Unfraktionierte Massenkultur des Mausskelettmuskels zur Rekapitulation der Nischen- und Stammzellruhe

Summary

Die Skelettmuskulatur besteht aus mehreren Zelltypen, einschließlich residenter Stammzellen, von denen jede einen besonderen Beitrag zur Muskelhomöostase und -regeneration leistet. Hier werden die 2D-Kultur von Muskelstammzellen und die Muskelzellnische in einer ex vivo Umgebung beschrieben, die viele der physiologischen, in vivo und Umwelteigenschaften bewahrt.

Abstract

Der Skelettmuskel ist das größte Gewebe des Körpers und erfüllt mehrere Funktionen, von der Fortbewegung bis zur Kontrolle der Körpertemperatur. Seine Funktionalität und Genesung nach Verletzungen hängt von einer Vielzahl von Zelltypen und von molekularen Signalen zwischen den Kernmuskelzellen (Myofasern, Muskelstammzellen) und ihrer Nische ab. Die meisten Versuchsumgebungen bewahren diese komplexe physiologische Mikroumgebung nicht, und sie erlauben auch nicht die Ex-vivo-Untersuchung von Muskelstammzellen in Ruhezustand, einem Zellzustand, der für sie entscheidend ist. Hier wird ein Protokoll für die ex vivo Kultur von Muskelstammzellen mit zellulären Komponenten ihrer Nische skizziert. Durch den mechanischen und enzymatischen Abbau von Muskeln erhält man eine Mischung von Zelltypen, die in eine 2D-Kultur gegeben wird. Die Immunfärbung zeigt, dass innerhalb von 1 Woche mehrere Nischenzellen in Kultur neben Myofasern und vor allem Pax7-positiven Zellen vorhanden sind, die die Eigenschaften ruhender Muskelstammzellen aufweisen. Diese einzigartigen Eigenschaften machen dieses Protokoll zu einem leistungsstarken Werkzeug für die Zellamplifikation und die Erzeugung von ruhenden Stammzellen, die zur Beantwortung grundlegender und translationaler Fragen verwendet werden können.

Introduction

Bewegung, Atmung, Stoffwechsel, Körperhaltung und Aufrechterhaltung der Körpertemperatur hängen alle von der Skelettmuskulatur ab, und Fehlfunktionen in der Skelettmuskulatur können daher schwächende Pathologien (d. h. Myopathien, Muskeldystrophien usw.) verursachen. ¹. Aufgrund seiner wesentlichen Funktionen und seines Überflusses hat die Skelettmuskulatur die Aufmerksamkeit von Forschungslabors weltweit auf sich gezogen, die sich bemühen, die Schlüsselaspekte zu verstehen, die eine normale Muskelfunktion unterstützen und als therapeutische Ziele dienen können. Darüber hinaus ist die Skelettmuskulatur ein weit verbreitetes Modell zur Untersuchung der Regeneration und Stammzellfunktion, da sich ein gesunder Muskel nach einer vollständigen Verletzung und Degeneration vollständig selbst reparieren kann, hauptsächlich aufgrund seiner ansässigen Stammzellen²; Diese werden auch Satellitenzellen genannt und sind unter der Basallamina in der Peripherie der Muskelfasern lokalisiert³.

Die Kernzellen der adulten Skelettmuskulatur sind die Myofasern (lange synzytiale multinukleäre Zellen) und die Satellitenzellen (Stammzellen mit myogenem Potenzial, die ruhen, bis eine Verletzung sie aktiviert). Die letztgenannten Zellen sind die zentralen Zellen der Muskelregeneration, und dieser Prozess kann in ihrer Abwesenheit nicht stattfinden 4,5,6,7. In ihrer unmittelbaren Mikroumgebung gibt es mehrere Zelltypen und molekulare Faktoren, die ihnen Signale geben. Diese Nische etabliert sich allmählich im Laufe der Entwicklung und bis ins Erwachsenenalter⁸. Der adulte Muskel enthält mehrere Zelltypen (Endothelzellen, Perizyten, Makrophagen, fibroadipogene Vorläuferzellen (FAPs), regulatorische T-Zellen usw.) ^9,10 und extrazelluläre Matrixkomponenten (Laminine, Kollagene, Fibronektin, Fibrilline, Periostin, etc.) ¹¹, die miteinander und mit den Satellitenzellen im Kontext von Gesundheit, Krankheit und Regeneration interagieren.

Die Bewahrung dieser komplexen Nische in experimentellen Umgebungen ist grundlegend, aber auch eine Herausforderung. Ebenso schwierig ist es, die Ruhe aufrechtzuerhalten oder wieder herzustellen, ein Zellzustand, der für Satellitenzellen kritisch ist⁹. Es wurden mehrere Methoden eingeführt, um diese Herausforderungen teilweise zu bewältigen, jede mit ihren Vor- und Nachteilen (ausführlich im Diskussionsabschnitt). Hier wird eine Methode vorgestellt, die diese beiden Barrieren teilweise überwinden kann. Muskeln werden zunächst entnommen und dann mechanisch und enzymatisch abgebaut, bevor die heterogene Zellmischung in Kultur gegeben wird. Im Verlauf der Kultur werden viele Zelltypen der Nische nachgewiesen und Satellitenzellen beobachtet, die in den Ruhezustand zurückgekehrt sind. Als letzter Schritt des Protokolls werden die Immunfluoreszenzschritte vorgestellt, die den Nachweis jedes Zelltyps durch die Verwendung allgemein anerkannter Marker ermöglichen.

Protocol

Alle Versuche entsprachen den französischen und EU-Tierschutzvorschriften des Institut Mondor de Recherche Biomédicale (INSERM U955), insbesondere der Richtlinie 2010/63/EU. Die Tiere wurden in einer kontrollierten und angereicherten Umgebung in den Tiereinrichtungen mit den Zertifizierungsnummern A94 028 379 und D94-028-028 gehalten. Sie wurden nur von autorisierten Forschern und Tierpflegern angefasst und vom Personal der Tierhaltung visuell auf Anzeichen von Unbehagen während ihres Lebens untersucht. Sie wurden vor…

Representative Results

Dieses Protokoll ermöglicht die Kultivierung von Muskelzellen, während die Satellitenzellen und die meisten Zellen aus ihrer endogenen Nische geschützt werden. Abbildung 2 fasst die wichtigsten Schritte des Protokolls zusammen, während wesentliche Teile der Dissektion und des Aufschlusses in Abbildung 1 dargestellt sind. Eine Dissektion der Muskulatur der Hintergliedmaßen wird empfohlen (Abbildung 1A-C<…

Discussion

Die Funktion der Skelettmuskulatur bei Erwachsenen wird durch eine fein orchestrierte Reihe von zellulären Interaktionen und molekularen Signalen untermauert. Hier wird eine Methode vorgestellt, die es ermöglicht, diese Parameter in einer ex vivo Umgebung zu untersuchen, die der physiologischen Mikroumgebung sehr ähnlich ist.

Mehrere Gruppen haben über In-vitro-Methoden zur Kultivierung myogener Zellen berichtet. Diese Methoden zielten darauf ab, Satellitenzellen zu isoli…

Materials

anti-CD31	BD	550274	dilution 1:100
anti-FOSB	Santa Cruz	sc-7203	dilution 1:200
anti-GFP	Abcam	ab13970	dilution 1:1000
anti-Ki67	Abcam	ab16667	dilution 1:1000
anti-MyHC	DSHB	MF20-c	dilution 1:400
anti-MYOD	Active Motif	39991	dilution 1:200
anti-MYOG	Santa Cruz	sc-576	dilution 1:150
anti-Pax7	Santa Cruz	sc-81648	dilution 1:100
anti-PDGFRα	Invitrogen	PA5-16571	dilution 1:50
b-FGF	Peprotech	450-33	concentration 4 ng/mL
bovine serum albumin (BSA) – used for digestion	Sigma Aldrich	A7906-1006	concentration 0.2%
BSA IgG-free, protease-free – used for staining	Jackson ImmunoResearch	001-000-162	concentration 5%
cell strainer 40 um	Dominique Dutscher	352340
cell strainer 70 um	Dominique Dutscher	352350
cell strainer 100 um	Dominique Dutscher	352360
Collagenase	Roche	10103586001	concentration 0.5 U/mL
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Euromedex	UD8050-05-A
Dispase	Roche	4942078001	concentration 3 U/mL
Dissection forceps size 5	Fine Science Tools	91150-20
Dissection forceps size 55	Fine Science Tools	11295-51
Dissection scissors (big, straight)	Fine Science Tools	9146-11	ideal for chopping
Dissection scissors (small, curved)	Fine Science Tools	15017-10
Dissection scissors (small, straight)	Fine Science Tools	14084-08
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	ThermoFisher	41966-029
EdU Click-iT kit	ThermoFisher	C10340
Fetal bovine serum – option 1	Eurobio	CVF00-01
Fetal bovine serum – option 2	Gibco	10270-106
Matrigel	Corning Life Sciences	354234	coating solution
Parafilm	Dominique Dutscher	090261	flexible film
Penicillin streptomycin	Gibco	15140-122
Paraformaldehyde – option 1	PanReac AppliChem ITW Reagents	211511.1209	concentration 4%
Paraformaldeyde – option 2	ThermoFisher	28908	concentration 4%
Shaking water bath	ThermoFisher	TSSWB27
TritonX100	Sigma Aldrich	T8532-500 ML	concentration 0.5%
Wild-type mice	Janvier	C57BL/6NRj