Overview
Drosophila mikrobiyotası hayvanın gelişimini, bağışıklığını ve fizyolojisini etkiler. Bu videoda, koloni oluşturan birimleri tüm vücut preparatlarından belirleyerek sineklerden bakterileri ölçmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Öne çıkan protokol, dört bakteri türü kullanılarak gnotobiyotik koşullar altında yetiştirilen sineklerle tekniği göstermektedir.
Protocol
Bu protokol Koyle ve ark.,Axenic ve Gnotobiotic Koşullar Altında Meyve Sineği Drosophila melanogaster Yetiştirme, J. Vis. Expbir alıntıdır. (2016).
1. Yumurtaları Kaynat ve Steril Diyete Aktar
- İç tarafları %70 etanol ile püskürterek biyogüvenlik kabinini hazırlayın. Alt kısmı bir laboratuvar dokusuyla silin ve kaputu ~ 15 dakika boyunca UV ışığıyla sterilize edin. Etanol ile püskürtülerek ve hemen biyogüvenlik kabinine yerleştirilerek biyolojik olmayan tüm malzemeleri (numune bardakları, boya fırçası, atık konteyneri, 400 ml sterilize su ve 100 ml% 0,6 sodyum hipoklorit) sterilize edin. UV ışığı ile 15 dakika sterilize edin.
- Yumurtalarla birlikte burçları 120 ml'lik bir numune kabına veya başka bir steril kaba yerleştirerek 2 sodyum hipoklorit yıkamadan ilkine başlayın. Yavaşça kenarın hemen altına kadar burçlara ~90 ml% 0.6 sodyum hipoklorit çözeltisi dökün.
- Yumurtaları 2,5 dakika durulayın. Hipoklorit çözeltisinde burçları yukarı ve aşağı hareket ettirmek için forseps kullanarak yumurtaları periyodik olarak yeniden askıya alın.
- Burçları doğrudan biyogüvenlik kabininin içinde 90 ml çamaşır suyu ile önceden doldurulmuş ikinci bir numune kabına aktarın.
- Biyogüvenlik kabininin içindeki 1.3. İkinci çamaşır suyu tedavisinin sonunda, yumurtalar burç kenarlarına yapışmaya başlamalıdır.
- Biyogüvenlik kabininde 1.7-1.8 adımlarını uygulayın.
- Çamaşır suyunu atın ve burçları steril suyla 3 kez yıkayın. Burçları kanatlarla hareket ettirerek her yıkama sırasında yumurtaları birkaç kez yeniden askıya alın. Üçüncü yıkamanın sonunda çoğu yumurta burç tarafına takılmalıdır.
- Etanolde sterilize edilmiş bir boya fırçası kullanarak, yumurtaları burç kenarından steril diyete aktarın. Yumurtaları ayrı ayrı veya küçük gruplar halinde aktarın. Şişe başına 30-50 yumurta hedefleyin. Oksijenin tüpe girmesini sağlamak için kapakları gevşek bırakın. Şişeler baltalı kalacaksa, bir böcek inkübatörüne aktarın; aksi takdirde, aşağıdaki gibi bakteri ekleyin.
2. 4 Bakteri Türü Kullanarak Gnotobiyotik Sinekler Yapın
- Bakteri Hazırlayın
- 1.1. adımda olduğu gibi gerekli malzemelerle (pipetler, pipet uç kutuları, sterilize santrifüj tüpleri, MRS suyu ve test tüpü rafları) sterilize edilmiş bir biyogüvenlik kabini hazırlayın. Biyogüvenlik kabinine yerleştirmeden önce test tüplerinin dışını etanolle ıslatılmış bir laboratuvar mendili ile silin.
- Önce steril bir mikroyakıt tüpüne 500 μl gece büyümesini aktararak bakterileri peletin. Bakteri yoğunluğu düşükse, her tüpe 1,5 ml'ye kadar ekleyin veya sırayla süpernatantı çıkarın ve aynı tüpe ekstra kültür ekleyin. Numuneleri biyogüvenlik kabininden çıkarın ve 10.000 x g'da 10 dakika santrifüj alın. Numuneler arasında kirlenmeyi önlemek için filtre ipuçlarını kullanın.
- OD600'iölçerek her kültürün yoğunluğunu belirleyin. Çok kuyulu bir plaka okuyucu kullanıyorsanız, her kültürün 200 μl'lik kısmını 1, 2 ve 4 kat seyreltmelerde 96 kuyu plakasına aktarın.
- Spektrofotometreyi ve aşağıdaki denklemleri okuyan bir plaka kullanarak her hücre peletinin (2.1.2) seyreltülecek mMRS miktarını belirleyin. Her sinek şişesine 50 μl aşılamak için yeterli et suyu eklemeyi planlayın.
- Plaka okuma spektrofotometresinde her bakteri kültürünün 1:1, 1:2 ve 1:4 seyreltilmesi için OD600 okumalarını toplayın. 0,1 ile 0,2 arasında bir OD 600 değeri üreten her bakteri suşu için seyreltme seçin ve 2.1.4.2 veya 2.1.4.3'te verilen formüllerde bu değeri ve karşılık gelen seyreltme faktörünü 'O' ve 'D' olarak kullanın.
- Burada açıklanan 4 türü kullanıyorsanız, hücreleri eşdeğer koloni şekillendirme ünitesine (CFU)/ml yoğunluklarına normalleştirin (daha önce Newell ve Douglas, Appl Environ Microbiol'da belirlenen CFU dönüşümüne OD600. (2014)) bu denklemi kullanarak:
E = ((O-B) x V x D)/C
burada E = peletin yeniden öğütüleceği hacim (μl), O = OD600 bakteri, B = OD600 boş ortam, D = kat seyreltme, V = santrifüjlemeden önce μl bakteri kültürü, C = OD600 önceden belirlenmiş sabit. Bu denklemleri kullanan hesaplama örnekleri için Ek Kod Dosyası'na bakın. Otomatik olarak boş olan spektrofotometreler için "O-B" yerine "O" kullanın.
NOT: Önceden belirlenmiş sabitler (birimler OD600, normalleştirilmiş 107 CFU ml-1, Newell ve Douglas türetilen sabitler, Appl Environ Microbiol. (2014)) şunlardır: A. tropicalis (0.052), A. pomorum (0.038), L. brevis (0.056), L. plantarum (0.077). - Diğer bakteri türlerini kullanıyorsanız (CFU/OD600 sabiti yoksa), bu denklemi kullanarak yoğunluğu OD600 = 0.1'e normalleştirin:
E = ((O-B) x V x D)/0,1 OD600
NOT: Birimler 2.1.4.2 adımındakiyle aynıdır. Bu denklemleri kullanan hesaplama örnekleri için Ek Kod Dosyası'na bakın.
- Biyogüvenlik kabininde, bir pipet ucu ile süpernatantı çıkarın ve peleti 2.1.4.2 adımında hesaplandıkça taze mMRS veya PBS'de yeniden atın.
- Inoculate Bakteri
- 50 μl bakteriyi steril diyet ve biyogüvenlik kabinindeki kafeinsiz yumurtalarla konik tüplere aktarın. Şişeler arasındaki kirlenmeyi önlemek için yumurta transferden sonra bakteri ekleyin.
- Aşılanmış tüpleri 25 °C'de bir inkübatöre yerleştirin.
3. Sterilite için CFU Yükünü / Testini Ölçün
- Tüm vücut sinek homojenatlarındaki CFU yükünü ölçmek için, 5 sineği (eklozyon sonrası 5-7 gün) 125 μl seramik boncuk ve 125 μl mMRS suyu içeren 1,7 ml'lik bir mikrofuge tüpüne aktarın. Homojenize, 4.0 M/sn'de 30 saniye boyunca bir doku homojenizatör kullanarak uçar.
- Alternatif olarak, boncukları atla ve 1 dakika boyunca plastik pestilli mikrosantrifüj tüplerinde el homojenize edin.
- Bağırsak mikrobiyotasını ölçüyorsanız, eksojen mikropları gidermek için yüzey sinekleri sterilize eder. Transfer, 1 dakika boyunca 100 μl% 70 etanol içeren bir mikrosantrifüj tüpüne uçar, etanol epirat ve homojenizasyonlar için yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Bağırsağın DNA içeriği ölçülecekse, etanol yıkamadan önce% 0.6 sodyum hipoklorit ile 1 dakika durulayın.
- Homojenatı 875 μl mMRS, vorteks 5 sn ve pipet 120 μl homojenatı bir mikrotiter plakanın ilk kuyusuna seyreltin.
- Sonraki iki kuyuda 10 μl homojenat ve 70 μl MRS kullanarak iki sıralı 1:8 seyreltme gerçekleştirin.
- İlk kuyudan 10 μl çıkarın ve 70 μl MRS içeren ikinci kuyuya ekleyin, ikinci kuyunun içeriğini iyice karıştırın, ikinci kuyudan 70 μl MRS içeren üçüncü kuyuya 10 μl aktarın ve iyice karıştırın. Bu, orijinal 1.000 μl homojenatın toplam 3 konsantrasyonuna yol açar: seyreltilmemiş, 1:8 ve 1:64.
- Her seyreltmenin 10 μl'sini bir mMRS plakasına aktarın (istenirse çok kanallı bir pipet kullanarak). Seyreltmeyi agar yüzeyinden birkaç milimetre aşağı yaymak için kabı hafifçe bükün ve plakayı hareket ettirmeden önce sıvının kurumasını bekleyin. Plakalar 2 günlükse sıvı plaka üzerinde hızlı bir şekilde kurur ve iki komşu damlacığın karışmasını azaltır.
- 1-2 gün boyunca 30 °C'de kuluçkaya yatır. Plakaları inkübatörden ayrı bir kez çıkarın, bireysel koloniler görülebilir ve 10-100 izole koloni ile bir seyreltmeden sayılır.
- E = C x D/P x V/F denklemini kullanarak uçucu başına CFU'yü hesaplayın;
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ek Kod Dosyası: Örnek Hesaplamalar. Bu dosyayı görüntülemek için lütfen tıklayınız (İndirmek için sağ tıklayınız).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Brewer's Yeast | MP Biomedicals, LLC. | 903312 | |
Glucose | Sigma Aldrich | 158968-3KG | |
Agar | Fisher--Lab Scientific | fly802010 | |
Welch's 100% Grape Juice Concentrate | Walmart or other grocery store | 9116196 | |
Cage: 32 oz. Translucent Round Deli Container | Webstaurant Store | 999L5032Y | |
Translucent Round Deli Container Lid | Webstaurant Store | 999YNL500 | |
Stock Bottles | Genesee Scientific | 32-130 | |
Droso-Plugs | Genesee Scientific | 49-101 | |
Nylon Mesh | Genesee Scientific | 57-102 | |
Plastic Bushing | Home Depot | 100404002 | |
Plastic Bushing Cap | Home Depot | 100153897 | |
Specimen Cup | MedSupply Partners | K01-207067 | |
Repeater M4 | Eppendorf | 4982000322 | |
50 ml Centrifuge Tubes | TrueLine Centrifuge Tubes | TR2003 | |
Food Boxes | USA Scientific | 2316-5001 | |
Lysing Matrix D Bulk | MP Biomedicals, LLC. | 116540434 | |
Filter Pipette Tips, 300 µl | USA Scientific | 1120-9810 | |
Petri Dishes | Laboratory Product Sales | M089303 | |
Ethanol | Decon Laboratories, INC. | 2701 | |
Paintbrush | Walmart | 5133 | |
Forceps | Fisher | 08-882 | |
Household Bleach (6-8% Hypochlorite) | Walmart | 550646751 | |
Universal Peptone | Genesee Scientific | 20-260 | |
Yeast Extract | Fisher Scientific | BP1422-500 | |
Dipotassium Phosphate | Sigma Aldrich | P3786-1KG | |
Ammonium Citrate | Sigma Aldrich | 25102-500g | |
Sodium Acetate | VWR | 97061-994 | |
Magnesium Sulfate | Fisher Scientific | M63-500 | |
Manganese Sulfate | Sigma Aldrich | 10034-96-5 | |
MRS Powder | Sigma Aldrich | 69966-500G | |
96 Well Plate Reader | BioTek (Epoch) | NA | |
1.7 ml Centrifuge Tubes | USA Scientific | 1615-5500 | |
Filter Pipette Tips, 1,000 µl | USA Scientific | 1122-1830 | |
96 Well Plates | Greiner Bio-One | 655101 | |
Ceramic Beads | MP Biomedicals, LLC. | 6540-434 | |
Tissue Homogenizer | MP Biomedicals, LLC. | 116004500 | |
Class 1 BioSafety Cabinet | Thermo Scientific | Model 1395 |