Encyclopedia of Experiments: Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
- İlk olarak, sinekleri gelişimin istenen aşamasında toplayın ve steril bir tüpe yerleştirin. Sadece iç mikrobiyotayı saymak için, sineklerin dışını% 70 etanol içine batırarak sterilize edin. Hem iç hem de dış mikrobiyotayı ölçmek için, bu sterilizasyon adımını atlayın.
Artık kültürlenebileceğiniz bakteriler içeren homojen bir karışıma sahip olmalısınız. Sıvı bakteriyel ortam kullanarak homojenatın hacmini getirin. Homojenatın seri seyreltmelerini gerçekleştirin ve bakteriniz için uygun katı büyüme ortamında bu seyreltmelerin sabit bir hacmini plakalayın. Bakteriler büyüdükçe, tabakta koloniler oluşacaktır. Numunenin Koloni Şekillendirme Birimlerini veya CFU'yu belirlemek için 10 ila 100 koloniye sahip seyreltmeyi bulun.
Örnek protokolde, steril sinekleri gnotobiyotik veya tanımlanmış bakteri kültürü ile aşılayacağız ve CFO'ları toplayacak ve ölçeceğiz.
- 100 mikrolitre gecelik büyümeyi steril bir mikroyakıt tüpüne aktarmak için filtre uçlarını kullanın. Daha sonra, her kültürün 200 mikrolitresini 96 kuyulu bir tabağa aktarın. Örnekleri biyogüvenlik kabininden çıkarın ve bakterileri peletmek için santrifüj edin. Bir, iki ve dört kat seyreltme yaptıktan sonra, optik yoğunluğu veya OD600'ü çok kuyulu bir plaka okuma spektrofotometresi üzerinde ölçün.
OD600'ü aldıktan sonra, bir pipet ucu ile süpernatant kaldırmak ve pelet yeniden askıya taze mMRS kullanın. Çok türlü bir kokteyl oluşturmak için eşit oranlarda seyreltilmiş bakteri suşları karıştırın. Steril diyet ve dehorionated yumurta içeren konik tüplere kokteyl 50 mikrolitre aktarın. Şişeler arasında kirlenmeyi önlemek için yumurta transfer sonra bakteri eklemek emin olun.
Koloni Şekillendirme Birimlerini veya CFO'ları ölçmek için, beş sineği 125 mikrolitre seramik boncuk ve 125 mikrolitre mMRS suyu içeren 1,7 mililitrelik bir mikrofuge tüpüne aktarın. Sinekleri bir doku homojenizatörü kullanarak homojenize edin.
İlk kuyudan 10 mikrolitre çıkarın ve 70 mikrolitre MRS içeren ikinci kuyuya ekleyin. ve iyice karıştırın. Her seyreltmenin 10 mikrolitresini bir mMRS plakasına aktarın. Seyreltmeyi agar yüzeyinden birkaç milimetre aşağı yaymak için kabı hafifçe bükün ve plakayı hareket ettirmeden önce sıvının kurumasını bekleyin. Farklı bireysel koloniler görünür olduğunda plakaları inkübatörden çıkarın ve 10 ile bir seyreltmeden sayın 100 izole koloniye.
