Encyclopedia of Experiments: Biology
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- ड्रोसोफिला तंत्रिका तंत्र में वीवो कैल्शियम इमेजिंग में प्रदर्शन करने के लिए, जीसीएएमपी जैसे आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड कैल्शियम संकेतक की अभिव्यक्ति को रुचि के न्यूरॉन्स तक लक्षित करें। जब न्यूरॉन्स एक क्रिया क्षमता को आग लगाते हैं, तो झिल्ली के तेजी से अपध्रुवीकरण से वोल्टेज-गेटेड कैल्शियम चैनल खुल जाते हैं, जिससे कोशिका में अंतर्कोशिकीय कैल्शियम की आमद होती है।
GCaMP एक संलयन प्रोटीन है जिसमें बढ़ाया हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन, या EGFP, संशोधित किया जाता है और एन-टर्मिनस में मायोसिन लाइट चेन के M13 टुकड़े को जोड़ा जाता है, और कैल्शियम-बाध्यकारी प्रोटीन, calmodulin, सी-टर्मिनस में । कैल्शियम शांत करने के लिए बांधता है, GCadulin में संरचना परिवर्तन ट्रिगर, प्रोटीन फ्लोरेस में वृद्धि के कारण ।
वीवो में न्यूरोनल गतिविधि के लिए प्रॉक्सी के रूप में जीसीएएमपी फ्लोरेसेंस में छवि परिवर्तन करने के लिए, प्रत्याशित गतिविधि के साथ तंत्रिका तंत्र के क्षेत्र का पर्दाफाश करें। फिर, एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग करें जो जीसीएएमपी गतिशीलता को कैप्चर कर सकता है और एक उत्तेजना वितरण सेटअप से लैस है। उत्तेजना, उदाहरण के लिए, एक गंध, जबकि न्यूरॉन्स का जवाब देने में GCaMP फ्लोरेसेंस रिकॉर्डिंग।
उदाहरण प्रोटोकॉल में, हम देखेंगे कि GCaMP कार्यात्मक इमेजिंग का उपयोग घ्राण साहचर्य सीखने के दौरान मस्तिष्क के मशरूम निकायों में प्रतिक्रियाओं की कल्पना करने के लिए किया जा रहा है।
- जीएफपी-आधारित कैल्शियम संकेतकों के दृश्य के लिए, एक अवरक्त लेजर और पानी विसर्जन उद्देश्य से लैस एक मल्टीफोटोन माइक्रोस्कोप के लेजर को ट्यून करें, एक कंपन अलग मेज पर स्थापित, ९२० नैनोमीटर की एक उत्तेजन तरंग दैर्ध्य के लिए, और एक GFP बैंडपास फिल्टर स्थापित करें । मोटे जेड समायोजन घुंडी का उपयोग कर, मस्तिष्क के जेड धुरी के माध्यम से स्कैन करने के लिए ब्याज के मस्तिष्क क्षेत्र का पता लगाने । फसल समारोह का उपयोग करने के लिए केवल ब्याज के क्षेत्र पर स्कैनिंग ध्यान केंद्रित करने के लिए स्कैन समय को कम करने के लिए, और स्कैन दृश्य इस तरह घुमाएं कि सिर के पूर्ववर्ती नीचे की ओर सामना करना पड़ रहा है तो, फ्रेम समायोजित करें । आकार 512 पिक्सल द्वारा 512 तक और कम से कम 4 हर्ट्ज की फ्रेम दर प्राप्त करने के लिए प्रत्येक फ्रेम के लिए गणना स्कैन समय को ध्यान में रखते हुए स्कैन करने के लिए क्षेत्र का चयन करें।
गंध-पैदा कैल्शियम क्षणिक दृश्य के लिए, छवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर और गंध वितरण कार्यक्रम को जोड़ने में सक्षम एक पूर्व प्रोग्राम मैक्रो पैकेज शुरू करें और एफ0 बेसलाइन मूल्य स्थापित करने के लिए 6.25 सेकंड के लिए माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर में माप शुरू करें। गंध वितरण प्रणाली में, एक 2.5 सेकंड गंध उत्तेजना वितरित करें, जो यहां एलईडी की रोशनी से संकेत दिया जाता है, जो विशिष्ट गंध कप वाल्व के उद्घाटन और समापन से शुरू होता है, इसके बाद गंध ऑफसेट के अंत में रिकॉर्डिंग के 12.5 सेकंड होते हैं। फिर, उसी तरीके से एक दूसरे और तीसरे गंध के लिए डिलीवरी दोहराएं।
इस सेटअप में साहचर्य कंडीशनिंग करने के लिए, कंप्यूटर नियंत्रित गंध वितरण प्रणाली का उपयोग करने के लिए वातानुकूलित उत्तेजना प्लस गंध ६० सेकंड के लिए पेश करते हैं, 12 90 वोल्ट के बिजली के झटके के साथ। 60 सेकंड के ब्रेक के बाद, बिना बिजली के झटके के 60 सेकंड के लिए अकेले स्थिति उत्तेजना शून्य गंध पेश करें। प्रशिक्षण चरण खत्म करने के 3 मिनट बाद पूर्व प्रशिक्षण गंध उत्तेजना प्रोटोकॉल को दोहराकर फिर से प्रशिक्षण के बाद की गंध-पैदा किए गए कैल्शियम यात्रियों को मापें। फिर, इमेजिंग फाइलों को बाद में छवि विश्लेषण के लिए उपयुक्त प्रारूप में सहेजें।
