ショウジョウバエインビボ カルシウムイメージング:神経活動の機能的イメージング法

-ショウジョウバエ神経系で生体内カルシウムイメージングを行うために、GCaMPのような遺伝的にコードされたカルシウム指標の発現を目的のニューロンに標的とする。ニューロンが作用電位を引き起こすと、膜の急速な脱分極が電圧ゲートカルシウムチャネルを開き、細胞内に細胞外カルシウムが流入する。

GCaMPは、緑色蛍光タンパク質(EGFP)を修飾してN末流のミオシン軽鎖のM13断片に、カルシウム結合タンパク質、カルモジュリン、C末流でカルシウム結合する融合タンパク質であり、カルシウムはカルモジュリンに結合し、GCaMPのコンフォメーション変化を引き起こし、タンパク質の蛍光の増加を引き起こす。

生体内の神経活動の代理としてGCaMP蛍光の変化を画像化するには、予想される活動で神経系の領域を露出させる。次に、GCaMPダイナミクスを捉え、刺激送達のセットアップを備えた蛍光顕微鏡を使用する。

このプロトコルの例では、嗅覚連想学習中に脳のキノコの身体の応答を可視化するためにGCaMP機能イメージングが使用されていることがわかります。

- GFPベースのカルシウム指標の可視化のために、赤外線レーザーと水浸しの目的を備えた多光子顕微鏡のレーザーを調整し、振動孤立したテーブルに取り付けられ、920ナノメートルの励起波長に、GFPバンドパスフィルタを取り付けます。粗いZ調整ノブを使用して、脳のZ軸をスキャンして対象の脳領域を見つけます。 512 x 512ピクセルにサイズを設定し、各フレームの計算されたスキャン時間を考慮して、少なくとも 4つの Hertzのフレームレートを達成するために、スキャンする領域を選択します。

臭気誘発カルシウム過渡的可視化のために、画像取得ソフトウェアと臭気送達プログラムをリンクできる事前プログラムされたマクロパッケージを開始し、6.25秒間顕微鏡ソフトウェアで測定を開始してF0ベースライン値を確立します。 臭気デリバリーシステムでは、特定の臭いカップバルブの開閉によって引き起こされるLEDの照明によってここに示される2.5秒の臭気刺激を送り出し、その後、臭いオフセットの終わりに12.5秒の記録が続きます。

この設定で自動調整を実行するには、コンピュータ制御の臭気デリバリーシステムを使用して、12 90ボルトの電気ショックと一緒に60秒間、条件付き刺激と臭いを提示します。