Encyclopedia of Experiments: Biology
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- Para realizar imagens in vivo de cálcio no sistema nervoso Drosophila, direcionar a expressão de um indicador de cálcio geneticamente codificado, como o GCaMP, aos neurônios de interesse. Quando os neurônios disparam um potencial de ação, a rápida despolarização da membrana faz com que canais de cálcio fechados de tensão se abram, levando a um fluxo de cálcio extracelular na célula.
GCaMP é uma proteína de fusão na qual a proteína fluorescente verde aprimorada, ou EGFP, é modificada e fundida ao fragmento M13 da cadeia de luz da micosina no N-terminus, e à proteína de ligação de cálcio, calmodulin, no C-terminus. O cálcio se liga à calmodulina, desencadeia mudanças de conformação no GCaMP, causando um aumento na fluorecência da proteína.
Para as mudanças de imagem na fluorescência GCaMP como proxy para atividade neuronal in vivo, exponha a região do sistema nervoso com atividade antecipada. Em seguida, use um microscópio fluorescente que possa capturar a dinâmica GCaMP e esteja equipado com uma configuração de entrega de estímulos. Entregue o estímulo, por exemplo, um odor, ao registrar fluorescência GCaMP em neurônios que respondam.
No protocolo de exemplo, veremos imagens funcionais GCaMP sendo usadas para visualizar respostas nos corpos de cogumelos do cérebro durante o aprendizado associativo olfativo.
- Para visualização dos indicadores de cálcio baseados em GFP, sintonize o laser de um microscópio multifotônio equipado com um laser infravermelho e um objetivo de imersão em água, instalado em uma mesa isolada de vibração, a um comprimento de onda de excitação de 920 nanômetros, e instalar um filtro de bandpass GFP. Usando o botão de ajuste Z grosseiro, escaneie através do eixo z do cérebro para localizar a região de interesse do cérebro. Use a função da cultura para focar a varredura apenas na área de interesse para minimizar o tempo de varredura, e gire a visão de varredura de tal forma que o anterior da cabeça esteja voltado para baixo. tamanho para 512 por 512 pixels e selecione a região a ser digitalizada, levando em conta o tempo de varredura calculado para cada quadro para alcançar uma taxa de quadro de pelo menos 4 Hertz.
Para visualização transitória de cálcio evocada pelo odor, inicie um pacote macro pré-programado capaz de vincular o software de aquisição de imagens e o programa de entrega de odor e inicie a medição no software de microscópio por 6,25 segundos para estabelecer um valor de linha de base F0. No sistema de entrega de odor, entregue um estímulo de odor de 2,5 segundos, indicado aqui pela iluminação dos LEDs, desencadeado pela abertura e fechamento de válvulas específicas de copo de odor, seguido por 12,5 segundos de gravação no final do deslocamento do odor.
Para realizar condicionamento associativo nesta configuração, use o sistema de entrega de odor controlado por computador para apresentar o estímulo condicionado mais odor por 60 segundos, Ao lado de choques elétricos de 12 90 volts. Após uma pausa de 60 segundos, apresente a condição de estímulo menos odor sozinho por 60 segundos sem choque elétrico. Meça os transitórios de cálcio evocados pelo odor pós-treino novamente repetindo o protocolo de estimulação do odor pré-treino 3 minutos após o término da fase de treinamento.
