Comptage des unités de formation de colonies (FC) : Quantification des bactéries des corps volants

Overview

Le microbiote drosophile a un impact sur le développement, l’immunité et la physiologie de l’animal. Cette vidéo décrit une méthode pour quantifier les bactéries des mouches en déterminant les unités formant la colonie à partir de préparations du corps entier. Le protocole en vedette démontre la technique avec les mouches, élevés dans des conditions gnotobiotic en utilisant quatre espèces bactériennes.

Protocol

Ce protocole est un extrait de Koyle et coll.,Élevage de la mouche des fruits Drosophila melanogaster Sous Axenic et Gnotobiotic Conditions, J. Vis. Exp. (2016).

1. Oeufs de déchorionate et transfert à la diète stérile

1. Préparer l’armoire de biosécurité en pulvérisant l’intérieur (y compris les côtés) avec 70% d’éthanol. Essuyer le fond avec un tissu de laboratoire, et stériliser le capot avec de la lumière UV pendant ~ 15 min. Stériliser tous les approvisionnements non biologiques (tasses à spécimens, pinceau, forceps, conteneur à déchets, eau stérilisée de 400 ml et 100 ml d’hypochlorite de sodium à 0,6 %) en pulvérisant de l’éthanol et en les plaçant immédiatement dans l’armoire de biosécurité. Stériliser avec la lumière UV pendant 15 min.
2. Commencez le premier des 2 lavages d’hypochlorite de sodium en plaçant le buisson avec les oeufs dans une tasse de spécimen de 120 ml ou un autre récipient stérile. Versez lentement ~90 ml de solution hypochlorite de sodium de 0,6 % dans le buisson jusqu’à ce qu’il soit juste en dessous de la jante.
3. Rincer les œufs pendant 2,5 minutes. Suspendre périodiquement les œufs en utilisant des forceps pour déplacer le buisson de haut en bas dans la solution hypochlorite.
4. Transférer le buisson directement dans une deuxième tasse de spécimen, pré-rempli de 90 ml d’eau de Javel, à l’intérieur de l’armoire de biosécurité.
5. Répétez l’étape 1.3 à l’intérieur de l’armoire de biosécurité. À la fin du deuxième traitement à l’eau de Javel, les œufs devraient commencer à adhérer aux côtés du buisson.
6. Effectuez les étapes 1.7-1.8 dans le cabinet de biosécurité.
7. Jeter l’eau de Javel et laver le buisson avec de l’eau stérile 3 fois. Suspendre à nouveau les œufs plusieurs fois au cours de chaque lavage en déplaçant le buisson avec des forceps. À la fin du troisième lavage, la plupart des œufs doivent être fixés sur le côté du buisson.
8. À l’aide d’un pinceau stérilisé à l’éthanol, transférer les œufs du côté du buisson au régime stérile. Transférer les œufs individuellement ou en petits lots. Visez 30-50 oeufs par flacon. Laissez les bouchons lâches pour permettre à l’oxygène d’entrer dans le tube. Si les flacons doivent rester axeniques, transférer dans un incubateur d’insectes; sinon, ajouter des bactéries comme ci-dessous.

2. Faire des mouches gnotobiotic utilisant 4 espèces bactériennes

1. Préparer les bactéries
   1. Préparer une armoire de biosécurité stérilisée avec les fournitures nécessaires (pipettes, boîtes à pointes pipette, tubes centrifugeuses stérilisés, bouillon MRS et supports à tubes à essai) comme à l’étape 1.1. Essuyer l’extérieur des tubes à essai à l’aide d’un lingette de laboratoire imbibé d’éthanol avant de le placer dans une armoire de biosécurité.
   2. Pelleter les bactéries en transférant d’abord 500 μl de croissance pendant la nuit à un tube de microfuge stérile. Si la densité bactérienne est faible, ajouter jusqu’à 1,5 ml à chaque tube ou enlever séquentiellement le supernatant et ajouter une culture supplémentaire au même tube. Retirer les échantillons de l’armoire de biosécurité et de la centrifugeuse pendant 10 min à 10 000 x g. Utilisez des conseils de filtre pour éviter la contamination entre les échantillons.
   3. Déterminez la densité de chaque culture en mesurant od₆₀₀. Si vous utilisez un lecteur de plaques multi-puits, transférez 200 μl de chaque culture à une plaque de 96 puits en dilutions 1, 2 et 4 fois.
   4. Déterminer la quantité de mMRS dans laquelle diluer chaque granulé cellulaire (2,1,2) à l’aide d’un spectrophotomètre de lecture de plaque et des équations suivantes. Prévoyez d’ajouter suffisamment de bouillon pour inoculer 50 μl à chaque flacon de mouche.
      1. Recueillir od₆₀₀ lectures pour un spectrophotomètre de lecture de plaque 1:1, 1:2, et 1:4 de chaque culture bactérienne sur un spectrophotomètre de lecture de plaque. Sélectionnez la dilution pour chaque souche bactérienne qui produit une valeur OD₆₀₀ entre 0,1 et 0,2 et utilisez cette valeur et son facteur de dilution correspondant comme « O » et « D » dans les formules données en 2.1.4.2 ou 2.1.4.3.
      2. Si vous utilisez les 4 espèces décrites ici, normalisez les cellules en unités équivalentes de formation de colonies (CFU)/ml densités (OD₆₀₀ à conversion CFU déterminée précédemment dans Newell et Douglas, Appl Environ Microbiol. (2014)) en utilisant cette équation :
         E = ((O-B) x V x D)/C
         où E = volume pour résuspendre les granulés (μl), O = OD₆₀₀ bactéries, B = OD₆₀₀ supports blancs, D = pli-dilution, V = μl culture bactérienne avant centrifugation, C = OD₆₀₀ de constante prédéterminée. Consultez le fichier de code supplémentaire pour des exemples de calculs utilisant ces équations. Pour les spectrophotomètres qui blanchissent automatiquement, utilisez « O » à la place de « O-B ».
         REMARQUE: Les constantes prédéterminées (unités OD₆₀₀, normalisées à 10⁷ CFU ml^-1, constantes dérivées de Newell et Douglas, Appl Environ Microbiol. (2014)) sont les suivants: A. tropicalis (0.052), A. pomorum (0.038), L. brevis (0.056), L. plantarum (0.077).
      3. Si l’utilisation d’autres espèces bactériennes (aucune constante CFU/OD₆₀₀ n’est disponible), normalisez la densité jusqu’à₆₀₀ OD = 0,1 en utilisant cette équation :
         E = ((O-B) x V x D)/0,1 OD₆₀₀
         REMARQUE: Les unités sont les mêmes qu’à l’étape 2.1.4.2. Consultez le fichier de code supplémentaire pour des exemples de calculs utilisant ces équations.
   5. Dans l’armoire de biosécurité, retirer le surnatant à l’aide d’une pointe de pipet et réutiliser la pastille dans des mMRS frais ou PBS tel que calculé à l’étape 2.1.4.2.
2. Bactéries inoculées
   1. Transférer 50 μl de bactéries dans les tubes coniques avec un régime stérile et des œufs déchorionés dans une armoire de biosécurité. Ajouter les bactéries après le transfert d’œufs pour éviter la contamination entre les flacons.
   2. Placer les tubes inoculés dans un incubateur à 25 °C.

3. Mesurer la charge/test de la CFU pour la stérilité

1. Pour mesurer la charge de CFU dans les homogénéités de mouche de corps entier, transférez 5 mouches (5-7 jours après l’éclosion) à un tube de microfuge de 1,7 ml contenant 125 μl de perles en céramique et 125 μl de bouillon mMRS. Homogénéiser les mouches à l’aide d’un homogénéisateur tissulaire pendant 30 sec à 4,0 M/sec.
   1. Alternativement, omettez les perles et homogénéisez à la main dans les tubes de microcentrifugeuse avec des pilons en plastique pendant 1 min.
   2. Si vous quantifiez le microbiote intestinal, la surface stérilise les mouches pour éliminer les microbes exogènes. Transférer les mouches dans un tube de microcentrifugeuse contenant 100 μl 70% d’éthanol pendant 1 min, aspirer l’éthanol et transférer dans un nouveau tube de microcentrifugeuse pour homogénéisations. Si la teneur en ADN de l’intestin est mesurée, rincer pendant 1 min avec 0,6 % d’hypochlorite de sodium avant le lavage à l’éthanol.
2. Diluer l’homogénéité avec 875 μl mMRS, vortex pendant 5 sec, et pipet 120 μl d’homogénéité dans le premier puits d’une plaque de microtiter.
3. Effectuez deux dilutions séquentielles de 1:8 à l’aide de 10 homogénéités de μl et de 70 μl de MRS dans les deux puits suivants.
   1. Retirer 10 μl du premier puits et l’ajouter au deuxième puits contenant 70 μl mrs. Bien mélanger le contenu du deuxième puits, transférer 10 μl du deuxième puits au troisième puits contenant 70 μl mrs, et bien mélanger. Cela conduit à 3 concentrations totales de l’homogénéité originale de 1 000 μl : non diluée, 1:8 et 1:64.
4. Transférer 10 μl de chaque dilution dans une plaque mMRS (à l’aide d’un pipet multicanal si désiré). Inclinez légèrement le plat pour étendre la dilution de plusieurs millimètres sur la surface de l’agar et laissez sécher le liquide avant de déplacer la plaque. Le liquide sèche rapidement sur la plaque si les plaques ont 2 jours, réduisant ainsi le mélange de deux gouttelettes voisines.
5. Incuber à 30 °C pendant 1-2 jours. Retirez les plaques de l’incubateur une fois distinctes, les colonies individuelles sont visibles et comptez à partir d’une dilution avec 10 à 100 colonies isolées.
6. Calculer le CFU par mouche à l’aide de l’équation E = C x D/P x V/F, où E = CFU par mouche, C = nombre de colonies comptées, D = dilution, P = μl plaqué, V = volume d’homogénéité de mouche, et F = nombre de mouches homogénéisées.

Representative Results

Fichier de code supplémentaire : Calculs d’échantillons. S’il vous plaît cliquez ici pour voir ce fichier (Cliquez à droite pour télécharger).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Brewer's Yeast	MP Biomedicals, LLC.	903312
Glucose	Sigma Aldrich	158968-3KG
Agar	Fisher--Lab Scientific	fly802010
Welch's 100% Grape Juice Concentrate	Walmart or other grocery store	9116196
Cage: 32 oz. Translucent Round Deli Container	Webstaurant Store	999L5032Y
Translucent Round Deli Container Lid	Webstaurant Store	999YNL500
Stock Bottles	Genesee Scientific	32-130
Droso-Plugs	Genesee Scientific	49-101
Nylon Mesh	Genesee Scientific	57-102
Plastic Bushing	Home Depot	100404002
Plastic Bushing Cap	Home Depot	100153897
Specimen Cup	MedSupply Partners	K01-207067
Repeater M4	Eppendorf	4982000322
50 ml Centrifuge Tubes	TrueLine Centrifuge Tubes	TR2003
Food Boxes	USA Scientific	2316-5001
Lysing Matrix D Bulk	MP Biomedicals, LLC.	116540434
Filter Pipette Tips, 300 µl	USA Scientific	1120-9810
Petri Dishes	Laboratory Product Sales	M089303
Ethanol	Decon Laboratories, INC.	2701
Paintbrush	Walmart	5133
Forceps	Fisher	08-882
Household Bleach (6-8% Hypochlorite)	Walmart	550646751
Universal Peptone	Genesee Scientific	20-260
Yeast Extract	Fisher Scientific	BP1422-500
Dipotassium Phosphate	Sigma Aldrich	P3786-1KG
Ammonium Citrate	Sigma Aldrich	25102-500g
Sodium Acetate	VWR	97061-994
Magnesium Sulfate	Fisher Scientific	M63-500
Manganese Sulfate	Sigma Aldrich	10034-96-5
MRS Powder	Sigma Aldrich	69966-500G
96 Well Plate Reader	BioTek (Epoch)	NA
1.7 ml Centrifuge Tubes	USA Scientific	1615-5500
Filter Pipette Tips, 1,000 µl	USA Scientific	1122-1830
96 Well Plates	Greiner Bio-One	655101
Ceramic Beads	MP Biomedicals, LLC.	6540-434
Tissue Homogenizer	MP Biomedicals, LLC.	116004500
Class 1 BioSafety Cabinet	Thermo Scientific	Model 1395