Encyclopedia of Experiments: Biology
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- Zuerst fliegen im gewünschten Entwicklungsstadium sammeln und in eine sterile Röhre legen. Um nur die innere Mikrobiota zu zählen, sterilisieren Sie das Äußere der Fliegen, indem Sie sie in 70% Ethanol eintauchen. Um sowohl die interne als auch die externe Mikrobiota zu messen, überspringen Sie diesen Sterilisationsschritt. Als nächstes mahlen Sie die Fliegen in einem kleinen Volumen von bakteriellen Wachstumsmedien mit Keramikperlen und einem Gewebehomogenisator oder manuell mit einem Schädling. Es sollte darauf geachtet werden, keine Bakterien aus externen Quellen einzuführen, um eine Kontamination der Proben zu verhindern.
Sie sollten nun eine homogene Mischung mit Bakterien haben, die Sie kulturieren können. Bringen Sie das Volumen des Homogenats mit flüssigem bakteriellen Medium. Führen Sie serielle Verdünnungen des Homogenats und Platte ein konstantes Volumen dieser Verdünnungen auf dem entsprechenden festen Wachstumsmedium für Ihre Bakterien. Wenn die Bakterien wachsen, bilden sich Kolonien auf der Platte. Finden Sie die Verdünnung, die einen Bereich von 10 bis 100 Kolonien hat, um die bildenden Kolonieeinheiten zu bestimmen.
Im Beispielprotokoll impfen wir sterile Fliegen mit einer gnotobiotischen oder definierten Bakterienkultur und sammeln und messen KBE.
- Verwenden Sie Filterspitzen, um 100 Mikroliter über Nacht wachstum auf ein steriles Mikrofugenrohr zu übertragen. Als nächstes übertragen Sie 200 Mikroliter jeder Kultur auf eine 96-Well-Platte. Entfernen Sie die Proben aus dem Biosicherheitsschrank und zentrifugieren Sie sie, um die Bakterien zu pellet. Nach der Herstellung von ein-, zwei- und vierfachen Verdünnungen, messen Sie die optische Dichte oder OD600 auf einem Multi-Well-Platten-Lesespektrometer.
Nach Erhalt des OD600 Entfernen Sie den Überstand mit einer Pipettenspitze und verwenden Sie frische mMRS, um das Pellet wieder aufzuhängen. Mischen Sie die verdünnten Bakterienstämme in gleichen Verhältnissen, um einen Multi-Arten-Cocktail zu schaffen. Übertragen Sie 50 Mikroliter des Cocktails in die konischen Schläuche, die die sterile Ernährung und dechorionierte Eier enthalten. Achten Sie darauf, die Bakterien nach dem Eitransfer hinzuzufügen, um eine Kontamination zwischen Fläschchen zu verhindern.
Um die Koloniebildeinheiten oder KBE zu messen, Fünf Fliegen in ein 1,7 Milliliter Mikrofuge-Rohr mit 125 Mikroliter Keramikperlen und 125 Mikroliter mMRS-Brühe übertragen. Homogenisieren Sie die Fliegen mit einem Gewebehomogenisator. Es sollten keine ganzen Teile übrig bleiben. Anschließend das Homogenat mit 875 Mikroliterm mMRS verdünnen, das Homogenat für fünf Sekunden wirbeln und die Pipette 120 Mikroliter in den ersten Brunnen einer Mikrotiterplatte.
Entfernen Sie 10 Mikroliter aus dem ersten Brunnen und fügen Sie es in den zweiten Brunnen mit 70 Mikroliter MRS. Mischen Sie den Inhalt des zweiten gut. Dann übertragen 10 Mikroliter vom zweiten Brunnen auf den dritten Brunnen mit 70 Mikroliter MRS, und mischen Sie gründlich. Übertragen Sie 10 Mikroliter jeder Verdünnung auf eine mMRS-Platte. Leicht geneigt die Schale, um die Verdünnung mehrere Millimeter auf der Oberfläche des Agars zu verteilen und die Flüssigkeit vor dem Verschieben der Platte trocknen zu lassen. Entfernen Sie die Platten aus dem Brutkasten, sobald einzelne Kolonien sichtbar sind und zählen Sie sie aus einer Verdünnung mit 10 bis zu 100 isolierten Kolonien. Schließlich berechnen Sie die KBE pro Fliege.
