Koloni Şekillendirme Birimlerini Sayma (CFO'lar): Sinek Cisimlerinden Bakterileri Ölçme

Overview

Drosophila mikrobiyotası hayvanın gelişimini, bağışıklığını ve fizyolojisini etkiler. Bu videoda, koloni oluşturan birimleri tüm vücut preparatlarından belirleyerek sineklerden bakterileri ölçmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Öne çıkan protokol, dört bakteri türü kullanılarak gnotobiyotik koşullar altında yetiştirilen sineklerle tekniği göstermektedir.

Protocol

Bu protokol Koyle ve ark.,Axenic ve Gnotobiotic Koşullar Altında Meyve Sineği Drosophila melanogaster Yetiştirme, J. Vis. Expbir alıntıdır. (2016).

1. Yumurtaları Kaynat ve Steril Diyete Aktar

1. İç tarafları %70 etanol ile püskürterek biyogüvenlik kabinini hazırlayın. Alt kısmı bir laboratuvar dokusuyla silin ve kaputu ~ 15 dakika boyunca UV ışığıyla sterilize edin. Etanol ile püskürtülerek ve hemen biyogüvenlik kabinine yerleştirilerek biyolojik olmayan tüm malzemeleri (numune bardakları, boya fırçası, atık konteyneri, 400 ml sterilize su ve 100 ml% 0,6 sodyum hipoklorit) sterilize edin. UV ışığı ile 15 dakika sterilize edin.
2. Yumurtalarla birlikte burçları 120 ml'lik bir numune kabına veya başka bir steril kaba yerleştirerek 2 sodyum hipoklorit yıkamadan ilkine başlayın. Yavaşça kenarın hemen altına kadar burçlara ~90 ml% 0.6 sodyum hipoklorit çözeltisi dökün.
3. Yumurtaları 2,5 dakika durulayın. Hipoklorit çözeltisinde burçları yukarı ve aşağı hareket ettirmek için forseps kullanarak yumurtaları periyodik olarak yeniden askıya alın.
4. Burçları doğrudan biyogüvenlik kabininin içinde 90 ml çamaşır suyu ile önceden doldurulmuş ikinci bir numune kabına aktarın.
5. Biyogüvenlik kabininin içindeki 1.3. İkinci çamaşır suyu tedavisinin sonunda, yumurtalar burç kenarlarına yapışmaya başlamalıdır.
6. Biyogüvenlik kabininde 1.7-1.8 adımlarını uygulayın.
7. Çamaşır suyunu atın ve burçları steril suyla 3 kez yıkayın. Burçları kanatlarla hareket ettirerek her yıkama sırasında yumurtaları birkaç kez yeniden askıya alın. Üçüncü yıkamanın sonunda çoğu yumurta burç tarafına takılmalıdır.
8. Etanolde sterilize edilmiş bir boya fırçası kullanarak, yumurtaları burç kenarından steril diyete aktarın. Yumurtaları ayrı ayrı veya küçük gruplar halinde aktarın. Şişe başına 30-50 yumurta hedefleyin. Oksijenin tüpe girmesini sağlamak için kapakları gevşek bırakın. Şişeler baltalı kalacaksa, bir böcek inkübatörüne aktarın; aksi takdirde, aşağıdaki gibi bakteri ekleyin.

2. 4 Bakteri Türü Kullanarak Gnotobiyotik Sinekler Yapın

1. Bakteri Hazırlayın
   1. 1.1. adımda olduğu gibi gerekli malzemelerle (pipetler, pipet uç kutuları, sterilize santrifüj tüpleri, MRS suyu ve test tüpü rafları) sterilize edilmiş bir biyogüvenlik kabini hazırlayın. Biyogüvenlik kabinine yerleştirmeden önce test tüplerinin dışını etanolle ıslatılmış bir laboratuvar mendili ile silin.
   2. Önce steril bir mikroyakıt tüpüne 500 μl gece büyümesini aktararak bakterileri peletin. Bakteri yoğunluğu düşükse, her tüpe 1,5 ml'ye kadar ekleyin veya sırayla süpernatantı çıkarın ve aynı tüpe ekstra kültür ekleyin. Numuneleri biyogüvenlik kabininden çıkarın ve 10.000 x g'da 10 dakika santrifüj alın. Numuneler arasında kirlenmeyi önlemek için filtre ipuçlarını kullanın.
   3. OD_600'iölçerek her kültürün yoğunluğunu belirleyin. Çok kuyulu bir plaka okuyucu kullanıyorsanız, her kültürün 200 μl'lik kısmını 1, 2 ve 4 kat seyreltmelerde 96 kuyu plakasına aktarın.
   4. Spektrofotometreyi ve aşağıdaki denklemleri okuyan bir plaka kullanarak her hücre peletinin (2.1.2) seyreltülecek mMRS miktarını belirleyin. Her sinek şişesine 50 μl aşılamak için yeterli et suyu eklemeyi planlayın.
      1. Plaka okuma spektrofotometresinde her bakteri kültürünün 1:1, 1:2 ve 1:4 seyreltilmesi için OD₆₀₀ okumalarını toplayın. _{0,1 ile 0,2} arasında bir OD 600 değeri üreten her bakteri suşu için seyreltme seçin ve 2.1.4.2 veya 2.1.4.3'te verilen formüllerde bu değeri ve karşılık gelen seyreltme faktörünü 'O' ve 'D' olarak kullanın.
      2. Burada açıklanan 4 türü kullanıyorsanız, hücreleri eşdeğer koloni şekillendirme ünitesine (CFU)/ml yoğunluklarına normalleştirin (daha önce Newell ve Douglas, Appl Environ Microbiol'da belirlenen CFU dönüşümüne OD_600. (2014)) bu denklemi kullanarak:
         E = ((O-B) x V x D)/C
         burada E = peletin yeniden öğütüleceği hacim (μl), O = OD₆₀₀ bakteri, B = OD₆₀₀ boş ortam, D = kat seyreltme, V = santrifüjlemeden önce μl bakteri kültürü, C = OD₆₀₀ önceden belirlenmiş sabit. Bu denklemleri kullanan hesaplama örnekleri için Ek Kod Dosyası'na bakın. Otomatik olarak boş olan spektrofotometreler için "O-B" yerine "O" kullanın.
         NOT: Önceden belirlenmiş sabitler (birimler OD₆₀₀, normalleştirilmiş 10⁷ CFU ml^-1, Newell ve Douglas türetilen sabitler, Appl Environ Microbiol. (2014)) şunlardır: A. tropicalis (0.052), A. pomorum (0.038), L. brevis (0.056), L. plantarum (0.077).
      3. Diğer bakteri türlerini kullanıyorsanız (CFU/OD₆₀₀ sabiti yoksa), bu denklemi kullanarak yoğunluğu OD₆₀₀ = 0.1'e normalleştirin:
         E = ((O-B) x V x D)/0,1 OD₆₀₀
         NOT: Birimler 2.1.4.2 adımındakiyle aynıdır. Bu denklemleri kullanan hesaplama örnekleri için Ek Kod Dosyası'na bakın.
   5. Biyogüvenlik kabininde, bir pipet ucu ile süpernatantı çıkarın ve peleti 2.1.4.2 adımında hesaplandıkça taze mMRS veya PBS'de yeniden atın.
2. Inoculate Bakteri
   1. 50 μl bakteriyi steril diyet ve biyogüvenlik kabinindeki kafeinsiz yumurtalarla konik tüplere aktarın. Şişeler arasındaki kirlenmeyi önlemek için yumurta transferden sonra bakteri ekleyin.
   2. Aşılanmış tüpleri 25 °C'de bir inkübatöre yerleştirin.

3. Sterilite için CFU Yükünü / Testini Ölçün

1. Tüm vücut sinek homojenatlarındaki CFU yükünü ölçmek için, 5 sineği (eklozyon sonrası 5-7 gün) 125 μl seramik boncuk ve 125 μl mMRS suyu içeren 1,7 ml'lik bir mikrofuge tüpüne aktarın. Homojenize, 4.0 M/sn'de 30 saniye boyunca bir doku homojenizatör kullanarak uçar.
   1. Alternatif olarak, boncukları atla ve 1 dakika boyunca plastik pestilli mikrosantrifüj tüplerinde el homojenize edin.
   2. Bağırsak mikrobiyotasını ölçüyorsanız, eksojen mikropları gidermek için yüzey sinekleri sterilize eder. Transfer, 1 dakika boyunca 100 μl% 70 etanol içeren bir mikrosantrifüj tüpüne uçar, etanol epirat ve homojenizasyonlar için yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Bağırsağın DNA içeriği ölçülecekse, etanol yıkamadan önce% 0.6 sodyum hipoklorit ile 1 dakika durulayın.
2. Homojenatı 875 μl mMRS, vorteks 5 sn ve pipet 120 μl homojenatı bir mikrotiter plakanın ilk kuyusuna seyreltin.
3. Sonraki iki kuyuda 10 μl homojenat ve 70 μl MRS kullanarak iki sıralı 1:8 seyreltme gerçekleştirin.
   1. İlk kuyudan 10 μl çıkarın ve 70 μl MRS içeren ikinci kuyuya ekleyin, ikinci kuyunun içeriğini iyice karıştırın, ikinci kuyudan 70 μl MRS içeren üçüncü kuyuya 10 μl aktarın ve iyice karıştırın. Bu, orijinal 1.000 μl homojenatın toplam 3 konsantrasyonuna yol açar: seyreltilmemiş, 1:8 ve 1:64.
4. Her seyreltmenin 10 μl'sini bir mMRS plakasına aktarın (istenirse çok kanallı bir pipet kullanarak). Seyreltmeyi agar yüzeyinden birkaç milimetre aşağı yaymak için kabı hafifçe bükün ve plakayı hareket ettirmeden önce sıvının kurumasını bekleyin. Plakalar 2 günlükse sıvı plaka üzerinde hızlı bir şekilde kurur ve iki komşu damlacığın karışmasını azaltır.
5. 1-2 gün boyunca 30 °C'de kuluçkaya yatır. Plakaları inkübatörden ayrı bir kez çıkarın, bireysel koloniler görülebilir ve 10-100 izole koloni ile bir seyreltmeden sayılır.
6. E = C x D/P x V/F denklemini kullanarak uçucu başına CFU'yü hesaplayın;

Representative Results

Ek Kod Dosyası: Örnek Hesaplamalar. Bu dosyayı görüntülemek için lütfen tıklayınız (İndirmek için sağ tıklayınız).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Brewer's Yeast	MP Biomedicals, LLC.	903312
Glucose	Sigma Aldrich	158968-3KG
Agar	Fisher--Lab Scientific	fly802010
Welch's 100% Grape Juice Concentrate	Walmart or other grocery store	9116196
Cage: 32 oz. Translucent Round Deli Container	Webstaurant Store	999L5032Y
Translucent Round Deli Container Lid	Webstaurant Store	999YNL500
Stock Bottles	Genesee Scientific	32-130
Droso-Plugs	Genesee Scientific	49-101
Nylon Mesh	Genesee Scientific	57-102
Plastic Bushing	Home Depot	100404002
Plastic Bushing Cap	Home Depot	100153897
Specimen Cup	MedSupply Partners	K01-207067
Repeater M4	Eppendorf	4982000322
50 ml Centrifuge Tubes	TrueLine Centrifuge Tubes	TR2003
Food Boxes	USA Scientific	2316-5001
Lysing Matrix D Bulk	MP Biomedicals, LLC.	116540434
Filter Pipette Tips, 300 µl	USA Scientific	1120-9810
Petri Dishes	Laboratory Product Sales	M089303
Ethanol	Decon Laboratories, INC.	2701
Paintbrush	Walmart	5133
Forceps	Fisher	08-882
Household Bleach (6-8% Hypochlorite)	Walmart	550646751
Universal Peptone	Genesee Scientific	20-260
Yeast Extract	Fisher Scientific	BP1422-500
Dipotassium Phosphate	Sigma Aldrich	P3786-1KG
Ammonium Citrate	Sigma Aldrich	25102-500g
Sodium Acetate	VWR	97061-994
Magnesium Sulfate	Fisher Scientific	M63-500
Manganese Sulfate	Sigma Aldrich	10034-96-5
MRS Powder	Sigma Aldrich	69966-500G
96 Well Plate Reader	BioTek (Epoch)	NA
1.7 ml Centrifuge Tubes	USA Scientific	1615-5500
Filter Pipette Tips, 1,000 µl	USA Scientific	1122-1830
96 Well Plates	Greiner Bio-One	655101
Ceramic Beads	MP Biomedicals, LLC.	6540-434
Tissue Homogenizer	MP Biomedicals, LLC.	116004500
Class 1 BioSafety Cabinet	Thermo Scientific	Model 1395