Drosophila In Vivo Kalsiyum Görüntüleme: Nöronal Aktivitenin Fonksiyonel Görüntüleme Yöntemi

- Drosophila sinir sisteminde in vivo kalsiyum görüntüleme yapmak için, GCaMP gibi genetik olarak kodlanmış bir kalsiyum göstergesinin ilgi çekici nöronlara ifadesini hedef alın. Nöronlar bir eylem potansiyeli ateşlediğinde, zarın hızlı depolarizasyonu voltaj kapılı kalsiyum kanallarının açılmasına neden olur ve hücre içine hücre dışı kalsiyum akınına yol açar.

GCaMP, gelişmiş yeşil floresan proteinin bulunduğu bir füzyon proteinidir, veya EGFP, N-terminustaki miyosin ışık zincirinin M13 parçasına ve C-terminustaki kalsiyum bağlayıcı protein calmodulin'e modifiye edilir ve kaynaştırır.

Vivo nöronal aktivite için bir proxy olarak GCaMP floresan görüntü değişiklikleri için, beklenen aktivite ile sinir sisteminin bölgesini maruz. Sonra, GCaMP dinamikleri yakalayabilir floresan mikroskop kullanın ve bir uyarıcı teslimat kurulumu ile donatılmıştır. Uyarıcı, örneğin bir koku, yanıt veren nöronlarda GCaMP floresan kaydederken.

Örnek protokolde, koku alma ilişkilendirilebilir öğrenme sırasında beynin mantar vücutlarındaki yanıtları görselleştirmek için GCaMP fonksiyonel görüntülemenin kullanıldığını göreceğiz.

- GFP bazlı kalsiyum göstergelerinin görselleştirilmesi için, kızılötesi lazer ve titreşim izole bir masaya monte edilmiş su daldırma hedefi ile donatılmış çok sesli bir mikroskobun lazerini 920 nanometrelik bir uyarlama dalga boyuna ayarlayın, ve bir GFP bandpass filtresi takın. Kaba Z ayar düğmesini kullanarak, ilgi çekici beyin bölgesini bulmak için beynin z ekseninde tarama yapın. Tarama süresini en aza indirmek için taramayı yalnızca ilgi alanına odaklamak için kırpma işlevini kullanın ve tarama görünümünü başın ön kısmı aşağı bakacak şekilde döndürün. boyutu 512 x 512 piksel ve en az 4 Hertz kare hızı elde etmek için her kare için hesaplanan tarama süresini dikkate alarak taranacak bölgeyi seçin.

Koku uyandıran kalsiyum geçici görselleştirme için, görüntü alma yazılımını ve koku dağıtım programını birbirine bağlayabilen önceden programlanmış bir makro paketi başlatın ve F0 taban çizgisi değeri oluşturmak için mikroskop yazılımında ölçüme 6,25 saniye boyunca başlayın. Koku dağıtım sisteminde, burada LED'lerin aydınlatılmasıyla belirtilen, belirli koku kabı vanalarının açılıp kapanmasıyla tetiklenen 2,5 saniyelik bir koku uyaranı ve ardından koku uzaklığının sonunda 12,5 saniyelik kayıt yapın.

Bu kurulumda ilişkilendirilebilir koşullandırma yapmak için, bilgisayar kontrollü koku dağıtım sistemini kullanarak şartlandırılmış uyaranı ve kokuyu 60 saniye boyunca sunmak, 12 adet 90 voltluk elektrik şokunun yanı sıra. 60 saniyelik bir aradan sonra, durum uyaran eksi kokuyu elektrik çarpması olmadan 60 saniye boyunca tek başınız sunun. Eğitim aşamasını bitirdikten 3 dakika sonra eğitim öncesi koku stimülasyon protokolünü tekrarlayarak eğitim sonrası koku uyandıran kalsiyum geçicilerini tekrar ölçün.