitpunkten fixiert sind, fügen Sie PFA zu den zu fixierenden Vertiefungen hinzu und lassen Sie die Platte 5 Minuten lang bei 37 °C im Inkubator. - Pipettieren Sie die PFA heraus und fügen Sie PBS für 10 s (0,15 ml/Well) hinzu. Pipettieren Sie das PBS heraus und fügen Sie frisches PBS für 5 Minuten (0,15 ml/Well) hinzu.
HINWEIS: Wenn alle Vertiefungen gleichzeitig fixiert sind, inkubieren Sie mit PBS bei Raumtemperatur. Wenn die Vertiefungen zu unterschiedlichen Zeitpunkten fixiert sind, fügen Sie PBS zu den festen Vertiefungen hinzu und lassen Sie die Platte 5 Minuten lang bei 37 °C im Inkubator. Fügen Sie dann 0,4 ml PBS hinzu und bewahren Sie die Platte bis zu 1 Woche im Inkubator auf.
9. Permeabilisierung und Blockierung
- Wenn Sie bereit sind, das PBS zu färben, pipettieren Sie es aus und permeabilisieren Sie es mit 0,5 % TritonX 100 in PBS (0,15 ml/Well) für 8 Minuten. Pipettieren Sie den TritonX 100, spülen Sie ihn 10 s lang (0,15 ml/Well) mit PBS, pipettieren Sie den PBS heraus und waschen Sie ihn 5 Minuten lang mit PBS (0,15 ml/Well).
- Block mit 5% IgG-freiem BSA in PBS für 30-60 min (0,15 ml/Well).
10. Färbung
- Pipettieren Sie die BSA heraus und fügen Sie die primäre Antikörpermischung in PBS verdünnt (0,15 ml/Well) hinzu (siehe Materialtabelle; Verdünnungen: Anti-CD31 1:100, Anti-FOSB 1:200, Anti-GFP 1:1.000, Anti-KI67 1:1.000, Anti-MyHC 1:400, Anti-MYOD 1:200, Anti-MYOG 1:150, Anti-PAX7 1:100, Anti-PDGFRa 1:50) für die nächtliche Inkubation bei 4 °C.
HINWEIS: Nach der Antikörperinkubation die Antikörpermischung auffangen, Natriumazid hinzufügen und bei 4 °C oder −20 °C (gemäß den Anweisungen des Antikörperherstellers) für die zukünftige Wiederverwendung aufbewahren. - Pipettieren Sie die Antikörpermischung heraus, spülen Sie sie 10 s lang mit PBS (0,15 ml/Well), pipettieren Sie die PBS heraus und waschen Sie sie 5 Minuten lang mit PBS (0,15 ml/Well).
- Pipettieren Sie das Wasch-PBS heraus, fügen Sie die sekundäre Antikörpermischung (Ziegen-Anti-Maus Alexa Fluor 488, Ziegen-Anti-Kaninchen Alexa Fluor 555, Ziegen-Anti-Ratten-Alexa Fluor 647, Ziegen-Anti-Maus Alexa Fluor 555, Ziegen-Anti-Huhn Alexa Fluor 488, alle in Verdünnungen von 1:500-1.000 verwendet) und Zellmarker (z. B. DAPI) in PBS (0,15 ml/Well) verdünnt hinzu (siehe Materialtabelle), und 1 h bei Raumtemperatur lichtgeschützt inkubieren.
- Pipettieren Sie die sekundäre Antikörpermischung, spülen Sie sie 10 s lang (0,15 ml/Well) mit PBS ab, pipettieren Sie die PBS, waschen Sie sie 5 Minuten lang mit PBS (0,15 ml/Well), pipettieren Sie die PBS heraus und montieren Sie sie.
HINWEIS: Wenn 8-Well-Platten mit abnehmbaren Separatoren verwendet werden, ziehen Sie die Separatoren vor der Montage ab.
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Representative Results
Dieses Protokoll ermöglicht die Kultivierung von Muskelzellen, während die Satellitenzellen und die meisten Zellen aus ihrer endogenen Nische geschützt werden. Abbildung 2 fasst die wichtigsten Schritte des Protokolls zusammen, während wesentliche Teile der Dissektion und des Aufschlusses in Abbildung 1 dargestellt sind. Eine Dissektion der Muskulatur der Hintergliedmaßen wird empfohlen (Abbildung 1A-C), da diese Muskelgruppe gut erforscht ist und einen entwicklungsbedingten Ursprung und molekulare Hierarchien teilt14. Es wird empfohlen, alle Mischungen unter sterilen Bedingungen zuzubereiten. Darüber hinaus wurde eine geringere Kulturkontamination festgestellt, wenn die Aufschlussmischung durch einen 0,22-μm-Filter unter einer Zellkulturhaube geleitet wurde.
Beim Auftragen von 1/30 einer Bulk-Präparation auf beschichtete 1 cm 2-Well-Platten sind längliche Zellen 3-4 Tage nach Beginn der Kultur sichtbar. Dies kann jedoch je nach Zellkonzentration variieren, und verlängerte Zellen können später auftreten, insbesondere beim Expandieren von gefrorenen Bulk-Präparaten. Etwa 7 Tage später sollte das Medium gelb geworden sein, und zu diesem Zeitpunkt sind tägliche Mediumwechsel erforderlich. Zusätzlich müssen die Vertiefungen an dieser Stelle mit Myotuben abgedeckt werden. Die Endothelzellen machen nur einen kleinen Teil der Kultur aus. Das Hauptindiz für eine erfolgreiche Kultur sind reichlich vorhandene PAX7+-Zellen, die möglicherweise fixiert und gefärbt werden müssen. Ein praktisches Mausmodell, das nach Möglichkeit verwendet werden könnte, ist die Tg:Pax7-nGFP-Linie 12, die die Visualisierung der PAX7-Positivität in Form von GFP-Expression ermöglicht; so können die Satellitenzellen von der Reporter-GFP leicht detektiert werden. GFP kann bei 20-facher Vergrößerung auf einem inversen Epifluoreszenzmikroskop beobachtet werden, was die Analyse des Kulturerfolgs während der laufenden Kultur ermöglicht. Dies ermöglicht auch die Live-Bildgebung von PAX7-GFP-Zellen in Massenkulturen. Kulturen dürfen nicht länger als 10 Tage belassen werden. Danach beginnt die Anzahl der Reservezellen abzunehmen, und die Myotuben können sich von der Platte lösen. Fehlgeschlagene Kulturen, auch basierend auf den jüngsten Erfahrungen mit Kulturen aus gefrorenen Zellen, können immer noch einen großen Anteil an Fasern, aber nur sehr wenige PAX7-GFP-Zellen erzeugen. Bei der Verwendung von Mäusen ohne Fluoreszenzmarker für PAX7 ist eine Färbung erforderlich, um die Wirksamkeit der Reservezellgenerierung zu beurteilen.
Die folgenden Antikörper wurden getestet und funktionieren gut mit dem in Protokollabschnitt 10 vorgestellten Färbeprotokoll: Anti-PAX7 (ein Marker für Satellitenzellen und aktivierte Myoblasten 15; auch ein Marker für Reservezellen, die in dieser Kultur entstehen), Anti-Myosin (ein Marker für Myotuben15), Anti-CD31 (ein Marker für Endothelzellen16), Anti-GFP (wenn Reportermäuse verwendet werden), anti-MYOD (ein Marker für Myoblasten 15), anti-MYOG (ein Marker für differenzierende Myozyten 15), anti-KI67 (ein Marker für proliferierende Zellen17) und anti-PDGFRα (ein Marker für FAPs15). Abbildung 3 zeigt myogene und Nischenzellen nach 7 Tagen in Kultur. In Abbildung 3A-C wurden Muskelmassen von Wildtyp-Mäusen kultiviert, während für Abbildung 3D-F Muskelmassen aus der oben genannten Tg:Pax7-nGFP-Linie kultiviert wurden. Die Doppelfärbung mit PAX7 und KI67 (Abbildung 3A) ermöglichte die Markierung der Reservezellen, die nach 5 Tagen in Kultur erschienen und Muskelstammzellmerkmale aufwiesen, wie z.B. den Austritt aus dem Zellzyklus (KI67-Status) und eine Lokalisation als "Satelliten" zu den gebildeten Myotuben. Die Doppelfärbung mit MyHC und MYOG (Abbildung 3B,D,E) ermöglichte die Markierung der Zellen, die durch Muskeldifferenzierung vorrückten und so progressiv MYOG exprimierten und dann zu mehrkernigen MyHC+-Myotuben verschmolzen. Die Färbung mit CD31 oder PDGFRα ermöglichte die Markierung von Nischenzellen (Abbildung 3C), wie z. B. Endothelzellen und FAPs. Abbildung 3D,E zeigt aufstrebende Reservezellen, die durch GFP markiert sind. Die Co-Färbung mit GFP und MyHC ermöglichte die Bewertung der Satellitenzellposition der Reservezellen (Abbildung 3E), während die Co-Färbung mit GFP und anderen Aktivierungs-/Differenzierungsmarkern die Bewertung der ruheähnlichen Natur der Reservezellen ermöglichte (Abbildung 3F).
Abbildung 2: Überblick über die Protokollschritte. (A–D) Aufeinanderfolgende Schritte von (A) Dissektion, (B) Aufschluss, (C) Filtration und (D) Kultur. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Immunfärbung der Zellpopulationen. (A) Immunfluoreszenz von myogenen (markiert durch PAX7; grün) und zyklischen (markiert durch KI67; rot) Zellen. Die Zellkerne werden mit DAPI (blau) gegengefärbt. Das Vorhandensein von nicht-zyklischen myogenen Zellen (KI67-PAX7+) zeigt, dass das Protokoll ruheähnliche Zellen von Wildtyp-Mäusen produzieren kann, die nach 7 Tagen Kultur reichlich vorhanden sind. (B) Immunfluoreszenz von Myotuben (markiert durch Myosin-Schwerkette [MyHC]; grün) und Myozyten (markiert durch MYOG; rot) nach 7-tägiger Kultur von Zellen von Wildtyp-Mäusen. Die Zellkerne werden mit DAPI (blau) gegengefärbt. (C) Immunfluoreszenz von myogenen Zellen (markiert durch PAX7; grün), mesenchymalen fibro-adipogenen Vorläuferzellen (markiert durch PDGFRa; rot) und Endothelzellen (markiert durch CD31; magenta) nach 7-tägiger Kultur von Zellen von Wildtyp-Mäusen. Die Zellkerne werden mit DAPI (blau) gegengefärbt. (D) Immunfluoreszenz von GFP+-Zellen (grün) und Myozyten (markiert durch MYOG; magenta) nach 8-tägiger Kultur von Zellen aus Tg:Pax7-nGFP-Mäusen , in denen PAX7-exprimierende Zellen durch nukleäres GFP markiert sind. (E) Immunfluoreszenz von GFP+-Zellen (grün) und Myotuben (markiert durch MyHC; rot) nach 7-tägiger Kultur von Zellen aus Tg:Pax7-nGFP-Mäusen . Beachten Sie, dass die satellitenzellähnlichen Zellen nach 7 Tagen in der Kultur erscheinen. (F) Quantifizierung des GFP+-Zellanteils, der Marker von Satellitenzellen (PAX7), Aktivierung (FOSB), Proliferation (KI67) oder myogene Differenzierung (MYOD, MYOG) mitexprimiert. Die Fehlerbalken geben die Standardabweichung an. Maßstabsleiste: 100 um. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Die Funktion der Skelettmuskulatur bei Erwachsenen wird durch eine fein orchestrierte Reihe von zellulären Interaktionen und molekularen Signalen untermauert. Hier wird eine Methode vorgestellt, die es ermöglicht, diese Parameter in einer ex vivo Umgebung zu untersuchen, die der physiologischen Mikroumgebung sehr ähnlich ist.
Mehrere Gruppen haben über In-vitro-Methoden zur Kultivierung myogener Zellen berichtet. Diese Methoden zielten darauf ab, Satellitenzellen zu isolieren, um ihre myogenen Vorläufereigenschaften zu untersuchen. Es werden zwei Hauptansätze verwendet, um reine Satellitenzellen zu isolieren, entweder aus Kulturen isolierter Fasern aus Soleus- und/oder EDL-Muskeln18oder aus FACS-isolierten Satellitenzellen, aus Bulk-Muskeln, wobei ein Panel von Antikörpern für Pax7, CD34 und a7-Integrin für die positive Selektion und CD45, CD31 und Sca1 für die negative Selektion verwendet wird 19,20,21. Andere haben auch mechanische Hähne verwendet, um primäre Myoblasten aus Massenkulturen auf gelatinebeschichteten Platten zu isolieren, da sie im Vergleich zu anderen Zellen wie FAPs zerbrechliche Adhäsionseigenschaften aufweisen22,23. Während diese Ansätze geeignet sind, um die Aktivierung von Satellitenzellen zu untersuchen oder sie in Kultur zu vermehren, wachsen die Zellen in einer Umgebung, in der die Stützzellen beraubt sind, die normalerweise zu ihrer Nische beitragen. Darüber hinaus erfordern diese Ansätze, dass die myogenen Vorläuferzellen länger als 2 Wochen aufbewahrt werden, um ruhende einkernige Reservezellen mit hoher Pax7-Expression zu etablieren18. Es wurde auch über Co-Kulturen von Satellitenzellen und anderen Zelltypen, wie z. B. Makrophagen, berichtet. Dies ermöglichte die Untersuchung des direkten Beitrags einer bestimmten Zelle zu myogenen Eigenschaften wie Proliferation, Differenzierung und Fusion24. Mehrere Einzelzell-RNA-seq-Studien haben die zelluläre Zusammensetzung des Skelettmuskels detailliert beschrieben25,26. Da unsere Kulturbedingungen die Bildung von myogenen Zellen begünstigen, haben wir im Vergleich zu diesen in vivo Studien einen viel höheren Anteil an Reservezellen und einen geringeren Anteil an Stützzellen in Massenkulturen beobachtet.
Bei der hier beschriebenen Methode wurden drei kritische Schritte identifiziert, die den Wirkungsgrad steigern können. Erstens ist ein schnelles und effizientes Zerkleinern notwendig, um eine optimale Muskeldissoziation während der 2 h Verdauung und anschließend eine höhere Zellausbeute zu gewährleisten. Zweitens ist eine kontinuierliche Rotation während der Verdauung sehr wichtig, um die richtige Diffusion der Enzyme durch das Gewebe zu gewährleisten. Schließlich ist auch eine schonende mechanische Dissoziation wichtig für eine optimale Gewebedissoziation.
Es gibt vier Haupteinschränkungen dieses Protokolls. Erstens bleibt es ein Ex-vivo-System, was bedeutet, dass einige physiologische und biophysikalische Signale verloren gehen oder verändert werden können. Dazu gehört die Signalübertragung zu/von den Muskelfasern, da die Fasern vor der Beschichtung verloren gehen und die Myotuben während der Kultur wieder aufgebaut werden. Zweitens bleibt abzuwarten, ob die gebildeten Myotuben embryonale oder adulte Eigenschaften aufweisen und ob sie die verschiedenen Fasertypen in langsamen und schnellen Muskeln repräsentieren. Zum Vergleich: Kulturen der C2C12-Muskelzelllinie und menschlicher Myoblasten haben gezeigt, dass Myotuben in 2D-Kultur weniger reif sind als ihre in vivo Gegenstücke 27,28, während primäre Maus-Myoblastenkulturen zu Myosintypen zu führen scheinen, die für die in vivo 29 gefundenen Myosintypen repräsentativ sind. Drittens verlieren die Zellen bei dieser Methode ihre In-situ-Position während der Gewebedissoziation, und den neu gebildeten Myotuben fehlen neuromuskuläre und myotendinöse Verbindungen; Daher sollten Ergebnisse zu räumlichen Merkmalen mit Vorsicht interpretiert werden. Viertens wurde das vorgestellte Protokoll für gesunde erwachsene Muskeln optimiert, aber Anpassungen können erforderlich sein, wenn das Ausgangsmaterial aus gealterten oder myopathischen Muskeln stammt, die eine ausgedehnte Fibrose, eine erhöhte adipogene Ablagerung oder eine beeinträchtigte Zellaktivierung aufweisen.
Die meisten dieser Einschränkungen gelten auch für andere Methoden der Ex-vivo-Muskeluntersuchung, aber dieses Protokoll hat mehrere Vorteile gegenüber ihnen. Es ist das einzige Protokoll, das es ermöglicht, eine große Anzahl von ruhenden Reserve-Satellitenzellen zu ernten. Darüber hinaus stellt es eine kostengünstige und unkomplizierte Methode dar, die keine speziellen Kulturbedingungen oder Fachkenntnisse erfordert, die mit induzierten pluripotenten Stammzellen, embryonalen Stammzellen, Myosphärenkulturen oder Organoidkulturen verbunden sind. Darüber hinaus hängt die Massenkultur nicht von der komplizierten Infrastruktur und Standardisierung ab, die mit Kulturen von myogenen Zellen in Hydrogelen oder anderen Gerüsten verbunden ist. Im Vergleich zu Kulturen von isolierten Myofasern, FACS-isolierten Primärzellen oder mit Vorplattieren angereicherten Primärzellen bewahrt die Massenkultur mehr Zellpopulationen, die in der physiologischen Muskelumgebung vorhanden sind. Diese Zellen durchlaufen einen relativ physiologischen Weg der Aktivierung und Differenzierung, der von den Wachstumsfaktoren des Kulturmediums angetrieben wird und nicht von den extremen und ungewöhnlichen Signalen der Schlangengifte, die üblicherweise zur Untersuchung der Muskelregeneration in vivo verwendet werden 30,31. Schließlich ist die vorgestellte Zellkultur vorteilhaft gegenüber der Verwendung von C2C12-Zellen, die, wie bei jeder Zelllinie, genetische Veränderungen im Vergleich zu endogenen oder primären Zellen aufweisen.
Die oben genannten Vorteile machen dieses Protokoll zu einem leistungsstarken Werkzeug für Anwendungen wie die Zellamplifikation und die Erzeugung eines ruheähnlichen Satellitenzellpools, die für die Entwicklung von Zelltherapien oder sogar für die Beantwortung grundlegender Fragen zur Ruhephase und zellulären/molekularen Regulation erforderlich sind. Darüber hinaus kann das Protokoll verwendet werden, um die molekulare Signalübertragung durch Medikamente, siRNA-Targeting oder Transfektion mit Vektoren (Plasmiden, Viren) zu modifizieren, die die Überexpression oder Expression dominanter negativer Formen der interessierenden Faktoren induzieren.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass keine Interessenkonflikte bestehen.
Acknowledgments
Für Abbildung 2 wurden Vorlagen von Servier Medical Art (https://smart.servier.com/) verwendet. Das FR-Labor wird von der Association Française contre les Myopathies - AFM via TRANSLAMUSCLE (Stipendien 19507 und 22946), der Fondation pour la Recherche Médicale - FRM (EQU202003010217, ENV202004011730, ECO201806006793), der Agence Nationale pour la Recherche - ANR (ANR-21-CE13-0006-02, ANR-19-CE13-0010, ANR-10-LABX-73) und der La Ligue Contre le Cancer (IP/SC-17130) unterstützt. Die oben genannten Geldgeber spielten keine Rolle bei der Konzeption, Sammlung, Analyse, Interpretation oder Berichterstattung dieser Studie oder dem Schreiben dieses Manuskripts.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-CD31 | BD | 550274 | dilution 1:100 |
| anti-FOSB | Santa Cruz | sc-7203 | dilution 1:200 |
| anti-GFP | Abcam | ab13970 | dilution 1:1000 |
| anti-Ki67 | Abcam | ab16667 | dilution 1:1000 |
| anti-MyHC | DSHB | MF20-c | dilution 1:400 |
| anti-MYOD | Active Motif | 39991 | dilution 1:200 |
| anti-MYOG | Santa Cruz | sc-576 | dilution 1:150 |
| anti-Pax7 | Santa Cruz | sc-81648 | dilution 1:100 |
| anti-PDGFRα | Invitrogen | PA5-16571 | dilution 1:50 |
| b-FGF | Peprotech | 450-33 | concentration 4 ng/mL |
| Bovine serum albumin (BSA) – used for digestion | Sigma Aldrich | A7906-1006 | concentration 0.2% |
| BSA IgG-free, protease-free – used for staining | Jackson ImmunoResearch | 001-000-162 | concentration 5% |
| Cell strainer 40 um | Dominique Dutscher | 352340 | |
| Cell strainer 70 um | Dominique Dutscher | 352350 | |
| Cell strainer 100 um | Dominique Dutscher | 352360 | |
| Collagenase | Roche | 10103586001 | concentration 0.5 U/mL |
| Culture plate | Sarstedt | 94.6140.802 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Euromedex | UD8050-05-A | |
| Dispase | Roche | 4942078001 | concentration 3 U/mL |
| Dissection forceps size 5 | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Dissection forceps size 55 | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Dissection scissors (big, straight) | Fine Science Tools | 9146-11 | ideal for chopping |
| Dissection scissors (small, curved) | Fine Science Tools | 15017-10 | |
| Dissection scissors (small, straight) | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | ThermoFisher | 41966-029 | |
| EdU Click-iT kit | ThermoFisher | C10340 | |
| Fetal bovine serum – option 1 | Eurobio | CVF00-01 | |
| Fetal bovine serum – option 2 | Gibco | 10270-106 | |
| Matrigel | Corning Life Sciences | 354234 | coating solution |
| Parafilm | Dominique Dutscher | 090261 | flexible film |
| Paraformaldehyde – option 1 | PanReac AppliChem ITW Reagents | 211511.1209 | concentration 4% |
| Paraformaldeyde – option 2 | ThermoFisher | 28908 | concentration 4% |
| Penicillin streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Shaking water bath | ThermoFisher | TSSWB27 | |
| TritonX100 | Sigma Aldrich | T8532-500 ML | concentration 0.5% |
| Wild-type mice | Janvier | C57BL/6NRj |
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