Comptage des unités de formation de colonies (FC) : Quantification des bactéries des corps volants

- Tout d’abord, recueillir les mouches au stade de développement souhaité et les placer dans un tube stérile. Ne compter que le microbiote interne, stériliser l’extérieur des mouches en les insérant dans 70 % d’éthanol. Pour mesurer à la fois le microbiote interne et externe, sautez cette étape de stérilisation. Ensuite, moudre les mouches dans un petit volume de supports de croissance bactérienne à l’aide de perles de céramique et d’homogénéisant tissulaire, ou manuellement avec un pilon. Il faut prendre soin de ne pas introduire de bactéries provenant de sources externes, afin d’éviter la contamination des échantillons.

Vous devriez maintenant avoir un mélange homogène contenant des bactéries que vous pouvez culture. Augmenter le volume de l’homogénéate à l’aide d’un milieu bactérien liquide. Effectuer des dilutions périodiques de l’homogénéité et plaquer un volume constant de ces dilutions sur le milieu de croissance solide approprié pour vos bactéries. Au fur et à mesure que les bactéries se développent, des colonies se formeront sur la plaque. Trouvez la dilution qui a une plage de 10 à 100 colonies pour déterminer les unités de formation des colonies, ou CFU, de l’échantillon.

Dans le protocole de l’exemple, nous inoculons les mouches stériles avec une culture bactérienne gnotobiotic ou définie et recueillons et mesurons des CFUs.

- Utiliser des pointes de filtre pour transférer 100 microlitres de croissance nocturne dans un tube de microfuge stérile. Ensuite, transférez 200 microlitres de chaque culture dans une plaque de 96 puits. Retirez les échantillons de l’armoire de biosécurité et centrifugez-les pour pelleter les bactéries. Après avoir fait des dilutions dilutions d’un, deux et quatre fois, mesurez la densité optique ou l’OD600 sur un spectrophotomètre de lecture multi-puits.

Après avoir obtenu l’OD600, retirer le supernatant à l’aide d’une pointe de pipette et utiliser des mMRS frais pour suspendre à nouveau la pastille. Mélanger les souches bactériennes diluées en ratios égaux pour créer un cocktail multi-espèces. Transférer 50 microlitres du cocktail vers les tubes coniques contenant le régime stérile et les œufs déchorionnés. Assurez-vous d’ajouter les bactéries après le transfert d’œufs pour éviter la contamination entre les flacons. Puis placez les tubes inoculés dans un incubateur.

Pour mesurer les unités de formation des colonies ou FC, transférez cinq mouches dans un tube de microfuge de 1,7 millilitre contenant 125 microlitres de perles de céramique et 125 microlitres de bouillon mMRS. Homogénéiser les mouches à l’aide d’un homogénéisateur tissulaire. Il ne devrait pas rester de morceaux entiers de la mouche. Ensuite, diluer l’homogénéité avec 875 microlitres de mMRS, vortex l’homogénéité pendant cinq secondes, et pipette 120 microlitres dans le premier puits d’une plaque de microtiter.

Retirer 10 microlitres du premier puits et l’ajouter au deuxième puits contenant 70 microlitres de MRS. Bien mélanger le contenu du deuxième puits. Transférer ensuite 10 microlitres du deuxième puits au troisième puits contenant 70 microlitres de MRS, et bien mélanger. Transférer 10 microlitres de chaque dilution dans une assiette mMRS. Inclinez légèrement le plat pour étendre la dilution de plusieurs millimètres sur la surface de l’agar et laissez le liquide sécher avant de déplacer la plaque. Retirez les plaques de l’incubateur une fois que des colonies individuelles distinctes sont visibles et comptez-les d’une dilution avec 10 à 100 colonies isolées. Enfin, calculer le CFU par mouche.