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顕微鏡検査と染色:グラム、カプセル、内胞染色

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細菌は、形状、細胞の配置、カプセルを産生するかどうか、胞子を形成するかどうかなど、多くの特徴を持つ顕微鏡生物です。これらの特徴はすべて染色によって視覚化され、異なった細菌種の同定そして分類を助けることができる。

細胞の形状と配置の最初の2つの特徴を調べるために、グラム染色と呼ばれる簡単な技術を使用することができます。ここで、結晶バイオレットは、スライド上に熱固定された細菌に適用される。その後、デカラーライザーが適用され、厚いペプチドギリカン層を持つ細菌は、この層がデカラーライザーによって容易に浸透しないので、紫色に染色します。これらの細菌はグラム陽性と呼ばれる。

グラム陰性細菌は、より薄いペプチドギリカン層を持っており、紫色を失い、脱色剤を脱汚します。しかし、サフラニンカウンター染色を加えると赤みがかったピンク色に染まり、外側のリポ多糖層に結合します。一度染色されると、細胞は、鎖やクラスターなどの形態、大きさ、および配置のために観察することができ、分類および同定にさらに役立ちます。

微生物学者のツールキットのもう一つの有用な技術は、いくつかのタイプの細菌細胞を取り囲む外部カプセルを視覚化するために使用されるカプセル染色です。カプセル非イオン組成物と汚れを撃退する傾向があるため、単純な染色方法は機能しません。代わりに、細菌細胞が結晶紫色で染色される前に、まずコンゴ赤などの酸性着色剤で背景を染色する負の染色技術が使用されます。これは、細胞の周りに明確なハローとして存在する任意のカプセルを残します。

ここでカバーされる最終的な主要な染色技術は、研究されている細菌が胞子を形成するかどうかを判断するのに役立ちます。悪条件では、一部の細菌は、極端な温度や脱水のような環境ストレスの期間を通じて細菌の生存を確保することである内胞子、休眠、タフ、非生殖構造を生成します。しかし、すべての細菌種が内生胞を作るわけではないため、多くの染料に対して不浸透性であるため、標準的な技術で染色することは困難です。シェーファーフルトン法は、スライドに固定された細菌に適用されるマラカイト緑色の汚れを使用しています。スライドは、サフラニンで染色される前に水で洗浄されます。栄養細胞はピンクがかった赤色に見え、存在する内胞子は緑色で表示されます。このビデオでは、これらの一般的な細菌染色技術を実行し、光顕微鏡を使用して染色サンプルを調べる方法を学びます。

手順を開始するには、長い髪を結び、ラボコートや手袋を含む適切な個人用保護具を着用してください。

その後、実験室の拭き取りで新鮮な顕微鏡スライドをきれいにします。次に、1Xリン酸のピペット10マイクロリットルを第1スライド上に緩衝生理食塩水を入れた。次に、滅菌ピペット先端を使用して、LB寒天プレートから単一の細菌コロニーを選択する。液体中の細菌コロニーを塗りつぶし、薄く、均一な層を作り出す。ベンチ上部にスライドをセットし、完全に空気乾燥させます。

乾燥したら、ブンゼンバーナーを点灯させて細菌を加熱します。トングを使用して、バーナー炎を数回通り、細菌の側面を上にして、あまりにも長く炎の中でスライドを保持しないように注意して、細胞を歪める可能性があります。

さて、シンクの上で作業し、スライドレベルを保持し、完全に細菌の汚れをカバーするためにグラムのクリスタルバイオレットの数滴を適用し、その後、45秒間立つためにベンチにスライドを置きます。次に、スライドを斜めに保持し、スライドの上部に水の流れをそっと噴き出し、細菌の汚れを直接噴出しないように注意してください。さて、もう一度スライドレベルを保持し、グラムのヨウ素溶液を塗布して染色された細菌を完全に覆い、さらに45秒間放置します。次に、前に示したように、スライドからヨウ素を慎重にすすいでください。スライドを斜めに保持したまま、Gramのデカラー化剤をスライドに数滴加え、染色された細菌の上を約5秒間実行できるようにします。直ちに、前に示したように水ですすいでください。これにより、スミアの過色化が制限されます。次に、スライドレベルをもう一度保持し、グラムのサフラニンカウンターステインを塗布し、染色された細菌を完全に覆います。45秒後、スライドからサフラニンを水で軽くすすいでから、ペーパータオルで乾かします。

最後に、浸漬油の滴をスライドに直接追加し、その後、100Xオイル対物レンズで軽微顕微鏡を使用してスライドを調べます。

この染色プロトコルを開始するには、まず正しい個人用保護具を着用し、次に使用するガラススライドがきれいであることを確認します。

次に、ソリューションを準備します。1%の結晶バイオレット溶液を作るために、0.25グラムの結晶紫色粉末を25ミリリットルの蒸留水と混合し、溶解するまで渦を混ぜます。次いで、0.25グラムのコンゴ赤色粉末を25ミリリットルの蒸留水と渦を溶かして溶かして1%コンゴ赤溶液を調製する。さて、スライド上のコンゴ赤溶液のピペット10マイクロリットル。クリーンな無菌ピペットチップを使用して、LB寒天プレートから単一の細菌コロニーを選択します。次に、細菌コロニーを染料に塗り込み、薄く均一な層を作り出す。細菌スライドを5~7分間完全に空気乾燥させます。スライドが乾燥したら、スミアをカバーするのに十分な1%の結晶バイオレットでスミアを洪水し、1分間座らせます。さて、スライドを斜めに持ち、スライドの上に水の流れをそっと噴き出し、細菌を直接噴出しないように注意してください。完全に空気が乾燥するまで、スライドを45度の角度で保持し続けます。最後に、浸漬油の滴をスライドに直接追加し、次に、100Xオイル目的の小顕微鏡を使用してスライドを調べます。

内胞スポア染色を行うには、まず、0を混合して0.5%のマラカイトグリーン溶液を調出す。125グラムのマラカイトグリーンパウダーを25ミリリットルの蒸留水で、溶解するまで溶液を渦にする。次に、スライドの中心に1X PBSのピペット10マイクロリットル。次に、滅菌ピペット先端を使用して、LB寒天プレートから単一の細菌コロニーを選択する。細菌を液体に塗りつぶし、薄くても均一な層を作り出します。次に、ベンチ上部にスライドをセットし、完全に空気乾燥させます。乾燥したら、ブンゼンバーナーを点灯させて細菌を加熱します。青いバーナーの炎を数回通り、細菌側を上に向けて渡します。次に、スライドが冷却されたら、熱固定スミアの上にプリカットレンズペーパーを置きます。次に、最も高い設定にホットプレートをオンにし、沸騰に水のビーカーをもたらします。

レンズペーパーをマラカイトグリーン溶液で飽和させ、トングを使用して、沸騰した水のビーカーの上にスライドを置き、5分間蒸します。必要に応じて、一滴ずつ多くの染料を加えることで、レンズ紙を湿らせておきます。次に、もう一度トングを使用して、ビーカーからスライドを拾い、レンズペーパーを取り外して捨てます。スライドが 2 分間冷やされます。シンクの上で作業し、スライドを斜めに保持し、スライドの上部に水の流れをそっと噴き出します。次に、スライドレベルを保持し、スライドを完全にカバーするためにサフラニンを適用します。その後、1分間放置します。次に、スライドを斜めに保持し、前に示したようにすすいで下げます。スライドをベンチ上部の空気乾燥させます。最後に、浸漬油の滴をスライドに直接追加し、その後、100Xオイルの目的で、軽い顕微鏡でスライドを調べます。

グラム染色プロトコルでは、2つの異なる色の汚れが生じる可能性があります。濃い紫色の染色は、細菌がグラム陽性であり、結晶紫色の染色を保持していることを示します。対照的に、赤みがかったピンクの染色はグラム陰性細菌の特徴であり、代わりにサフラニンカウンター染色によって着色されます。さらに、異なる形状や細菌の配置は、グラム染色後に視覚化することができます。例えば、コッチ、または丸い細菌を棒状のバチルスから区別したり、鎖を形成する細菌を同定したり、典型的に塊として凝集するものと比較して、または一体的に発生する細菌を同定することができる。

カプセル染色顕微鏡画像では、細菌細胞は通常紫色に染色され、スライドの背景は暗く染色されるべきである。この暗い背景に対して、細菌のカプセルが存在する場合、細胞の周りに明確なハローとして現れる。

最後に、内胞スポア染色では、栄養細胞はサフラニンカウンター染色によって赤く染色されます。内胞子がサンプル中に存在する場合、これらはマラカイト緑色の汚れを保持し、青色緑色に見えます。

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