Encyclopedia of Experiments: Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
- כדי לבצע הדמיית סידן vivo במערכת העצבים Drosophila, למקד את הביטוי של מחוון סידן מקודד גנטית, כגון GCaMP, לנוירונים של עניין. כאשר נוירונים לירות פוטנציאל פעולה, depolarization מהיר של הממברנה גורם ערוצי סידן מגודר מתח לפתוח, המוביל זרם של סידן חוץ תאי לתוך התא.
GCaMP הוא חלבון היתוך שבו חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר, או EGFP, משתנה ומותך לשבר M13 של שרשרת אור המיוסין ב- N-terminus, ולחלבון מחייב הסידן, calmodulin, בטרמינוס C. סידן נקשר לרגיעה, מפעיל שינויי קונפורמציה ב- GCaMP, וגורם לעלייה בפלואורסצנטיות של החלבון.
כדי שינויים בתמונה בפלואורסצנטיות GCaMP כפרוקסי לפעילות עצבית ב vivo, לחשוף את האזור של מערכת העצבים עם פעילות צפויה. לאחר מכן, להשתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי שיכול ללכוד דינמיקה GCaMP ומצויד בהגדרת משלוח גירוי.
בפרוטוקול הדוגמה, נראה הדמיה תפקודית GCaMP בשימוש כדי לדמיין את התגובות בגופי הפטריות של המוח במהלך למידה אסוציאטיבית חוש הריח.
- להדמיה של מחווני סידן מבוססי GFP, לכוון את הלייזר של מיקרוסקופ מולטי פוטון מצויד לייזר אינפרא אדום ומטרת טבילה במים, מותקן על שולחן מבודד רטט, לאורך גל עירור של 920 ננומטר, ולהתקין מסנן פס GFP. באמצעות ידית התאמת Z גסה, לסרוק דרך ציר z של המוח כדי לאתר את אזור המוח של עניין. השתמש בפונקציית היבול כדי למקד את הסריקה רק על האזור המעניין כדי למזער את זמן הסריקה, ולסובב את תצוגת הסריקה כך הקדמי של הראש פונה כלפי מטה. גודל ל 512 על ידי 512 פיקסלים ובחר את האזור להסרה, תוך התחשבות בזמן הסריקה המחושב עבור כל מסגרת כדי להשיג קצב מסגרות של לפחות 4 הרץ.
להדמיה חולפת של סידן מעורר ריח, ליזום חבילת מאקרו מתוכנתת מראש המסוגלת לקשר בין תוכנת רכישת התמונה לבין תוכנית אספקת הריח ולהתחיל את המדידה בתוכנת המיקרוסקופ למשך 6.25 שניות כדי לקבוע ערך בסיסי F0. במערכת מסירת הריח, לספק גירוי ריח 2.5 שניות, המצוין כאן על ידי תאורה של נוריות, מופעלות על ידי פתיחה וסגירה של שסתומי כוס ריח ספציפיים, ואחריו 12.5 שניות של הקלטה בסוף קיזוז הריח.
כדי לבצע מיזוג אסוציאטיבי בהתקנה זו, השתמש במערכת מסירת הריח הנשלטת על-ידי המחשב כדי להציג את הגירוי המותנה בתוספת ריח למשך 60 שניות, לצד 12 זעזועים חשמליים של 90 וולט. לאחר הפסקה של 60 שניות, הציגו את גירוי המצב מינוס ריח לבדו למשך 60 שניות ללא התחשמלות.
