Zählen von Koloniebildenden Einheiten (KBE): Quantifizierung von Bakterien aus Flugkörpern

Overview

Drosophila-Mikrobiota beeinflusst die Entwicklung, Immunität und Physiologie des Tieres. Dieses Video beschreibt eine Methode zur Quantifizierung von Bakterien aus Fliegen, indem die koloniebildenden Einheiten aus Ganzkörperpräparaten bestimmt werden. Das vorgestellte Protokoll demonstriert die Technik mit Fliegen, die unter gnotobiotischen Bedingungen mit vier Bakterienarten aufgezogen werden.

Protocol

Dieses Protokoll ist ein Auszug aus Koyle et al., Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions, J. Vis. Exp. (2016).

1. Dechorionate Eier und Transfer zu Sterile Diät

1. Bereiten Sie den Biosicherheitsschrank vor, indem Sie die Innenseite (einschließlich Der Seiten) mit 70% Ethanol besprühen. Wischen Sie den Boden mit einem Laborgewebe ab und sterilisieren Sie die Kapuze mit UV-Licht für 15 min. Sterilisieren Sie alle nichtbiologischen Vorräte (Probenbecher, Pinsel, Zangen, Abfallbehälter, 400 ml sterilisiertes Wasser und 100 ml 0,6 % Natriumhypochlorit) durch Sprühen mit Ethanol und sofort in den Biosicherheitsschrank. Sterilisieren Sie mit UV-Licht für 15 min.
2. Beginnen Sie die erste von 2 Natriumhypochlorit-Washes, indem Sie die Buchse mit den Eiern in einen 120 ml-Probenbecher oder einen anderen sterilen Behälter legen. Gießen Sie langsam 90 ml 0,6% Natriumhypochloritlösung in die Buchse, bis knapp unter dem Rand.
3. Eier für 2,5 min abspülen. Die Eier regelmäßig wieder aussetzen, indem Sie Zangen verwenden, um die Buchse in der Hypochloritlösung nach oben und unten zu bewegen.
4. Die Buchse direkt in einen zweiten, mit 90 ml Bleichmittel vorgefüllten Probenbecher in den Biosicherheitsschrank überführen.
5. Wiederholen Sie Schritt 1.3 im Biosicherheitsschrank. Am Ende der zweiten Bleichbehandlung sollten die Eier beginnen, an den Seiten der Buchse zu haften.
6. Führen Sie die Schritte 1.7-1.8 im Biosicherheitsschrank aus.
7. Entsorgen Sie die Bleiche und waschen Sie die Buchse mit sterilem Wasser 3 mal. Die Eier während jeder Wäsche mehrmals wieder aufhängen, indem Sie die Buchse mit Zangen bewegen. Am Ende des dritten Waschens sollten die meisten Eier an der Seite der Buchse befestigt werden.
8. Mit einem in Ethanol sterilisierten Pinsel eier von der Seite der Buchse auf die sterile Diät übertragen. Eier einzeln oder in kleinen Chargen übertragen. Ziel für 30-50 Eier pro Durchstechflasche. Lassen Sie die Kappen locker, damit Sauerstoff in das Rohr gelangen kann. Wenn Fläschchen axtisch bleiben sollen, in einen Insektenbrutkasten überführen; andernfalls fügen Sie Bakterien wie unten hinzu.

2. Machen Sie gnotobiotische Fliegen mit 4 Bakterienarten

1. Vorbereiten von Bakterien
   1. Bereiten Sie einen sterilisierten Biosicherheitsschrank mit notwendigen Vorräten (Pipetten, Pipettenspitzenboxen, sterilisierte Zentrifugenrohre, MRS-Brühe und Reagenzgläser) wie in Schritt 1.1 vor. Wischen Sie die Außenseite von Reagenzgläsern mit einem mit Ethanol getränkten Labortüchern ab, bevor Sie sie in den Biosicherheitsschrank legen.
   2. Pellet die Bakterien durch zuerst übertragung 500 l von über Nacht Wachstum auf eine sterile Mikrofuge Rohr. Wenn die bakterielle Dichte gering ist, addieren Sie bis zu 1,5 ml zu jeder Röhre oder entfernen Sie nacheinander Überstand und fügen Sie dem gleichen Röhrchen zusätzliche Kultur hinzu. Proben aus dem Biosicherheitsschrank und der Zentrifuge für 10 min bei 10.000 x g entfernen. Verwenden Sie Filterspitzen, um Verunreinigungen zwischen Proben zu vermeiden.
   3. Bestimmen Sie die Dichte jeder Kultur, indem Sie OD₆₀₀messen. Wenn Sie einen Multi-Well-Plattenleser verwenden, übertragen Sie 200 l jeder Kultur auf eine 96-Well-Platte in 1-, 2- und 4-fachen Verdünnungen.
   4. Bestimmen Sie die Menge an mMRS, in der jedes Zellpellet (2.1.2) mit einem Plattenlesespektrophotometer und den folgenden Gleichungen verdünnt werden soll. Planen Sie, genügend Brühe hinzuzufügen, um 50 l zu jeder Fliegenfläschchen zu impfen.
      1. Sammeln Sie OD_{600-Messungen} für eine 1:1, 1:2 und 1:4 Verdünnung jeder Bakterienkultur auf einem Plattenlesespektrophotometer. Wählen Sie die Verdünnung für jeden Bakterienstamm aus, der einen OD_600-Wert zwischen 0,1 und 0,2 erzeugt, und verwenden Sie diesen Wert und den entsprechenden Verdünnungsfaktor als "O" und "D" in den Formeln in 2.1.4.2 oder 2.1.4.3.
      2. Wenn Sie die 4 hier beschriebenen Arten verwenden, normalisieren Sie Diezellen zu einer gleichwertigen Koloniebildenden Einheit (CFU)/ml Dichten (OD₆₀₀ in CFU Konvertierung zuvor in Newell und Douglas, Appl Environ Microbiol bestimmt. (2014)) mit dieser Gleichung:
         E = ((O-B) x V x D)/C
         wobei E = Volumen zum Wiederaufhängen von Pellets in (l), O = OD₆₀₀ Bakterien, B = OD₆₀₀ Blankmedien, D = Faltenverdünnung, V = -l-Bakterienkultur vor der Zentrifugation, C = OD₆₀₀ der vorbestimmten Konstante. Siehe Ergänzende Codedatei für Beispiele für Berechnungen mit diesen Gleichungen. Für Spektralphotometer, die automatisch leer sind, verwenden Sie "O" anstelle von "O-B".
         HINWEIS: Die vorgegebenen Konstanten (Einheiten OD₆₀₀, normalisiert auf 10⁷ CFU ml^-1, Konstanten abgeleitet in Newell und Douglas, Appl Environ Microbiol. (2014)) sind wie folgt: A. tropicalis (0.052), A. pomorum (0.038), L. brevis (0.056), L. plantarum (0.077).
      3. Wenn Sie andere Bakterienarten verwenden (keine CFU/OD_{600-Konstante} verfügbar ist), normalisieren Sie die Dichte auf OD₆₀₀ = 0,1 mit dieser Gleichung:
         E = ((O-B) x V x D)/0,1 OD₆₀₀
         HINWEIS: Die Einheiten sind die gleichen wie in Schritt 2.1.4.2. Siehe Ergänzende Codedatei für Beispiele für Berechnungen mit diesen Gleichungen.
   5. Im Biosicherheitsschrank überstand mit einer Pipettenspitze entfernen und das Pellet in frischem mMRS oder PBS wie in Schritt 2.1.4.2 berechnet wieder aufsetzen.
2. Inokulatische Bakterien
   1. Übertragen Sie 50 l der Bakterien in die konischen Röhrchen mit steriler Ernährung und dechorionierten Eiern im Biosicherheitsschrank. Fügen Sie Bakterien nach dem Eitransfer hinzu, um eine Kontamination zwischen Durchstechflaschen zu verhindern.
   2. Geimpfte Rohre bei 25 °C in einen Inkubator geben.

3. Messen Sie Die KBE-Last/den Test auf Sterilität

1. Um die KBE-Last in Ganzkörper-Fliegenhomogenaten zu messen, übertragen Sie 5 Fliegen (5-7 Tage nach der Eklat) auf ein 1,7 ml Mikrofuge-Rohr, das 125 l Keramikperlen und 125 l mMRS-Brühe enthält. Homogenisieren Sie Fliegen mit einem Gewebehomogenisator für 30 Sek. bei 4,0 M/sec.
   1. Alternativ lassen Sie Perlen weg und homogenisieren Sie in Mikrozentrifugenrohren mit Kunststoffschädlingen für 1 min.
   2. Bei der Quantifizierung der Darmmikrobiota sterilisieren die Oberflächen die Fliegen, um exogene Mikroben zu entfernen. Transferfliegen in ein Mikrozentrifugenrohr, das 100 l 70% Ethanol für 1 min enthält, Ethanol ansaugen und für Homogenisierungen in ein neues Mikrozentrifugenrohr übertragen. Wenn der DNA-Gehalt des Darms gemessen wird, spülen Sie 1 min mit 0,6% Natriumhypochlorit vor dem Ethanolwaschen aus.
2. Das Homogenat mit 875 l mMRS, Wirbel für 5 Sek. und Pipetten 120 l Homogenat in den ersten Brunnen einer Mikrotiterplatte verdünnen.
3. Führen Sie in den nächsten beiden Bohrungen zwei sequentielle 1:8-Verdünnungen mit 10-l-Homogenat und 70-l-MRS durch.
   1. 10 l aus dem ersten Brunnen nehmen und in den zweiten Brunnen mit 70 l MRS geben. Mischen Sie den Inhalt des zweiten brunnen gründlich, übertragen Sie 10 l vom zweiten Brunnen auf den dritten Brunnen, der 70 'l MRS enthält, und mischen Sie ihn gründlich. Dies führt zu 3 Gesamtkonzentrationen des ursprünglichen Homogenats von 1.000 l: unverdünnt, 1:8 und 1:64.
4. Übertragen Sie 10 l jeder Verdünnung auf eine mMRS-Platte (falls gewünscht mit einer Mehrkanalpipette). Leicht geneigt die Schale, um die Verdünnung mehrere Millimeter auf der Agar-Oberfläche zu verteilen und Flüssigkeit trocknen zu lassen, bevor die Platte bewegt. Die Flüssigkeit trocknet schnell auf der Platte, wenn die Platten 2 Tage alt sind, wodurch das Mischen von zwei benachbarten Tröpfchen reduziert wird.
5. Bei 30 °C für 1-2 Tage inkubieren. Entfernen Sie Platten aus dem Brutkasten einmal unterschiedlich, einzelne Kolonien sind sichtbar, und zählen aus einer Verdünnung mit 10-100 isolierten Kolonien.
6. Berechnen Sie die KBE pro Fliege mit der Gleichung E = C x D/P x V/F, wobei E = CFU pro Fliege, C = Anzahl der gezählten Kolonien, D = Verdünnung, P = l plattiert, V = Volumen des Fliegenhomogenats und F = Anzahl der homogenisierten Fliegen.

Representative Results

Ergänzende Codedatei: Beispielberechnungen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei anzuzeigen (Rechtsklick zum Herunterladen).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Brewer's Yeast	MP Biomedicals, LLC.	903312
Glucose	Sigma Aldrich	158968-3KG
Agar	Fisher--Lab Scientific	fly802010
Welch's 100% Grape Juice Concentrate	Walmart or other grocery store	9116196
Cage: 32 oz. Translucent Round Deli Container	Webstaurant Store	999L5032Y
Translucent Round Deli Container Lid	Webstaurant Store	999YNL500
Stock Bottles	Genesee Scientific	32-130
Droso-Plugs	Genesee Scientific	49-101
Nylon Mesh	Genesee Scientific	57-102
Plastic Bushing	Home Depot	100404002
Plastic Bushing Cap	Home Depot	100153897
Specimen Cup	MedSupply Partners	K01-207067
Repeater M4	Eppendorf	4982000322
50 ml Centrifuge Tubes	TrueLine Centrifuge Tubes	TR2003
Food Boxes	USA Scientific	2316-5001
Lysing Matrix D Bulk	MP Biomedicals, LLC.	116540434
Filter Pipette Tips, 300 µl	USA Scientific	1120-9810
Petri Dishes	Laboratory Product Sales	M089303
Ethanol	Decon Laboratories, INC.	2701
Paintbrush	Walmart	5133
Forceps	Fisher	08-882
Household Bleach (6-8% Hypochlorite)	Walmart	550646751
Universal Peptone	Genesee Scientific	20-260
Yeast Extract	Fisher Scientific	BP1422-500
Dipotassium Phosphate	Sigma Aldrich	P3786-1KG
Ammonium Citrate	Sigma Aldrich	25102-500g
Sodium Acetate	VWR	97061-994
Magnesium Sulfate	Fisher Scientific	M63-500
Manganese Sulfate	Sigma Aldrich	10034-96-5
MRS Powder	Sigma Aldrich	69966-500G
96 Well Plate Reader	BioTek (Epoch)	NA
1.7 ml Centrifuge Tubes	USA Scientific	1615-5500
Filter Pipette Tips, 1,000 µl	USA Scientific	1122-1830
96 Well Plates	Greiner Bio-One	655101
Ceramic Beads	MP Biomedicals, LLC.	6540-434
Tissue Homogenizer	MP Biomedicals, LLC.	116004500
Class 1 BioSafety Cabinet	Thermo Scientific	Model 1395